Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика видового состава и эколого-физиологические особенности микробоценозов тлей (Homoptera: Aphididae), паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Динамика видового состава и эколого-физиологические особенности микробоценозов тлей (Homoptera: Aphididae), паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях"

На правах рукописи

Малышина Марина Сергеевна

ДИНАМИКА ВИДОВОГО СОСТАВА И ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ (НОМОРТЕЛА: АРНЮГОАЕ), ПАРАЗИТИРУЮЩИХ НА ДРЕВЕСНЫХ И КУСТАРНИКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

г 4 ок г ¿он

Саратов-2013

005536068

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» на кафедре микробиологии и физиологии растений

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Петерсон Александра Михайловна, кандидат биологических наук, доцент

Батлуцкая Ирина Витальевна,

доктор биологических наук, профессор,

НИУ «Белгородский государственный

университет»,

заведующая кафедрой биотехнологии и микробиологии

Карпунина Лидия Владимировна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», заведующая кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии

ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет»

Защита состоится 15 ноября 2013 г. в 12 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83. E-mail: biosovet@sgu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Автореферат разослан «/2» ог/йл/м. 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной экологии любой макроорганизм рассматривается как среда обитания, как своеобразная экосистема в узком значении этого понятия. Важнейшим компонентом такой экосистемы являются микроорганизмы, обитающие во внутренней среде хозяина и оказывающие на него огромное влияние (Сукачев, 1972; Балашов, 1982). Несмотря на это, микробоценозы большинства видов живых организмов остаются практически неизученными. Объектами наших исследований являются тли - широко распространённые вредители сельскохозяйственных культур. Многие фенотипические признаки этих насекомых определяются не собственными генами, а генами живущих в них бактерий, что позволяет рассматривать тлей как своеобразные симбиотические «сверхорганизмы» (Russel, Moran, 2006; Guay et al., 2009; Degnan et al., 2010). До настоящего времени внимание исследователей привлекали, в основном, облигатные симбионты тлей -бактерии рода Buchnera. Эти бактерии обеспечивают своих хозяев незаменимыми аминокислотами, которых нет в растительных соках, определяют способность насекомых приспосабливаться к колебаниям температуры (Douglas, 1998; Tsuchida et al., 2010). Из факультативных бактериальных симбионтов тлей в мировой литературе описано лишь небольшое количество видов, ассоциированных с гороховой тлёй (Mandrioli, Manicardi, 2013). Присутствие этих симбионтов защищает их хозяев от наездников и энтомопатогенных грибов, придает насекомым защитную пигментацию, способствует синтезу некоторых аминокислот. Вопрос о том, насколько разнообразны микробные ассоцианты других видов тлей, и какую роль они могут играть в жизнедеятельности своих хозяев остается открытым.

Интерес к изучению тлей связан и с их участием в сохранении и передаче возбудителей болезней растений (Nault, 1997; Leach, 2007; Hogenhout, 2008; Stawrinides, Nadarasah, 2011). В литературе большое внимание уделяется роли тлей как переносчиков фитопатогенных вирусов. Среди возбудителей бактериозов растений лишь для Pseudomonas syringae (Stavrinides et al., 2009), Dickeya dadantii, Erwinia aphidicola, Pantoea stewartii (Nadarasah, Stavrinides, 2011) доказана способность выживать и размножаться в организмах этих насекомых. Детальное изучение спонтанной микробной обсеменённости тлей поможет выявить более широкий спектр фитопатогенов, способных сохраняться в организмах этих вредителей.

Изучение микробоцйнозов тлей является важным этапом разработки новых микробиологических методов ограничения численности насекомых. Существующие биопрепараты на основе облигатных энтомопатогенов имеют ряд недостатков, главный из которых — необходимость в постоянных повторных обработках. Причина этого в высокой степени специализации таких микроорганизмов: гибель насекомых влечет за собой отмирание самих возбудителей бактериозов. Этот недостаток микробных инсектицидов может быть устранен с помощью методов генной инженерии. Предлагается вводить

гены, обеспечивающие синтез токсических веществ, . в широко распространенные сапрофитные бактерии (Lacey, Kaya, 2007). Такие микроорганизмы после гибели вредителей будут сохраняться в природной среде как обычные сапрофиты и в течение длительного времени контролировать численность насекомых. Становится актуальным поиск штаммов бактерий, которые могли бы послужить материалом для создания таких трансгенных агентов.

В связи с этим, исследование микробоценозов тлей не только представляет теоретический интерес, но и имеет большое практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы стало выявление видового состава и эколого-физиологических особенностей микробоценозов тлей, паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить эколого-физиологические аспекты формирования микробоценозов тлей.

2. Установить структуру микробоценозов четырёх видов тлей: яблонной (Aphis pomi Deg.), сливоопыленной (Hyalopterus pruni Geoffr.), вишневой (Myzuscerasi F.) и смородиновой (Aphis schneidert C.B.), и количественные показатели содержания отдельных видов бактерий-ассоциантов в организмах этих насекомых.

3. Оценить роль исследуемых видов тлей как резервуаров фитопатогенных бактерий в природе.

4. Выявить изменчивость качественных и количественных характеристик микробоценозов тлей.

Научная новизна. Впервые установлена структура микробоценозов яблонной (А. pomi), сливоопыленной (Н. pruni), вишневой (М cerasi) и смородиновой (А. schneiden) тлей; показана высокая степень изменчивости микробоценозов тлей как в разные годы, так и в течение одного сезона; доказана способность тлей сохранять в своём организме фитопатогенные виды Brenneria nigrifluens, Curtobacterium flaccumfaciens, Erwinia mallotivora, Pantoea ananatis, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris; установлено высокое содержание в организмах тлей азотфиксирующих бактерий.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют представления о роли тлей в циркуляции бактерий в природе. Выявленная способность некоторых фитопатогенных бактерий сохраняться в организме тли позволит фитопатологам более точно прогнозировать распространение вызываемых ими бактериозов растений. Выделены штаммы бактерий, которые являются обитателями окружающей среды, но способны успешно проникать во внутреннюю среду тлей и активно там размножаться. Эти штаммы могут быть использованы для создания трансгенных энтомопатогенов, которые позволят более эффективно контролировать численность этих вредителей.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Биодиверситиология. Современные проблемы сохранения и изучения биологического разнообразия» (Чебоксары, 2010); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); Международной заочной научно-практической конференции: «Современные тенденции в науке: новый взгляд» (Тамбов, 2011); I Международной интернет-конференции «Растения и микроорганизмы» (Казань, 2011); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2012); XIV съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из которых 4 в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автор лично провёл полевые и лабораторные исследования. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление проведены автором самостоятельно. Доля участия автора в совместных публикациях составляет 60-80%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах, содержит 23 таблицы, 31 рисунок. Состоит из введения, б глав, 6 выводов, заключения, списка литературы, включающего 184 источника, в том числе 121 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробоценозы тлей в значительной степени формируются за счет микроорганизмов, попадающих во внутреннюю среду насекомых с кормовых растений и способных адаптироваться к новым условиям обитания.

2. Организмы яблонной, сливоопыленной, вишневой и смородиновой тлей являются средой обитания для широкого круга гетеротрофных и фитопатогенных бактерий. Многие сапрофитические виды бактерий, изолированные из тлей, обладают различными факторами фитопатогенности.

3. Видовой состав микробоценозов всех исследованных видов тлей крайне нестабилен и существенно изменяется в разные годы и в течение сезона.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, научно-практическая значимость, представлены сведения об апробации работы и сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ТЛЕЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

В главе проведен обзор литературы, посвященной особенностям морфологии, физиологии и экологии тлей, которые могут оказывать влияние на формирование микробоценозов этих насекомых. Обобщены имеющиеся в мировой литературе данные об облигатных и факультативных симбионтах тлей, рассмотрена роль тлей в сохранении и распространении фитопатогенных микроорганизмов; проанализированы перспективы использования энтомопатогенных микроорганизмов для борьбы с этими вредителями.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований послужили бескрылые и крылатые самки тлей, собранные в Саратовском, Энгельсском, Балашовском и Базарно-Карабулакском районах Саратовской области в 2007-2012 гг. Было исследовано 2300 особей яблонной (Aphis pomi Deg.), 1000 особей сливоопыленной (Hyalopterus pruni Geoffr.), 800 особей вишневой (Myzus cerasi F.), и 1100 особей смородиновой (Aphis schneiden C.B.) тлей. Из каждого биотопа одновременно исследовалось по 100 насекомых.

Непосредственно перед бактериологическим посевом насекомых усыпляли, обрабатывали в 96%-ном этаноле в течение 5 мин для уничтожения микроорганизмов, обитающих на внешних покровах, затем дважды промывали в стерильном физиологическом растворе. 10 экземпляров тлей, обработанных таким образом, растирали в ступке с 0,5 мл физиологического раствора, и полученный гомогенизат высевали на ГРМ-агар, картофельную среду, среду Сабуро, а также на экспериментальные среды на основе водных вытяжек из кормовых растений. Посевы инкубировали при температуре 28°С в течение 48— 72 ч. Далее проводили количественный учёт выделенных штаммов микроорганизмов и отсев их для дальнейшего изучения. Культуральные, морфологические и биохимические свойства изолятов изучали по общепринятым методикам (Нетрусов, 2005). При выявлении факторов фитопатогенности определяли способность к мацерации тканей тест-растений и целлюлолитическую активность (Желдакова, Мямин, 2006). В ходе работы с каждым штаммом было поставлено около 20 биохимических тестов, которые позволили выявить способность изолятов использовать различные химические соединения в своем метаболизме, установить диапазон их устойчивости к некоторым физико-химическим факторам.

Первоначальную идентификацию выделенных ассоциантов проводили по фенотипическим признакам. Видовая принадлежность доминирующих штаммов и штаммов фитопатогенных бактерий была подтверждена секвенированием 16S рРНК в сервисной лаборатории «Синтол» (г. Москва).

Для изучения микрофлоры поверхности кормовых растений тлей проводили посевы смывов с листьев на ГРМ-агар и картофельную среду. Для

подтверждения способности бактерий попадать в организм тли с поверхности кормового растения использовали штамм Serratia marcescens 205, который обладал ярко-красной пигментацией, и его можно было легко выявить в посеве. Этот штамм был выделен нами из организмов калиновой тли Aphis viburni Scop. Взвесями этого штамма в концентрациях Ю2, 104, 106, 109 м.к./мл обрабатывали поверхности листьев яблони и вишни, на которых обитали колонии тлей. На 1, 2 и 3-е сутки проводили микробиологические исследования смывов с листьев и внутренней среды насекомых.

Для изучения микрофлоры внутренней среды листьев кормового растения фрагмент листовой пластинки обрабатывали в спирте в течение пяти минут, затем промывали в физиологическом растворе. 0,1 г листовой пластинки гомогенизировали с 0,9 мл физиологического раствора. Полученную суспензию засевали на питательные среды ГРМ-агар и картофельную среду. Через 48-72 ч проводили учет выросших колоний.

Численность микроорганизмов во внутренней среде насекомых оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) в пробе из 10 особей тлей. Индексы общности видового состава микробоценозов тлей рассчитывали как отношение видов, общих для двух сравниваемых групп, к общему количеству выделенных из них видов, выраженное в процентах. Встречаемость рассчитывали как число проб, в которых обнаружены бактерии данного вида, к общему числу проб, выраженное в процентах (Беклемишев, 1970).

Обработку полученных данных проводили с помощью программы Статистика 6.0. В основу кластерного анализа были положены такие параметры, как средняя встречаемость в организмах тлей за весь период исследования, максимальная встречаемость в 10 пробах из одного биотопа, а также средние и максимальные количественные показатели в пробе. Использование в анализе максимальных показателей обусловлено интересом к видам, способным успешно проникать в организм тли и достигать там высокой численности. Количество кластеров, которые целесообразно выделять в микробоценозе того или иного вида тли, определяли с помощью графика процесса объединения (Graph of Amalgamation schedule) и таблицы объединения объектов (Amalgamation schedule). Выявленному количеству кластеров соответствовало расстояние объединения, равное 6.

Глава 3. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОРМИРОВАНИЯ МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ

Формирование микробоценоза внутренней среды любого макроорганизма является важным этапом его развития. Известно, что передача по вертикали, т.е. от материнских особей дочерним, характерна только для облигатных симбионтов тлей - бактерий рода Buchnera, которые обнаруживаются уже у эмбрионов насекомых (Bermingham, Wilkinson, 2010). Мы предположили, что основная часть факультативных ассоциантов приобретается тлями во время

g

контакта с кормовым растением. Для выяснения сходства микрофлоры кормового растения и внутренней среды питающихся на нем тлей были параллельно проведены их микробиологические исследования. Было установлено, что видовое разнообразие микроорганизмов на поверхности растения всегда намного выше, чем во внутренней среде тли. Индексы общности видового состава микрофлоры поверхности листа кормового растения и внутренней среды насекомых составили у яблонной тли 31,5 %, сливоопыленной тли - 28,5%, вишнёвой тли - 23,1%, смородиновой тли — 15,0%.

Для подтверждения возможности проникновения бактерий с поверхности кормовых растений во внутреннюю среду насекомых была проведена обработка поверхности кормовых растений яблонной и вишнёвой тлей взвесями бактерий Serratia marcescens 205 в различных концентрациях.

При использовании взвесей в концентрации от 102 до 106 м.к./мл единичные клетки S. marcescens обнаруживались на поверхности листьев вишни лишь в течение первых суток и в организм насекомых не попадали. При использовании взвеси в концентрации 10 м.к./мл, S. marcescens в течение 3-х суток выделялся как с поверхности листьев, так и из внутренней среды вишневой тли. При обработке листьев яблони взвесями в концентрациях от 104 до 109 м.к./мл бактерии сохраняли свою жизнеспособность на поверхности кормовых растений лишь в течение первых суток и не изолировались из организмов насекомых.

Таким образом, успешное попадание интродуцированного штамма в организм тлей зависит как от его концентрации на поверхности растения, так и от вида насекомого.

После проникновения в макроорганизм, бактериям необходимо адаптироваться к специфическим условиям внутренней среды своего хозяина. Известно, что бактерии, активно размножающиеся в том или ином макроорганизме, как правило, приносят ему определенную пользу (если они не являются патогенными для него). В противном случае в процессе эволюции неизбежно возникнут механизмы, препятствующие их размножению там. В связи с этим нами были изучены биологические свойства штаммов, выделенных из внутренней среды насекомых, позволяющие им адаптироваться к обитанию во внутренней среде насекомых и оказывать влияние на функционирование организма хозяина.

Из-за высоких концентраций углеводов во флоэмном соке, тли подвергаются постоянному осмотическому стрессу. Известен ряд механизмов, позволяющих тлям избегать обезвоживания (Ashford, 2000; Powell, Hardie, 2002; Pompon et al., 2010). Дополнительным осморегуляторным механизмом может служить способность бактериальных ассоциантов тли к использованию Сахаров в качестве источника углерода и энергии. Действительно, 79% штаммов были способны использовать те или иные углеводы. Помимо глюкозы — углевода, чаще всего используемого бактериями, большое количество

штаммов было способно расщеплять сахарозу, которая является основным компонентом флоэмного сока растений (таблица 1).

Таблица 1 — Сахаролитическая активность бактерий-ассоциантов различных видов тлей

Количество штаммов, использующих данный углевод, %

Виды тлей сахароза маннит глюкоза лактоза арабиноза ксилоза манноза

Яблонная 45,6 20,9 54,3 12,3 14,8 22,2 22,2

Сливоопыленная 62,9 29,6 62,9 16,6 27,7 31,4 31,4

Вишневая 51,2 30,7 53,8 7,6 23,0 23,0 28,2

Смородиновая 72,8 38,9 59,3 16,9 30,5 32,2 54,2

Причем количественные показатели сахаролитических штаммов достигали 106 -107 КОЕ, а несахаролитических штаммов не превышали 103-1<Г КОЕ в пробе. Таким образом, способность к использованию Сахаров бактериями-ассоциантами не только позволяет им самим активно размножаться за счет этих соединений, но и существенно влияет на их концентрацию в пищеварительном канале насекомых.

Важным ресурсом-ограничителем для любого биологического вида является азот. Наиболее остро проблема азотного питания стоит у тлей, питающихся растительным соком, с низкой концентрацией азотсодержащих соединений. Ряд растительноядных насекомых (некоторые муравьи, термиты) решают эту проблему за счёт азотфиксирующих ассоциативных микроорганизмов (Pinto-Tomas et al., 2009; Reid, Lloyd-Jones, 2009). Наши исследования впервые показали, что в организме тлей также присутствует большое количество азотфиксирующих бактерий. Способностью к фиксации молекулярного азота в разных видах тлей обладали от 62,7 до 94,4% изолятов. Большое количество штаммов было способно использовать нитраты, присутствующие в растительных соках, в качестве источника азота или в энергетическом метаболизме. Протеолитическая активность бактерий-ассоциантов была значительно ниже, так как белков в пищеварительном тракте тли крайне мало (таблица 2).

Таблица 2 - Способность бактерий-ассоциантов различных видов тлей к трансформации азотсодержащих соединений

Виды тлей Количество штаммов, использующих данное соединение, %

N 2 Ж)3~ Белки

ассимиляционная нитратредукция диссимиляционная нитратредукция

Яблонная 79,5 84,3 77,1 43,3

Сливоопыленная 94,4 87,0 94,4 37,0

Вишневая 87,1 92,2 92,3 41,0

Смородиновая 62,7 76,2 91,5 69,4

Тли способны сохранять жизнеспособность при температуре от +1 до +39°С (НагеН е1 а1., 2010). Было важно выяснить, будут ли бактерии-ассоцианты успешно функционировать при таких температурах. Оказалось, что большая часть выделенных штаммов более устойчива к низким температурам (таблица 3).

Таблица 3 — Диапазон устойчивости бактерий-ассоциантов различных видов тлей к некоторым физико-химическим факторам

Виды тлей Количество штаммов, способных к росту при данном значении фактора, %

температура рН

10°С 28°С 43 °С 5 7 10

Яблонная 59,2 100 25,9 43,2 100 92,5

Сливоопыленная 72,2 100 24,0 51,8 100 88,8

Вишневая 56,4 100 23,0 51,2 100 92,3

Смородиновая 47,4 100 15,2 84,7 100 88,1

От 15,2 до 25,9% штаммов были способны размножаться при температуре +43 °С. Таким образом, при колебаниях температуры окружающей среды от +10 до +43°С часть ассоциантов будет сохранять метаболическую активность.

Известно, что в пищеварительном канале растительноядных насекомых поддерживается щелочная реакция среды (Сартега, 2008). Следовательно, чтобы успешно существовать в таких условиях микроорганизмы должны быть алкалотолерантными. Действительно, от 88,1 до 92,5% штаммов, выделенных из разных видов тлей, оказались способны к росту даже при рНЮ.

Таким образом, микробоценоз тлей формируется преимущественно за счет микроорганизмов, попадающих во внутреннюю среду насекомых с кормовых растений. Часть обитателей внешней среды в организме насекомых неизбежно погибнет, часть сможет адаптироваться к этой специфической экологической нише, будет успешно там размножаться, и оказывать определенное влияние на организм своего хозяина.

Глава 4. СТРУКТУРА МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ, ПАРАЗИТИРУЮЩИХ НА ДРЕВЕСНЫХ И КУСТАРНИКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

Наши исследования показали, что организм тли является резервуаром для огромного количества микроорганизмов. Из одной пробы выделялось от одного до семи видов бактерий и грибов. Бактериальные ассоцианты изолировались из 100% проб, а их общие количественные показатели варьировали от 103 до 107 КОЕ в 10 особях. Встречаемость грибов в организмах исследованных видов тлей в весенне-летний период была низкой (не более 10%), а количественное содержание в отдельных пробах не превышало 103 КОЕ. В связи с этим, основное внимание в работе было уделено бактериальной составляющей микробоценозов этих насекомых.

Всего из организмов четырех видов тлей было выделено 915 штаммов бактерий, идентификация которых показала их принадлежность к 86 видам 36 родов.

В микробоценозах всех исследованных насекомых наиболее разнообразно был представлен род Bacillus (27 видов). Отдельные роды {Aureobacterium, Curtobacterium, Microbacterium, Enterococcus, Staphylococcus, Aeromonas, Envinia, Pantoea, Pseudomonas, Serratia, Xenorhabdus) включали от двух до семи видов, остальные таксоны в микробоценозах тлей имели единичных представителей.

Из организмов яблонной тли за весь период исследований было выделено 65 видов 29 родов, сливоопыленной - 37 видов 19 родов, вишневой — 31 вид 19 родов, смородиновой - 38 видов 19 родов.

Статистический анализ показателей встречаемости и численности бактериальных ассоциантов во внутренней среде тлей позволил объединить выделенные виды в несколько кластеров. В микробоценозе яблонной тли было выделено пять кластеров (рисунок 1), в микробоценозах сливоопыленной, вишневой и смородиновой тлей - четыре кластера (рисунки 2, 3, 4).

Рисунок 1 - Кластеры, выделяемые в микробоценозе яблонной тли

Третий и четвёртый кластеры яблонной тли были очень схожи по основным сравниваемым параметрам, отличаясь только по встречаемости в отдельных биотопах.

ЧШ1ЦШШН!

а Р 8 а Г! .й

Рисунок 2 - Кластеры, выделяемые в микробоценозе сливоопылённой тли

5

5 Ё

ь. |

е .о б в 55 ? Е

5 4 5-0 5 » 6 5 й, а о

«= О '5 Ч чЗ

3 «.3

■г: о у

0$

I - и й

^ ^ 1-1 * 03

§ И а

и <

3 ■§. 3 э § *

I В

«1 1

Я ^

■а а

05 05

Рисунок 3 - Кластеры, выделяемые в микрободенозе вишнёвой тли 12

¿03 1 1 §■ Е .г- в а "

4 о; Е в) § 4 о. Е а а;

8 1 5 ^ 1 -I 6 8 « 1-5 § § -к л 5 8 5

" ■ ■ ^"С»« § о* |

Рисунок 4 - Кластеры, выделяемые в микробоценозе смородиновой тли

В целом в микробоценозах всех исследованных видов тлей выделялись четыре основных группы бактериальных ассоциантов с разной степенью адаптированности к обитанию в организмах тлей. Первая группа включала

виды, которые регулярно встречаются в организмах тлей и достигают там высокой численности, т.е. это виды, наиболее адаптированные к обитанию во внутренней среде насекомых. Вторая группа объединяла бактериальных ассоциантов, которые также выделялись из организмов тлей в разных биотопах и в разные годы, но показатели их встречаемости и численности быпи ниже, чем у предыдущей группы. Третья группа (у яблонной тли это виды третьего и четвёртого кластера) включала бактериальных ассоциантов, которые редко попадают в организм тли, но, попав туда, могут активно там размножаться, достигая высокой концентрации в организме насекомого. К четвёртой группе (у яблонной тли это виды пятого кластера) относились виды, которые редко попадают в организм тли, и их численность там никогда не достигает высоких показателей.

Индексы общности видового состава исследованных видов тлей варьировали от 28,3 до 46,3% (рисунок 5). Наиболее схожими оказались микробоценозы яблонной и сливоопылённой тлей (индекс общности 46,3%).

Рисунок 5 - Индексы общности (%) видового состава микробоценозов различных видов тлей

Несмотря на достаточно низкие индексы общности, было выделено 12 видов (Bacillus clausii, В. drentensis, В. funiculus, В. lentus, В. subtilis, В. pumilus, Curtobacterium herbarum, Kurthia zopfli, Aerococcus viridans, Marinococcus albus, Paracoccus carotinifaciens, Pantoea stewartii), встречавшихся во всех исследованных таксонах насекомых. Вид Р. stewartii оказался доминирующим в микробоценозах всех видов тлей, что говорит о его высокой адаптационной способности.

Глава 5. ОРГАНИЗМЫ ТЛЕЙ КАК РЕЗЕРВУАРЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Наши исследования показали, что внутренняя среда тли благоприятна для сохранения широкого круга фитопатогенных бактерий (таблица 4).

Таблица 4 - Выделение фитопатогенных бактерий из организмов тлей

Виды фитопатогенных бактерий Объекты выделения (виды тлей) Количественные показатели содержания в организме тли, КОЕ в пробе

Brenneria nigrifluens яблонная юМо'

сливоопыленная юМо"

Curlobacterium flaccumfaciens яблонная 103-10'

сливоопыленная 10ь

смородиновая 10'

Erwinia mallotivora смородиновая 103

Pantoea ananatis яблонная 106-10'

вишневая 104-105

смородиновая 10'

Pantoea stewartii яблонная ю'-ю'

сливоопыленная юМо7

вишневая 104-10'

смородиновая юМо'

Ralstonia solanacearum сливоопыленная 10'

Xanthomonas campestris яблонная 103-105

Наиболее широкий спектр фитопатогенных бактерий (5 видов) был выделен из организмов яблонной тли, из организмов сливоопыленной и смородиновой тлей было изолировано по четыре фитопатогенных вида, из вишневой тли - два.

Таким образом, из всех исследованных нами видов наибольшее значение как резервуар фитопатогенов имеет яблонная тля, способная сохранять в своём организме наибольшее число фитопатогенных видов в высоких концентрациях. Наиболее активно тли участвуют в сохранении в природе популяции Р. з(е-н>агШ, который входил в число доминирующих видов у всех исследованных таксонов насекомых

Помимо хорошо известных фитопатогенных видов в последнее время многие сапрофитические виды постепенно переходят в разряд условно-патогенных и патогенных. Выделенные в ходе экспериментов штаммы сапрофитических видов бактерий-ассоциантов были проверены на способность к мацерации растительных тканей и на наличие целлюлолитической активности. Было установлено, что 44% всех изолятов обладали различными

факторами фитопатогенности. В большем количестве такие бактерии выделялись из организмов яблонной и сливоопылённой тлей. Обращают на себя внимание 3 штамма, обладавшие несколькими факторами фитопатогенности. Именно они с наибольшей вероятностью могут оказаться патогенными для растений (таблица 5).

Таблица 5 - Штаммы сапрофитических видов бактерий, обладающие наибольшим количеством факторов фитопатогенности

Штамм Объекты Наличие Мацерация тканей

выделения целлюлазы картофеля моркови свёклы

В. simplex 422 смородиновая + + + +

B.funiculus 166 тля + + - +

В. pumilus 580 вишневая тля - + + +

+ положительная реакция; - отрицательная реакция

Таким образом, тли могут являться носителями как уже известных фитопатогенов, так и видов, которые потенциально способны вызывать патологические изменения в растительных тканях.

Глава 6. ДИНАМИКА МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ

Отмечена высокая вариабельность микробоценозов исследуемых насекомых. Индексы общности микробоценозов тлей одного вида, собранных с одних и тех же кормовых растений в одни и те же периоды, но в разных районах Саратовской области не превышали 26,9% у яблонной тли, 41,6% у сливоопылённой, 40% у вишневой и 16% у смородиновой тли. Низкие значения индексов общности можно объяснить достаточно большим видовым разнообразием выделяемых бактерий. При этом лишь 2-3 ассоцианта изолировались из организмов одного вида тлей во всех исследованных биотопах. К числу таких стабильных ассоциантов у яблонной тли можно отнести В. clausii, В. subtilis и Р. stewartii, у сливоопылённой тли - В. subtilis и Р. stewartii, у вишневой тли - В. subtilis, В. pumilus, Serratia plymuthica, у смородиновой - В. subtilis и Р. stewartii. Однако, несмотря на стабильность выделения этих видов, их количественные показатели содержания в организмах тлей и показатели встречаемости существенно варьировали в разных районах.

Изменчивы оказались и микробоценозы тлей, собранных в одних и тех же биотопах в разные годы. Индексы общности микробоценозов яблонной тли в разные вегетационные сезоны составляли от 23,5 до 45,4%, сливоопылённой-от 24,1 до 47,0%, вишневой - от 20,0 до 40,0%, смородиновой - от 30,0 до 42,8%. Отмечено, что из организмов одного вида тли лишь несколько

ассоциантов выделялось в течение всех лет исследования. Однако, несмотря на стабильность выделения этих видов в разные годы, количественные показатели их содержания в организмах насекомых и показатели встречаемости в течение одного сезона у многих из них были низкие. Максимальной численности в организмах тлей в разные годы достигали разные виды бактерий.

Моделями для изучения динамики микробоценоза насекомых в течение сезона послужили смородиновая и яблонная тли. Исследования смородиновой тли проводили с мая по июль 2012 г. Оказалось, что в микробоценозе этого вида ежемесячно происходила смена доминанта (таблица 6).

Таблица 6 - Встречаемость (%) некоторых видов бактерий в организмах смородиновой тли в течение вегетационного сезона 2012 г.

Виды бактерий Месяцы

май июнь июль

Serratia plymuthica 35 0 0

Bacillus subtilis 25 0 0

В. pumilus 15 40 0

В. soli 45 10 0

В. thuringiensis 0 80 30

Pantoea stewartii 0 10 40

B. horikoshii 0 0 60

Вид, доминировавший в предыдущие месяцы, в последующие либо не изолировался совсем, либо выделялся в меньшем количестве. При аналогичных исследованиях яблонной тли были отмечены схожие закономерности.

Ежемесячные микробиологические исследования тлей не позволили обнаружить период смены доминанта. С этой целью была проведена серия 10-дневных исследований микробоценозов тлей, снимаемых с одного итого же кормового растения. В качестве модельного объекта была выбрана смородиновая тля, поскольку у неё наиболее чётко прослеживалась смена доминирующих видов в течение сезона (таблица 7).

Таблица 7 — Смена доминирующих видов в микробоценозе смородиновой тли в течение 10 дней (встречаемость в пробах, %)

Виды бактерий Сутки

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

В. horti 0 0 0 30 0 0 30 0 0 0

В.imperiale 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0

В. pumilus 100 60 100 100 100 60 30 0 0 0

В. simplex 0 0 0 0 100 100 60 100 60 100

P. stewartii 60 30 0 30 100 60 100 100 100 60

Исследования первых проб выявили доминирование в микробоценозе смородиновой тли вида В. pumilus. Его стабильность сохранялась в течение первых шести дней, но, уже начиная с пятого дня в большинстве проб появлялись В. simplex и P. stewartii, которые вскоре становились главными доминантами.

Таким образом, микробоценоз тлей является динамичной системой, на которую оказывают влияние микробная обсемененность кормового растения, физиологическое состояние насекомого-хозяина и т.д. Изменения этих параметров приводят к изменениям качественных и количественных характеристик микробоценозов тлей.

ВЫВОДЫ

1. Основными источниками микроорганизмов, обитающих в пищеварительных каналах тлей, являются поверхность и внутренняя среда кормовых растений насекомых-хозяев. Индексы общности видового состава микробоценозов поверхности кормового растения и внутренней среды тлей составляют от 15,0 до 31,5%, микробоценозов внутренней среды растения и внутренней среды насекомых - от 48,2 до 57,6%.

2. Успешность выживания бактерий в организмах насекомых зависит от их способности адаптироваться к специфическим условиям этих биотопов: щелочной реакции среды, высокой концентрации сахарозы и недостатку азотных соединений. Показано, что алкалотолерантными являются от 88,1 до 92,5% выделенных из тлей штаммов, использовать сахарозу были способны от 45,6 до 72,8%, процесс азотфиксации могут осуществлять от 62,7 до 94,4% изолятов.

3. В состав микробоценоза яблонной тли {Aphis pomi Deg.) входят 65 видов бактерий 29 родов, сливоопылённой (Hyalopterus pruni Geofïr.) -37 видов 19 родов, вишневой (Myzus cerasi F.) - 31 вид 19 родов, смородиновой (Aphis schneiden C.B.) - 38 видов 19 родов. Количественные показатели содержания отдельных видов бактерий в организмах насекомых-хозяевах варьируют от 103 до 107 КОЕ в пробе.

4. В микробоценозах тлей выделяются четыре основные экологические группы бактериальных ассоциантов, характеризующиеся разной степенью адаптированное™ к обитанию во внутренней среде насекомых. К группе доминирующих видов у яблонной и сливоопылённой тлей относятся В. subtilis, В. pumilus, P. stewartii, вишневой - В. horti, P. simplex, P. stewartii, S. plymuthica, смородиновой - В. simplex, В. pumilus, В. soli, P. stewartii.

5. В состав микробоценозов тлей входят фитопатогенные бактерии Brenneria nigrifluens, Curtobacterium flaccumfaciens, Erwinia mallotivora, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris. 44% штаммов сапрофитических видов бактерий, изолированных из тлей, обладали различными факторами фитопатогенности.

6. Микробоценозы тлей являются чрезвычайно динамичными структурами. Индексы общности видового состава микробоценозов насекомых одного вида, собранных в разных районах Саратовской области, составляют от 16 до 42%, в разные годы - от 20 до 47%. В течение одного сезона также происходит смена как общего видового состава микробоценозов, так и доминирующих видов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ♦-публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ

1. Петерсон, А.М. Динамика микробоценоза яблонной тли {Aphis pomi Deg.) в Саратовской области в 2007-2009 гг. / Петерсон A.M., Глинская Е.В., Зарезина Д.О., Малышина М.С. // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2010. - Вып. 8. - С. 96-100.

2. Петерсон, A.M. Таксономическое разнообразие бактерий, ассоциированных с организмом сливоопыленной тли (Hyalopterus pruni Geoffr.) / Петерсон А.М., Глинская Е.В., Зарезина Д.О., Малышина М.С. И Биодиверситиология. Современные проблемы сохранения и изучения биологического разнообразия: сб. матер. II Международ, науч.-практ. конф. -Чебоксары, 2010. - С. 32-34.

3. Малышина, М.С. Сезонная динамика видового состава микробной ассоциации яблонной тли {Aphis pomi Deg.) / Малышина М.С. // Исследования молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2011. - Вып. 9. - С. 55-59.

4. Малышина, М.С. Яблонная тля {Aphis pomi Deg.) как возможный переносчик фитопатогенных бактерий / Малышина М.С. // Современные тенденции в науке: новый взгляд: сб. науч. тр. - Тамбов, 2011. - С. 77.

5. Глинская, Е.В. Организм тли как резервуар сапрофитных и фитопатогенных бактерий в природе / Глинская Е.В, Петерсон A.M., Малышина М.С. // Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке: матер. Международ, научн. конф. - СПб., 2011. — С. 32.

6. Петерсон, A.M. Участие некоторых видов тли в сохранении фитопатогенных бактерий в природе / Петерсон А.М., Глинская Е.В., Малышина М.С. // Растения и микроорганизмы: матер. I Международ, интернет-конф. - Казань, 2011. - С. 202-205.

7. Малышина, М.С. Микробоценоз сливоопыленной тли {Hyalopterus pruni Geoffr.) в Саратовской области / Малышина М.С. //Исследования молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2012. - Вып. 10. - С. 54-57.

8. Малышина, М.С. Роль внеклеточных симбионтов в осморегуляции тли (Insecta, Homoptera) / Малышина М.С., Петерсон A.M., Глинская Е.В. //Энтомопатологические и паразитологические исследования в Поволжье: сб. науч. тр. - Изд-во Сарат. ун-та, 2012. - Вып. 10. - С. 92-96.

ы

с /

9. Петерсон, A.M. Роль факультативных бактерий-симбионтов в азотном питании тли Aphis pomi Deg. (Homoptera: Aphidoidea) / Петерсон A.M., Глинская E.B., Малышина M.C. //XIV съезд Русского энтомологического общества: матер, съезда. - СПб, 2012. - С. 340.

10.* Петерсон, A.M. Сравнительная характеристика микробных ассоциаций некоторых видов тли в Саратовской области / Петерсон A.M., Глинская Е.В., Малышина М.С. // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология, 2011. - Т. 11, вып. 2. - С. 63-67.

11.* Малышина, М.С. Биологические свойства бактерий-ассоциантов вишневой тли (Myzus cerasi F., 1775) (Insecta: Homoptera, Aphididae) /Малышина M.C., Петерсон A.M., Глинская E.B. // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология, 2013. - Т. 13, вып. 1. - С. 4752.

12. Малышина, М.С. Микробоценоз калиновой тли (Aphis viburni Scop.) в Саратовской области в 2011-2012 гг. / Малышина М.С. // Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов: матер. Всероссийской конф,- Саранск, 2013. - С. 121-125.

13.* Малышина, М.С. Выявление факторов фитопатогенности у бактерий-ассоциантов некоторых видов тли в Саратовской области / Малышина М.С., Петерсон A.M., Балтаева С.Ю. // Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология, 2013. - Т. 13, вып. 2. - С. 49-53.

14.* Малышина, М.С. Микробоценоз яблонной тли (Aphis pomi Deg., 1775) в некоторых районах Саратовской области / М.С. Малышина, Е.В. Глинская, A.M. Петерсон // Поволжский экологический журнал. - 2013. -№2.-С. 226-230.

Подписано в печать 13.07.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 148.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель СерманЮ.Б. Свидетельство №3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малышина, Марина Сергеевна, Саратов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» кафедра микробиологии и физиологии растений

На правах рукописи

04201 451 1 06

Малышина Марина Сергеевна

ДИНАМИКА ВИДОВОГО СОСТАВА И ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ (НОМОРТЕ11А: АРНГОГОАЕ), ПАРАЗИТИРУЮЩИХ НА ДРЕВЕСНЫХ И КУСТАРНИКОВЫХ РАСТЕНИЯХ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Петерсон А.М., к.б.н., доцент

Саратов 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 4

1 ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ТЛЕЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ (обзор литературы).............................................................................. 8

1.1 Тли как среда обитания микроорганизмов....................................... 8

1.1.1 Морфология и жизненные циклы тлей......................................... 8

1.1.2 Строение и функционирование пищеварительной системы тлей -основного места локализации микроорганизмов................................. 15

1.2 Симбиотические микроорганизмы тлей........................................ 18

1.3 Роль тлей в распространении фитопатогенных микроорганизмов....... 23

1.4 Энтомопатогенные микроорганизмы и их использование для борьбы

с тлей....................................................................................... 26

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................. 34

2.1 Характеристика района исследования......................................................................................34

2.2 Места сборов насекомых......................................................................................................................35

2.3 Материал исследования........................................................................................................................37

2.4 Методы исследования..........................................................................................................................41

2.4.1 Методы выделения микроорганизмов из внутренней среды тлей...... 41

2.4.2 Методы изучения биологических свойств выделенных

штаммов................................................................................... 42

2.4.3 Методы изучения влияния микрофлоры кормового растения на видовой состав микробоценозов тлей............................................... 44

2.4.4 Методы изучения экологических показателей, используемых в работе...................................................................................... 45

2.4.5 Методы статистической обработки результатов

исследования............................................................................. 45

3 ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФОРМИРОВАНИЯ

МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ.......................................................... 47

3.1 Основные источники микроорганизмов, входящих в состав

микробоценозов тлей....................................................................................................................................47

3.2 Биологические свойства бактерий, позволяющие им адаптироваться к

обитанию во внутренней среде насекомых................................................................................51

4 СТРУКТУРА МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ, ПАРАЗИТИРУЮЩИХ НА ДРЕВЕСНЫХ И КУСТАРНИКОВЫХ РАСТЕНИЯХ......................................................56

4.1 Структура микробоценоза яблонной тли (А. pomi)......................................................56

4.2 Структура микробоценоза сливоопыленной тли (Н. pruni)................................59

4.3 Структура микробоценоза вишневой тли (М cerasi)..............................................61

4.4 Структура микробоценоза смородиновой тли (А. Schneideri)............................64

4.5 Сравнительная характеристика микробоценозов различных видов

тлей..............................................................................................................................................................................65

5 ОРГАНИЗМЫ ТЛЕЙ КАК РЕЗЕРВУАРЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДЕ..................................................................................................................................................................72

6 ДИНАМИКА МИКРОБОЦЕНОЗОВ ТЛЕЙ..........................................................................79

6.1 Динамика микробоценозов тлей в различных районах Саратовской области..........................................................................................................................................................................79

6.2 Динамика микробоценозов тлей в разные годы..............................................................88

6.3 Сезонная динамика микробоценозов тлей..........................................................................110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................................................115

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................122

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................123

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА............................................................141

Введение

Актуальность темы. В современной экологии любой макроорганизм рассматривается как среда обитания, как своеобразная экосистема в узком значении этого понятия. Важнейшим компонентом такой экосистемы являются микроорганизмы, обитающие во внутренней среде хозяина и оказывающие на него огромное влияние (Сукачев, 1972; Балашов, 1982). Несмотря на это, микробоценозы большинства видов живых организмов остаются практически неизученными. Объектами наших исследований являлись тли - широко распространённые вредители сельскохозяйственных культур. Многие фенотипические признаки этих насекомых определяются не собственными генами, а генами живущих в них бактерий, что позволяет рассматривать тлей как своеобразные симбиотические «сверхорганизмы» (Russel, Moran, 2006; Guay et al., 2009; Degnan et al., 2010). До настоящего времени внимание исследователей привлекали, в основном, облигатные симбионты тлей - бактерии рода Buchnera. Эти бактерии обеспечивают своих хозяев незаменимыми аминокислотами, которых нет в растительных соках, определяют способность насекомых приспосабливаться к колебаниям температуры (Douglas, 1998; Tsuchida et al., 2010). Из факультативных бактериальных симбионтов тлей в мировой литературе описано лишь небольшое количество видов, ассоциированных с гороховой тлёй (Mandrioli, Manicardi, 2013). Присутствие этих симбионтов защищает их хозяев от наездников и энтомопатогенных грибов, придает насекомым защитную пигментацию, способствует синтезу некоторых аминокислот. Вопрос о том, насколько разнообразны микробные ассоцианты других видов тлей, и какую роль они могут играть в жизнедеятельности своих хозяев остается открытым.

Интерес к изучению тлей связан и с их участием в сохранении и передаче возбудителей болезней растений (Nault, 1997; Leach, 2007; Hogenhout, 2008; Stawrinides, Nadarasah, 2011). В литературе большое внимание уделяется роли

тлей как переносчиков фитопатогенных вирусов. Среди возбудителей бактериозов растений лишь для Pseudomonas syringae (Stavrinides et al., 2009), Dickeya dadantii, Envinia aphidicola, Pantoea stewartii (Nadarasah, Stavrinides, 2011) доказана способность выживать и размножаться в организмах этих насекомых. Детальное изучение спонтанной микробной обсеменённости тлей поможет выявить более широкий спектр фитопатогенов, способных сохраняться в организмах этих вредителей.

Изучение микробоценозов тлей является важным этапом разработки новых микробиологических методов ограничения численности насекомых. Существующие биопрепараты на основе облигатных энтомопатогенов имеют ряд недостатков, главный из которых - необходимость в постоянных повторных обработках. Причина этого в высокой степени специализации таких микроорганизмов: гибель насекомых влечет за собой отмирание самих возбудителей бактериозов. Этот недостаток микробных инсектицидов может быть устранен с помощью методов генной инженерии. Предлагается вводить гены, обеспечивающие синтез токсических веществ, в широко распространенные сапрофитные бактерии (Lacey, Kaya, 2007). Такие микроорганизмы после гибели вредителей будут сохраняться в природной среде как обычные сапрофиты и в течение длительного времени контролировать численность насекомых. Становится актуальным поиск штаммов бактерий, которые могли бы послужить материалом для создания таких трансгенных агентов.

В связи с этим, исследование микробоценозов тлей не только представляет теоретический интерес, но и имеет большое практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы стало выявление видового состава и эколого-физиологических особенностей микробоценозов тлей, паразитирующих на древесных и кустарниковых растениях.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить эколого-физиологические аспекты формирования микробоценозов тлей.

2. Установить структуру микробоценозов четырёх видов тлей: яблонной (Aphis pomi Deg.), сливоопыленной (Hyalopterus pruni Geoffr.), вишневой (Myzus cerasi F.) и смородиновой (Aphis schneiden C.B.), и количественные показатели содержания отдельных видов бактерий-ассоциантов в организмах этих насекомых.

3. Оценить роль исследуемых видов тлей как резервуаров фитопатогенных бактерий в природе.

4. Выявить изменчивость качественных и количественных характеристик микробоценозов тлей.

Научная новизна. Впервые установлена структура микробоценозов яблонной (А. pomi), сливоопыленной {Н. pruni), вишневой (М cerasi) и смородиновой (А. schneiden) тлей; показана высокая степень изменчивости микробоценозов тлей как в разные годы, так и в течение одного сезона; доказана способность тлей сохранять в своём организме фитопатогенные виды Brenneria nigrifluens, Curtobacterium flaccumfaciens, Envinia mallotivora, Pantoea ananatis, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris; установлено высокое содержание в организмах тлей азотфиксирующих бактерий.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют представления о роли тлей в циркуляции бактерий в природе. Выявленная способность некоторых фитопатогенных бактерий сохраняться в организме тли позволит фитопатологам более точно прогнозировать распространение вызываемых ими бактериозов растений. Выделены штаммы бактерий, которые являются обитателями окружающей среды, но способны успешно проникать во внутреннюю среду тлей и активно там размножаться. Эти штаммы могут быть использованы для создания трансгенных энтомопатогенов, которые позволят более эффективно контролировать численность этих вредителей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микробоценозы тлей в значительной степени формируются за счет микроорганизмов, попадающих во внутреннюю среду насекомых с кормовых растений и способных адаптироваться к новым условиям обитания.

2. Организмы яблонной, сливоопыленной, вишневой и смородиновой тлей являются средой обитания для широкого круга гетеротрофных и фитопатогенных бактерий. Многие сапрофитические виды бактерий, изолированные из тлей, обладают различными факторами фитопатогенности.

3. Видовой состав микробоценозов всех исследованных видов тлей крайне нестабилен и существенно изменяется в разные годы и в течение сезона.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на II Международной научно-практической конференции «Биодиверситиология. Современные проблемы сохранения и изучения биологического разнообразия» (Чебоксары, 2010); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2011); Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); Международной заочной научно-практической конференции: «Современные тенденции в науке: новый взгляд» (Тамбов, 2011); I Международной интернет-конференции «Растения и микроорганизмы» (Казань, 2011); Региональной конференции биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2012); XIV съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012) Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013).

1 ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ТЛЕЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

(обзор литературы)

1.1 Тли как среда обитания микроорганизмов 1.1.1 Морфология и жизненные циклы тлей

Тли формируют монофилетическую группу, которая сформировалась около 280 миллионов лет назад (Grimaldi, Engel, 2005). Эти насекомые относятся к подклассу Pterygota - высшие или крылатые насекомые, к отделу Hemimetabola -насекомые с неполным превращением, надотряду Hemipteroidea, отряду Homoptera - Равнокрылые, подотряду Aphidinea - Тли. Подотряд делится на два надсемейства: собственно тлей (Aphidoidea) и хермесовых (Adelgoidea). Некоторые авторы считают эти надсемейства лишь семействами (Бей-Биенко, 2008).

В мировой фауне описано приблизительно 4400 видов тлей (Le Trionnaire et al., 2008). На территории России известно около 1000 видов тлей (Бей-Биенко, 2008).

Первые подробные данные о морфологии тлей в России были представлены в работах русского афидолога А.К. Мордвилко (1898, 1914, 1929). В дальнейшем морфологические особенности этих насекомых уточнялись во многих работах как отечественных, так и зарубежных авторов.

Тли - мелкие насекомые от 0,5 до 6 - 7,5 мм, форма тела варьирует от округлой до удлиненной. Покровы тлей мягкие, нежные, состоят из трех слоев: наружной эпикутикулы, внутренней эпикутикулы и прокутикулы (Brey et al., 1985). Химический анализ экстракта из кутикулы гороховой тли (Acyrthosiphon pisum Harris) показал наличие в ней 27% углеводородов, 20% алкильных эфиров, 14% метиловых эфиров жирных кислот, 13% триглицеридов, 16% свободных жирных кислот и 10% н-спиртов. Внешние компоненты кутикулы включали

свободные аминокислоты и моносахариды, попавшие из экскрементов тли -медвяной росы (Brey et al., 1985).

Многие тли выделяют на поверхности тела белое восковидное вещество в виде мучнистой пыли или в виде длинных белых нитей. По сообщению N. Pike и D. Richard (2002) выделяемое вещество является гидрофобным и дополнительно защищает тлей от внешних воздействий.

Окраска тлей может быть различной (Мордвилко, 1910; Ивановская, 1977; Абдрашитова, 2005). N. Moran с соавторами (2010) сообщают о наличии у тлей каротиноидов. Зеленые формы содержат a-, ß-, у-каротины (желтые или желто-оранжевые соединения), красные (коричневые) формы помимо каротинов содержат ликопин или торулен (красные соединения). Филогенетический анализ позволяет предположить передачу генов каротиноидов от грибов к предку многих современных видов тлей (Moran, Jarvik 2010). О грибном происхождении генов красной и зеленой окраски гороховой тли также сообщает T. Fukatsu (2010). M. Caillaud и J. Losey (2009) считают, что полиморфизм окраски гороховой тли определяется менделевскими законами, однако T. Tsuchida, R. Koga et al. (2010) сообщают, что в природных популяциях изменять цвет тлей с красного на зеленый способны симбиотические бактерии рода Rickettsiella. В работе R.L. Jenkins с коллегами о главных каротиноидных пигментах злаковой тли {Sitobion avenae F.) также указывается, что синтез каротиноидов, ответственных за зеленый и коричневый цвет тлей, может находиться под контролем внутриклеточных эндосимбиотических бактерий (Jenkins et al., 1999).

Тело тлей, как и всех насекомых, подразделяется на три отдела — голову, грудь и брюшко (рисунок 1).

Рисунок 1 - Особенности морфологии тли: А - крылатая девственная самка-расселительница;

Б - бескрылая девственная самка: 1 - усик, 2 - его шпиц, 3 - птеростигма, 4 - соковые трубочки, 5 - хвостик, 6 - хоботок (по: Бей-Биенко, 1980 с изм.).

На голове располагаются ротовые органы и одна пара усиков. Усики 3-6-члениковые, вершинный членик заканчивается острием, или шпицем. На члениках усика имеются органы чувств - ринарии, форма которых может быть различной (неправильная, округлая, вытянутая, полукольцевая, кольцевая, поперечно-линейная, звездчатая) (Ивановская, 1977). Глаза сложные, крупные, с трехфасеточным бугорком. У крылатых особей кроме сложных глаз имеются еще три простых глазка: один на лбу, а два между сложными глазами на темени. Хоботок 4-члениковый, короткий или длинный (Мордвилко, 1910; Ивановская, 1977; Захваткин, 2001). На вершине последнего членика хоботка имеются очень мелкие волоски - микросенсиллы. Три пары постоянных волосков имеются перед вершиной последнего членика, под ними расположены дополнительные волоски.

Грудь трехчленистая, несет три пары ходильных ног. Крылатые самки-расселительницы имеют две пары прозрачных крыльев с простым жилкованием, которые складываются кровлеобразно (Мордвилко, 1910; Ивановская, 1977; Бей-Биенко, 2008).

Брюшко состоит из 8 сегментов и, как правило, лишено ног (Бей-Биенко, 1980). На стернитах брюшка расположены дыхальца, на тергитах - краевые бугорки. На спинной стороне, по бокам V и ногда VI се гментов расположены соковые трубочки {cornicles), которые являются проводниками из гемоцеля во внешнюю среду и гомологичны жировому телу (Мордвилко, 1898; Lindsay, 1969; Ивановская, 1977). В них обнаружены 5 типов вакуолей и игольчатые кристаллы, описаны клапан, мускулатура и трахеи (Lindsay, 1969).

Длина соковых трубочек зависит от того, в каких колониях живут тли: в рассеянных колониях преобладают насекомые с более длинными cornicles, в плотных колониях - с короткими. Соковые трубочки выполняют экскреторную и защитную функции. В ответ на нападение естественных врагов отдельные виды тлей выбрасывают через cornicles феромоны тревоги, представляющие собой секвитерпеновые соединения (Francis et al., 2005; Verheggen et al., 2009). Соковые трубочки выполняют функцию и механической защиты от врагов. Установлено, что колонии тлей с короткими cornicles чаще посещаются муравьями (Mondor, Roitberg, Stadler, 2002). На посл