Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика и механизмы формирования цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Динамика и механизмы формирования цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе"

На правах рукописи

ЖАРСКАЯ ОКСАНА ОЛЕГОВНА

УДК 576.311.347:612.176

ДИНАМИКА И МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ДЕРИВАТОВ ЯДРЫШКА В МИТОЗЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры клеточного ядра отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета ям. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук Зацепина Ольга Владимировна

доктор биологических наук Попенко Владимир Иванович доктор биологических наук Ляпунова Наталья Алексеевна Институт общей генетики им.

Н.И. Вавилова РАН

Зашита состоится «16» февраля 2006 г. в часов минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « /¿» Si^SaJUi, 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук / J E.H. Калистратова

SLOP G ft tàùb

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что основные функции наиболее крупного структурного домена клеточного ядра - ядрышка - такие, как транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг траискриптов рРНК и сборка рибосомных частиц, осуществляются, главным образом, на стадии интерфазы, когда ядрышко сохраняет структурную и функциональную целостность (Oison et al., 2002). При вступлении растительных и животных клеток в митоз транскрипция рДНК постепенно прекращается, а значительная часть ядрышковых белков и РНК мигрируют в цитоплазму и (или) ассоциируют с поверхностью хромосом, образуя так называемый периферический хромосомный материал (ПХМ) (Ченцов, 2000; DiMario, 2004; Leung et al., 2004). В результате этих изменений ядрышко постепенно деструктурируется и к метафазе митоза, как правило, полностью распадается. Из основных молекулярных компонентов ядрышка в связи с ядрьпшеообразующими районами хромосом (ЯОР) сохраняются лишь компоненты транскрипционного комплекса РНК полимеразы I, включая ее специфический фактор UBF (Zatsepina et al., 1993; Jordan et al., 1996, Gérbane - Younes et al., 1997; Sirri et al., 1999). Восстановление ядрышка начинается в поздней анафазе или ранней телофазе с реактивации транскрипции рДНК (Dousset et al., 2000; Мухарьямова, Зацепина, 2001; Leung et al., 2004) и появления многочисленных дискретных структур, материал которых, по-видимому, может использоваться для построения дочерних ядрышек. На сегодняшний день известны два типа таких структур, которые получили название митотических производных ядрышка: «цитоплазматические ядрышковые дериваты», ЦЯД (NDF, nucleolus derived foci), формирующиеся в цитоплазме в анафазе (Beven et al., 1996; Zatsepina et al., 1997a; Dundr et al., 1997), и проядрышки (PNBs, prenucleolar bodies), формирующиеся в дочерних ядрах в телофазе (Anguilier et al., 2005; Hernandez-Verdun, 2005). Показано, что в состав этих телец входят частично-процессированные 45-46S рРНК, малые ядрышковые РНК (мякРНК) и белки ядрышка, участвующие в процессинге рРНК.

В последние годы на основании анализа поведения белков в живых клетках установлено, что митотические производные ядрышка являются высоко динамичными структурами. Так, проядрышки способны сливаться друг с другом и с новоформирующимися ядрышками (Dundr et al., 2000, Savino et al., 1999,2001 ; Angelier et al., 2005), a материал ЦЯД мигрирует в дочерние ядра (Dundr et al., 2000). На основании полученных данных, авторами предложена гипотеза постмитотической сборки ядрышка у млекопитающих, согласно которой материал ЦЯД и проядрышек используется для построения формирующегося

рос. национальна?* !

БИБЛИОТЕКА А

ядрышка, причем порядок миграции индивидуальных белков в ядрышки отражает этап биогенеза рибосом, в котором этот белок участвует.

Однако имеющийся на сегодняшний день экспериментальный материал не дает возможности однозпачно раскрыть проблему формирования ядрышка в конце митоза. Остаются открытыми фундаментальные вопросы, касающиеся механизмов регуляции сборки производных ядрышка; функций, выполняемых этими митотическими образованиями; роли различных составляющих этих телец в поддержании их структурной и функциональной целостности; а также механизмов, обеспечивающих транспорт их материала в дочерние ядра и ядрышки. На сегодняшний день наименее изученными остаются цитоплазматические ядрышковые дериваты (ЦЯД).

Важную роль в реорганизации ядрышка в митозе играет уровень фосфорилирования его белков, таких как транскрипционные факторы рДНК (Heix et al., 1998; Klein, Grummt, 1999; Sirri et al., 1999) и фосфопротеины ядрышка В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин, участвующие в созревании транскринтов пре-рРНК (Belenguer et al., 1990; Peter et al., 1990; Jiang et al., 1999, 2000; Okuwaki et al., 2002). Киназой, осуществляющей дополнительное фосфорилирование этих белков в клетках высших эукариот, является основная митотическая циклин В-зависимая киназа Cdkl (Епифанова, 2003) Однако практически не решенным остается вопрос о том, какую роль играет митотическое фосфорилирование/дефосфорилирование ядрьпыковых белков в сборке цитоплазматических производных ядрышка.

Основная цель работы - исследование динамики, состава и возможных механизмов формирования цитоплазматических производных ядрышка в разных типах культур клеток млекопитающих, а также в клетках корневой меристемы лука Allium сера L. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ закономерностей формирования и состава индивидуальных ЦЯД (рРНК, белки зрелого ядрышка фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин, Nop52, UBF) на завершающих стадиях нормального митоза.

2. Исследовать влияние ингибирования синтеза и процессинга рРНК на сборку ЦЯД в митотических клетках млекопитающих.

3. Исследовать возможность индукции преждевременной сборки цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе в клетках млекопитающих в условиях обратимого воздействия растворов низкой ионной силы (гипотонического шока), который индуцирует появление проядрышек в ядрах интерфазных клеток (Zatsepina et al., 19976).

4. Изучить возможность индукции преждевременной сборки ЦЯД в митозе в клетках млекопитающих и растений под действием специфического (росковитин) и менее

специфического (стауроспорин) ингибиторов активности митотической циклин В-зависимой киназыС(1к1.

5. Изучить влияние ингибиторов митотической Cdkl на электрофоретическую подвижность основных белков ядрьппка - фибрилларина, С23/нуклеолнна, В23/нуклеофозмина.

Научная новизна работы. В работе впервые детально описана динамика формирования ЦЯД в нормальном митозе в нескольких типах клеток млекопитающих (клетки зеленой мартышки CV1, человека HeLa, мыши ЗТЗ и свиньи СПЭВ). Установлено, что ЦЯД являются динамичными структурами, характерными для многих гтролиферируютиих клеток эукариот. Показано, что большинство ЦЯД однородны по белковому составу и содержат белки раннего и позднего пропессинга рРНК зрелого ядрышка (фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин, Nop52), но не содержат фактора транскрипции рнбосомных генов, белка UBF. Предложены два способа индукции преждевременной сборки ЦЯД в метафазе митоза, которые, по-видимому, являклся взаимосвязанными. Так, впервые получены данные о том, что обратимое воздействие растворов низкой ионпой силы (гипотонического шока) на клетки млекопитающих индуцирует преждевременное образование ЦЯД на стадии метафазы. Показано, что эффективным индуктором сборки ЦЯД в метафазе является ингибирование циклин В-зависимой киназы Cdkl. Установлено, что рРНК, входящая в состав нормальных и индуцированных ЦЯД (иЦЯД), является необходимой для их формирования и синтезируется за несколько часов до начала деления клеток. На основании полученных и литературных данных, высказано предположение, что молекулярные механизмы формирования ЦЯД включают дефосфорилирование фосфопротеинов В23 и С23, что способствует их взаимодействию с рРНК. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в естественных и индуцированных производных ядрьппка может происходить процессинг рРНК.

Практическое значение работы. Выполненная работа представляет не только теоретический, но и практический интерес в биологии и медицине. Данные о возможности преждевременной сборки ЦЯД в метафазе митоза могут быть положены в основу индукции сборки ЦЯД в клеточных лизатах In vitro с целью последующего анализа их полного белкового состава методами масс-спектрометрии и дальнейшего изучения структурно-функциональных характеристик этих митотических производных ядрьппка. Данные о влиянии на ядрьппковый аппарат в делящихся клетках ингибиторов активности митотической циклин В-зависимой киназы Cdkl важны для клинической медицины,

поскольку один из них - росковитин - нашел применение в качестве антиопухолевого агента. Полученные данные могут быть использованы в качестве лекционного материала.

Апробация работы: основные результаты работы были представлены на 19-м международном симпозиуме «Клеточное ядро» (Мунштершварцах, Германия, 2005; на XV всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); на лабораторном семинаре в центре биологических исследований CIB CSIC (Мадрид, Испания, 2005); на Московском семинаре по биологии клетки и ' совместном заседании кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова и отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описание экспериментальных моделей. Работу проводили на следующих культурах клеток млекопитающих: клетки зеленой мартышки CV1, которые выращивали в смеси сред ДМЕМ и F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (HyClone) и антибиотиков; клетки культуры человека Hei л и мыши ЗТЗ вырагцивали в среде ДМЕМ с добавлением 5-7% эмбриональной сыворотки теленка (HyClone) и антибиотиков в стандартных концентрациях; клетки свиньи СПЭВ культивировали, как описано ранее (Мухарьямова и Зацепина, 2001). Для анализа белкового ЦЯД состава использовали кроличьи поликлональные антитела к специфическому фактору транскрипции рДНК, белку UBF (Santa Cruz); аутоиммунную сыворотку к фибрилларину, полученную от больного системной склеродермией (Мухарьямова и др., 1998); мышиные моноклональныс антитела к В23/нуклеофозмину (Zatsepina et al., 1999); аутоиммунные сыворотки к белку Nop52, полученные от'больных ревматоидным артритом я, (предоставлены М.О.Дж. Ольсоном; Университет г. Джексона, Миссиссиппи, США); мышиные моноклональные антитела к С23/нуклеолину (предоставлены М.О.Дж. Ольсоном); мышиные моноклональные антитела к ß-тубулину (Sigma, предоставлены Е.С. Надеждиной; Институт белка РАН).

Для иммуноцитохнмического анализа клетки, растущие на покровных стеклах, отмывали от культуральной среды в 0.1 М буфере ФСБ (фосфатно-солевой буфер, 140 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 1.5 мМ КН2Р04 и 8.1 мМ Na2HP04, pH 7.2 - 7.4), фиксировали абсолютным метанолом 10 мин при -20° С или 2% параформальдегидом (Sigma) на буфере ФСБ 10-20 мин при комнатной температуре. После фиксации параформальдегидом клетки дополнительно обрабатывали 0.2%-ным раствором Тритона Х-100 на буфере ФСБ в течение 5-10 мин, затем тщательно отмывали от детергента. Инкубацию с первыми антителами

проводили в течение 40 мин при 37° С, 1 ч при комнатной температуре или ночь при 4° С. Затем клетки промывали буфером ФСБ и инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ или ТРИТЦ (Sigma), в течение 45-60 мин при комнатной температуре Для окраски хроматина ядер и митотических хромосом использовали флуорохром DAPI (4'6-Diamidino-2'-phenylindole, Sigma) в концентрации 1 мкг/мл (10 мин). После окраски стекла с клетками заключали в Мовиол (Calbiochem). Препараты изучали в флуоресцентный микроскоп Аксиоверт 200 (Carl Zeiss, Германия), используя объектив Флуар 100х/ЧА 1.25 и соответствующие наборы фильтров. Изображения записывали с помощью 13-битной черно-белой камеры CoolSnapc/ (Roper Scientific, США) и переводили в псевдо-цвета с помощью программы AdobePhotoshop, версия 7.0.

Для выявления аргентофильных белков в клетках меристемы лука Allium сера L. луковицы очищали, промывали, помещали в стеклянные цилиндрические стаканы и выращивали в фильтрованной проточной воде при температуре 25±0.5° С, в темноте и с аэрацией в течение 2-3 дней. Контрольные и обработанные росковитином корешки фиксировали в смеси 10% водного раствора формальдегида (Probus) и 1% водного раствора гидрохинона (Merck) в соотношении 1:1 и окрашивали серебром по модифицированному методу Fernandez-Gomez et al., 1969.

Для изучения ЦЯД в условиях обратимого гипотонического воздействия, клетки CV1 или HeLa отмывали от культуральной среды в ФСБ, а затем помещали в ФСБ, разведенный дистиллированной водой в соотношении 1 5 (0.02 М ФСБ, рН 7.2-7.4), на 5-60 мин при 37° С. Затем клетки возвращали в культуральную среду полного состава и инкубировали в ней в течение 5-20 мин в стандартных условиях (см. выше). Клетки фиксировали 3% параформальдегидом, разведенным на 0.1 М ФСБ, и использовали для иммуноцитохимического окрашивания Клетки, подвергнутые воздействию только гипотоничного раствора, фиксировали 3% параформальдегидом на буфере ФСБ соответствующей молярности.

Для ингибирования циклин В-зависимой кииазы Cdkl клетки млекопитающих, растущие на покровных стеклах в чашках Петри, обрабатывали росковитином (Sigma) в концентрации 150 мкМ (Sigma) в течение 10-60 мин при 37° С и стауроспорином в концентрации 100 нг/мл (Upstate Biotechnology) в течение 10-60 мин при 37° С и фиксировали для иммуноцитохимического анализа. В этих условиях достигалась полная инактивация Cdkl (Sirri et al., 2000a; Lu et al., 1996). Луковицы Allium сера L обрабатывали росковитином (Sigma) в концентрации 150 мкМ, добавленным в воду, в течение 10-60 мин, затем корешки длиной 1 см отделяли с помощью пинцета и фиксировали для выявления

аргентофильных белков. В качестве контроля клетки животных обрабатывали ингибитором основных внутриклеточных фосфатаз окадаевой кислотой (1 мкМ) в течение 20-60 мин.

Для ингибирования синтеза рРНК актиномицин Д (0.08 мкг/мл, Sigma) добавляли на 30 мин-6 ч в инкубационную среду. Ингибитор процессинга пре-рРНК - аналог аденозина 5.6-дихлоро-1Р-д-рнбофуранозилбензимидазол (ДРБ, Sigma)-использовали в концентрации 100 мкг/мл и добавляли к клеткам на 15 мин-6 ч. Обработанные клетки промывали и фиксировали для иммуноцитохимического анализа, как описано выше.

Обработку нормальных или подвергнутых экспериментальному воздействию клеток РНКазой А производили по методике, описанной Жарской с соавторами (2002). В альтернативе, нефиксированные клетки обрабатывали 0.1%-ным раствором Тритона Х-100 на ФСБ 3 мин при 4° С и помещали в РНКазу А в конечной концентрации 200 мкг/мл на 10 мин при 37° С. Клетки фиксировали 3% параформальдегидом на 0.1 М ФСБ. Перед использованием РНКаза А была инактивирована нагреванием при + 60° С в течение 30 мин для удаления возможной ДНКазной активности. Полученные результаты принципиально не отличались от условий обработки ферментом.

Для синхронизации культуры клеток HeLa использовали методику двойного тимидинового блока с добавлением к среде культивирования тимидина в концентрации 2 мМ (Узбеков, 2004). Для накопления на стадии метафазы синхронизированные или асинхронные клетки инкубировали в присутствии нокодазола в концентрации 50 нг/мл в течение 1.5-14 ч. Известно, что при такой продолжительности К-митоза активность Cdkl сохраняется (Sirri et al., 2000а). Клетки, растущие в культуральных флаконах, использовали для получения клеточных лизатов. Клетки, растущие на покровных стеклах, фиксировали и использовали для иммуноцитохимического контроля эффективности обработки.

Для синхронизации корневой меристемы лука, луковицы инкубировали с 0.75 мМ гидроксимочевины (Sigma) в течение 14 ч (Samaniego et al., 2002), соблюдая указанные раннее условия культивирования, отмывали от гидроксимочевины и помещали в фильтрованную проточную воду для накопления митотических клеток. Для накопления К-метафазных клеток корешки луковиц инкубировали с 0.5% колхицина в течение 5-10 ч. Контроль за фазами клеточного цикла проводили по содержанию ДНК в клетках с помощью метода проточной цитометрии.

Электрофорез белков проводили по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, 1970). Анализ электрофоретической подвижности белков В23 и С23 проводили на иммуноблотах лизатов асинхронных и синхронизированных в К-метафазе клеток HeLa (см. выше). Синхронизированные клетки обрабатывали росковитином или стауроспорином, добавляя ингибиторы в культуральную среду на 15-30 минут. Клетки лизировали в

стандартном буфере Лэммли. Тотальную концентрацию белков в лизатах определяли по методу Лоури.

Для выявления частично-процессированной пре-рРНК в нормальных и индуцированных ЦЯД, использовали методику флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ (Dundr, Olson, 1998), модифицированную в нашей лаборатории. Пробы были получены из плазмид, содержащих фрагменты генов рРНК человека (Dundr, Olson, 1998). Пробы метили биотином (Biotin- 16-UTP, Roche) методом транскрипции in vitro с использованием Sp6 и Т7 РНК полимераз (SP6/T7 transcription Kit, Roche). В работе были использованы пробы, позволяющие выявлять короную часть 5' внешнего транскрибируемого спейсера рРНК (pBss-5'ETS core part) и последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера I (pAxk-ITSI). Пробы РНК гибридизировали in situ с препаратами клеток CV1. При необходимости до фиксации клеток в культуральную среду добавляли росковитин или стауроспорин на 15-30 минут. После гибридизации сигнал выявлялся с помощью каскада антител, конъюгированных с авидин-родамином (Roche). Для выявления ЦЯД использовали мышиные моноклональные антитела к белку В23; хроматина ядер и митотических хромосом окрашивали красителем DAPI. Препараты анализировали во флуоресцентный микроскоп Аксиоверт 200 (Carl Zeiss, Германия), используя объектив Флуар 100х/ЧА 1.25 и соответствующие наборы фильтров.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Динамика и свойства ЦЯД в нормальных митотических клетках млекопитающих и растений.

1.1. Общие закономерности образования и динамика ЦЯД на завершающих стадиях митоза в норме в клетках млекопитающих и растений. Известно, что наиболее характерными компонентами ЦЯД являются белки зрелого ядрышка фибрилларин, В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин (Dundr et al., 1997; Zatsepina et al., 1997a; Мухарьямова и др., 1998). Поэтому для иммуноцитохимического выявления этих структур в разных типах клеток млекопитающих мы использовали антитела к данным белкам. ЦЯД впервые выявляются в клетках, как правило, сразу после начала сегрегации хромосом и всегда до начала цитотомии. По основным морфологическим признакам, эта стадия соответствует ранней анафазе. Сравнение числа клеток с ЦЯД и количества телец, формирующихся в одной клетке, показывает, что «эффективность» их образования варьирует между клеточными культурами. В клетках CV1 ЦЯД присутствуют во всех анафазных клетках, причем число телец на клетку достигает сотни (рис 1). ЦЯД также регулярно образуются в клетках HeLa,

но их число на клетку не превышает 40-60. В культурах СПЭВ и ЗТЗ число ЦЯД на клетку составляет в среднем 20-30. Таким образом, из четырех изученных вариантов клеточных культур наиболее удобными для изучения цитоплазматических производных ядрышка нами были выбраны клетки СУ1 Полученные иммуноцитохимическим анализом данные свидетельствуют об изменении общего числа ЦЯД, размеров индивидуальных телец и их пространственного расположения в цитоплазме клеток на завершающих стадиях митоза. Так, в ранней анафазе ЦЯД видны как многочисленные и относительно мелкие (0.3-0.5 мкм) тельца. К началу телофазы средний размер ЦЯД увеличивается до 1-2 мкм, а их число заметно уменьшается. К концу телофазы в цитоплазме сохраняются лить одиночные ЦЯД. Цитоплазматические дериваты ядрышка сохраняются вплоть до раннего в]-периода, когда в ядрах проявляются отчетливые дочерние ядрышки. Сходная динамика ЦЯД на завершающих стадиях митоза наблюдается в других типах исследованных клеточных культур (НеЬа, СПЭВ и ЗТЗ). Эти наблюдения указывают на возможность слияния ЦЯД в ходе митоза.

Рисунок 1. Цитоплазматические ядрышковые дериваты в нормальном митозе. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток CV1 антителами к белку В23 (а-в) и выявление аргентофильных белков ядрышка нитратом серебра в клетках Allium сера L. (г): а - поздняя анафаза, б - ранняя телофаза, в - поздняя телофаза (ранний Gi-период), г - ранняя телофаза. ЦЯД указаны длинными стрелками, проядрышки - короткими стрелками. Масштабная линия -10 мкм.

Для проведения сравнительного анализа динамики ЦЯД в конце митоза в клетках животного и растительного происхождения мы использовали клетки корневой меристемы лука Allium сера L. В связи с некоторыми трудностями выявления изучаемых телец в цитоплазме клеток растений с помощью иммуноцитохимической реакции, мы окрашивали клетки нитратом серебра. Такой подход позволяет выявлять белки С23 и В23, которые, с

одной стороны, входят в состав ЦЯД (Dundr et al, 1997; Zatsepina et al, 1997a), а с друюй, являются двумя основными аргентофильными белками ядрышка в клетках животных (Sirri et al., 20006) и растений (Gonzalez-Camacho, Medina, 2004). Показано, что в клетках корешков Allium сера L. ЦЯД присутствуют в цитоплазме многих анафазных клеток, причем число телец на клетку варьирует (от 10-20 до 50 и более) (рис 1) Динамика ЦЯД на завершающих стадиях митоза в клетках корневой меристемы лука, в целом, отражает динамику ЦЯД в клетках млекопитающих.

1.2. Ко-локализация ЦЯД с астральными микротрубочками веретена деления в клетках млекопитающих Анализ расположения ЦЯД в анафазных и ранних телофазных клетках CV1 показывает, что эти тельца располагаются в цитоплазме не случайным образом - как правило, ЦЯД видны в кортикальных слоях цитоплазмы и полностью отсутствуют в зоне митотического веретена. Принимая во внимание литературные данные о направленной миграции ЦЯД в зону ядра в телофазе митоза (Dundr et al., 2000) и о том, что в клеточном транспорте участвуют астральные микротрубочки веретена деления (Nilsson, Wallin, 1998), мы предположили, что ЦЯД перемещаются по клетке не случайным образом. С целью проверки этого предположения, мы провели двойное иммуномечение клеток CV1 антителами к фибрилларину и В23 (для выявления ЦЯД) и ß-тубулину (для выявления микротрубочек). Анализ полученных изображений, показал, что в независимости от способа фиксации и иммуномечения клеток ЦЯД преимущественно располагаются рядом с астральными микротрубочками веретена деления. Эти наблюдения свидетельствует в пользу участия астральных микротрубочек в траспорте ЦЯД.

1.3. Состав индивидуальных ЦЯД: белки и чаетично-процессированная пре-рРНК. Для того, чтобы ответить на вопрос, насколько однороден белковый состав индивидуальных ЦЯД, мы провели двойные иммуноцитохимические окрашивания клеток CV1 смесью антител к фибрилларину и С23, фибрилларину и В23, В23 и Nop52, фибрилларину и UBF. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в состав каждого ЦЯД входят, как правило, четыре из изученных белков - фибрилларин, В23, С23, и, в меньшей степени, белок Nop52, но не входит транскрипционный фактор UBF. Белки фибрилларин и В23 отчетливо выявляются в ЦЯД в анафазе и ранней телофазе, однако в конце митоза интенсивность окраски ЦЯД на фибрилларин оказывается существенно меньше, чем на В23. В целом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что белками, наиболее прочно связанными с ЦЯД, являются белки, участвующие в поздних стадиях процессинга рРНК.

Иммуноцитохимическая окраска ЦЯД антителами к В23 или фибрилларину в анафазных и телофазных клетках СVI и HeLa полностью блокируется при обработке клеток РНКазой А. Полученный результат указывает на то, что данные белки в составе ЦЯД

взаимодействуют с РНК. Флуоресцентная гибридизация in situ проб рРНК с препаратами клеток CV1 выявила присутствие частично-процессированной рРНК в ЦЯД в анафазе и телофазе. Эти наблюдения соответствуют литературным данным, полученным на других клеточных культурах (Dundr, Olson, 1998; Dundr et al., 2000).

1.4. Влияние актиномммна Д и ДРБ на формирование ЦЯД в митотических клетках. Чтобы выяснить, какую роль рРНК играет в стабилизации ЦЯД и когда она синтезируется, клетки CV1 инкубировали с 0 08 мкг/мл актиномицина Д, специфически блокирующего транскрипцию рДНК (Ченцов, Андреев, 1966; Gimenez-Martin et al., 1977, Ochs et al., 1985, Benavente et al., 1987, Dousset et al., 2000), в течение 30 мин-6 ч. В другой серии экспериментов клетки инкубировали с 100 мкг/мл ДРБ, который ингибирует синтез гетерогенной ядерной РНК и практически не влияет на транскрипцию рДНК, но нарушает нормальный процессинг пре-рРНК, резко истощая пул 32S и 28S рРНК (Scheer, Rose, 1984; Granick, 1975; Taram et al., 1976; La Panse et al., 1999), в течение 15 мин-6 ч. Динамика изменений ядрышка в интерфазных клетках при указанных обработках соответствовала данным литературы, а длительная обработка ингибиторами не блокировала вступление клеток в митоз (Zatsepina et al., 1997а). Полученные на основании двойного окрашивания клеток антителами к белкам В23 и фибрилларину данные показывают, что на ранних сроках обработки актиномицином Д или ДРБ (15 мин-1.5 ч) количество ЦЯД практически не отличается от нормы; на более длительных сроках (2-3 ч) число ЦЯД существенно уменьшается; длительная обработка ингибиторами (4-6 ч) полностью препятствует образованию ЦЯД в анафазе митоза. Принимая во внимание среднюю продолжительность митоза, можно сделать заключение, что рРНК, входящая в состав ЦЯД, синтезруется за несколько часов до начала клеточного деления (Жарская, Зацепина, 2005а).

2. Индукция преждевременной сборки ЦЯД в метафазных клетках животных и растений.

2.1. Индукция образования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих под действием обратимого гипотонического воздействия. На сегодняшний день в литературе полностью отсутствуют сведения о механизмах, регулирующих сборку ЦЯД в клетках животных и растений Одним из подходов к решению этого вопроса может быть экспериментальная индукция сборки производных ядрышка на тех стадиях клеточного цикла, когда в нормальных условиях они отсутствуют. Раннее показано, что обратимое воздействие растворов низкой ионной силы приводит к образованию в ядрах клеток телец, обладающих свойствами проядрышек (Zatsepina et al., 19976). Однако вопрос о том, происходит ли в этих условиях формирование ЦЯД,оставался открытым.

Обработка живых клеток СУ1 и НеЬа 0.02 М ФСБ в течение 5-60 мин временно блокирует клетки в метафазе. Эти наблюдения полностью соответствуют литературным данным, полученным на клетках других объектов (Смирнова и др, 1987; 2а1зер5па & а1. 19976). Однако, если после кратковременного (10-15 мин) воздействия гипотоничного ФСБ, клетки переносили в нормальную культуральную среду на 10-15 мин и после фиксации окрашивали антителами к фибрилларину, в цитоплазме 30-60% метафазных клеток выявлялись многочисленные дискретные округлые тельца, размером до 0.3-2 мкм (рисунок 2). Двойное иммуномечение клеток различными антителами показало, что в состав практически каждого индуцированного ЦЯД (иЦЯД) входят основные белки естественных ЦЯД фибрилларин, С23, В23 и №р52, но никогда не выявляется фактор транскрипции рРНК иВБ. Для того чтобы проверить, входит ли в состав иЦЯД РНК, клетки после переноса в изотоничную среду обрабатывали РНКазой А, а затем инкубировали с антителами к В23 или фибрилларину. Ни в одной из митотических клеток ЦЯД при этом не выявляются. Таким образом, общая морфология и молекулярный состав образованных дискретных телец позволяют отождествлять их с ЦЯД, формирующимися в анафазе нормального митоза Следует особо отметить, что в клетках, обнаруживающих дискретные тельца, сохраняется характерное для метафазы расположение хромосом в виде правильной метафазной пластинки. В клетках с длинными и тонкими хромосомами, которые предположительно находятся в профазе или ранней прометафазе, как и в цитоплазме интерфазных клеток, индукция ЦЯД не наблюдается. В анафазных и телофазных клетках число ЦЯД существенно не изменяется по сравнению с контролем. Эти данные показывают, что кратковременное и обратимое воздействие гипотонического шока на живые клетки является индуктором преждевременной сборки ЦЯД в метафазе митоза.

Из литературы известно, что реакция клеток на растворы низкой ионной силы зависит степени выраженности цитоскелета, а «гиперчувствительность» метафазных клеток к гипотонии может быть связана с его реорганизацией по сравнению с интерфазой (Смирнова и др., 1987). Принимая во внимание эти данные, в настоящей работе мы изучили возможность индукции ЦЯД после остановки клеток СУ1 и НеЬа в К-митозе с помощью нокодазола. В К-метафазных клетках, инкубированных в 0.02 М ФСБ, а затем в культуральной среде полного состава, сборки ЦЯД не происходит. Эти наблюдения подчеркивают важную роль целостности цитоскелета для индукции формирования ЦЯД в митозе (Жарская, Зацепина, 20056).

Рисунок 2. Индукция преждевременной сборки ЦЯД в метафазных клетках.

Иммуноцитохимическое окрашивание метафазных клеток CV1 антителами к фибрилларину (а-?) и окраска хромосом красителем ДАПИ (а'-г'): а, а-контроль, б, б'-обратимое гипотоническое воздействие, в, в-инкубирование с росковитином, г, г'- инкубирование со стауроспорином. и ЦЯД указаны стрелками. Маштабная линия - 10 мкм.

2.2. Индукция формирования ЦЯД в метафазных клетках млекопитающих и растений под действием ингибиторов циклил В - зависимой киназы Cdkl росковитина или стауроспорина. Известно, что росковитин взаимодействует с АТФ-связывающими участками циклин-зависимых киназ, участвующих в регуляции прохождения клеткой клеточного цикла (Cdk), и является селективным ингибитором комплексов Cdkl/циклин В, С(1к2/циклин А и, в меньшей степени, других киназ (De Azevedo et al, 1997; Meijer, et al., 1997); стауроспорин являе1ся менее селективным ингибитором Cdkl (Gouillex et al., 1994; Meijer, 1995). Поскольку основным регулятором прохождения клеткой митоза является комплекс Cdkl/циклин В, a Cdkl фосфорилирует основные белки ядрышка в митозе (Peter et al., 1996), мы решили проследить, как ингибирование этой циклин-зависимой киназы отражается на распределении ядрышковых компонентов на завершающих стадиях митоза. После кратковременного (10-20 мин) инкубирования клеток HeLa, CV1, СПЭВ и ЗТЗ, растущих на покровных стеклах, в среде с росковитином в концентрации 150 мкМ или стауроспорином в концентрации 100 нг/мл и окрашивания фиксированных клеток антителами к фибрилларину, в цитоплазме клеток, находящихся в метафазе, выявляются многочисленные дискретные округлые тельца, размером 0.3-1.5 мкм (рисунок 2). Содержание таких клеток составляет 90-95% для стауроспорина и 80-90% для росковитина

среди общего числа метафаз. Общее число ЦЯД в анафазных и телофазных клетках существенно не изменяется.

Совокупность наблюдений позволяет сделать вывод о том, что клетки, содержащие индуцированные ЦЯД (иЦЯД), находятся именно на стадии метафазы. Так, в клетках с иЦЯД сохраняется характерное для метафазы расположение хромосом и морфология веретена деления. Кроме того росковитин и стауроспорин индуцируют ЦЯД в клетках, блокированных в К-метафазе нокодазолом.

Для выяснения белкового состава иЦЯД мы провели двойное иммуномечение клеток млекопитающих на белки фибрилларин и В23, фибрилларин и С23, В23 и Nop52, а также на фибрилларин и UBF. Результаты этой окраски показали, что в иЦЯД выявляются все перечисленные белки, кроме UBF. Во всех клетках UBF выявляется исключительно в ЯОР

Для того чтобы проверить, входит ли в состав преждевременно индуцированных ЦЯД РНК, клетки инкубированные с росковитином или стауроспорином, обрабатывали с РНКазой А, а затем окрашивали антителами к фибрилларину и В23: ни в одной из митотических клеток при различных условиях обработки РНКазой А ЦЯД не наблюдаются. Эти результаты указывают на то, что данные белки в иЦЯД связаны с РНК Принимая во внимание присутствие незрелой рРНК в естественных ЦЯД, мы посмотрели, входит ли частично-процессированная пре-рРНК в состав иЦЯД. Для этого использовали метод флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ с пробами к внешнему и внутреннему транскрибируемым спейсерам пре-рРНК с последующей иммуноцитохимической окраской препаратов клеток на белок В23. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что гибридизация обеих проб происходит в виде дискретных точек, содержащих также белок В23, в цитоплазме метафазных, анафазных и телофазных клеток, обработанных ишибиторами Cdkl.

Таким образом, морфология, белковый состав и присутствие частично-процессированной пре-рРНК позволяют отождествлять индуцированные дискретные тельца с ЦЯД, формирующимися в анафазе нормального митоза. Кроме того, как и в контроле, образование метафазных ЦЯД после обработки росковитином частично или полностью блокируется в клетках, предварительно инкубированных с актиномицином Д в течение 3.5 ч. Эти данные свидетельствуют о том, что наличие достаточного количества рРНК в клетке необходимо для сборки ЦЯД под действием ингибитором Cdkl.

Как было указано выше, ЦЯД выявляются в норме в клетках корневой меристемы лука Allium сера L. с помощью метода окраски аргентофильных белков ядрышка. Для того, чтобы ответить на вопрос о возможности индукции преждевременного образования производных ядрышка в метафазных клетках растений, мы инкубировали корешки Allium сера L в воде с росковитином в концентрации 150 мкМ. Результаты эксперимента показали,

что индуцированные ЦЯД собираются в метафазных клетках через 20-60 мин после начала действия ингибитора. Контроль за фазами митоза осуществлялся на светооптическом уровне с помощью фазового контраста.

Таким образом, наши данные показывают, что кратковременное воздействие ингибиторов циклин В - зависимой киназы Cdkl на живые клетки растительного и животного происхождения является эффективным индуктором преждевременной сборки ЦЯД на стадии метафазы митоза.

2.3. Влияние ингибиторов Cdkl на электрофоретическую подвижность белков В23/нуклеофозмипа. С23/нуклеолина и фибрилларина. Раннее было показано, что митотическое гиперфосфорилировапие белков В23 и С23, осуществляемое комплексом Cdkl/циклин В, замедляет их электрофоретическую подвижность на иммуноблотах лизатов клеток цыпленка (Peter et al., 1990) и HeLa (Lu et al., 1996; Zatsepina et al., 1997a; Okuwaki et al., 2002). В настоящей работе мы изучили подвижность белков В23, С23 и фибрилларина в асинхронных и синхронизированных клетках HeLa в контроле и после ингнбирования Cdkl Как и ожидалось, на иммуноблотах асинхронных клеток НеТ.а антитела к В23 и С23 выявляют полосы в районе 38-40 кДа и 105-110 кДа соответсвенно. Положение белковых полос в митотических клетках оказывается несколько выше, чем в асинхронной культуре. Под воздействием росковитина и стауроспорина электрофоретическая подвижность белков В23 и С23 в лизатах митотических клеток снижается до значений, характерных для асинхронных клеток. Электрофоретическая подвижность фибрилларина - ядрышкового белка, не являющегося фосфопротеином - остается практически одинаковой во всех образцах. Таким образом, можно предположить, что при обработке клеток ингибиторами Cdkl происходит дефосфорилирование фосфопротеинов ядрышка В23/нуклеофозмина и С23/нуклеолина.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что ЦЯД собираются в митотических клетках как животного, так растительного происхождения, на стадии анафазы или ранней телофазы (Beven и др., 1996, Zatsepina et al., 1997, Dundr et al., 1997). Наши наблюдения показали, что во всех типах исследованных клеток млекопитающих, включая CV1, ЗТЗ, HeLa и СПЭВ, а также в клетках меристемы корешка лука Allium сера L, формирование ЦЯД происходит в ранней анафазе митоза, однако «эффективность» образования этих телец варьирует между разными типами клегочных культур. Очевидно, различия в «эффективности» формирования ЦЯД не связаны с тканевой принадлежностью клеток, поскольку среднее число ЦЯД в различалось как между

фибробластами (CV1 и ЗТЗ), так и между эпителиальными клетками (СПЭВ и HeLa). Можно полагать, что образование ЦЯД отражает общий уровень метаболизма в этих клетках, а также, возможно, определяется их размерами. Нельзя также исключить, что образование ЦЯД более характерно для клеток, полученных от взрослого организма (CV1 и HeLa), чем для клеток эмбриональных тканей (ЗТЗ и СПЭВ). Объектом, наиболее удобным для изучения цитоплазматических дериватов ядрышка в клетках млекопитающих, являются клетки CV1, обладающие крупным ядрышком и большими размерами.

Несмотря на существенные различия между митозом у животных и растений (Ченцов, 2004), закономерности формирования и динамика ЦЯД, в целом, одинакова в пролиферирующих растительных и животных клетках. Полученные данные позволяют сделать вывод об универсальности данных макроструктурных образований и, возможно, механизмов их образования. Эти механизмы, скорее всего, не связаны с простым переносом ядрышкового материала материнской клетки в дочерние, так как часто наблюдается ассиметричное распределение ЦЯД в цитоплазме некоторых клеток, как растительного и животного происхождения (Dundr и др., 1997, наши наблюдения). Ко-локализация ЦЯД с астральными микротрубочками веретена деления указывает на то, что в нормальном митозе в миграции ЦЯД в направлении дочерних ядер (Dundr et al., 2000) могут участвовать элементы цитоскелета.

В дополнение к известным данным о белковом составе ЦЯД, мы провели их иммуноцитохимический анализ с одновременным и «перекрестным» выявлением различных ядрышковых белков. Анализ белкового состава ЦЯД в митотических клетках CV1 показал, что с момента образования и вплоть до распада ЦЯД содержат белки зрелого ядрьппка, участвующие в позднем процессинге рРНК, такие, как В23, С23 и NOP52. Фактор раннего процессинга пре-рРНК фибрилларин наиболее отчетливо виден в составе ЦЯД в анафазе и ранней телофазе. Аналогичные данные о более высокой лабильности фибрилларина по сравнению с белками позднего процессинга рРНК были получены для проядрышек (Dundr et al., 2000, Savino et al., 1999, 2001; Angelier et al., 2005). Ни при каких условиях фиксации и обработки клеток в составе ЦЯД не выявляется фактор транскрипции рДНК, белок UBF.

Наряду с белками, необходимыми для созревания рРНК, в состав естественных ЦЯД входит незрелая рРНК, которая синтезировалась в интерфазе, предшествующей митозу, а также мякРНК (Beven et al., 1996; Dundr, Olson, 1998; Dundr et al., 2000). В совокупности эти данные говорят о том, что одной из возможных функций ЦЯД может быть участие во внеядрышковом процессинге рРНК. Последующий более детальный анализ состава рРНК в динамике этих структур поможет ответить на вопрос о возможном участии ЦЯД в созревании рРНК.

Данные нашей работы по обработке клеток ингибиторами транскрипции рДНК (актиномицином Д) и процессинга рРНК (ДРБ) впервые показали, что рРНК является существенным компонентом ЦЯД и в ее отсутствии образования ЦЯД не происходит, более того, необходимая для построения ЦЯД рРНК синтезируется за несколько часов до начала клеточного деления.

Ранее показано, что эффективным индуктором образования проядрьппек в ядрах интерфазных клеток различных культур млекопитающих является обратимое воздействие растворов низкой ионной силы на живые клетки (Zatsepina и др., 19976, в). В настоящей работе мы впервые показали, что обратимое воздействие гипотонического шока на метафазные клетки приводит к формированию структур, которые по своему составу и основным свойствам соответствуют ЦЯД, формирующимся в анафазе нормального митоза. В иЦЯД присутствуют те же белки, что и в естественных ЦЯД, включая В23, С23, фибрилларин и NOP52. В индуцированных ЦЯД не выявляется белок UBF, отсутствующий также в составе анафазных производных ядрышка. Подобно естественным ЦЯД, тельца, индуцированные в метафазе, чувствительны к обработке клеток РНКазой А (Жарская, Зацепина, 20056).

Две группы фактов говорят о гом, что важную роль в индукции сборки ЦЯД с помощью обратимого гипотонического воздействия могут играть ионы кальция. Во-первых, хорошо известно, что Са(2+) участвует в регуляции митоза и завершении его терминальных стадий, когда в цитоплазме клеток наблюдается временное повышение концентрации свободного Са(2+), [Са (2+)](i) (Вагап, 1994; Santella, 1998; Groigno, Whitaker, 1998). Установлено, что ионы кальция вызывают активацию некоторых киназ (например, протеин-киназы С), которые являются негативными регуляторами циклин В-зависимой киназы Cdkl (Suprynowicz et al., 1994; 2000),и деградацию циклина В1 в мышиных эмбрионах (Marangos, Carroll, 2004). Вторая группа фактов показывает, что одной из реакций интерфазных клеток на гипотонический шок является повышение [Са (2+)](i) за счет высвобождения Са(2+) из внутриклеточных депо, а также вхождения в клетку извне (Shen et al., 2001; Hermoso et al., 2004). На основании этих данных можно предположить, что и в наших условиях обратимое гипотоническое воздействие индуцирует повышение [Са (2+)](i) в цитоплазме метафазных клеток. Этот процесс инициирует цепь реакций, последовательными стадиями которой являются инактивация Cdkl и дефосфорилирование белков, участвующих в образовании ЦЯД. В первую очередь, к таким белкам относятся фосфопротеины В23 и С23. Результатом их дефосфорилирования может является переход РНК-белковых комплексов из растворимого в нерастворимое состояние, сопровождающийся образованием аналогов телофазных ЦЯД в цитоплазме метафазных клеток. Одним из дополнительных условий

индукции ЦЯД с помощью обратимого гипотонического воздействия служит структурная целостность митотического аппарата в метафазных клетках в момент воздействия гипотонии. Более тонкие механизиы участия цигоскелета в организации ЦЯД могут быть предметом будущих исследований.

Известно, что росковитин является относительно специфическим ингибитором митотической киназы Cdkl (Lu et al., 1996; De Azevedo et al., 1997), активность которой в комплексе с циклином В повышается именно во время митоза (Meijer et al., 1997). Наши данные впервые показали, что воздействие росковитина или стауроспорина приводит к формированию на стадии метафазы структур, которые по своему составу и основным свойствам соответствуют ЦЯД, формирующимся в анафазе нормальпого митоза (рис 3; Jaiskaja et al., 2005). В иЦЯД присутствуют те же белки, что и в естественных ЦЯД, включая В23, С23, фибрилларин и NOP52, а также частично-процессированная рРНК, но не выявляется белок UBF. Таким образом, ингибирование Cdkl в митозе имеет плейотропный эффект. В пользу этого утверждения свидетельствуют по крайней мере три группы фактов: преждевременная активация транскрипции рДНК в метафазных клетках (Sirri et al., 1999, 2000а; Hernandez-Verdun et al., 2002); начало преждевременной цитотомии без расхождения хромосом к полюсам веретена (Niiya et al., 2005) и преждевременная индукция ЦЯД (наши данные).

метафаза

Росковитин/ стауроспорин

Дефосфорилироваиие В23 и С23

Cdkl-циклин В

L

В23 и С23 связываются с пре-рРНК

В23 и С23 гиперфосфорилированы и не связаны с пре-рРНК

Инактивация Cdkl

Индукция ЦЯД

Активация рДНК (Sirri et al., 200«)

б

Рисунок 3. Возможные механизмы сборки ЦЯД в митозе в результате ингибирования митотической С<1к1. В нормальной метафазе ЦЯД отсутствуют, а комплекс Сс1к1-циклин В находится в активном состоянии (а). Воздействие ингибиторов С<1к1 приводит дефосфорилированию белков В23 и С23 и связыванию их с пре-рРНК. В результате в метафазных клетках происходит преждевремепное формирование ЦЯД (б).

Ингибирование Cdkl киназы приводит к ускорению электрофоретической подвижности В23 и С23 по сравнению с нормальным митозом, которое может быть вызвано дефосфорилированием этих белков. Раннее показано, что дефосфорилирование фосфопротеина В23 повышает его РНК-связывающую активность (Lu et al., 1996; Okuwaki et al., 2002).

Индукция иЦЯД под действием обратимого гипотонического шока и ингибиторов Cdkl наблюдалась в цитоплазме только метафазных и, возможно, поздних прометафазных клеток, но никогда не происходила на предшествующих стадиях митоза (в профазе), а также в интерфазе. Эти наблюдения позволяют заключить, что преждевременная сборка ЦЯД отражает особенности метаболического состояния клеток и ядрышковых белков в метафазе (поздней прометафазе) митоза. Известно, что в метафазе белки В23/нуклеофозмин, С23/нуклеолин и фибрилларин образуют растворимые макромолекулярные комплексы, в стабилизации которых, по-видимому, принимает участие (р)РНК (Pinol-Roma, 1999). Есть основания полагать, что в метафазе эти комплексы находятся в растворимом состоянии, поскольку экстракция метафазных клеток буфером, содержащим детергент, препятствует иммуномечению цитоплазмы на В23 и другие белки. Напротив, телофазные ЦЯД оказываются устойчивыми к экстракции (Zatsepina и др., 1997а). Можно заключить поэтому, что обратимое воздействие гипотонического шока и действие ингибиторов Cdkl на метафазные клетки вызывает переход растворимых комплексов ядрышковых белков и рРНК в нерастворимое состояние. Возможно, именно дефосфорилирование В23 и С23 является механизмом, запускающим процесс образования цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе, при условии, что в клетках присутствуют необходимые количества пре-рРНК.

ВЫВОДЫ

1. ЦЯД образуются в нормальном митозе в ранней анафазе во всех типах изученных клеток млекопитающих (клетки зеленой мартышки CV1, человека HeLa, мыши ЗТЗ и свиньи СПЭВ) и растений (Allium сера L.).

2. Индивидуальные ЦЯД содержат белки раннего и позднего процессинга рРНК зрелого ядрышка (фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин, Nop52), а также частично-процессированную рРНК. ЦЯД не содержат фактора транскрипции рибосомных генов, белка UBF. Состав и динамика отдельных компонентов ЦЯД свидетельствует в пользу участия этих производных ядрышка во внеядрьппковом процессинге рРНК.

3 рРНК, входящая в состав ЦЯД является необходимой для их формирования и синтезируется за несколько часов до начала деления клеток.

4. Обратимое воздействие растворов низкой ионной силы (гипотонического шока) на клетки HeLa и CV1 является индуктором преждевременного образования ЦЯД на стадии метафазы Механизмы образования иЦЯД в этих условиях могут включать повышение концентрации [Ca (2+)](i) и последующую инактиваю комплекса Cdkl-циклин В.

5. Ингибирование основной митотической киназы Cdkl индуцирует преждевременное образование ЦЯД в клетках млекопитающих и растений на стадии метафазы.

6. Молекулярные механизмы формирования иЦЯД в условиях ингибирования митотической киназы Cdkl, по-видимому, включают дефосфорилирование белков В23/нуклеофозмина и С23/нуклеолина, что приводит к повышению их способности взаимодействовать с рРНК.

7. Полученные и литературные данные позволяют сделать вывод о том, что циклин В-зависимая киназа Cdkl играет важную роль в сборке ядрышка в митозе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Жарская О.О., Меджидова A.A., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Зацепина О.В. Иммуноцитохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. Доклады Академии Наук, 2002, том 387: 589-592.

2.Жарская О.О, Зацепина О.В. Закономерности образования цитоплазматических производных ядрышка в разных культурах клеток млекопитающих в митозе. Цитология, 2005, том 47 (9): 780-788.

3.Жарская О.О., Зацепина О.В. Индукция преждевременной сборки предшественников ядрышка в метафазных клетках CV1 и HeLa с помощью обратимого гипотонического шока. Цитология, 2005, том 47 (10): 874-881.

4.Jarskaja О.О., Kunalina E.R., Sheval E.V., Olson M.OJ., Zatsepina O.V. Premature induction of nucleolus derived foci at metaphase of mitosis by inhibition of CDK-type kinases. EMBO/FEBS 19® International Workshop on the Cell Nucleus, 2005, Munsterschwarwazach Abbey (Germany), p. 33.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint ru e-mail: zakaz@stpnnt ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 16 01.2006 г

4¿iO ъ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жарская, Оксана Олеговна

СОКРАЩЕНИЯ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Регуляторные механизмы клеточного цикла.

2.2. Митотическое деление клеток животных и растений.

2.3. Ядрышко - основной структурный домен клеточного ядра.

2.3.1. Ультраструктура ядрышка.

2.3.2. Биогенез рибосом.

2.3.3. Основные белки клеток животных и растений, участвующие в созревании рРНК.

2.3.4. Аргенарильные белки ядрышка.

2.4. Ядрышко во время митоза.

2.4.1. Распад ядрышка в профазе/прометафазе.

2.4.2. Сборка ядрышка в конце митоза.

2.4.3. Регуляторные механизмы реорганизации ядрышка в митозе.

2.5. Процесс формирования активного ядрышка в конце митоза.

2.5.1. Восстановление транскрипции рДНК в поздней анафазе/ранней телофазе

2.5.2. Периферический хромосомный материал (ПХМ).

2.5.3. Проядрышки (prenucleolar bodies, PNBs).

2.5.3.1. Ранние исследования.

2.5.3.2. Состав проядрышек.

2.5.3.3. Динамика проядрышек в конце митоза.

2.5.4. Цитоплазматические ядрышковые дериваты, ЦЯД (nucleolus derived foci, NDF).

2.5.4.1. Состав ЦЯД.

2.5.4.2 Частично-процессированная пре-рРНК в ЦЯД.

2.5.4.3. Динамика ЦЯД и проядрышек.

2.5.5. Модель постмитотической сборки ядрышка (нуклеологенеза) у высших эукариот.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Антитела и сыворотки.

3.2.1. Первые антитела.

3.2.2. Вторые антитела.

3.2.3. ДНК-конструкты.

3.3. Иммунофлуоресцентный анализ.

3.4. Обработка клеток.

3.5. Синхронизация клеток животных и растений в митозе.

3.6. Обратимое воздействие гипотонического шока.

3.7. Обработка клеток РНКазой А.

3.8. Окрашивание ядрышек растительных клеток нитратом серебра (модифицированный метод, Fernandez-Gomez et al., 1969).

3.9. Флуоресцентная РНК-РНК гибридизация in situ.

3.9.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.9.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.9.3. Мечение проб методом транскрипции in vitro.

3.9.4. Проверка эффективности мечения проб с помощью дот-блота.

3.9.5. Проведение флуоресцентной РНК-РНК гибридизации in situ.

3.10. Проточная цитометрия.

3.11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ).

3.12. Иммуноблотинг.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика и механизмы формирования цитоплазматических дериватов ядрышка в митозе"

Хорошо известно, что основные функции наиболее крупного структурного доменаклеточного ядра - ядрышка - такие, как транскринция рибосомных генов (рДНК),нроцессинг 47-45 S транскринтов рРНК и сборка рибосомных частиц, осушествляются,главным образом, на стадии интерфазы, когда ядрьннко сохраняет структурнуюцелостность (Olson et al., 2002). При вступлении растительных и животных клеток в митозтранскрипция рДНК постепенно прекращается, а значительная часть ядрышковых белкови РНК мигрируют в цитоплазму и (или) ассоциируют с поверхностью хромосом, образуятак называемый периферический хромосомный материал (ПХМ) (Ченцов, 2000; DiMario,2004; Leung et al., 2004). В результате этих изменений ядрьппко постепеннодеструктурируется и к метафазе митоза, как правило, полностью распадается. Изосновных молекулярных компонентов ядрышка в связи с ядрышкообразуюшимирайонами хромосом (ЯОР) сохраняются лишь компоненты транскрипционного комплексаРНК полимеразы I, включая ее специфический ко-фактор белок UBF (Zatsepina et al., 1993,1996; Roussel et al., 1996; Chen et al., 2005). Восстановление ядрышка начинается впоздней анафазе или ранней телофазе с реактивации транскрипции рДНК (Morcillo et al.,1976; Roussel et al., 1996; Frompoix et al, 1998; Dousset et al., 2000; Мухарьямова,Зацепина, 2001; Hemandez-Verdun et al., 2002; Leung et al., 2004) и появлениямногочисленных дискретных структур, материал которых может использоваться дляпостроения дочерних ядрышек. На сегодняшний день известны два типа таких структур,которые получили название митотических производных ядрышка: цитоплазматическиеядрышковые дериваты, ЦЯД (nucleolus derived foci, NDF), которые образуются вцитоплазме анафазных клеток (Beven et al., 1996; Zatsepina et al., 1997a; Dundr et al., 1997;Olson, Dundr, 2005), и проядрьппки (prenucleolar bodies, PNBs), формирующиеся вдочерних ядрах в телофазе (Olson et al., 2002; Hemandez-Verdun et al., 2002; Dimario, 2004;Olson, Dundr, 2005; Hemandez-Verdun, 2006). Однако, несмотря на принципиальные7различия в локализации и времени формирования, ЦЯД и проядрышки содержатпрактически одни и те же ядрьппковые белки, мякРНК, пре-рРНК, а также имеют сходнуюфибро-гранулярную ультраструктуру (Dundr et al., 1997, 2000; Dundr, Olson, 1998). Этиданные свидетельствуют в пользу определенного «родства» между ЦЯД и проядрышками.В последние годы на основании анализа поведения белков в живых клеткахустановлено, что митотические производные ядрьппка являются высоко динамичнымиструктурами. Так, показано, что проядрышки способны сливаться друг с другом и сповоформирующимися ядрышками (Dmidr et al., 2000, Savino et al., 1999, 2001; Angelier etal., 2005), a материал ЦЯД мигрирует в дочерние ядра (Dundr et al., 2000). На основанииполученных данных, авторами предложена гипотеза постмитотической сборки ядрьппка вклетках эукариот, согласно которой материал ЦЯД и проядрьппек используется дляпостроения формируюшегося ядрьппка, а порядок миграции индивидуальных белков вядрьппки отражает этап биогенеза рибосом, в котором этот белок участвует.Однако имеюшийся на сегодняшний день экспериментальный материал не даетвозможности однозначно раскрыть проблему формирования ядрьппка в конце митоза. Вчастности, остаются неизвестными механизмы регуляции сборки производных ядрьппка вмитозе, а также функции, выполняемые этими митотическими образованиями. До концане выяснена роль различных составляющих производных ядрьппка в поддержании ихструктурной и функциональной целостности. Практически ничего не известно омеханизмах, обеспечивающих транспорт материала ядрьппковых дериватов в дочерниеядра и ядрыщки.Одним из подходов к изучению механизмов формирования производных ядрышкав митозе является разработка условий для индукции их сборки на тех стадиях митоза,когда в нормальном митозе они отсутствуют. Ранее показано, что эффективныминдуктором образования проядрьппек в ядрах интерфазных клеток различных культурмлекопитающих является обратимое воздействие растворов низкой ионной силы наживые клетки (Zatsepina et al., 1997b,c). Однако вопрос о том, происходит ли в этих8условиях формирование ЦЯД, до начала выполнения настоящей работы оставалсяоткрытым.Известно, что важную роль в реорганизации ядрышка в митозе играет уровеньфосфорилирования его белков, таких как транскрипционные факторы рДНК (Klein,Grummt, 1999; Sirri et al., 2002) и белки ядрьппка В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин,участвующие в созревании транскриптов пре-рРНК (Belenguer et al,, 1990; Peter et al.,1990; Jiang et al, 1999, 2000; Okuwaki et al., 2002). Киназой, осуществляющейдополнительное фосфорилирование этих белков в митозе у высщих эукариот, являетсяосновная митотическая киназа Cdkl, которая проявляет активность в комплексе сциклинами А и В (Епифанова, 2003). По мере заверщения митоза происходит деградацияциклинов А и В под действием убиквитин-зависимых протеолитических ферментовсложного белкового комплекса АРС/С (anaphase-promoting complex/cyclosome ubiquitinligase), стимулирующего анафазу. Каскад этих реакций приводит к инактивациикомплексов Cdkl-циклин. В то же время в анафазе происходит образование ЦЯД. Можнопредположить, что два этих процесса взаимосвязаны и инактивация Cdkl являетсяиндуктором сборки ЦЯД. Известно, что в метафазе белки В23/нуклеофозмин,С23/нуклеолин и фибрилларин образуют растворимые макромолекулярные комплексы, встабилизации которых, по-видимому, принимает участие (р)РНК (Pinol-Roma, 1999). Естьоснования полагать, что в метафазе эти комплексы находятся в растворимом состоянии,поскольку экстракция метафазных клеток буфером, содержащим детергент, препятствуетиммуномечению цитоплазмы на В23 и другие белки. Напротив, телофазные ЦЯДоказьшаются устойчивыми к экстракции (Zatsepina и др., 1997а). Однако практически нерещенным остается вопрос о том, какую роль играет митотическоефосфорилирование/дефосфорилирование и, следовательно, изменение свойствядрыщковых белков в сборке цитоплазматических производных ядрышка.Основная цель работы - исследование динамики, состава и возможныхмеханизмов формирования цитоплазматических производных ядрышка в разных типахкультур клеток млекопитающих, а также в клетках корневой меристемы лука АШит сераL. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:1. Провести сравнительный анализ закономерностей формирования и составаиндивидуальных ЦЯД (рРНК, белки зрелого ядрышка фибрилларин, С23/нуклеолин,В23/нуклеофозмин, Nop52, UBF) на завершающих стадиях нормального митоза.2. Исследовать влияние ингибироваиия синтеза и процессинга рРНК на сборкуЦЯД в митотических клетках млекопитающих.3. Исследовать возможность индукции преждевременной сборкицитоплазматических дериватов ядрьппка в митозе в клетках млекопитаюших в условияхобратимого воздействия растворов низкой ионной силы (гипотонического шока), которыйиндуцирует появление проядрышек в ядрах иптерфазных клеток (Zatsepina et al., 1997б,с).4. Изучить возможность индукции преждевременной сборки ЦЯД в митозе вклетках млекопитающих и растений под действием специфического (росковитин) и менееспецифического (стауроспорин) ингибиторов активности митотической циклин Взависимой киназы Cdkl.5. Изучить влияние ингибиторов митотической Cdkl на электрофоретическуюподвижность основных белков ядрьппка - фибрилларина, С23/нуклеолина,В23/нуклеофозмина.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Жарская, Оксана Олеговна

1. ЦЯД образуются в нормальном митозе в ранней анафазе во всех типах изученных

клеток млекопитающих (клетки зеленой мартышки CV1, человека HeLa, мыши ЗТЗ и

свиньи СПЭВ) и растений (АШит сера L.). 2. Индивидуальные ЦЯД содержат белки раннего и позднего процессинга рРНК зрелого

ядрышка (фибрилларин, С23/нуклеолин, В23/нуклеофозмин, Nop52), а также частично процессированную рРНК. ЦЯД не содержат фактора транскрипции рибосомных генов,

белка UBF. Состав и динамика отдельных компонентов ЦЯД свидетельствует в пользу

участия этих производных ядрышка во внеядрышковом процессинге рРНК.

3. рРНК, входяшая в состав ЦЯД, является необходимой для их формирования и

синтезируется за несколько часов до начала деления клеток. 4. Обратимое воздействие растворов низкой ионной силы (гипотонического шока) на

клетки HeLa и CV1 является индуктором преждевременного образования ЦЯД на

стадии метафазы. Механизмы образования иЦЯД в этих условиях могут включать

повышение концентрации [Са (2+)] (i) и последующую инактиваю комплекса Cdkl-

циклип В,

5. Ингибирование основной митотической киназы Cdkl индуцирует нреждевременное

образование ЦЯД в клетках млекопитающих и растений на стадии метафазы. 6. Молекулярные механизмы формирования иЦЯД в условиях ингибирования

митотической киназы Cdkl, по-видимому, включают дефосфорилирование белков

В23/нуклеофозмина и С23/нуклеолина, что нриводит к повыщению их способности

взаимодействовать с рРНК.

7. Полученные и литературные данные позволяют сделать вывод о том, что циклин В зависимая киназа Cdkl играет важную роль в сборке ядрышка в митозе.7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жарская О.О., Меджидова А.А., Федорова Н.Е., Кущ А.А., Зацепина О.В.

Иммупоцитохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной

инфекции фибробластов эмбриона человека ш vitro. Доклады Академии Наук, 2002, том

387: 589-592. 2. Жарская О.О., Зацепина О.В. Закономерности образования

цитоплазматических производных ядрышка в разных культурах клеток млекопитающих в

митозе. Цитология, 2005а, том 47 (9): 780-788. 3. Жарская О.С, Зацепина О.В. Индукция преждевременной сборки

предшественников ядрышка в метафазных клетках CV1 и HeLa с помощью обратимого

гипотонического шока. Цитология, 20056, том 47 (10): 874-881. 4. Jarskaja О.О., Kunafina E.R., Sheval E.V., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. Premature induction of nucleolus derived foci at metaphase of mitosis by inhibition of CDK-type

kinases. EMBO/FEBS 19"' International Workshop on the Cell Nucleus, 2005,

Munsterschwarwazach Abbey (Germany), p. 33.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жарская, Оксана Олеговна, Москва

1. Бураков В.В., Чабан И.А., Поляков В.Ю. и др. (1994) Экстрахромосомиыйпериферический материал в эндосперме пшеницы. Цитология 36 (11), 1062-1068.

2. Вейко H.H., Ляпунова H.A., Косякова Н.В., Спитковский Д.М. (2001) Элементыструктурной организации транскрибируемой области рибосомного повтора (рДНК) в лимфоцитах периферической крови человека. Мол биология 35, 52-64.

3. Гурченков В.В., Ползиков М.А., Магоулас К., Романова Л.Г. Зацепина О.В. (2005)Свойства и функции нового белка ядрышка в клетках мыши ЗТЗ. Биоорг химия 31 (6), 578-585.

4. Дудник O.A., Зацепина О.В. (1995) Поведение некоторых ядрышковых белков вусловиях обратимого пространственного разобщения структурных компонентов ядрышка. Цитология 37(1/2), 126-132.

5. Дудник O.A., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. (1995) Влияние растворов низкой ионнойсилы на структуру и функцию ядрышек в живых клетках СПЭВ. Цитология 35 (5), 10-16.

6. Епифанова О.И. (2003) Лекции о клеточном цикле. М, КМК Scientific Press, 2-е изд.,159 с.

7. Жарская О.О., Барсукова A.C., Меджидова A.A., Федорова Н.Е., Кущ A.A., ЗацепинаО.В. (2003) Активация транскрипции рибосомных генов при цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. Цитология 45 (7), 690-701.

8. Жарская О.О., Зацепина О.В. (2005а) Закономерности образования цитоплазматических производных ядрышка в разных культурах клеток млекопитающих в митозе. Цитология 47 (9), 780-788.

9. Жарская О.О., Зацепина О.В. (20056) Закономерности образования цитоплазматических производных ядрышка в разных культурах клеток млекопитающих в митозе. Цитология 47 (10), 874-881.

10. Жарская О.О., Меджидова A.A., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Зацепина О.В. (2002) Иммуноцитохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. Докл Акад Наук 387, 589-592.

11. Зацепина О.В., Прусов А.Н., Семенов М.В. (1995) Иммунолокализация фактора инициации транскрипции рибосомных генов UBF интерфазе и митозе. Цитологтя 37(1/2), 137-144.

12. Копнин Б.П. (2000) Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых основ канцерогенеза. Биохимия 65, 5-33.

13. Мухарьямова К.Ш., Дудник O.A., Сперанский А.И., Зацепина О.В. 1998. Сравнительная локализация основных белков ядрышка фибрилларина и В23 в делящихся клетках млекопитающих. Биологические мембраны 15 (6), 657-669.

14. Мухарьямова К.Ш., Зацепина О.В. 2001. Визуализация транскрипции рибосомных генов в клетках культуры ткани СПЭВ с помощью бромированного уридинтрифосфата. Цитология 43, 792-796.

15. Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. (1968) Электронно-микроскопическое выявление матрикса хромосом в связи с их естественным разрыхлением. Докл Акад Наук СССР 182, 205-208.

16. Сабанеева Е.В. (1988) Соотношение ядрышкового организатора и фибриллярного центра ядрышка. Цитология 30 (12), 1395-1440.

17. Смирнова Е.А., Гребенщикова В.И., Ченцов Ю.С. (1985) Оценка функционального состояния культивируемых клеток, помещенных в гипотонические условия, путем прижизненного окрашивания нейтральным красным. Цитология 27 (8), 882-886.

18. Смирнова Е.А., Казачкина В.И., Гребенщикова В.И., Ченцов Ю.С. (1987) Устойчивость разных типов клеток к действию гипотонии. Цитология 29 (1), 47-53.

19. Узбеков Р.Е. (2004) Анализ клеточного цикла и методика исследования динамики уровня экспрессии белков па его различных фазах с использованием синхронизированных клеток. Биохомия 69 (5), 485-496.

20. Челидзе П.В., Зацепина О.В. (1988) Морфофункциональная классификация ядрышек. Успехи современной биологии 105 (2), 252-267.

21. Ченцов Ю.С. (2000) Периферический материал или матрикс митотических хромосом: структура и функции. Онтогенез 31 (6), 388-399.

22. Ченцов Ю.С. (2004) Введение в клеточную биологию М, ИКЦ Академкнига, 494 с.

23. Ченцов Ю.С., Андреев В.В. (1966) Подавление роста ядрышек в разделившихся клетках культуры ткани при действии низкиз доз актиномиципа. Прижизненные наблюдения. Жури. общ. биологии 27 (5), 615-619.

24. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. (1969) Электронно-микроскопическое исследование хромосом Crepis capillaris. Докл Акад Наук СССР 189, 185-187.

25. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. 1974. Ультраструктура клеточного ядра. М, Наука.

26. Abramova N.B., Neyfakh А.А. (1973) Migration of newly synthesized RNA during mitosis. III. Nuclear RNA in the cytoplasm of metaphase cells. Exp Cell Res 77, 136-142.

27. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. (2005) Nucleolar proteome dynamics. Nature 433, 77-83.

28. Andersen J.S., Lyon C.E., Fox A.H., Leung A.K.L., Lam Y.W., Steen H., Mann M., Lamond A.I. (2002) Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr Biol 12, 111.

29. Angelier N., Tramier M., Louvet E., Coppey-Moisan M., Savino T.M., De Mey J.R., Hernandez-Verdun D.D. (2005) Tracking the interactions of rRNA processing proteins during nucleolar assembly in living cells. Mol Biol Cell 16, 2862-2871.

30. Aris J.P. and Blobel G. (1991) cDNA cloning and sequencing of human fibrillarin, a conserved nucleolar protein recognized by autoimmune antisera. Proc Nat Acad Sci USA 88, 931-935.

31. Azum-Gelade M.C., Noaillac-Depeyre J., Caizergues-Ferrer M., Gas N. (1994) Cell cycle redistribution of U3 snRNA and fibrillarin. Presence in the cytoplasmic nucleolus remnant and in the prenucleolar bodies at telophase. J Cell Sci 107,463-75.

32. Bachellerie J.P., Cavaille J., Huttenhofer A. (2002) The expanding snoRNA world. Biochemie 84, 775-790.

33. Badis G., Fromont-Racine M., Jacquier A. (2003) A snoRNA that guides the two most conserved pseudouridine modifications within rRNA confers a growth advantage in yeast. RNA 9 (7), 771-779.

34. Baran I. (1994) Exit from mitosis induced by a calcium transient: the relation to the MPF and InsP3 dynamics. Biosystems 33, 203-214.

35. Barneche F., Steinmetz F., Echeverria M. (2000) Fibrillarin genes encode both a conserved nucleolar protein and a novel small nucleolar RNA in volved in ribosomal RNA methylation in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 275 (35), 27212-27220.

36. Beckmann R., Buchner K., Jungblut P.R., Eckerskom C., Weise C., Hilbert R., Hucho F. (1992) Nuclear substrate of protein kinase C. Em J Biochem 210, 45-51.

37. Belenguer P., Caizergues-Ferrer M., Labbe J.-C., Doree M., and Amalric F. (1990) Mitosisspecific phosphorylation of nucleolin by p34cdc2 protein kinase. Mol Cell Biol 10, 3607-3618.

38. Bell P., Mais C., McStay B., Scheer U. (1997) Association of the nucleolar transcription factor UBF with the transcriptionally inactive rRNA genes of pronuclei and early Xenopus embryos. J Cell Sci 110, 2053-2063.

39. Bell P., Scheer U. (1996) Prenucleolar bodies contain coilin and are assembled in Xenopus egg extract depleted of specific nucleolar proteins and U3 RNA. J Cell Sci 109,43-54.

40. Benavente R. (1991) Postmitotic nuclear reorganization events analyzed in living cells. Chromosoma 100 (4), 215-220.

41. Benavente R., Rose K.M., Reimer G., Hiigle-Dôrr B., Scheer U. (1987) Inhibition of nucleolar reformation after microinjection of antibodies to RNA polymerase I into mitotic cells. J Cell Biol 105, 1483-1491.

42. Beven A.F., Lee R., Razaz M., Leader D.J., Brown J.W., Shaw P.J. (1996) The organization of ribosomal RNA processing correlates with the distribution of nucleolar snRNAs. J Cell Sci 109, 1241-1251.

43. Biggiogera M., Fakan S., Kaufmann S.H., Black A., Shaper J.H., Busch H. (1989) Simultaneous immunoelectron microscopic visualization of protein B23 and C23 distribution in the HeLa cell nucleolus. JHistochem Cytochem 37, 1371-1374.

44. Borovjagin A.V., Gerbi S.A. (1999) U3 small nucleolar RNA is essential for cleavage at sites 1, 2 and 3 in pre-rRNA and determines which rRNA processing pathway is taken in Xenopus oocytes. JMolBiol 286, 1347-1363.

45. Brill S.J., DiNardo S., Voelker-Meiman K., Sternglanz R. (1987) Need for DNA topoisomerase activity as swivel for DNA replication and for transcription of ribosomal genes. Nature 326,414-416.

46. Burd C.G., Dreyfuss G. (1994) Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 265, 615-621.

47. Caizergues-Ferrer M., Belenguer P., Lapeyre B., Amalric F., Wallace M.O., Olson M.O. (1987) Phosphorylation of nucleolin by a nucleolar type N11 protein kinase. Biochemistry 26 (24), 7876-7883.

48. Canduri F., Uchoa H.B., De Azevedo W.F.Jr. (2004) Molecular models of cyclin-dependent kinase 1 complexed with inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 324 (2), 661-556.

49. Castro A., Bernis C., Vigneron S., Labbe J.C., Lorca T. (2005) The anaphase-promoting complex: a key factor in the regulation of cell cycle. Oncogene 24 (3), 314-325.

50. Cerdido A., Medina F.J. (1995) Subnucleolar location of fibrillarin and variation in its levels during the cell cycle and during differentiation of plant cells. Chromosoma 103, 625-634

51. Chan P.K., Aldrich M., Busch H. (1985) Alterations in immunolocalization of the phosphoprotein B23 in Hela cells during serum starvation. Exp Cell Res 161, 101-10.

52. Chan PK., Aldrich M., Cook R.G., Busch H. (1986) Amino acid sequence of protein B23 phosphorylation site. J Biol Chem 261, 1868-1872.

53. Chan W.Y., Liu Q.R., Boijigin J., Busch H., Rennert O.M., Tease L.A., Chan P.K. (1989) Characterization of the cDNA encoding human nucleophosmin and studies of its role in normal and abnormal growth. Biochemistry 28,1033-1039.

54. Chen D, Dundr M, Wang C, Leung A, Lamond A, Misteli T, Huang S (2005) Condensed mitotic chromatin is accessible to the transcription machinery and chromatin structural proteins. J Cell Biol 168 (1), 41-54.

55. Cheutin T., O'Donohue M.-F., Beorchia A., Vandelaer M., Kaplan H., Defever B., Ploton D., Thiry M. (2002) Three-dimensional organization of active rRNA genes within the nucleolus. J Cell Sci 115, 3297-3307.

56. Cmarko D., Verschure P.V., Rothblum L.I., Hernandez-Verdun D., Amalric F., van Driel R., Fakan S. (2000) Ultrastructural analysis of nucleolar transcription in cells microinjected with 5-bromo-UTP. Histochem Cell Biol 113, 181-187.

57. De Career G., Cerdido A., Medina F.J. (1997) NopA64, a novel nucleolar phosphoprotein from proliferating onion cells, sharing immunological determinants with mammalian nucleolin. Planta 201 (4), 487-495.

58. De Veylder L., Joubes J., Inze D.(2003) Plant cell cycle transitions. Curr Opin Plant Biol 6 (6), 536-543.

59. Derenzini M. (2000) The AgNORs. Micron 31, 117-120.

60. Dewitte W., Murray J.A. (2003) The plant cell cycle. Annu Rev Plant Biol. 54, 235-264.

61. DiMario PJ. (2004) Cell and molecular biology of nucleolar assembly and disassembly. Int RevCytol 239, 99-178.

62. Dousset T., Wang C., Verheggen C., Chen D., Hernandez-Verdun D., Huang S. (2000) Initiation of nucleolar assembly is independent of RNA polymerase I transcription. Mol Biol Cell 11, 2705-17.

63. Dundr M., Meier U.T., Lewis N., Rekosh D., Hammarskjold M.L., Olson M.O. (1997) A class of nonribosomal nucleolar components is located in chromosome periphery and in nucleolus-derived foci during anaphase and telophase. Chromosoma 105, 407-417.

64. Dundr M., Misteli T., Olson M. O. (2000) The dynamics of postmitotic reassembly of the nucleolus. J Cell Biol 150, 433-446.

65. Dundr M., Olson M. O. (1998) Partially processed pre-rRNA is preserved in association with processing components in nucleolus-derived foci during mitosis. Mol Bio Cell 9, 2407-2422.

66. Earnshaw W.C. and Bernat R.L. (1991) Chromosomal Passengers: Toward an Integrate d View of Mitosis, Chromosoma 100, 139-146.

67. Eliceiri G.L. (1999) Small nucleolar RNAs. Cell Mol Life Sci 56 (1-2), 22-31.

68. Emiliani V., Sanvitto D., Tramier M., Piolot T., Petrasek Z., Kemnitz K., Durieux C., Coppey-Moisan M. (2003) Low-intensity twodimensional imaging of fluorescence lifetimes in living cells. Appl Phys Lett 83, 2471-2473.

69. Fabian G.R., Hopper A.K. (1987) RRP1, a Saccharomyces cerevisiae gene affecting rRNA processing and production of mature ribosomal subunits. J Bacteriol 169 (4), 1571-1578.

70. Fan H., Penman S. (1971) Regulation of synthesis and processing of nucleolar components in metaphase-arrested cells. J Mol Biol 59,27-42.

71. Fatica A., Tollervey D. (2002) Making ribosomes. Curr Opin Cell Biol 14, 313-318.

72. Fernandez-Gomez M.E., Sanchez-Pina M.A., Risueno M.C., Medina F.J., Stockert JC (1983) Differential staining of the nucleolar organizing region (NOR) and nucleolar components by a new silver technique in plants. Cell Mol Biol 29 (2), 181-187.

73. Fernandez-Gomez M.E., Stockert J.C., Lopez-Saez J.F., Gimenez-Martin G. (1969) Stainng plant cell nucleoli with AgN03 after formalin-hydroquinone fixation. Stain Technol 44 (1), 48-49.

74. Fields A.P., Kaufmann S.H., Shaper J.H. (1986) Analysis of the internal nuclear matrix, oligomers of a 38 kD nucleolar polypeptide stabilized by disulfide bonds. Exp Cell Res 164, 139-153.

75. Finch R.A., Revanker G.R., Chan P.K. (1997). Structural and functional relationships of toyocamycin on NPM translocation. Anti-Cancer Drug Design 12, 205-215.

76. Fischer P.M., Endicott J., Meijer L. (2004) Cyclin-dependent kinase inhibitors. Prog Cell Cycle Res 5, 235-248.

77. Fomproix N., Gebrane-Younes J., Hernandez-Verdun D. (1998) Effects of anti-fibrillarin antibodies on building of functional nucleoli at the end of mitosis. J Cell Sc 111, 359-72.

78. Fromont-Racine M., Senger B., Saveanu C., Fasiolo F. (2003) Ribosome assembly in eukaryotes. Gene 313, 17-42.

79. Gall J.G. (2003). The centennial of the Cajal body. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 975-980.

80. Gautier T., Dauphin-Villemant C., Andre C., Masson C., Arnoult J., Hernandez-Verdun D. (1992a) Identification and characterization of a new set of nucleolar ribonucleoproteins which line the chromosomes during mitosis. Exp Cell Res 200, 5-15.

81. Gautier T., Fomproix N., Masson C., Azum-Gelade M.C., Gas N., Hernandez-Verdun D. (1994) Fate of specific nucleolar perichromosomal proteins during mitosis: Cellular distribution and association with U3 snoRNA. Biol Cell 82, 81-93.

82. Gautier T., Masson C., Quintana C., Arnoult J., Hernandez-Verdun D. (1992c) The ultrastructure of the chromosome periphery in human cell lines. An in situ study using cryomethods in electron microscopy. Chromosoma 101, 502-510.

83. Gautier T., Robert-Nicoud M., Guilly M.-N., Hernandez-Verdun D. (1992b) Relocation of nucleolar proteins around chromosomes at mitosis. A study by confocal laser scanning microscopy. J Cell Sci 102, 729-737.

84. Gerbi S.A., Borovjagin A.V., Lange T.S. (2003) The nucleolus: A site of ribonucleoprotein maturation. Curr. Opin Cell Biol 15, 318-325.

85. Ghisolfi L., Gerard J., Amalric F., Erard M. (1992). The glycine-rich domain of nucleolin has an unusual supersecondary structure responsible for its RNA-helix-destabilizing properties. J Biol Chem 267, 2955-2959.

86. Ghisolfi-Nieto L., Joseph G., Puvion-Dutilleul F., Amalric F., and Bouvet P. (1996) Nucleolin is a sequence-specific RNA-binding protein: characterization of targets on pre-ribosomal RNA. J Mol Biol 260, 34-53.

87. Goessens G. (1984) Nucleolar structure. Int Rev Cytol 87, 107-158.

88. Golias C.H., Charalabopoulos A., Charalabopoulos K. (2004) Cell proliferation and cell cycle control: a mini review. Int J Clin Pract 2004 58 (12), 1134-1141.

89. Gonzalez-Camacho F., Medina F.J. (2004) Identification of specific plant nucleolar phosphoproteins in a functional proteomic analysis. Proteomics 4 (2), 407-417.

90. Gonzalez-Camacho F., Medina F.J. (2006) The nucleolar structure and the activity of NopAlOO, a nucleolin-like protein, during the cell cycle in proliferating plant cells. Histochem Cell Biol 125 (1-2), 139-153.

91. Gouilleux F., Wakao H., Mundt M., Groner B. Prolactin induces phosphorylation of Tyr694 of Stat5 (MGF), a prerequisite for DNA binding and induction of transcription. EMBOJ 13 (18), 4361-4369.

92. Granick D. (1975a) Nucleolar necklaces in chick embryo fibroblast cells. I. Formation of necklaces by dichlororibobenzimidazole and other adenosine analogues that decrease RNA 153, 1097-1110.

93. Granick D. (19756) Nucleolar necklaces in chick embryo fibroblast cells. II. Microscope observations of the effect of adenosine analogues on nucleolar necklace formation. J Cell Biol 65,418-427.

94. Gray N., Detivaud L., Doerig C., Meijer L. (1999) ATP-site directed inhibitors of cyclin-dependent kinases. Curr Med Chem 6, 859-876.

95. Grummt I. (1999) Regulation of mammalian ribosomal gene transcription by RNA polymerase I. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 62, 109-154.

96. Guillot P.V., Martin S., Pombo A. (2005) The organization of transcription in the nucleus of mammalian cells. In: Diekmann PHaS (eds) Vision of the cell nucleus. ASP, CA, 95105.

97. Guldner H.-H., Szostecki C., Vosber H.-P., Lakomek H.-J., Penner E., Bautz F.A. (1986) Scl 70 autoantibodies from scleroderma patients recognize a 95 kDa protein identified as DNA topoisomerase I. Chromosoma 94, 132-138.

98. Hadjiolov A.A. (1985) Cell Biol. Monographs. 12.

99. Hardcastle I.R., Golding B.T., Griffin R.J. (2002) Designing inhibitors of cyclin-dependent kinases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 42, 325-348.

100. Hermoso M., Olivero P., Torres R., Riveros A., Quest A.F., Stutzin A. (2004) Cell volume regulation in response to hypotonicity is impaired in HeLa cells expressing a protein kinase Calpha mutant lacking kinase activity. J Biol Chem 279, 17681-17689.

101. Hernandez-Verdun D. (2006) Nucleolus: from structure to dynamics. Histochem Cell Biol 125 (1-2), 127-137. Epub 2005 Nov 22.

102. Hernandez-Verdun D., Gautier T. (1994) The chromosome periphery during mitosis. Bioessays 16, 179-185.

103. Hernandez-Verdun D., Roussel P., Gebrane-Younes G. (2002) Emerging concepts of nucleolar assembly. J Cell Sci 115, 2265-2270.

104. Herrera A.H., Olson M.O.J. (1986) Association of protein C23 with rapidly labeled nucleolar RNA. Biochemistry 25, 6258-6264.

105. Herrera J.E., Savkur R., Olson M.O. (1995) The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Res 23, 3974-3979.

106. Hingorani K., Szebeni A., Olson M.O.J. (2000) Mapping the functional domains of nucleolar protein B23 .J Biol Chem 275, 24451-24457.

107. Hisatake K., Nishimura T., Maeda Y., Hanada K., Song C.Z., Muramatsu M. (1991) Cloning and structural analysis of cDNA and the gene for mouse transcription factor UBF. Nucl Acids Res 19,4631^637.

108. Hoang C., Ferre-D'Amare A.R. (2001) Cocrystal structure of a tRNA Psi55 pseudouridine synthase: Nucleotide flipping by an RNA-modifying enzyme. Cell 107, 929-939.

109. Horsey E.W., Jakovljevic J., Miles T.D., Harnpicharnchai P., Woolford J.L.Jr. (2004) Role of the yeast Rrpl protein in the dynamics of pre-ribosome maturation. RNA 10 (5), 813827.

110. Hozak P., Geraund G., Hernandez-Verdun D. (1992a) Revealing nucleolar architecture by low ionic strength treatment. Exp Cell Res 203, 128-133.

111. Hozak P., Roussel P., Hernandez-Verdun D. (1992b) Procedures for specific detection of silver-stained nucleolar proteins on western blots. J Histochem Cytochem 40, 1089-1096.

112. Hsu T.C., Arrighi F.E., Klevecz R.R. Brinkley B.R. (1965) The nucleoli in mitotic divisions of mammalian cells in vitro. J Cell Biol 26, 539-553.

113. Huang S. (2002) Building an efficient factory: Where is pre-rRNA synthesized in the nucleolus? J Cell Biol 157,739-741.

114. Hubbell H.R. 1985. Silver staining as an indicator of active ribosomal genes. Stain Technol 60, 285-94.

115. Hugle B., Hazan R., Scheer U., Franke W.W. (1985) Localization of ribosomal protein SI in the granular component of the interphase nucleolus and its distribution during mitosis. J Cell Biol 100, 873-886.

116. Hunt T. (1991) Cell biology. Cell cycle gets more cyclins. Nature 350 (6318), 462-463.

117. Inze D. (2005) Green light for the cell cycle. EMBOJ 24 (4), 657-662.

118. Jantzen H.-M., Armon A., Bell, Tjian R. 1990. Nucleolar transcription factor hUBF contains a DNA-binding motif with homology to HMG proteins. Nature 344, 830-6.

119. Jarskaja O.O., Kunafina E.R., Sheval E.V., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. (2005) Premature induction of nucleolus derived foci at metaphase of mitosis by inhibition of CDK-type kinases. EMBO/FEBS 19th International Workshop on the Cell Nucleus, p. 33.

120. Jiang P.S., Chang J.H., Yung B.Y. (2000) Different kinases phosphorylate nucleophosmin/B23 at different sites during G(2) and M phases of the cell cycle. Cancer Lett 153(1-2), 151-160.

121. Jiang P.S., Yung B.Y. (1999) Down-regulation of nucleophosmin/B23 mRNA delays the entry of cells into mitosis. Biochem Biophys Res Commun 257 (3), 865-870.

122. Jimenez-Garcia L.F., Rothblum L.I., Busch H., Ochs R.L. (1989) Nucleologenesis: use of non-isotopic in situ hybridization and immunocytochemistry to compare the localization of rDNA and nucleolar proteins during mitosis. Biol Cell 65, 239-246.

123. Jimenez-Garcia L.F., Segura-Valdez M.L., Ochs R.L., Rothblum L.I., Hannan R, Spector DL. (1994) Nucleologenesis: U3 snRNA-containing prenucleolar bodies move to sites of active pre-rRNA transcription after mitosis. Mol Biol Cell 5, 955-966.

124. Jones C.E., Busch H., Olson M.O. (1981) Sequence of a phosphorylation site in nucleolar protein B23. Biochim Biophys Acta 667, 209-212.

125. Kiss T. (2002) Small nucleolar RNAs: An abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. Cell 109, 145-148.

126. Klein J., Grummt I. (1999). Cell cycle-dependent regulation of RNA polymerase I transcription: The nucleolar transcription factor UBF is inactive in mitosis and early Gi. Proc Natl Acad Sci USA 96, 6096-6101.

127. Knockaert M., Greengard P., Meijer L. (2002) Pharmacological inhibitors of cyclin-dependent kinases. Trends Pharmacol Sci 23, 417-425.

128. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature 111 (5259), 680-685.

129. Lafontaine D.L., Tollervey D. (2001) The function and synthesis of ribosomes. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (7), 514-520.

130. Lafontaine D.L.J., Bousquet-Antonelli C., Henry Y., Caizergues-Ferrer M., Tollervey D.1998) The box H + ACA snoRNAs carry Cbf5p, the putative rRNA pseudouridine synthase. Genes Dev 12, 527-537.

131. Lafontaine J.G. (1958) Structure and mode of formation of the nucleolus in meristematic cells of Vicia faba and Allium cepa. JBiophys Biochem Cytol 4, 777-784.

132. Lafontaine J.G., Chouinard L.A. (1963) A correlated light and electron microscope study of the nucleolar material during mitosis in Vicia faba. J Cell Biol 17, 167-201.

133. Le Panse S., Masson C., Herliot L., Chassery J.-M., Junerra H.R., Hernandez-Verdun D.1999) 3-D organization of single ribosomal transcription units after DRB inhibition of RNA polymerase II transcription. J Cell Sci 112, 2145-2154.

134. Lerch-Gaggl A., Haque J., Li J., Ning G., Traktman P., Duncan S.A. (2002) Pescadillo is essential for nucleolar assembly, ribosome biogenesis, and mammalian cell proliferation. J Biol Chem 277,45347-55.

135. Leung A.K., Andersen J.S., Mann M., Lamond A.I. (2003) Bioinformatic analysis of the nucleolus. Biochem J 376, 553-569.

136. Leung, A. K. L., and Lamond, A. I. (2003). The dynamics of the nucleolus. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 13, 39-54.

137. Li Y.-P., Busch R.K., Valdez B.C., Busch H. (1996) C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. Eur J Biochem 237, 153-158.

138. Liu J., Mailer J.L. (2005) Xenopus Polo-like kinase Plxl: a multifunctional mitotic kinase. Oncogene 24 (2), 238-247.

139. Louvet E., Junera H.R., Le Panse S., Hernandez-Verdun D. (2005) Dynamics and compartmentation of the nucleolar processing machinery. Exp Cell Res 304, 457-470.

140. Lu Y.Y., Lam C.Y., Yung B.Y. (1996) Decreased accumulation and dephosphorylation of the mitosis-specific form of nucleophosmin/B23 in staurosporine-induced chromosome decondensation. Biochem J317 (1), 321 -327.

141. Lucretti S., Dolezel. (1995) J.Cell cycle synchronization, chromosome isolation, and flow-sorting in plants. Methods Cell Biol 50, 61-83.

142. Magoulas C., Zatsepina O.V., Jordan P.W., Jordan E.G., Fried M. (1998) The SURF-6 protein is a component of the nucleolar matrix and has a high binding capacity for nucleic acids in vitro. Eur J Cell Biol 75, 174-183.

143. Malinsky J., Kobrena K., Bednar J., Stulik J., Raska I. (2002) Searching for active ribosomal genes in situ: Light microscopy in light of the electron beam. J Struct Biol 140, 227-231.

144. Marangos P., Carroll J.(2004) Fertilization and InsP3-induced Ca2+ release stimulate a persistent increase in the rate of degradation of cyclin B1 specifically in mature mouse oocytes. Dev Biol 272 (1), 26-38.

145. Matera A.G., Tycowski K.T., Steitz J.A., Ward D.C. (1994) Organization of small nucleolar ribonucleoproteins (snoRNPs) by fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Biol Cell 5(12), 1289-1299.

146. Maxwell E.S., Fournier M.J. (1995) The small nucleolar RNAs. Ann Rev Biochem 35, 897-933.

147. Medina F.J., Cerdido A., Fernandez-Gomez M.E. (1995) Components of the nucleolar processing complex (Pre-rRNA, fibrillarin, and nucleolin) colocalize during mitosis and are incorporated to daughter cell nucleoli. Exp Cell Res 221 (1), 111-125.

148. Meijer L., Raymond E. (2003) Roscovitine and other purines as kinase inhibitors. From starfish oocytes to clinical trials. Acc Chem Res 36 (6). 417-425.

149. Morcillo G., De la Torre C. (1980) The effect of RNA synthesis inhibitors on prenucleolar bodies. Experientia 36, 836-837.

150. Morcillo G., De la Torre C., Gimrenez-Martin G. (1976) Nucleolar transcription during plant mitosis. Exp Cell Res 102, 311-316.

151. Morgan D.O. (1997) Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol 13, 261-291.

152. Mosgoeller, W., Scho" fer, C., Wesierska-Gadek, J., Steiner, M., Mu" ller, M., and Wachtler, F. (1998). Ribosomal gene transcription is organized in foci within nucleolar components. Histochem. Cell Biol. 109, 111-118.

153. Moss T., Stefanovsky V.Y. (2002) At the center of eukaryotic life. Cell 109 (5), 545-548.

154. Murray A. (1994) Cell cycle checkpoints. Curr Opin Cell Biol 6 (6):872-876.

155. Murray AW. (2004) Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 116 (2), 221-234.

156. Nazar R.N. (2004) Ribosomal RNA processing and ribosome biogenesis in eukaryotes. IUBMB Life 56 (8), 457-465.

157. Niiya F, Xie X, Lee KS, Inoue H, Miki T. Inhibition of cyclin-dependent kinase 1 induces cytokinesis without chromosome segregation in an ECT2 and MgcRacGAP-dependent manner. J Biol Chem. 2005 Oct 28;280(43):36502-9. Epub 2005 Aug 23.

158. Nilsson H., Wallin M. (1998) Microtubule aster formation by dynein-dependent organelle transport. Cell Motil Cytoskeleton 41, 254-263.

159. Noel J.S., Dewey W.C., Abel J.H., Thompson R.P. (1971) Ultrastructure of the nucleolus during the Chinese hamster cell cycle. J Cell Biol 49, 830-847.

160. O'Mahony D.J., Rothblum L.I. (1991) Identification of two forms of the RNA polymerase I transcription factor UBF. Proc Natl Acad Sci USA 88, 3180-3184.

161. O'Sullivan A.C., Sullivan G.J., McStay, B. (2002) UBF binding in vivo is not restricted to regulatory sequences within the vertebrate ribosomal DNA repeat. Mol Cell Biol 22, 657668.

162. Ochs R. L., Busch H. (1984) Further evidence that phosphoprotein C23 (110 kD/pI 5.1) is the nucleolar silver staining protein. Exp Cell Res 152, 260-265.

163. Ochs R.L., Lischwe M., O'Leary P., Busch H. (1983) Localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23 during mitosis. Exp Cell Res 146, 139-149.

164. Ochs R.L., Lischwe M., Spohn W.N., Busch H. (1985a) Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. Biol Cell 54, 123-133.

165. Ochs R.L., Lischwe M.A., Shen E., Carroll R.E., Busch H. (1985b) Nucleologenesis:composition and fate of prenucleolar bodies. Chromosoma 92, 330-336.97

166. Okuda M., Horn H.F., Tarapore P., Tokuyama Y., Smulian A.G., Chan P.K., Knudsen E.S., Hofmann I.A., Snyder J.D., Bove K.E., Fukasawa K. (2000) Nucleophosmin/B23 is a target of CDK2/cyclin E in centrosome duplication. Cell 103 (1), 127-140.

167. Olson M.O., Dundr M. (2005) The moving parts of the nucleolus. Histochem Cell Biol 123, 203-216.

168. Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A. (2002) Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. Int Rev Cytol 219,199-266.

169. Olson M.O.J. (1990) The role of proteins in nucleolar structure and function. In "The Eukaryotic Nucleus: Molecular Biochemistry and Macromolecular Assemblies" (P. R. Straus and S. H. Wilson, Eds.), 2, 519-559. Telford Press, West Caldwell, NJ.

170. Orrick L.R., Olson M.O., Busch H. (1973) Comparison of nucleolar proteins of normal rat liver and Novikoff hepatoma ascites cells by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 70 (5), 1316-1320.

171. Paweletz N., Risueno M.C. (1982) Transmission electron microscopic studies on the mitotic cycle of nucleolar proteins impregnated with silver. Chromosoma 85, 261-273.

172. Peculis B., and Steitz J.A. (1993) Disruption of U8 nucleolar snRNA inhibits 5.8S and 28S rRNA processing in the Xenopus oocyte. Cell 73, 1233-1245.

173. Pelayo H.R., Lastres P., De la Torre C. (2001) Replication and G2 checkpoints: their response to caffeine. Planta 212 (3), 444-453.

174. Pellar G.J., DiMario P.J. (2003) Deletion and site-specific mutagenesis of nucleolin's carboxy GAR domain. Chromosoma 111, 461-469.

175. Peter M., Nakagawa J., Doree M., Labbe J.C., Nigg E.A. Cell. (1990) Identification of major nucleolar proteins as candidate mitotic substrates of cdc2 kinase. Cell 60, 791-801.

176. Pfeifle J., Boiler K., Anderer F.A. (1986) Phosphoprotein ppl35 is an essential component of the nucleolus organizer region (NOR). Exp Cell Res 162, 11-22.

177. Phillips S.G. (1972) Repopulation of the postmitotic nucleolus by preformed RNA. J Cell Biol 53,611-623.

178. Pines J. (1995) Cyclins and cyclin-dependent kinases: a biochemical view. Biochem J Jun 308 (3), 697-711.

179. Pinol-Roma S. (1999) Association of nonribosomal nucleolar proteins in ribonucleoprotein . complexes during interphase and mitosis. Mol Biol Cell 10, 77-90.

180. Ploton D., Thiry M., Menager M., Lepoint A., Adnet J.J., Goessens G. (1987) Behavior of the nudeolus during mitosis. Chromosoma 100, 95-107.

181. Puvion-Dutilleul F., Mazan S., Nicoloso M., Christensen M.E., Bachellerie J.-P. (1991) Localization of U3 RNA molecules in nucleoli of HeLa and mouse 3T3 cells by high resolution in situ hybridization. Eur J Cell Biol 56, 178-186.

182. Puvion-Dutilleul F., Mazan S., Nicoloso M., Pichard E., Bachellerie J.-P., Puvion E. (1992) Alterations of nucleolar ultrastructure and ribosome biogenesis by actinomycin D. Implications forU3 snRNP function. Eur J Cell Biol 58, 149-162.

183. Roussel P., Andre C., Comai L., Hernandez-Verdun D. (1996) The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol 133, 235-246.

184. Roussel P., Hernandez-Verdun D. (1994) Identification of Ag-NOR proteins, markers of proliferation related to ribosomal gene activity. Exp Cell Res 214,465-472.

185. Samaniego R., de la Torre C., Moreno Diaz de la Espina S. (2002) Dynamics of replication foci and nuclear matrix during S phase in Allium cepa L. cells. Planta 215 (2), 195-204.

186. Santella L. (1998) The role of calcium in the cell cycle: facts and hypotheses. Biochem Biophys Res Commun 244, 317-324.

187. Savino T.M., Bastos R., Jansen E., Hernandez-Verdun D. (1999) The nucleolar antigen Nop52, the human homologue of the yeast ribosomal RNA processing RRP1, is recruited at late stages of nucleologenesis. J Cell Sci 112,1889-1900.

188. Savino T.M., Gebrane-Younes J., De Mey J., Sibarita J.B., Hernandez-Verdun D. (2001) Nucleolar assembly of the rRNA processing machinery in living cells. J Cell Biol 153, 1097-1110.

189. Savkur R.S., Olson M.O.J. (1998) Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA by protein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Res 26,4508-4515.

190. Scheer U, Benavente R (1990) Functional and dynamic aspects of the mammalian nucleolus. Bio Essays 12,14-21.

191. Scheer U., Hock R. (1999) Structure and function of the nucleolus. Curr Opin Cell Biol 11, 385-390.

192. Scheer U., Rose K.M. (1984) Localization of RNA polymerase I in interphase cells and mitotic chromosomes by light and electron microscopic immunocytochemistry. Proc Natl Acad Sci USA 81,1431-1435.

193. Scheer U., Trendelenburg M F., Franke W.W. (1975) Effects of actinomycin D on the association of newly formed ribonucleoproteins with the cistrons of ribosomal RNA in Triturus oocytes. J Cell Biol 65, 163-179.

194. Scherl A., Coute Y., Deon C., Calle A., Kindbeiter K., Sanchez J.-C., Greco A., Hochstrasser D., Diaz J.J. (2002) Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol Biol Cell 13, 4100-4109.

195. Schmidt-Zachmann M. S., Hiigle-Dorr В., Franke W. W. (1987) Aconstitutive nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. EMBOJ 6, 1881-1890.

196. Shaw P.J., Jordan E.G. (1995) The nucleolus. Cell Dev Biol 11, 93-121.

197. Shen M.R., Chou C.Y., Browning J.A., Wilkins R.J., Ellory J.C. 2001. Human cervical cancer cells use Ca2+ signalling, protein tyrosine phosphorylation and MAP kinase in regulatory volume decrease. J Physiol 537, 347-362.

198. Sirri V., Hernandez-Verdun D., Roussel P. (2002) Cyclin-dependent kinases govern formation maintenance of the nucleolus. J Cell Biol 156, 969-981.

199. Sirri V., Roussel P., Hernadez-Werdun D. (1999) The mitotically phosphorylated form of the transcription termination factor TTF-1 is associated with the repressed rDNA transcription machinery. J Cell Sci 112, 3259-3268.

200. Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D. (2000a) In vivo release of mitotic silencing of ribosomal gene transcription does not give rise to precursor ribosomal RNA processing. J Cell Biol 148, 259-270.

201. Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D. (2000b) The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. Micron 31 (2), 121-126.

202. Smetana K., Busch H. (1974) The nucleolus and nucleolar DNA. In "The Cell Nucleus" (H. Busch, Ed.) 1,73-147. Academic Press, New York.

203. Sollner-Webb В., Tycowski K.T., Steitz J.A. (1996) Ribosomal RNA processing in eukaryotes. In: Ribosomal RNA: structure, evolution, processing, and function in protein biosynthesis. CRC Press, New York, 469-490.

204. Spector D.L., Ochs R.L., Busch H. (1984) Silver staining, immunofluorescence, and immunoelectron microscopic localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23. Chromosoma 90,130-148.

205. Stevens B. (1965) The fine structure of the nucleolus during mitosis in the grasshopper neuroblast cell. J Cell Biol 24, 349-368.

206. Stockert J.C., Fernandez-Gomez M.E., Gimenez-Martin G., and Sanchez-Lopez J.F. (1970) Organization of argyrophilic nucleolar material throughout the division cycle of meristematic cells. Protoplasma 69, 265-278.

207. Suprynowicz F.A., Prusmack C., Whalley T. (1994) Ca2+ triggers premature inactivation of the cdc2 protein kinase in permeabilized sea urchin embryos. Proc Natl Acad Sci USA 91,6176-6180.

208. Szebeni A., Hingorani K., Negi S., Olson M.O.J. (2003) Role of protein kinase CK2 phosphorylation in the molecular chaperone activity of nucleolar protein B23 .J Biol Chem 278,9107-9115.

209. Szebeni A., Mehrotra B„ Baumann A., Adam S.A., Wingfield P.T., Olson M.O.J. (1997) Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLSconjugated albumin. Biochemistry 36, 3941-3949.

210. Szebeni A., Olson M.O.J. (1999) Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Sci. 8, 905-912.

211. Takemura M., Ohta N., Furuichi Y, Takahashi T., Yoshida S., Olson M.O., Umekawa H. (1994) Stimulation of calf thymus DNA polimerase activity by nucleolar protein B23. Biochem Biopiys Res Commun 199, 46-51.

212. Tamm I., Hand R., Caliguiri L.A. (1976) Action of dichlorobenzimidazole riboside on RNA synthesis in L-929 and HeLa cells. J Cell Biol 69, 229-240.

213. Thiry M., Lafontaine D.L. (2005) Birth of a nucleolus: the evolution of nucleolar compartments. Trends Cell Biol 15, 194-199.

214. Tokuyama Y., Horn H.F., Kawamura K., Tarapore P., Fukasawa K. (2001) Specific phosphorylation of nucleophosmin on Thr(199) by cyclin-dependent kinase 2-cyclin E and its role in centrosome duplication. J Biol Chem 276 (24), 21529-21537

215. Tschochner H., Hurt E. (2003) Pre-ribosomes on the road from the nucleus to the cytoplasm. Trends Cell Biol 13, 255-263.

216. Tuteja R., Tuteja N. (1998) Nucleolin: A multifunctional major nucleolar phosphoprotein. Crit Rev Biochem Mol Biol 33, 407-436.

217. Vermeulen K., Van Bockstaele D.R., Berneman Z.N. (2003) The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif36 (3), 131-149.

218. Voit R., Hoffmann M., Grummt I. (1999) Phosphorylation by G1-specific cdk-cyclin complexes activates the nucleolar transcription factor UBF. EMBO J18, 1891-1899.

219. Wang H., Boisvert D., Kim K.K., Kim R., Kim S.H. (2000) Crystal structure of a fibrillarin homologue from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile, at 1.6 A ° resolution. EMBO J19, 317-323.

220. Weisenberger D., Scheer U. (1995) A possible mechanism for the inhibition of ribosomal RNA gene transcription during mitosis. J Cell Biol 129, 561-575.

221. Weisenberger D., Scheer U., Benavente R. (1993) The DNA topoisomerase I inhibitor camptothecin blocks postmitotic reformation of nucleoli in mammalian cells. Eur J Cell Biol 61, 189-192.

222. Xue Z., Melese T. (1994) Nucleolar proteins that bind NLSs: a role in nuclear import or ribosome biogenesis. Trends Cell Biol 4,414-417.

223. Yasuda Y. Maul G.G. (1990) A nucleolar auto-antigen is part of a major chromosomal surface component. Chromosoma 99, 152-160.

224. Yung B.Y.M., Busch H., Chan PK. (1985) Translocation of nucleolar phosphoprotein B23 (37 kDa/ -15.1) induced by selective inhibitors of ribosome synthesis. Biochim Biophys Actu 826, 167-173.

225. Zatsepina O.V., Dudnic O.A., Chentsov Y.S., Thiry M., Spring H., Trendelenburg M.F. (1997b) Reassembly of functional nucleoli following in situ unraveling by low-ionic-strength treatment of cultured mammalian cells. Exp Cell Res 233 (1), 155-168.

226. Zatsepina O.V., Roussel A., Chan P.K., Olson M.O., Jordan E.G., Bornens M. (1999) The nucleolar phosphoprotein B23 redistributes in part to the spindle poles during mitosis. J Cell Sci 112,455-466.

227. Zatsepina O.V., Voit R., Grummt I., Spring H., Semenov M.V., Trendelenburg M.F. (1993) The RNA polymerase I-specific transcription initiation factor UBF is associated with transcriptionally active and inactive ribosomal genes. Chromosoma 102,599-611.

228. Zhang H., Shi X., Paddon H., Hampong M., Dai W., Pelech S. (2004) B23/nucleophosmin serine 4 phosphorylation mediates mitotic functions of polo-like kinase 1 .J Biol Chem 279 (34), 35726-35734.

229. Zhu Y., Lu D., DiMario P. (1999) Nucleolin; defective for MPF phosphorylation, localizes normally during mitosis and nucleologenesis. Histochem Cell Biol 111, 477-487.