Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика экспрессии генов сегментации у дрозофилы

ВАК РФ 03.00.28, Биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Динамика экспрессии генов сегментации у дрозофилы"

На правах рукописи

Мария Георгиевна Самсонова

ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СЕГМЕНТАЦИИ У ДРОЗОФИЛЫ

03 ии 28 - БИОИНФОРМАТИКА

Автореферат

диссср 1<)ции 1ы сомсклнис ученой с1с11с1111 докЕира биочо! ичсских паук

0031Б6117

Слпк1-Пс1србур1 2008

003166117

Рабсил выполнена в сидело ком пыо ирной биоло! и и Цеп ipa пора к к ihbii ых исследований Сап к i-Петербургскот юсударспилнюю полтехпическот уппверсиicia

Научный копсулыаш

Серий Гсор[ невич Ише-Вечтмов док юр биоло! ическнх наук, профессор, академик РАН

Официальные оппопеп 1ы

докюр биолог ических наук, профессор Я В Омельянчук

докюр биоло! ичсских паук, профессор А А Миронов

докюр биоло!ических паук, профессор А П Перевозчиков

Ведущая орииниация

Ilnciniyi молекулярной биолотн им В А Э|пелыард1а РАН

/£ - IWUMÙ 2008 I на jr

1й па соискашк ученой cieiiunt докю

Защи[а диссср1ации состтся Us^l-iу 2UU8 i па заседании дисирищион-

iïoi о совеiа по защи le диссерьщий на сонскашк ученой с iciiunt док юра био loi ических наук (Д-003 Oil 01) в HuciHiyie циюлоши и шитики СО РАН is конференц-зале Hnciiuyia но адресу G30090, i Новосибирск, нроснек! академика Лаврен i ьева, 10 [ел (383)333-12-78, e-mail dissov^bionct use îu

С диссер1ацией можно ознакомшься и бибчио1еке Ипсппуы цшоло! ии и icueiiik.ii СО РАН

Аторефера! разослан '

Ь

2008 1

Ученый секрсчарь дисиркщиоппо! о сове la, докюр биоло! ических наук

А Д Груздей

1 Общая характеристика работы

Pa6oia посвящена исследовапию механизмов де крмипации cti мепюв 1 и морфотк шческом ПОЛе сетешации у плодовой мушки дрозофилы

Морфо! СПСМ ическое пиле Я11ДЯСМСЯ ОСНОВНЫМ ЭЛе МС 11 ЮМ ОН iОК нии и, как физически обоеоб-кчшая обысп,, формируемся и резулы.ые сложных координированных взанмоченсишй со-с[являющих сю KOMHOHCHi - кчюв, фанскрип юв и белков Эш взаимодействия приВОДЯI к IOM\, 'НО Каждая КЧСЧКа [ЮЛЯ С [ (ШО|!и [СИ дсюрминироиашюй, выбирая ОДИН и J MHOI их возможных II у i cíl развшня (Белоусов, 2005) Дечсрмипация ceiMeiiioii происходи! в морфоюпе-[нческом но ie предсивляющем собою iy часи, эмбриона, iu коюроН в будущем разовьс 1Ся зародышевая полоска (Корочкпн, 2002, Gilbcit, 2003), и нриводш к определению положении [ранни, napaceiменюв (Maitniez-Anas and Lawience, 1985) Физическими комнопегпами мор-фо! el 1сч ичсско!о почя сечменцщии являююя leni.i сетешации и их продукп,1 (см раздел 2 1)

Выпо шеппый комплекс исследовании был орисп 1 ирован па создание opiiimiiuiiiiux мс-юдов получения количес1 венных данных из изображений карпш экспрессии кчюв, изучение особчмюскй динамики экспрессии iuioh cei ме п мции, мак Mai ическое моделирование экспрессии иной р,ар в цик ых 13 и 14А, а ыкже создание аыаса просфапсшеппо-времешюО экспрессии leiioií

1 1 Актуальность темы

Несмофя на большой обьем ипфоркыцпи о peíуля юрпых взаимодейС1виях i еиов ceiMcina-ции (Акаш, 1987, Iiiftham, 1988, Корочким, 2002), знания о механизмах риучяции эшх тю», и в особеппосш, о механизмах экспрессии кпов gap, явчяююя далеко по ночными Эш, с одной сюропы обьяспяе iся пепочиоюй эксиеримеп 1альиых данных о рем уля юрпых взаимо-дейсишях, с дру[ ой - ме юдоло! ическими |рудпое1ями, коюрые возникаю!, ко!да в|,1вод о peí уляlupnoM взаимо 1ейс! вии у miioiokjicючно! о opiапизма дечаемся па основе качеС1вснпо-I о анализа экспрессии i епа у му iaii юв Kpai ко Э1 и [рудное! и можно обозпачшь как проблемы пенрошворсчивосш, упикалыюеш и но nioii.i предполагаемою peíуляюрно!о механизма

Для доказак'льсиы, пеиротворечивосги i ипокмическою peí уля lopnoi о механизма ipe-буе1Ся учет вкчада всех peí уля юров исследуемо! о i епа Современные эксиеримеп i ал ь in, ie ме-юды однако, имею! oí раиичепную возможное i ь одновременною апа^шза влияния всех peiy-ляюров па данный len, поскольку они основаны на анализе карпш экспрессии у муицпов, а получение opianiuMoii с м\ 1ациями более чем в ipex peí уля юрах часю являекя пспросюй задачей Бочее юю, тшая сечь у m\ianioB по определению cocioiti из iieiio'inoiо, ичи де-феыною набора pe i учя юрпых взаимоде ЙС1 вий ichob Таким обра íom , выводы о cipyKivpe кчшой сечи дикот пша прихо'цпся делам, па основании данных miioi их эксиеримеп юв с MViainaMii Ненрошворечнвехмь же выявленных взаимоде По i вий можс! бьпь продемонстрирована юлько при проверке их в ишакшом развивающимся ор|апизме, содержащем полный набор реч \ля юров

Дру|ая проблема возникающая при инкрнреыции карпш экспрессии у MvianioB, сосю-111 в доказак'чьспю упнкалыюст механизма взаимодейстия, 1с докалаюльепк1 юю, чш данное peivmiopitoe взаимоде ЙС1 вис являемся прямым, а пе опосредованным Такие доказа-le ibeiBa ipe'Guoi проведения донолниюльных экепернменюв

II наконец, cyiueciB\ei фуидаметалвпая проблема демонсфации полно!м вь(явленных pe i уля юриых вз<п1Модейс1вий Дейс i ви юльпо, необходимое и, материнских ichob и i снов дар - физических K0Mii0iic.il i морфо! ene iiihcckoi о иочя сечметации - да я правильной экспрессии кчюв дар пе озпачле! дооаючпос i и эюю набора кчюв В принципе доклзщельсто ;tocia-

1 С'< I М( т I I - IIOTJK ДО» I 14 III ПО К JM ДУК>1ЦИ( ГЯ MO|><¡MXHOI И К СКИ< npVKIVpil 11 ¡I I Д]Ю Ю<]>ИЛ1 I

тчпосш выявленною peiy iMiopnoiü механизма пеиизможио без реконсфукции сисюмы ab initio из (лдельных, хорошо кон фолируемых компонепюв Очевидно, чю современные экс-перимешальпые меюды не позволяю« провесш 1акую реконС[рукцию, и, слсдова«елыю, она дочжпа бьпь провсден<1 т ы1ко с помощью MaieMai ическою моделирования и численных расчеши (Ра!ушпый et al, 2005)

Друюй вопрос, один из самых важных в эмбриоло] ин, cocioai в выяснении механизма де юрмипации клеюк и час «с й зародыша В основе эюю механизма лежи! ак!ивации lex v ш иных Iснов в разных клеи<ах, чю приводи! к возникновению iipocipanciBenno «^однородной кар!ипы экспрессии юиов ("узора"или uik называемою naiiepna) У дрозофилы дыерми ia-ция cei мен юв определяем положение нарасем мошпых, а не шменшых 1рапиц Образование napaceiмепюв предшесшуы формированию сечмешов па более поздних С1адиях развт !я В морфогенетическом поле се«мс1пации со минный пренаперн образую! полосы экспрессии «снов segment polanty (Lawieiice and Tolmston, 1989, Maitmez-Anas and Lawience, 1985, Inglum and Martinez-Anas, 1992, Жимулев, 2003)

Классическое обьмспеиие механизмов де1ерминации было предложено в 19G9 io;iy Л Вол-перюм, сформулировавшим icoprno позиционной информации (Wolpeit, 1969, Wolpeit, 1989) Couiacno эюй 1 сори и судьба клочки определяыся ее положением в определенном i «рос i panel витом поле зародыша, в коюром сущестуеч «раднечп копцеп«рации некой сш налы ой молекулы, называемой морфо!епом Счтывание информации о [радисте морфоюна и ее ин-юрпреищия приводя! к дифференциации клеюк в юм или ином направлении в зависимое in 01 уровня концешрации морфоюна

У дрозофилы нродук« ма1еринско1о координатою ivna bed являыся классическим примером морфоюна (Dnevci ami Nusslcm-Volhaid, 1988b, Dnevei and Nusskin-Volhaid, 198Sa, Epkiussi and St Johnston, 2004) Проведенные в последнее время юпетчсскис и 1еоре1ичс-ские исследования указываю! па ю, чю дейс!вие одною лишь морфо!ена Bed недосыючно для возникновения просфвнывепио неоодиородпой мрпшы экспрессии «ечюв в бласюдерме дрозофилы В нашей pa6oie исследована динамика позиционирования облаыей экспрессии юиов сс!мен1ации, и па основе полученных данных обсуждаыся адекватоеи» концеп «уал«»-ной модели Я Bojinepia для обьяспепия механизмов формирования ciimuhuoiu npenaiiepna в бласмодерме дрозофилы

Понимание принципов оришизации и фуикциопировапия морфо!ене1ичсскою ноля о i-мешации «ребусм дс1алыюю количесi вешки о описания динамики каждой из ею компоне и Несмофя па высокую разрешающую способное ib, мы од ДНК чипов 1ак же, как и многие дру| ис меюды количес пленной оценки экспрессии юпов (количес i венный PCR, CAT ahsa>s), имеег о[рапичеппое применение для решения эюй задачи Дело в юм, чю все эш меюды использую 1 юмоюпаил клеюк и, !аким образом, «еряю« информацию об экспрессии lenoB в iipocipaiiciBe Перспектвпым являе«ся испо шзование иммунофлуоресцешною маркирования биоло! ических макромолекул в сочеыиии с лазерной конфокальной микроскопией, кош-рая позволяем получай» качеывеппые цифровые изображения карпш экспрессии юной, юю-вые для извлечения количес« венных данных об экспрессии пуюм компыо1ерпой обрабо!кп

Очевидно, чю камееIво маicMaiическою моделирования зависи i oi качеыва экснериме и-«альпых ;;аппых Как были oimcmcho X Ктапо (Kitano, 2002) идеальный набор данных до «-жеп бы 11» исчерпывающим по ночною оцениваемых компопеш, измеряемых парамемров и по oxBaiy временной динамики, iочным в количе^ы ве ином оi ношении, а |акже cncicMaiическим Последнее означаем, чю способ получения данных разных шмон должен допускам» их <о-ыасовапную ишечрацию Хо!Я эт «ребовапия очечшдпы, в насюящее время лишь neMiioine набор]»] данных им удовле« воряю« и, поэюму, но «учение «акою набора данных по экспрессии юнов се« мешации имеем важное значение

Эффектвпое использование коли чес« вен ш»«х данных но экспрессии ichob сечмешации фебуы opi анизации набора данных в виде баз!»! данных, чюобеспечш эффектвпое хранение

и выборку информации, а мкже облеччш анализ данных, нацеленный на выявление новых биоло! ических закопомериооей изучаемою процесса и формулировку новых iiinoiej дчя их направленной проверки в эксперимен lax О i мс i им, ч ю по своей су i и 1акая база данных будс! npocipanel Belшо-временпим аыасом экспрессии i снов, поскольку она храни i kojhi'uciвенную информацию об экспрессии в разных ючках морфо! епечпческо! о поля и в разные момешы времени

1 2 Цели работы

Цели диссертационной рабоп>1 состяли н юм, чшбы

1 Разрабо!аи> новый копвеГкрпый мс юд количссiв<.иной оценки уровня эксирсссии ыав-пых компопет морфокмк тчсскот ноля сешешации у дрозофилы - генов сешсшации - на ocnoni изображений, полученных с помощью конфокальных микроскопов Эш1 Mi-iод должен нключагь сечмешацию изображений, удаление фоиовою сишала, опрсдсле-шк возрдсla эмбриона, npocipaiiciBOHiiyio peí псфацию карпш экспрессии и итерацию данных

2 Полуннь исчерпывающий но полною, ючпый в количес i венном ошоикмши и сиос-матческий набор колпчес i венных данных об экспрессии ichob сечмешации в каждом ядре каждою индивидуально! о эмбриона, а гакже эииюпиые, ииiciрированные данные об экспрессии каждою из 14 шюв симсшации в каждой облаои эмбриона в разные момен i ы Bpt мс ии,

3 Изучи и» динамику формирования облас!сй экспрессии юно» в морфокнепгкском поле симешации iiyicm оценки положения каждой облает в разные момешы времени,

4 Создан, MaieMaiическую модель механизмов рсмулмции экспрессии iciiob gap в цикче деления ядер 14А Примспиппь э í у модо и,,( чя /и sáuo [x коне i рукции a ni ichojí gap и выявления механизмов, обеспсчивающих сдвш и i рапиц обласюП экспрессии э1 их 11нов,

5 Для обк!чеиия pafioiu юорешков и биолоюв с данными создам, иросфапспкнпо-времепной aijiac экспрессии iciiob сешсшации в виде реляционной базы данных, до-ciynnofl веет Ilinepiiei

1 3 Объекты и методы исследования

Основным обьекюм иссчсдовапия являлись 1580 эмбрионов мух дикою шил (Oregoii-R), окрашенные метдом непрямою иммупофлуореецшinoiо маркирования для выявления белковых ирод\ kiob макринских коордшьи ных i енов birend (ЬЫ) и taudal (rati), i июп gap Kiupptl (Ki), bwips (hn), qiant (qt), huiLchbiuk (fib), failli ss (til) и lenoB раи-nile ( v<n-shpp(d (fix), ftrJi/-tnmzu (ftz), It au ij (It), umt (run), odd-shipptd (odd), slopi>t/-pan<d (sip) и pamd (pul) Примерно половина из эшх эмбрионов была ыкже прокрашена па i истцовые белки ;у|я подсвечивания обчас[сИ изображения, oí носящихся к ядрам 4490 изображений карпш экспрессии выше иеречисченных iciiob сечмешации у эмбрионов были получены в лаборашрии нроф Райпи-ца (Упиверсшо! Сюни Брук США) с помощью конфокальных микроскопов Leica TCS4D и Leica TS-SP2 Эш изображения имею! размер 1024 х 1024 пиксе ¡ей, для записи cm iiaih nci io чьзуе1ся восьмибитный форма! и пасфойки микроскопа, уменьшающие уровни, шума в peí исiрируемом сшиале, а ыкже процедура сканирования, позволяющая получить coi ла-еомаппые данные по экспрессии одною юна в индивидуальных эмбрионах, сканированных в разных эксперимен lax (Комиап et al , 1997, Kosmaii et al , 1998) Для сканирования выбирались эмбрионы разпою возрас1а, начиная с 10 цикча дробления ядер и кончая 1асфуляцией

Для извчечения количес! венных данных из изображений наряду с оршинальными методами, разрабо1апными i¡ данной рабою, использовали сыпдаршые мешды обрабо!кн изображений (Gonzalez and Woods, 2002)

Поскольку экспрессия i слон cei мен 1ации, i лавиым образом, являсчея функцией ноложе ния ядра вдоль мере дне-задней (А-Р) оси, ее распределение но юлу эмбриона досрочно хорошо можс1 бы i ь предсишлено » одном измерении Ввиду эюю, досрочным прсдсишлясюя анализ количсс1вспных данных из цешрллыюй 10% (но оси у) полоски, вырезанной в направлении А-Р, I с вдоль оси х Таким образом, каждому ядру соносишляеюя лишь ею х-координаы, и карпшы экспрессии имею! вид [рафиков, офажающих изменение экспрессии lenoii вдоль оси х Дчя описания облаоей одномерной каршны экспрессии leiioB иош и-¡<mani апирокеи-манию квадрантными сплайнами или 6i>icipoe избы i очной двоичное вейвлеч-преобразовапие с авюмашческим определением [ребусмою уровня декомпозиции карпшы экспрессии и визуальным кошрочем качеС1ва авюмашческою выделения признаков Для уменьшения раз-мсрнос i н in к юра признаков применяли факюрный анализ

Сдвш и облас^й экспрессин i с нов оценивали с помощью дисперсионно! о ашъииа Для выяснения механизмов взаимодейс! вин lenoii в сет ichob £,ар> а 1акже , i, i -а обьяспения механизмов сдвиюв облас1ей экспрессии этх (снов проводили ма1ема1Ическое моделирование, предсказанные peí уля юрпые взаимодейс i вия и i ипо1езы соиос1авляли с ли 1ера|уриыми данными и данными экснерименia Для создания нросфапспюнно-врсмепною аыаса экспрессии i нюп испол1>зовали реляционную СУБД IBM DB2, для реализации вэб-ин юрфейса i юл i.Jona i елм применяли 1акие icxiiojjoimm, как HTML, ISP, Java-сервле]ы, lava-aniuieibi и Iava-скришы

1 4 Научная новизна работы

В пасюящей рабою впервые

• разрабоиш конвейерный mol од получения количсс! венных данных по экспрессии шюв се1мен1ации из конфокальных изображений карпш экспрессии Э1их ichob Меюд вклю-4aei 5 процедур, а именно, cei меп 1ацию изображений, удаление фоиово! о сш пала, определение isojpacia эмбриона, npocipanciвенную речис1рацию каршп экспрессин и ише-фацию данных, коюрыс можно применят последоваюлыю и по 01делыюсш,

• получен полный, 10чный и сисюматческий набор количес! венных данных об экспрессии i спои cei метации в каждом ядре каждою из 1580 индивидуальных эмбрионов, а 1акже ип ici рировапные данные об экспрессии каждою из 14 юпов ссчмсчпации,

• показано, чю облает экспрессии кчюв симешации, локализованные в будущей зародышевой полоске, по мере своею формирования в цикле 14А смещаю 1ся к переднему полюсу эмбриона,

• предложена маюма!ическая модель для предсказания механизмов рефляции экспрессии нчюв gap в цикле 14А, правильно воспроизводящая временную динамику экспрессии этх [епов, dentin» перекрывания соседних ou л асi< it экспрессии, а [акже воспроизводящая сдвши [рапиц облас1ей экспрессии ichob gap в ходе цикла 14А,

• исслсуювапы механизмы сдвшов цешральпой облает экспрессии Kl, а 1акже í.i,uinx облас1ей экспрессии km и f/t но направлению к переднему концу эмбриона,

• создай просгранс1вепно-времеппой auiac экспрессии íenoB cei мешации в виде реляционной базы данных FlyEx, дос[у|Шой по сеш Iiiiiepnei

1 5 Основные положения, выносимые на защиту

1 Компыокрпая обрабо!ка цифровых изображений карши экспрессии iciiob, помученных с помощью копфокальпою микроскопа и иммупофлуоресце и i hoi о маркирования биоло-шческих макромолскуч, можем бы п. использована для получения количос i венных данных по экспрессии нчюн in situ

2 Количес! lit нпое описание ирос ipanci ве ппо-врсме мной динамики компопеш морфо! е пе-шчсскою но ш сечметации пеобхе» iiimo ,(ля понимания механизмов но фупкциопиро-вапия

3 Сдвит об lacicíi экспречгепи юноп сечмечпации важны для позиционирования областей экспрсссии HiioB-miiiiiciicií и ш раю i важную роль в формировании cci muí nioi о мрс-naii ерна

4 Макрипскис 1спы bril tad и iсны gap Ki, hni, i/t, lib, til не юлько необходимы, по и досытчпы для правильной экспрессии iciioh gap в будущей зародышевой полоске

5 Позиционная информация в бласюдерме дрозофичы задае1ся динамически меняющейся по времени комбинацией конципрациП продуктв мак1ринских и зшишческих icno» В каж м>Ш момеш времени э|а комбинация определяс1ея не ючько макриискими морфо-ю11 ши, по и спинами ipainiH o6jiacicí1 экспрессии iciiob eel мен lamín ю-ja речучятр-пых г,и i\<:i luui Эш юлковапие подразумевав i акнтный, а не пассивный способ шперпр< |ац!Ш ipa-uieiпа морфо1 сил и размьшае ¡ ipai/пцу между формированием к ип-lepupe |ацией полщиопной информации

1 6 Практическое значение работы

На\ чно-нрам ическая значимое м> рлбшм cocioiu в юм, чю в пей впервые pajpa6oian и успешно применен мемод конвейерной обрабо[ки каршн экспрессии нчюв сс1мешации с целью по-|учення копгюспнчщых данных по экспрессии iciioit Muí од был успешно адашировап для обрабо!ки данных по экспрессии ichob симечпацни п<1 уровне мРНК (Jaiissens et al , 200G), для обрабо1ки ошиче'ских срезов изображении карши экспрессии к пои в ядрах эмбриона дрозофилы, а ыкже дчя маекпровапия экспрессирующих облас[сй и получения количесшеп-ных данных по экспрессии iciiob в раппем развиши коралла Afiopota jnilUpojíi и морскою апемопа N( mafo^tt Ua vtrtnisrs (Ko/Iov et al 2007) Все эю позвочяе i сшит, разрабоишпый ме юд важным ипс1румепюм извлечения количесшеппой информации из изображений каршн экспрессии i сноп Oimcmjm [акже, чт о силу угпшерсалыюеш большпнета процедур разрабоишпый мс юд можем с небольшими модификациями примепя п.ся дчя обрабо!ки широко! о спекфа бночо! ических изображений и, ыким образом предС1авчяе1 шперсс для широкою кру| а ученых в облает мочекулярпой биолопш

В качечлвс о цюй из процедур коивейерио! о меюда предложен новый меюд определения позрасм.г эмбриона в цикле развишя 11Л, основанный па анализе динамичных каршн экспрсссии lena (ш, окрашенною v всех эмбрионов, и с|аидарiнзации эшх каршн экспрессии ошосшечыш üojpacia эмбриона, определенною в эксперимент Э101 меюд позволяем ли-юмашзпровап, проце'дуру нргчека-¡амия возрасы, делае i ненужным фудосмкос опре'дслеline возрас!а эксперимешальпым iivkm и, 1аким образом, являеюя важным усовершенствованием ме юда оире челепня возрасм эмбриона дрозофилы в раннем эмбрио! еиезе

Кочичесикнныс данные по экспрессии iciiob coi меи ыции, полученные в данной pa6oic, уникальны но oxBaiy временной динамики, ючны, имею! кчеючпое разрешение и получе-iii.i в pejyn.iaie снс 1 ема 1 ичеекпх и маспмабпых эксперимеп юв, проводимых в одной лабо-раюрии и с испо п.зованием о цтх и icx же сишдарiизоваппых мечодо» Эга особенность

сделала полученные д-шпые исключи к лыю восфебованными мировым сообш,сс!вом, исио п,-зующим их как в юорсшчсских исследованиях, 1ак и для изучения механизмов cei менищии, см например, Holloway et al, 2003, Pel сани and Haitenstcm, 2004, Diambia and da Costa, 2005, Aegeitct-Wiliiisen et al , 2005, Isalan et al , 2005, Ludwig et al , 2005, Holloway it al , 200G, Kiislma et al , 2005, Ochoa-Espmosa et al , 2005, Peikms et al, 200G, Yucel and Small, 200G, Zinzen and Papatsenko, 2007, Beigmann et al , 2007

Созданный нрос1ранс1вспно-временной аглас экспрессии iciiob сетешацип FlyEx яв |я-е 1ся о1крьиым ресурсом, широко используемым мировым сообщеспюм биочоюв и биоипфор-машков Так например, в 2000 юду общее количеспю обращений к FlyEx сос мнило более 2GOOOO

В раио! с ИССЛСЛУ-1 Cii 11С 11! [ылыгми нопрос эиирио.кл пи - механизмы дс ирмпилцни kJltlOK и чаС1ей зародыша в морфо1епс1ических полях Помимо эюю, выполненные исследования имею 1 важное значение для лучшею понимания медицинских аспекюв р<ивитя, а совокупное п> разрабомпных меюдов и моделей формируем в конечном иioie, меюдоло! ическую базу для реконс1рукции юнпой сечи оркшизма нри oicyiciBiui или oiраничениом использовании Myiai енеза

1 7 Апробация работы

Резулыа1ы диссермциопной рабои>1 были доложены на конференциях Computational Cell Biology Woikshop [CSHL 2007| (Cold Spiing Haiboi, USA, 2007), Сапк1-Пе1ербур1СКой международной конференции по нанобиошхноло!ни, пленарный доклад, (Сапк1-Пекрбур|, 200(>), 3 Woikshop on Data Integiation foi the Life Sciences |DILS200G| (Hinxton, UK), 1, 3, 4 и 5 Intel national Confeiuicc on Bioinfoimatics of Genoine Regulation and Stiuctnie |BGRS'1998, 2002, 2004, 200G|, в 2006 г - приглашенный доклад (Новосибирск, 1998, 2002, 2004 и 200G), 3 и 4 TICSP Woikshop on Computational Systems Biology, приглашенные доклады (Tampcie, Finland, 2005 и 200G), 2, 3 и 4 International Symposium on Netwoiks ш BiomfoimatK s, в 2005 и 2006 г г - приглашенные доклады, |ISNB 2005, 200G, 2007| (Amsteidain, tlie Netlieilands, 2005, 200G и 2007), NETTAB 2005 woikshop, Woikfiows management new abilities foi the biological mfonnation oveiflow (Naples, Italy, 2005), 2d Integiativc Bioinfoimatics Woikshop, приглашенный доклад, (Bielefeld, Geimany, 2005), 42, 44, 45 и 46 Annual Drosoplula Reseaicli Confeiences, (Washington DC, San Diego, Washington DC и Chicago, USA, 2001, 2003, 2004 и 2005), Intl Moscow Confeiuicc on Computational Moleeulai Biology (Moscow, Russia, 2003), 7, 10 и 11 Int Coufeience on Intelligent Systems foi Molecular Biology |ISMB99 ISMB02, ISMB03|, в 1999 г - премия SGI за лучший доклад на конференции, (Heidelbeig, Geimany, 1999, Edmonton, Canada, 2002, Bnsbane, Austialia, 2003), Computation in Cells EPSRC Emeiging Computing Paiadignis Woikshop, приглашенный доклад, (Heitfoidslme, UK, 2000) и l д

С использованием ма|ериалов диссертации аыором еде iano 2 npiii лашеппых доклада в Lawicnce Beikeley National Laboiatoiy, USA (2002 и 200G и ), доклад на Московском ciми-наре но биоииформа! ике (200G), прш лашенные доклады в 2003 i в Genetics Depaitmeit, Cambridge University (UK) и в Bioinfoimatics Reseaich Centre Univeisity of Glasgow (UK), нри-uiaintiiHbie доклады в 2005 i па Bioinfoimatics Colloquium, Gioig-August-EJniveisitat Gottmgen (Gennany) и на Watcnnan Semmais, the Leibniz Institute of Plant Genetics and Ciop Plant Reseaich (IPK, Geimany), прш лашенпый доклад в Lauience H Bakei Center foi Bioinfoimatics and Biological Statistics Seminal Senes, Iowa Univeisity, USA (2001), а 1акже 2 пршлашеппых лекции па the Lis Houclies Siinnnei School "Multiple Aspects of DNA and RNA fiom biophysics to bioinfoimatics"(2004) Также сделаны 3 пршлашеппых доклада на семинарах Dagstuhl Gd Dagstuhl Senimai foi Infoi illation and Simulation Systems for the Analysis of Gene Regulation and Metabolic Pathways (2001), Dagstuhl Seminal 04281 "Integiativc Bioinfoimatics - Aspects of the Vntual Cell (2004), Dagbtuhl Seminal 03051, "Infoiillation and Process Integiation A Life

Science Peispictivt "(2003) и mhoi их друшх семинарах Сделан !акже доклад па семинаре, opi авизованном фнрмоП Leica, "Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в бноло! ии"(СанК1-Пс1србур1, 200G)

Кроме mío pejyjibiaibi работ обсуждались lia Сапк1-Пе1ербур1СКом семинаре по компьютерной биоло! ии, на семинарах кафедр эмбриочо! ии и кчкмики CaiiKi-FleiepGypiCKoio io-сударс1венно1 о упиверешеча и были включены в лекцию на Международной школе-семинаре BGRS "Эволюция, сисюмная биоло! ия и суперкомпыоюрпые вычисления в биоинформаш-ке"в 2005 i (Новосибирск, Россия)

1 8 Публикации

По макршыам диссерищии опубликовано 45 научных pa6oi (все в соавюрсте), в юм числе 23 cían.и в реферируемых научных журналах

2 Структура диссертационной работы

Днссер|ация сосюш hj введения, 7 1лав, выводов и библиофафии (229 наименования) Ее полный обьем сос[авляе[ 1G5 сфапиц, количеспю рисунков 44

2 1 Содержание работы

Во Введении е^ьяспяююя акпалыюсп» и не тш рабом»!, ее научная новизна, пракшческая значимое!i> Сформулированы положения, выносимые назащщу Приведена информация об апробации pa6oii>i, количеств н\бликацпй атора, описана cipyKiypa диссерыции

Первая глава "Современные представления о детерминации сегментов у дрозофилы" являечея обзором ликра|уры

У дрозофичы морфоло! ичсски различимые i раницы eel мен юв формир\ Ю1СЯ i (Дыздо нозд-ik'e íoi о времени, koi да происходи i дсчермипация cei мен юв Формированию i раниц cei мен юв предшес!в\е| кра[ковремепиое появление i рапиц параси ме шов, коюрые возникаю! вовремя удлинения зародышевой полоски посередине каждо!о будуще!о ceiMcnia (Campos-Oitega anel Haltenstein, 1985) Дскрмппация ceiMcinoB приводи! к определению положения [раниц napacei мен юв (Maitmtz-Ana> anel Lawrence, 1985) и происходи i в морфо! сие шчсском ноле, преде мвчяющем собою на С1адии сипци i иалыюй бласюдермы и в цикле делении ядер 14А iy час1ь эмбриона, из ко юрой рл. юсье кя зародышевая полоска (Gilbert, 2003)

Раппий Э1ап развшия дрозофилы включае! оадию дроб юния и сипци iиальпую бласю-дефму С|адия сипци i иалмюй бласюдермы продолжасюя с цикла деления ядер 10 по цикл деления 13 В эю время ядра, лил рировавшие па периферию, образую! упорядоченный слой эпер| ид (эпершда- ядро, ассоциированное с ynaciKOM циюплазмы), прилсыющий к поверх-нос|и эмбриона Цикч деления ядер 14 - пе'рвый цикл последующей С1адии, называемой кле-ючной G 1асюдермой Часп» цикла 14, иредикс1вую1цая 1ас1руляции, называс1Ся цикчом деления 14А Во время i uncía 14А ядра удлиняю i ся вдоль собс! не ппой 6а. илыю-дпик.ип.поп осп и, вскоре после эю1 о, начипаечея iniBai ппация мембрап, коюрая обособляе i ячра в о i дельные KjieiKH Важно, чю вилок. до ночною образования клеючпой мембраны каждая формирующаяся кле iка сообщае 1Ся с ниже расположенным жел|ком посредспюм циюплазматческих каналов Эю де. iae i |юзможпым обмен белками между соседними эпер! идами в ючепие всей сыдии сиици шальной бласюдермы и цикла деления 14А

Главные физические компонены морфо!снснгкскою ноля се1мен[ации суп> кпы ccimcii-1ДЩ1И - идещифицировапы, к юпироваиы (Akam, 1987, Ingham, 1988) и подразделены па че-n.ipe фуины MaiepiiiiCKiie коирдшьи пые ¡сны (NnvJun-Volliaid et al , 1987) экспрсссируююя ма í ерппским к номом и влиякл па развимк переднею, заднею или юрмипальных районов

эмбриона Гены Apyi их i руин gap, pan-iule и lient. polanty являю1ся зиюшческимп, i e экспрессирукмся iciiomüm эмбриона (Nusslem-Volliaid and Wicschaus, 1980)

Билыиниспю маюрннских координа! пых И ЗИЮГИЧССКИХ ICIIOB шмеимцин кодирую! фапскрипционные факюры, коюрые рс1улирукм экспрессию зиюшческих ичюв cu mi 11 а-ции Таким образом, i епы cei ме и 1ации образую! сечьвзаимодейстующих дру| сдруюм iciiois-pu ул я i opoii A11 ал 11 j фе I ю i ilium двойных MyianioB выявил иерархию ре|улятрных взапмо-дсйС1вий в эюй юнной coin (см обзоры Акаш 1987, Iupjiam, 1988), is cooiiiciciiiiui с коюрой юны более высоких уровней (например, мак'рипскис коордипашьгс юны) ре1улирую! Ю'ны более низких уровней (например, юны gap), а по naoGopoi Помимо эюю выявлены суще-С1КС1ШЫС peí уля юрмыс взаимодейепшя между i снами, принадлежащими к одному уровню иерархии

Во второй главе "Материал и методы" приведена информация об е>бьек1е и меюдах исследования

В третьей главе "Метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации" paccMoipcn оршииальпый меюд, а 1акже лежащие в основе нею алтршмы, разрабоынные для количестепной оценки уровня экспрессии юнов се1ме|пации па основе изе>бражепий, полученных с помощью копфокалыю! о микроскопа Предложенный меюд е<б-рабо1ки являемся конвейерным и включаем 5 базовых процедур ceiменкщию изображений, удаление фоповою сшнала, определение возраС1а эмбриона, npocipanciBeiniyio poi ис i рацию KapiHii экспрессии и miiciрацию данных Описана ючнос1ь каждой из разрабо1анных npoi е-ДУР

Резул i> i a i ы предоавлопы вс1лп,ях A3, А5, АО, А8, А9, А15, A1G, А17, А19, А20, А21, А22, А25, А29, А31, АЗС, А38, А40, А42, А43, А45

Ci¿мчшищия июб/тшпшп нключае! чечыре эыпа (1) приведепни экснеримеп1алыюю изображения к скшдарпюй ориешации, 1ак чюбы нередпий конец эмбриона находился слева, а спинная часп> сверху, (2) выделение облает, занимаемой обьекюм па изображении, и 01сечепие иусюй облает по краям, (3) нос i роение "ядерной маски "эмбриона, ю есп> бинар-|юю изображения, в коюром юлько пиксели в 1раницах ядер имею! ненулевую ишепсив-посп>, (4) вычисление координа! цен i рондо» ядер и средней ни ichchbiioc i и флуоресценции в каждом ядре для каждою канала микроскопа, i е для каждою продуюа сканированною юна Среднюю итенсивпосп, флуоресценции счшаем пропорциональной уровню экспрессии юпа (Kosman et al , 1997)

3ian приведения изображения в С1апдаршую ориетацию пачинаеюя с посфоепия одпо ю изображения па основе усреднения двух ошических срезов для каждою из ipex юппнх про;1укюв, peí исфируемых у одною эмбриона Для изображений, прокрашенных па 1исю-повые белки, используемые в качес1ве ядерных маркеров, ил основе Э1их двух срезов eipoi м пиксельный максимум Дале-е для каждою эмбриона создаем |рубую маску nyieM консфу-ировдния лоиикселыю! о максимально] о изображения из чеилрох изображений, полученных в разных каналах микроскопа, и применения к эюму изображению пороювот и медианных филыров, а 1акжс нескольких циклов эрозии и дила!ации (Gonzalez and Woods, 2002) Маска эмбриона иснользуе1ся ;|дя вычисления ywia, на котрый надо noiiepnyib эмбрион, и для удаления случайных пикселей на ipanimax

На в юром Э1апе сфошся ыадкая маска эмбриона, коюрая вючпост иовюряем еюфор-му Для эюю создаем повое изображение пиксечыют максимума па основе предвари юлыю HOBcpiiyibix и обрезанных изображений и к почученпому изображению применяем носледз-Baiejibiio r.bi]),i.p.initi-uiiH i ис loi рамм!>1, медианный и нороювый филыры К полученному б i-нарному изображению применяем фапсформацию эвклидова раесюяпия, медианный и нороювый филыры, ню приводи i к созданию маски с операциями, более соотемовующими на1уральпым кошурам эмбриона С помощью алюртма Шена-Касlana (Slien and Castan, 1980), заполнения и эрозии получаем новую имдкую маску всею эмбриона и используем се

для обрезания изображений, помученных по всех каналах микроскопа

На [речьем и 4t 11stрiом этапах строится так называемая ядерная маска па. основе изображения, прократеипото lia i исюповые белки если оно имеется, ичи же па основе пикссль-пото максимума экспрессии трех остальных тепов Сначала для уси тения контраста и уточнении транпц ядер применяем локальное iтырапшшанне i ncioi раммы, удалят;м iранулировапный шум ал1орнтмом Криммипса и проводим несколько цт1к тов медттаппой фнлырации Далее, после iniiH.piировання значении всех пикселей создается изображение водораздела Обласп> водораздела определяс 1ся к<ж 1сррнтрия, запятая одним ядром и oi рапичепиая линией шириной в одип пиксс п, Каждая облаем, водораздеча харак1ернз\е1ея уникальным значением 1радании серою цве1а В peïyjn.iaie применения эрозии и пороювою филыра это изображение Iipeобраз\сIся is бинарное, тде |раницы водораздела имею! значение 0 Посче умножения эюю бинарною изображения па изображение пиксечыюю максимума или изображение i и-еюновых белком каждое ядро отделяется oi сосе (них ячер |рапицей из нулевых пиксе'лсй 9ia операция позвочяем раздечшь некоторые ядра, считппиеся на изображении В заверше1-ппе эрозия с последующим преобразованием рассюяпия (Vincent et al, 1997) и иоротовым филт,тром TT03IÏO 1ЯЮ1 удалип, из маски посторонние пяша, не являютциеся ядрами эмбриона По 1учеппая бинарная маска используется дчя извчечения количесiвенпых данных об экспрессии lenoB Координаты цептроича каждою ядра вычисляются с помощью ипвариап юв ме>мептов (Hit, 19G2) Наложеппе маски па изображения, тюлучеппые в каждом канале микроскопа, потволяем вттчиечттп cpevuine концетттрапии продукюв всех сканированных тенов в каждом ядре

Конечный результат нре'дс ывляет собой [аблицу, содержащую (х,у) координаты каждою ядра и нроцетпах от длины и ширины эмбриона, а |акже усредненную интенсивность флуоресценции, или относительный уровень экспрессии дчя каждою из сканированных у данною эмбриона кпов Разработанная нроце'дура извлечения количественной информации из биоло-I иче-ских изображений реализована в орит иналытом пакете PioStack (PiocessniR of Stacks) для визуальною посфоепия сложных процедур обработки данных н изобр<1жепиП

Качество построения ядерной маски обычно копiротируемся визуально путем ее паложе*-иия па изображение, полученное при сканировании тистопов ичи па пиксе чьпый максимум изображений, полученных в друт их каналах микроскопа Для автоматизации нами нредюжеп численный ме юд контроля качества ядерной маекп, осповаппый на том, что рл.lopoo ин тепсив-посте'й дчя пнксе'лей внутри я ¡ра Д'ЫЖ'еп бык, меньше, чем ыковой между пикселями внутри ядра и вне еч о

yàiLiKHHi фонового пинаю Хорошо извесшо, что наряду со специфическим окрашиванием, методы иммупофчуоресцеп т пот о маркирования биоло| ических образцов ш situ приводят к появлению неспецифическою сш нала, называемою фоном Возникновение эюю сит пала вызвано MHOI ими факюрами, из которых важная роль принадлежит первичным и вторичным антителам Неспецифиче1ский фон може 1 быть убран вручную для каж ют о конкретною счайда пукм установки значения оффеема Однако, очевидно, чю просюй усьпювкой офф-сема невозможно добиться удаления фона из всех картин экспрессии всех теном ввиду тою, что для каждой картины требуются свои установки для удаления фона

Очевидно, что даже незначительный уровень фона исказит численное значение уровня экспрессии lena Более mio, уровень фона варьируем от эмбриона к эмбриону и от эксперимента к эксперименту, что не позволяс! провеет сравнение данных, полученных в разных экспериме п lax

Разработанный нами метод удаления фоповою cm lui^ia осповап па наблюдении, что уровень флуоресценции в пуль-муiaiiiax, окрашенных lia oicyicinyioinnii белок, хорошо аппроксимируется двумерным нарабочоидом (или, is более общем случае, вынукчой поверхпоеппо вюрою порядка) Этот параболоид очень близок к симметричному ошоситечыю осей х и у Основная идея мемода удаления фона cocioin в опре\делсшш неэкпрессирующих облаС1ей эм-

Ориона, коюрые используются для аппроксимации фоном)!о сшпала, ч[обы за!ем удали п, ею масштабированием карпшы экспрессии

Неэкспрессирующие облает - учас1ки эмбриона, и коюрых данный ieii не экснрессируе1ся и болЕаиинсгпе ядер - для каждою ина первоначально онределяююя па основе пца1елыюю визуальною изучения карпш экспрессии во всех эмбрионах 3aieM неэкспрессирующие облает уючняююя на двумерной карпше экспрессии каждою эмбриона При эюм, в си iy искривления полос экспрессии вдоль оси у, их необходимо вынряыип,

Фоновый сишал аинроксимируе1ся квадрантным параболоидом но опорным ючкам, выделенным из пеэкспрессирующих обласкй эмбриона с выпрямленными но юсами Процедура применятся последовательно ко всем изображениям картп экспрессии, полученным у одпо-ю эмбриона Большие неэкспрессирующие облает слешем разбиваю на несколько облаоен с несущес1венпой вариацией фопа Опорными iочками счшаклся ючки, в коюрых уровень ин-leiiCHBiiocin флуоресценции на превышаем заданною пороювою значения, примерно равною 2/3 разброса значений экспрессии в облает

Параболоид S(x,y) = ацх2 + CV22?/2 + cvi2xy+aix + a2?/ + oo аппроксимирующий фон, cipo-И1ся при помощи ик'рапняюй он iимизациоиной процедуры Окончаюльпо фон удаляеюя ,и всею эмбриона линейным оюбражением шпепсивност, коюрос преобразуем значения флуоресценции равные или меньше уровня фона в ноль, а максимально возможную флуоресценцию (205) саму в себя Преобразование имеем вид

В резулыаю получаем нормированную каршпу экспрессии, в ко юрой каждое ядро харакю1-ризуеюя вскюром = {хг,у,,а^}, г = 1, N

Важно подчеркну п>, чю маснпабнрованис нормализованных нн юпсивпосюй в диапазоне |0,255| необходимо в силу зависимое i и фона ог выбора первичных и вюричиых апппел и оюугемвия еакой зависимост у уровня экспрессии гена

Процедура удаления фона из широких карнш экспрессии юпов hb и (ad, а 1акже icikjb paii-mle на ранних С1адиях даее лучший резулыа! при допущении снммефичнос!и по оси х начальною приближения параболоида Ген h(d. мредс[авл яе i собой специальный случай, поскольку для нею задняя I раница экспрессии не определена Хорошо извес1 по, чю копцешр i-ция белка Bcel распределена по экспоненциальному I радиану с максимумом в ан криорнем конце и досинасм фоново! о уровня в посюриорной феей эмбриона (Driever anel Nusslei i-Volhaiel, 1988b, Dnevei anel Nusslein-Volhaiel, 1988a) Мы нормируем карпту экспрессии bed добиваясь экспоненциальноеги нормированной карпшы

Под1верждеиие обосновашюсю предложенною мел ода удаления фоповою сш нала можно получигь иуюм визуальной инспекции карпш экспрессии Слабым мссюм визуальной оценьн являеюя неявное предположение о юм, чю пи один из iciiob сечмешации не име'ее равноме]> но низкою уровня экспрессии в районах, лежащих вне npocipanei вешю органиченных ofu i-сюй экспрессии Однако, при анализе данных, полученных при окрашивании одною и юю же белка разными первичными и вюричпыми анпиелами, сыновшся очевидно, чю [руппы ашисывороюк разно!о качеова даю! одни и ю же lipocipaiiciBeniio opiаииченные облает экспрессии, но разные уровни фопа Более юю, мемод удаления фоновот сш нала был пца-юлыю кстрован па му1апшых эмбрионах, юмозиюшых но пуль-му1ацни в каком-либо из ichob (и<, gt, km или Кт и окрашенных для выявления npo;iyKia Myiaiimoio iena Картны экспрессии у |аких мукшюв после удаления фопа фансформирукмся в пулевой урова ь экспрессии во всем эмбрионе

Визуальная оценка карти экспрессии показывасI, чю м(. iо,I удал< ния фопа даем хорошие резулыапл для эмбрионов, oiносящихся к циклу 14А Типичные резулыапл удаления фона

Рис. 1: Результаты удаления фона нз индивидуальных картин экспрессии ряда генов. За исключением случаев, когда, цикл деления ядер указан, все остальные картины экспрессии получены в эмбрионах, принадлежащих циклу 14А. Ненормализованные картины экспрессии изображены белыми кружками; картины экспрессии после удаления фонового сигнала показаны черными кружками; параболоид, аппроксимирующий фон, изображен сплошной линией.

из картин экспрессии bal. hb. Кг. c.vc., rua и h tía этой стадии приведены на рис. 1. Дли картин экспрессии генов gap и pair-rule на ранних стадиях точность метода значительно ниже. В циклах деления 10 12 картины экспрессии этих генов характеризуются очень низким уровнем интенсивности флуоресценции, присутствующей прак тически во всех частях эмбриона. На рис. 1 приведены типичные картины экспрессии <:vc и Aro в цикле 12 и результат удаления фона. Ин терпретация таких картин неоднозначна: возможно, что весь сигнал обусловлен неспецифической флуоресценцией и зиготическая экспрессия генов отсутствует.

Опрсдглптс. в/ыраптп. :)мв]Уш~та. Поскольку окрашивание и сканирование эмбрионов осуществлялось без учета их возраста., необходимы специальные методы для определения времени ггпя. В силу того, что циклы делений с 10 по 13 являются непродолжительными по времени. для определения возраста эмбриона на этом промежутке времени достаточен подсчет количества ядер. Однако, цикл деления 14А занимает около 50 минут и, поэтому простой подсчет количества ядер недостаточен. Предложенный для решения этой задачи экспериментальный метод требует использования одного из каналов микроскопа для получения изображений мембран. Он основан па измерении степени инвагинации мембраны у фиксированных эмбрионов и использовании стандартной кривой, описывающей временную динамику инвагинации мембран in vivo, для определения возраста, эмбриона (Merrill et al.. 1988).

Мы разработали новый метод определения возраста эмбриона в цикле деления ядер L4A, основанный па анализе высоко динамичных картин экспрессии гена еж, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возрасти эмбриона, определенного в эксперименте. Этот метод позволяет автоматизировать процедуру предсказания возраста, исключает трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, значительно улучшает метод определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.

В качестве первого шага в разработке метода все эмбрионы, принадлежащие циклу деления 14А. были распределены путем визуального анализа картин экспрессии cve. по восьми

временным классам Поскольку эмбрионы были сканированы без yneia их возрасiа, разумно предположи п> равномерное распределение возрасiа в выборке эмбрионов, принадлежащих циклу 14А Так как все восемь временных классов содержа! примерно одинаковое количсci во эмбрионов и цикл деления 14А занимай! около 50 мину! развшия, можно счшаи», чю каждый класс но длшелыюсж cooiBciciByei примерно G 5 мипу!ам Классификация эмбрионов, основанная на анализе динамики кар i и и экспрессии юна ( tu, хороню coi л асу с юя со с клип ю hiibai ипацни мембран

Для предсказании iKUpacia эмбриона но каршне экспрессии иснол1>зовапо обобщение л е-юдаБУМ (Suppoit Vectoi шасЬше) на случай peí рессиопио! о оценивания (Vapink, 1995, Smula and Scholkopf, 1998) Меюд предсказания возрасiа включаем три siana (1) формирование обучающей выборки эмбрионов, каждый элемслп ко юрой хАрак1еризуе1ся набором хараккрппх признаков, описывающих каршну экспрессии, и экспериментально определенным возрас юм, (2) иосфоошю peí рессионпой функции но обучающей выборке, (3) предсказание возрас!а д !я эмбрионов не включенных в обучающую выборку и не имеющих экспериментальных длит ix ociciienu инвашнации мембраны

В качес!вс обучающей выборки была использована ipyinia из 103 эмбрионов, принадлежащих временным классам 3-8 Каждый эмбрион обучающей выборки быч охараюеризовап мпо! омерным век юром, компонетами ко юрою являю (Си возрасi эмбриона и 13 парамефов, равных эксфемумам экспрессии юна tut Возрас! был определен nyicM измерения cieiienn инващ ипации мембран на дорсальной сюроне каждою из эмбрионов и использования ciaii-даршой кривой (MliiiU et al , 1988)

Малый размер обучающей выборки (103 эмбриона) но сравнению с размером век юра признаков (13) може i повлечь педосюверпое нредсказание и oic> ici вис усюйчивосш при изменении парамефов алюршмл Для уменьшения размерност век юра признаков был использован факюрпый анализ После применения флкюрною анализа к выборке из 501 эмбриона, оии-сящихся к циклу 14А, была получена совокупноеп> из 13 новых факюров Важно, чю для 103 эмбрионов обучающей выборки, первые два факюра имею! зиачшельную корреляцию с воз-расюм, 92% и 25% cooiboicibchho Эю позволило надежно предсказывап» возрас!, учиплвая в век юре nepi ючько первые фи факюра, и увеличили скоросп» сходимосш

В резулыаю подбора парамефов, дающих наилучшее совпадение рефессионпой функции с эксперимеп i альными дапш>1ми, было усыновлено, чю модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром в юрою порядка лучше всею оиласукися сданными

Резульииы оценки ючпоС1и предсказания возрас! а., осущссiв^юнной iiyieM последовакл hoi о исключении одно! о эмбриона из обучающей выборки и испочьзования ос iавишхея эмбрионов в качестве рабочей выборки для предсказания возраста исключенною эмбриона, показа-ш, чюобе модели имею! примерно одинаковую ючпоси» в случае испил 1>зоваиия в век юре чер! од hoi о, двух или ipex факюров Ошибка предсказании возрас!а сос1авлие i около дв>х мину! разшпия Эю хороший резулыал, если приняи» во внимание, чю возрас! эмбрионов в обучающей выборке паходшея в пределах oí 20 до 50 мину! с начала цикла деления 14А Таким образом, для аккураиюю предсказания возрА-cia эмбрионов, не включенных в обучающую выборку, ДОС1АЮЧНО юлько ipex факюров Чюбы провеС!и различие между моделями, примем во внимание, чю расчеп»! в задаче со скалярным ядром сходшся i ораздо быс ipee (па-пример, для ipex факюров за 59 шерации прошв 197) и, следоваюлыю, скалярная модерн» оказываемся более предпоч i тельной

Модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром в юрою порядка были испо н>-зовапы для предсказания возрас!а 398 эмбрионов, не принадлежащих обучающей выборке, причем век юр признаков был cociaBjieii из ipex факюров Предсказанные возраст хорошо коррелировали с классификацией эмбрионов по временным классам

Р( гш mjHu^iiH партии ж< п]н с( au sdtoa ( < г ш итации Использованные для получения данных конфокальные микроскопы позволило i получай» у одною эмбриона картпы экспрессии

ючько ipex юной Нас же niuepocyei просфлпспилшо-вре'меппая динамика, экспрессии всех кчюв, коп филирующих формирование upeiiai icpna cei мои ыции В силу индивидуальной ва-рнабелмюеш размеров эмбрионов, информацию об опюсиюлмюм расположении клршп экспрессии рлзиых [епов eí npocipancine невозможно получи и» просплм совмещением кар i пи экспрессии v индивидуальных эмбрионов, окрашенных анпнелами к разным белкам Чюбы репнпь Э1у задачу, данные, полученные для индивидуальных эмбрионов, должны бьпь приведены к общей сисюмс координа! с помощыо процедуры peine фации

В данной работе был разрабоыи меюд речисфации, основанный на видечепии кош рольных ючек в изображении и па преобразовании коордшьи для максимально hojihoiо совмещения Э1 их ючек в разных изображениях (Biown, 1902) В качечм ве коп фольпых ючек обычно иепользмо! какие-либо хараккрные признаки изображений Поскольку в пашем исследовании все эмбрионы были сканированы для выявления экспрессии i еиа ( а< и кар unía экспрессии эю1 о i еиа си чыю меняемся во времени, в качес i ве кон фольпых юче к hciюл 1>зовали харакир-пые признаки эюй карпшы - эксфемумы одномерной каргииы экспрессии, полученной nyiem экс!ракции данных из 10% цечпральпой полосы эмбриона

Peí исфация изображений производи 1ся посредс1Вом маенпабирования двумерных каршп экспрессии вдоль оси абсцисс с помощыо аффинного преобразования, минимизирующею суммарное расстояние между аг-коордшшами всех эксфемумов па разных каршнах и средним положением соопк 1С1вующих эксфемумов но всем peí исфируемым изображениям Число эксфемумов парьируе1 в зависимое in oí класса В качес ibc функционала качес та использована ме Ерика, основанная на вычислении эвклидова расстяпия

Точное п> реч ист рации оценивший! но величине сишдартых о i клонен и й положений эксфе-мумои о\ среднею значения юкализации сехижмсп>ующею эксфемума у эмбрионов одною и юю же временною класса Точное и, метда peine фации выше у эмбрионов из поздних временных классов и \ ме иынае 1ся oí цеп фа эмбриона к периферии У эмбрионов временно! о класса 8 ючиенмь peí hci рации в цетральпой 10% полосе паходшея в пре\делах 0 22 0 47% В дру| их учас! ках эмбриона Э1 и значения колеблю!Ся oí 0 29 до 4 42% и во miioi их случаях бываюс меньше 1% Поскольку диамеф одною ядра в цен ipe эмбриона ириблизи ¡елыю равен 1% длины эмбриона (ДЭ), а па периферии примерно в 1 5 раза больше, полученные значения свидскльс1в>Ю1 о высокой ЮЧПОС1И рсj исфацни

Kant труироаатк ттк ррироваииы i картин ib(iip(((uu saioa (( sah нтациа Главной целью нросфанС1веппой речисфации и удаления фона являйся носфоение карпя взаимною расположения обласкай экспрессии всех ичюв ccj медиации ,чля мпожес1ва эмбрионов одинаковою возрас!а Области экспрессии каждою íena на Kapie буду! представлены своей "эиг-лоппой' или "пширировлппой" кар i иной экспрессии, ко юрам харак юризуе 1ся средними для всею временною класса значениями шпоисчнпост флуоресценции Идеальная нитрированная кар i и на экспрессии дапио! о юна мое ла бы 6i>i i ь nocipoeEia в i иною in ческой си 1>ации, ко1да все эмбрионы имели бы одинаковую ядерную cipyKiypy, i е сосюяли бы из мпожеста ядер с одинаковыми jijiя всех эмбрионов коордипа!ами В »аком случае средние ишенсиниос1и фл>оресцепцип моми 6i»i 6e>eei> вычисчепы независимо в каждом ядре Однако, на самом деле количечмво и положение ядер в разных эмбрионах, а Еакжс плопюси» распредечения ядер виуфи каждою индивидуальною эмбриона пспосюяпиы Поэюму должна бьпь вычислена усредненная ядерная с t рук i ура кар i ним экспрессии, учи i ывающая э т особенное! и Э ia задача ре ше па п\ км определения просфаис i венной hjioi nocí и распределения ядер, ч ю позволило вычисчип» среднее значение дпамечра ядра в каждой ючке \средпспною эмбриона

Копеip\ ированне двумерных пиiei рироваппых Kapiии экспрессии мы ныиолпили, используя реч исфпроваиные данные, и для эмбрионов каждо! о временно! о класс<1 Дчя эюю каждому ядру каждою и пчи виду ал ыюю эмбриона с ывил и в cooibcmcibhc ядро усредненной ядерной Сф>К1уры кармшы экспрессии имеющее паибо ice близкие координа1ы, нос ie чею вычисля-j i и среднюю ин i е пси внос i ь флуоресценции но всем индивидуальным ядрам, ошесепным к

данному сродному ядру.

Интегрированная картина экспрессии

gt, Кг, eve

Рис. 2: Атлас экспрессии генов во временном классе 8. а. Интегрированные картины экспрессии (/t, Кг и eve; 6.картина экспрессии тех же генов у индивидуального эмбриона того же класса; в. интегрированная картина экспрессии Kr, km и yt в виртуальном эмбрионе.

Пример интегрированной двумерной картины экспрессии генов су¿, Кг и cve. у эмбрионов восьмого временного класса представлен па рис. 2а. Сравнение этой картины с картиной экспрессии тех же генов у индивидуального эмбриона класса 8 (рис. 26) покалывает, что интегрированная картина в целом правильно передает основные особенности экспрессии индивидуальных генов, включая форму и размер областей экспрессии. Представленная на этом же рисунке картина экспрессии генов Ki\ kni и gt (рис. 2в) интересна тем, что среди использованных в данной работе эмбрионов по было эмбрионов, одновременно окрашенных для выявления экспрессии этих генов. Картируя интегрированные картины экспрессии на усредненную ядерную структуру, теперь можно создавать так называемые "виртуальные эмбриоиы"с новыми комбинациями генов для визуализации взаимного расположения их областей экспрессии.

Для конструирования одномерных интегрированных картин экспрессии гонов сегментации координаты ядер каждой отрегистрироваппой одномерной картины экспрессии группировались вдоль оси х по R интервалам. Затем внутри каждого интервала вычислялось среднее значение интенсивности флуоресценции но всем эмбрионам данного временного класса. Число R выбиралось из тех соображений, что в цен тральной части эмбриона диаметр одного ядра составляет примерно 1% от его длины, и, следовательно, R должно быть равно 100 для тот, чтобы правильно смоделировать ядерную структуру картины экспрессии. Одномерные интегрированные картины экспрессии материнских генов во временном классе 3, генов gap и генов pair-rule во временном классе 8 изображены на рис. 3.

Разработанные нами методы были применены для получения количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1581) индивидуальных эмбрионов (рис. 4 и рис. 5), а также эталонных, интернированных данных об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени. Полученные данные имеют разрешение по пространству в одно ядро и разрешение по времени около 6.5 минут развития.

В четвертой главе "Динамическая природа позиционной информации" обсуждаются механизмы формирования сегментного препатторпа в бластодерме дрозофилы в свете

новых, полученных нами данных о динамике формирования областей экспрессии генов сегментации. Эти результаты представлены в статьях Al, А2, АН). АЗО, АЗЗ.

Рис. 3: Одномерные интегрированные карт инь» экспрессии материнских генов во временном классе 3 (а), генов gap (б) и генов pair-rule (в,г) во временном классе 8

Согласно классической теории, предложенной в 19G9 году Л.Волпертом (Wolpert, I960; Wolpert, 1989), судьба клетки определяется ее положением в определенном пространственном ноле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеиом. Считывание информации о градиенте морфогепа и ее интерпретация приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогепа. В соответствии с повой, уточненной концепцией, для классификации молекулы ii качестве морфогепа (Wolpert, 1989; Gunion and Bourillot, 2001) должно выполняться несколько условий: морфоген должен быть распределен по пространству в форме постепенно меняющегося градиента, перемещаться и действовать па больших расстояниях, а также исключительно и не посредстве пни обуславливать зависящую от порога индукцию по крайней мере двух разных состояний экспрессии генов в клетках-мишенях.

Важно, что уточненная концепция морфогена и понятно позиционной информации основаны на четком разграничении между формированием и интерпретацией позиционной информации. В основу этих концепций заложена статическая система координат, налагаемая па абсолютно пассивную ткапь-мишеиь в каждый момент развития после достижения градиентом стационарного состояния. Результаты анализа динамики формирования областей экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, демонстрируют абсолютную неадекватность такой концептуальной модели для описания механизмов формирования паттерна в бластодерме дрозофилы.

Материнские гены

т1 т7

Гены gap

Рис. 4: Картины экспрессии материнских генов и генов gap в начале (временной класс 1 (Т1)) и конце (временные классы 7 или 8 (Т7 или Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временною класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуальною эмбриона.

Для изучения динамики формирования областей экспрессии генов в морфогепотическом поле сегментации каждая область была охарактеризована небольшим числом характерных признаков (см. раздел 1.3). В качестве таких признаков выбирали положения максимумов экспрессии, а также ж-координаты точек, в которых уровень экспрессии достигал некого порогового значения, например 50% от максимального уровня.

Мы установили, что большинство областей экспрессии генов сегментации статистически значимо меняют свое положение по мере формирования. Особенно велики сдвиги центральной области экспрессии Кг, а также задних областей экспрессии (jt, kni и lib (рис. 4). Эти области сдвигаются от заднего конца эмбриона к переднему. Так например, задние границы областей экспрессии Кг, gt и hit смещаются примерно на 5, С и 15 ядер соответственно (табл. 1) 2.

диаметр ядер, расположенных вдоль центральной i (средне; $ад пей оси, приблизительно равен 1% ДЭ

Гены pair-rule

ПЕ m г 2 ииим ■ m

eve ftz h гип odd

ИД m m ш UIP »

eve ftz h ТЗ Т8 пт ГЗ odd ТВ

ES 11 Ид и ".....ft. Wx I

Рис. 5: Картины экспрессии гонов pair-rule 15 начале (временной класс 1 (XI)) и конце (временной класс 8 (Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временного класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуального эмбриона.

Таблица 1: Сдвиги областей экспрессии генов gap во времени.

Область gt aiit hb ant

Признак А (141) пик 2 (on пик 3 (145) Гр (144) Р (173)

Интервал 1 8 5 8 1 8 1 8 1 8

Сдвиг -1.43 * 0.64 * -5.53 0.06 * -0.88

Область Кг cent kni post gt post hb post

Признак А (261) Р (261) А (134) Р (134) А (137) Р (137) А (130) Р (136)

Интервал 1 8 1 8 1 8 1 8 1 8 1 8 3 8 3 8

Сдвиг 1.02 5.23 1.6 6.32 6.38 15.21 2.02 4.1

Для каждой области экспрессии приведены величины сдвигов неродной (А) и чадной (Р) границ. Для неродной области экспрессии gt приведены также сдвиги положения пиков области экспрессии '2 (па том интервале, где она существует) и области экспрессии 3 (рис. 4). Сдвиги положительны, если движение областей экспрессии происходит от .чадного копну к переднему, сдвиги в обратном направлении имеют отрицательные значения. Интервалы времени исчисляются во временных классах. Для каждой области экспрессии в скобках указан объем выборки эмбрионов, использованной для вычисления сдвига. Звездочкой отмочены сдвиги, но являющиеся статистически значимыми, "ant", "cení "и "post." обозначены области экспрессии, расположенные в передней, центральной и задней частях эмбриона соответственно.

Границы передней области экспрессии гена gt (рис. 4) не сдвигаются, и эта область не сужается со временем. Однако, во временном классе 4 у левой границы этой области начинает формироваться новая область (пик 2). Образование повой области сопровождается

сдвшом "роди ючьской обласп!"(пик 3) на ним» ядер в направлении, про!ивоположпом движению ос 1альных обласкай экспрессии ichob gap, ie к заднему концу эмбриона (ia6 i 1) В иигервале с исрио!о но восьмой временной классы крушзиа задней 1раницы передней o6!ii-с 1 и экспрессии ЬЬ увеличиваемся В указанном шмервале времени Э1а 1раница сдвшае1ся в направлении к заднему концу эмбриона ириблизи 1слыю па 0 9 ядер, однако сама передняя облаем» экспрессии hb не меняем своею положения (1абл 1)

Болыпинспю обласюй экспрессии ichob pair-iule юже изменяю! свое положение в ходе цикла 14А и с1а1ис!ически значимо смещаююя к переднему полюсу эмбриона (мбл 2) За исключением h и odd полоса 1 кчюв ран-mie либо не двшаемся, либо сдвигаемся очень незн i-чи 1слыю Почоса 1 h сдвш аемся по направлению к заднему концу, а полоса 1 odd - к переднему, причем последний сдвш коррелируй с образованием полосы 2 Наиболее значи юльпые сдвш и обнаружены для полос 7 см, h и ntn, причем Э1а полоса у чн смещаемся примерно па пяи> ядер

Таблица 2 Сдвш и обласюй экспрессии имюв pan-iule во времени

ген / область 1 2 3 4 5 в 7

< m (N G54) в к сдвиг 3 8 0 47 3 8 1 94 3 8 1 97 3 8 3 44 4 8 3 21 4 8 2 62 3 8 5 26

ftz (N 158) в к сдвиг 3 8 0 20 * 3 8 1 27 3 8 1 72 4 8 1 86 3-8 2 27 4 8 3 84 5 8 1 01 *

h (N 105) в к сдвиг 3 8 -2 18 3 8 1 54 3 8 3 61 4 8 1 11 4 8 2 61 4 8 3 25 4 8 3 82

odd (N 85) в к сдвиг 3 8 2 41 4 8 1 13 * 3 8 2 98 5 8 0 92 3 8 3 65 3 8 2 66 _

run (N G5) в к сдвиг 3 8 0 20 * 4 8 1 66 3 8 2 81 5 8 2 56 3 8 1 57 3 8 3 41 5 8 3 61

В камсе пк харак ирных признаков м< пользовано максимальное значение ипки-с и внос i и флуоре с це нции it каждой полосе Пром<жу1ки времени, иш коюрых вы ч ис лс мы < цзши, начинаю! с я с момииа появления полосы и и< чис ляюк я во времешн IX к laeeax (и к ) Об мм выборки N приведен дли кажде» о i с на Сдвш и д ш полое ы 7 odd не приводя и я, нос кольку она формирус к я в е амом конце цикла 14А Сдвш и положи и Л1 пы, если днижс пи( об iac и Й происходи i oi заднею концу к не рс 'нк м\, едвши в обра i ном направлении имекн oipimaie льиые значения Зве i J >ке)й о i ме чс hi i < циш и, ш яилшощт с я е iai ис i и к е ки значим! ши

Анализ сдвш ов обласюй экспрессии ieiia (о( у 120 эмбрионов, у коюрых ючиый возрао был определен пуюм измерения cienenn пива! ипации мембран и использования сыидартой кривой (Meiiill et al , 1988), показал, чю в ходе цикла 14А полосы rw сд!Ш1аю!ся к переднему полюсу эмбриона непрерывно, хо!я скороем, д|Н1жеиия полос 5 и С менее равномерна чем 1аковая у полосы 7

Движение не крайних, распо южеипых впуфи карат экспрессии полос iснов рап-ш1е, чаще всею коррелируем с образованием повой обласш экспрессии Так например, полоса 1 odd сдвш аллея очень сильно во временных классах с 3 по 5, ко!да oi ее задней 1рапицы о г почковывас!Ся полоса 2 Сходным образом, обр<иование полосы 7 odd во временных классах 5-7 сопровождаемся сначала сужением полосы G в итервале между временными классами G и 7, за коюрым слс/iyei сильный сдвш пикаэюй полехы во временных классах 7-8

Поскольку недавно было продемопсфировапо движение ядер в бласюдерме эмбриона (Keianen et al, 200G), а !акже вследсшие юю, чю болыиипсию iснов сечметации кодирую! фаискрнпциоппые факюры, предегавляегся важш»1м произвест оценку вклада Mopcjxucnc-

тических движений ядер в сдвиги областей экспрессии этих генов. С этой целью у живых эмбрионов оцепили на дорсальной и вентральной сторонах сдвиги трех ядер, положение которых примерно совпадает с местом формирования головной бороздки (с!) (ядро 31), с положением максимума полосы 3 /» в момент ее образования во временном классе 3 (ядро 51) и с положением задней границы центральной области экспрессии Кг во временном классе 1 (ядро 02).

с/( Длины 'ЭмОрион;»

Рис. в: Движение ядер in vivo в сравнении со сдвигами областей экспрессии. Панели (а), (б), и (в) - соответствующие указанным моментам времени кадры фильма, демонстрирующего дорсальную сторону живого эмбриона, (г) - одномерные графики картин экспрессии run и h во временных классах 3 и 8. Овалами, нарисованными пунктирной линией, в (в) обозначены положения задней границы Кг и полосы 3 Ii во временном классе 8. Сходные результаты были получены па дорсальной и вентральной сторонах 15 эмбрионов, (г) показано, что положения максимума полосы 3 Ii и минимума межполосного промежутка 2/3 run сдвигаются относительно друг друга i? интервале между временными классами 3 и 8.

Оказалось (рис.0), что в ходе цикла 14А ядра 51 и 62 сдвигаются к переднему концу эмбриона на расстояние, соо тветствующее половине диаметра ядра. Дальнейшие доказательства того, что обнаруженные в данной работе сдвиги областей экспрессии не обусловлены движением ядер, можно получить, рассмотрев поведение межполосного промежутка 2/3 гена run и полосы 3 h. В конце цикла 14А, во временном классе 8, картины экспрессии этих генов строго комплементарны и, следовательно максимум экспрессии h и минимум экспрессии run

локализуются в одном мссiс (ядре) Однако как с тедуеч из рисунка G на ранних стадиях эюю цикла межнолосиый иромежуюк 2/3 лт и почоса 3 h локализуются в разных местах эмбриона Таким образом, в ходе цикла 14А межпочосный промежуток 2/3 tun и полоса 3 Л сдвитатотся относительно дру1 друта Очевидно, что это явление не может быть обусловлено движением ядер

Э ттт фак т ы, а также данные об асимметричном расположении областей локализации мРНК тспов сечмешации относительно областей локализации соответствующих бе жов (см пятую главу), свицстел1>с1вуют о том, что сдвити обчастей эксттрессии и будущей зародышевой полоске являются следствием риуляции акгивпост ienoi> и не обусловлены движением ядер Эти сдви1 и по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии icitob pan-iub (3 5 ядер) и, следовательно, очень важны для позиционирования областей экспрессии тепов-митпепей и для формирования сет менnioiо препат терна

Важно, что в противоположность ядрам, расположенным в будущей зародышевой полоске, ядро 31, расположенное в mccic формирования толовпой бороздки, сдпшается к заднем" концу эмбриона примерно на расстояние равное 2 ядрам (рис б) Это1 сдвит совпадает inj направлению и сопоставим по величине с размерами сдвшов областей экспрессии тепов ссч-мешации, локализованных в юловном 01деле эмбриона (см рис 4 и рис 5) Таким образом, не исключено что сдвити обчастей экспрессии leiion сетмсптацшт в толовпом отделе мотут бьпь обусловлены движением ядер

Как известно, градиент Bed был первт>тм морфотенсIическим традиентом, который уда лост> увиден, непосредственно в экспериметтie (Dnever and Nusslem-Volhard, 1988b, Drieve-and Nussleiu-Volhard, 1988a) Однако, следует отменив, чю помимо Bed в бластодерме дро зофилы сутцесгвус1 второй материнский iрадист Н1>, и чю определение положения трапиц облас той экспрессии тенов-миптепей происходит в результате синерте1 ическот о взаимодейст вия эIих двух Iрадистов (Dncvci and Nusslcin-Volliaid, 1988b, Simpson-Blow et al , 1994, Rennt* et al , 1995) Кроме loio, It нашей работе показано, что концентрация морфокна Bed непостоянна и сильно меняется во времени, а облает экспрессии тепов gap и pan-rule являющихся мишенями действия материнских ¡радистов, меняюi свое почожение по мере развитя Все это озиачае т, что позиционную информацию в бляеюдерме дрозофилы не тьзя рассмагривать как некое носюяппое, заданное концентрацией морфот сна нозицпоппое число Наоборот, дан ные о движении еэбластей экспрессии iеиов-мишепей свидетельствуют о том, что позиционная информация не является статичной, а постоянно и бысфо меняется Как показано в пятой итавс диссертации (см ниже), сдвити и уточнение траииц экспрессии ichob gap происходят за счет взаимной регуляции этих ichob и не зависят oi действия материнских 1радисщоь и диффузии продуктов тепов gap между ядрами Материнские градиенты и юпы gap сов место определяют положение i рапиц экспрессии iснов paii-mle, коюрые тоже сдвитаю1ся по мерс разви i ия Разумно предположи i ь, ч ю 1акие сдвш и вчияю! на положение полос экснрес сии тепов segment polanty и, icm самым, на положение нарасеч меншых трапиц (Ingham and Mai tmez-Alias, 1992)

В CReie всею выше ск.иаппою, позиционную информацию в бластодерме дрозофилы с те-дует рассматривать как динамически меняющуюся во времени комбинацию концентраций продуктов материнских и зигошческих тенов В каждый момеш времени Э1а комбинация определяется не тлько материнскими морфо! снам и, но и сдвш ами i рапиц областей экспрессии i снов eel мсигации в результате ретуляюриых взаимодействий Эта фактовка нодразумевае! акптв-пый способ ишерпрегации i радиста морфотепа тт размываем ipaminy между формированием и ишерпрсмацией позиционной тшформации

Пятая глава "Регуляторные взаимодействия в сети генов gap" посвящена результатам математическою моделирования механизмов рету тяции экспрессии тепов gap в цикле 14А Для доказательства существования в эмбрионе дрозофичы предсказанных pel утя юр-пых механизмов использованы известные из литературы данные Исследован также механизм

обеспечивающий едшпи фаниц иблас left экспрессии ichob дар

Эю1 маириад изложен и рабоых А4, А10, All, А18, А24, А28, А34, А37, А41, А44 Моделируемся экспрессия iciiob и ссш, включающей 1ены Ы<1, г ad, lib, /\7, '//. km, и til, /1ля чею используемся мемод iiajiiaiiiü.iit мемодом [еппых ceieft (gene ciicmts) и впервые предложенный в (M)olsness et al , 1991, Rciuitz et al , 1995) В модели рассма[риваемся поведение сисюмы в цепочке яде'р, расположенной вдоль це'н фат,ной оси эмбриона и направлении А Р и заключенной в ишервале между коордипаыми, равными 35% и 92% ДЭ Поведение ядер во времени моделируем с помощью ipex последовательных процессов ишерфаза, миюз и деление Миюз оишчаемся oí ишерфазы юлько oicyiciBiic'M сшпеза белка Деление ядра являемся дискрешым во времени

Bnyipeiniee сосюяпне г-ю ядра определяеюя набором копцешрацпй г>° фапскрипциои-пых факюров, кодируемых кпами сечмешации с индексами а Изменение копцешрацпй во времени dv^jdt зависш oí vni íenciiBiioc i и грех процессов, происходящих и к'чепии ишерфазы сшпеза , диффузии и распада белка, преде 1авлепных суммой слаыемых в правой част следующею нелинейною дискрешот уравнения реакцни-диффузин

= Иа9 (Zb=i таЧ + + h")

+D°(n) [(„,<■_, - <) + K+1 - <)] (2)

-AX.

1де а = 1, ,N it N число зиеотческих ]енов в модели

Величины ТаЬ в (2) предс|а»ляю1 мафицу коэффициепюв ре!уляюрных взаимодейсiвий и харакюризую! peí уля юрпое дейС1 ние продук ia i сил b на экспрессию i епа a u®cd описывает коп цен i рацию морфо! епа Bed в ядре г Peí у 1яция белком Bed ак! ивпое i и i епа а описьшас1ся nap<iMeipoM ma Параме ф ha харакюризуе! ре|улнюрный вклад дру| их маюрипских факюров фапскрипции, равномерно распределенных в бласюдерме эмбриона О [ постельная ипleiiciiBiiocib сиикза онисывае 1ся с помощью ешмоидной функции рефляции экспрессии g(ua) = \ [(V/vV)2 + l) + . 'Де ua = J^ÍLi Т"ЧЬ + "iavfci + ha ecu, суммарный вклад ре!уляюров в экспрессию lena а Максимальная ииleiicuBiiocib сшпеза продукт lena а обозначена через R" Парамеф Аа ecu, скоросп, распада нродук|а lena а и соопюапсн с периодом полураспада данною белка по формуле rjy2 = hi2/A° Коэффициеш диффузии Da(n) обрапю пропорционален квадра1у рассюяпия между соседними ядрами

Копцетрации белков, обусловленные материнской экспрессией ichob hb и aid ("маюрнн-скне фадиешы"), использую1Ся как начальные условия ;|ля уравнений в цикле 13 Значения всех парамемров находя!ся iiyieM нодюпки решения модели к экспсримеп [альным данным по экспрессии в 9 носледоваюльных момешах времени - цикле 13 и 8 временных классах цикла 14А, i е решаемся обращая задача маюматчечжою моделирования Минимизируемся функционал качеС1ва, равный сумме квадраюв разпосюй между эксперимсп ыльными данными и резульииами расчема по модели

Е = J2 WW-nodel - <(í)datJ2 + EpenaUy, (3)

|де ['-'penalty - ппрафпая функция Суммирование прово инея но всем имеющимся данным Л',/, ю ecu,, ни всем измеренным концеп фациям белка для всех кнов а, всех ядер г и всех временных кчассов í Для нахождения парамефов модели иснол1>зовалась параллельна» версия сюхастческою меюда опшмизации - меюда численною о!жша Лама (PLSA) Эю1 меюд подробно описан в Mctiopolis et al , 1953, Knkpatiick et al, 1983, Lam and Delosme, 1988a, Lam and Delosme, 1988b, Renntz et al , 1995, Clin, 2001 Так как PLSA hmcci сюхасшческую природу, а функционал качсова имее1 мною локальных минимумов, ю ошимальиые значения парамефов, найденные в резулыаю нескольких проходов алюршма, Moiyi о1личап,ся

даже при сходных значениях функционала. В пашей работе каждый численный эксперимент заключался в нахождении GG параметров для системы из 348 дифференциальных уравнений, а один цикл работы алгоритма занимал па кластере из 10 процессоров Intel Xeon 2.4GHz от 8 до 160 часов в зависимости от начального приближения.

В результате расчетов было отобрано 10 сетей, картины экспрессии в которых находились в хорошем соответствии с данными. Распределение различных коэффициентов матрицы рс-гуляторпых взаимодействий в сетях по одинаково, по для большинства параметров устойчива тенденция к определенному типу регуляторпого взаимодействия.

На рис. 7 приведены данные о характере взаимодействия материнских генов и генов gap. Видно, что гены bed, и cad в основном активируют гены gap, а активность hb, km, gt., Кг регулируется по принципу автоактивации. Гены gap либо не взаимодействуют, либо репрессируют ДР.У1' друга. Исключением является действие Gt па hb. Наиболее сильная взаимная репрессия наблюдается между парами генов gt и Кг, а также между lib и кпг, причем области активности этих генов по перекрываются. Продукт терминального гена gap til репрессирует все другие гены gap, кроме hb.

а bed cad hit Kr J' kili III

№ 0/0/10 0/0/10 0/0/10 nn«. 0/2/8 lo/o/o Uiiii

Кг 0/0/10 0/0/10 9/1/(1 0/0/10 10/0/0 9/1/(1 10/0/0

SI 0/0/10 0/0/10 9/0/ 1 10/0/0 0/3/7 !.--.« 10/0/0

kni 3/0/7 0/0/10 10/0/0 6/4/0 9/Ш 0/0/1« №/W0

Рис. 7: Распределение коэффициентов матрицы регуляториых взаимодействий, а. Классификация параметров по типу взаимодействия. Строки - гены-мишени о, столбцы - гены-регуляторы Ь (см. уравнение (2)). Значения параметров Т и m < —0.005 классифицировались как репрессия регулятором b действия гепа-мишени а, значения в интервале от -0.005 до 0.005 классифицировались как отсутствие взаимодействия, а значения параметров > 0.005 классифицировались как активация. Числа соответствуют числу сетей, в которых данное значение Iпараметра означает репрессию/отсутствие взаимодействия/активагш ю соответственiю. Обычным шрифтом выделены взаимодействия, классифицированные в большинстве сетей как активация, курсив означает отсутствие взаимодействия, жирный шрифтом отмечены взаимодействия, классифицированные как репрессия, б -д. Графики разброса, значений параметров m и Т при регуляции экспрессии Кг (б), кпг (в), gt (г) и hb (д).

Помимо анализа матрицы регуляторных взаимодействий. с цслыо выявления специфических регуляторпых взаимодействий, обуславливающих формирование границ областей экспрессии генов-мишеней, был проколем графический анализ комбинированного вклада разных регуляторов (Tabv\ и rnavfcd) в регуляцию гена-мишени.

Графический анализ показал, что Вес! вносит весомый вклад в активацию передних областей активности <jt и hb. а также цеи'тралыюй области экспрессии Кг. Cad оказывает активирующее действие па экспрессию hid и //£ в задней половине эмбриона. Более того, Cad вноси т относительно большой вклад в активацию Кг в центральной области эмбриона, а также в ак тивацию экспрессии hb в передней половине эмбриона па ранних стадиях развития.

Взаимно репрессирующие взаимодействия генов gap локализованы в пространстве. Напомним, что Кг и <jt имеют непересекающиеся области экспрессии в бластодерме (рис. 3, 8а). Во всех сетях Gt репрессирует Кг (рис. 7а,б). Это взаимодействие определяет положение как передней, так и задней границ области активности Кг в цикле 14А (рис. 8в). Области активности hb и кпг пересекаются с областью активности Кг (рис. 3, рис. 86). В большинстве сетей НЬ и Kiii репрессируют Кг, однако эти воздействия являются более слабыми, чем действие Gt (рис. 7а,б). Kni участвует в определении положения задней границы центральной области активности Кг, а НЬ - передней.

40 50 60 70 Позиция на Д-Р оси (%)

40 50 60 70 80 Позиция на Д-Р оси (%)

Рис. 8: Анализ действия реирессоров. определяющих положение границ области экспрессии Кг. (а п б) Решения уравнений модели в позднем цикле 14А. (в и г) Профили репрессии для Кг в позднем цикле 14А. Суммарный вклад регуляторов и г показан сплошной черной линией как функция положения вдоль продольной оси эмбриона в процентах. Закрашенные области показывают индивидуальный вклад регуляторов. Горизонтальные пунктирные линии ограничивают уровни регуляции, ниже которых экспрессия меньше 1()%(нижпяя линия) и, выше которого больше 90% (верхняя линия) от максимального уровня. Вертикальные пунктирные линии ограничивают области па продольной оси, где иа ниже 10% уровня активности. Стрелка в в указывает на незначительный уровень дерепрессии Кг в отсутствии С^ Звездочки в г показывают насколько сдвинется граница области экспрессии Кг в отсутствии НЬ и Кш.

Результаты графического анализа комбинированного вклада разных регуляторов в регуляцию остальных генов gap (lib, кпг и gt) хорошо согласуются с результатами анализа коэффициентов матрицы регуляторпых взаимодействий (рис. 7).

Таким образом, нами обнаружено пять базовых регуляторпых механизмов, обеспечиваю-

щнх взаимное расположение областей экспрессии генов gap в эмбрионе (рис. 9):

• активации экспрессии генов gap под действием Вес! и Cad, распространяющаяся па широкие области эмбриона:

• автоактивация генов gap:

• сильная репрессия по принципу обратной связи между генами gap с неперекрывающимися областями экспрессии:

• асимметричная репрессия между генами gap, чьи области экспрессии перекрываются

• репрессия по принципу прямой связи экспрессии генов gap в задней части эмбриона под действием терминального гена til.

Рис. 9: Схематическое предс тавление топографии сети генов gap. Области экспрессии генов hb, kni, сit, Кг и til показаны в виде прямоугольников. Передняя часть эмбриона слева. Схема, основана па данных, представленных па рисунке 7а, причем показаны только те взаимодействия, которые наблюдались в 9 сетях gap из 1(1. Репрессия между генами показана в виде соединительных линий с усиками. Цвет фона обозначает области, испытывающие активирующее действие белков Bed (томно-серый) и Cad (светло-серый).

Анализ результатов численного моделирования динамики экспрессии генов gap позволяет выявить регуляторпые механизмы, обуславливающие сдвиги границ областей экспрессии этих генов. Отметим, что численное моделирование является в настоящее время единственно доступным способом решения этой проблемы в силу невозможности изучения се генетическими методами, поскольку мутанты, у которых такие сдвиги отсутствуют, пока не получены.

Решение модельной задачи, соответствующее найденным оптимальным значениям параметров, с высокой точностью воспроизводит сдвиги областей экспрессии гонов gap в будущей зародышевой полоске эмбриона. Более того, исследование поведения модели показало, что синтез белка происходит исключительно в передней половине каждой из исследуемых областей (центральной области экспрессии Кг, областей экспрессии kni и gt в задней половине эмбриона), тогда как is задней части областей экспрессии преобладает процесс распада соответствующих белков. Синтез белка в передней части и распад белка в задней части каждой из областей, действуя совместно, сдвигают эти области но направлению к переднему полюсу эмбриона.

Гипотеза об асимметричном расположении зон синтеза белка по отношению к областям экспрессии, сформулированная па основании моделирования, была под тверждена эксперимен-

сильными меюдами Было нокам.по, ч ю в цикле 14А облает распределения концомфаций мРНК Kr, кги и qt не симмечрично лок<1лизованы ошоси icvn.iio облаыей распределения коп-циираций соошыывующнх б(.лков и сдвипупл oiiiocniejn.no последних но направлению к переднему к<>/мly эмбриона Более 1010, обласш распределения копией i рации мРНК Э1их i с-hoií 1ак же, как ti обчаыи распределения копцеи I раций белка, смещаю i ся в ходе цикла 14А к переднему полюсу эмбриона

Решение уравнений модели 6ej диффузии (с нулевыми значениями iiapaMeipa Da), cooi-выстующес найденным ошимальпым значениям парамечров, военроилюдиi во времени и npocipaiic ine сдвш и об час i ей экспрессии Таким образом, диффузия не оказывлы cym.ec i ве п-ною влияния па сдвш и обчасюй экспрессии нчюв gap

Для обьясненмя механизмов едпш а облаыей экспрессии Кг, km и qt быч проведем фафи-ческий анализ рсчуляции экспрессии этх iciiob в облает сдвша и в нрилечаюших облаынх Оказалось, то у цеп фалыюй облает экспрессии Кг и задних облаыей экспрессии c/í и km сдвш задних фапиц происходи! и резулыаю асиммыричных peíуляюрпых взаимодейывий между Ki и кги, кш и qt, qt и hb (рис 9) Передние |рапицы этх облаыей экспрессии т-же двшаю[ся всчедстие смещения задних фаниц соседних облас[ей экспрессии iciiob gap, расположенных ближе к переднему полюсу эмбриона, либо в резулыаю ют, чю фаниц|,[ облас!сй экспрессии qt и lib в передней част эмбриона сишовяюя менее поло! ими Таким образом, сдвш и передних фаниц облас1сй экспрессии можно рассмафивап, как втричное явление, происходящее' из-за динамически! о поведения задних гршиц

Шестая глава "Создание атласа экспрессии генов сегментации во времени и пространстве" посвящена описанию ci рук [уры и функциональных возможности лишл экспрессии ¡снов ещмешации но времени и нросфанстс, FlyEx (littp //nielan spbcasiu, http //flyex anís sunysl) edu/flyex)

Маюриал нзчожеп » наших С1ап,ях А7, А12, АХЗ, А14, А23, A2G, А27, А32, А35, А39 FlyEx - реляционная база данных, созданная на основе СУБД IBM DB2, ноЛ1>зова1ельский ишерфейс кошрой связан с базой данных с помощью WWW-ссрвсра, Apache Tomcat и lava-серверов приложений Из последних, наибольший iiniepec нредыавляы сервер изображений Эю1 сервер разрабокш дчя обрабо!ки изображений карпш экспрессии [спив Он позволны выполни ib [акие операции как обьедипепие двух или ipex изображений в серой шкале в одно цвешое миожеывенное изображение, [операцию разпоспюю изображения между двумя изображениями, маскирование одною изображения дру! им, обеспечивае! кадрирование изображения, филырацшо ИН1С11СИВПОСШ флуоресценции и усиление Konipacia

На середину 2007 i FlyEx содержи! информацию о 1580 эмбрионах и 4490 картнах экспрессии 14 [ опии eel мешации Для каждою эмбриона храпи 1СЯ ядерная маска, все эмбрионы ошося1ся к циклам деления с 10 по 14А, общее число записей ;|ля наборов количестеппых данных соыавляы около 9 5 млн , для усредненных данных около 270 1ысяч FlyEx (акжо храши коэффициент peí исфации и нормализации, используемые дам иосфоепин "на ле1у" реч ис1рироваппых данных и данных с удаленным фоновым сш налом Для каждою мы ода реч исфации и каждою эмбриона, принадлежащею к временным классам 2 8 цикла деления ядер 14А, храшпея по 2 коэффициент peí исфации По G коэффициенши нормализации храпи i ся дчя каждо! о i спа в каждом эмбрионе Ип ici рироваппые да.| 11i i.ie нос ipoeni>i для каждо! о временною класса, по юлько для lex i енов, коюрые сканированы в более чем 9 эмбрионах Наполнение базы данных FlyEx нродочжаыся

Основная цель базы данных FlyEx cocioiii в о ты ах па запросы пользова1елсй о динамике формирования области экспрессии iciiob сететации Формы запросов раздеча "Анализ дапиых"обсС1Ючива!01 доыуп к различным операциям над изображениями и количестемными данными по экспрессии iciiob Эш операции позволяю! пользователю получаи» информацию о взаимном расположении облаыей экспрессии iciiob сеч мапации в различные временные мо-мешы, качесте данных но экспрессии i chois, динамике формирования обласюй экспрессии, о

с юнец и вариабельности экспрессии i сна » разных участках icjia эмбриона и н разные момеш i.i времени

FlyEx - 01кр|>пыН ресурс, широко исночьзусмый мировым сообшеством биолотв (см pas-дел "Практическое значение работы") Для облеч чеиия работы с данными, хранимыми ю FlyEx, предусмотрена возможность выгрузки любых обьемов данных по запросу пользователя

В седьмой главе "Заключение Анализ ранее разработанных и новых методов и моделей" проведен сравнительный анализ ранее использованных и разработанных в данной работе методов получения данных по экспрессии тепов сегментации и MaieMaiттчсских моделей детерминации сетмептов и процесса сет мен тации, а также количественных данных по экспрессии теттов сегментации с данными, полученными другими коллективами исследован -лей Подведены итоги диссертационной работы

Работу завершают Выводы

3 Выводы

1 Разработан орш тшалыгый конвейерный метод кочичественной оценки уровня экспрессии тепов сегментации па основе изображений, полученных с помощью копфокальпо!о микроскопа Этот метод включает такие процедуры как cciмептациго изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную peí ист рацию картин экспрессии и ип reí рацию данных

2 Показано, чю возраст эмбриона и цикле деления ядер 14А может быть предсказан с ЮЧ1ЮС1ЫО до 2 минут развития на основании анализа высоко динамичной картины эке-прессии тепа ívcii-sktpptd

3 Получен полный, ючттыГт и систематический набор количественных данных об экспрессии ICIIOB сет мен тации в каждом ядре каждою из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также ип тет рироваппые данные об экспрессии каждою из 14 тепов сетмсптацин Итерированные данные имеют пространственное разрешение в одно ядро и разрешение пи времени и 15 минут развития для цикла 13 и около G 5 мину i развития для цикла 14А

4 Показано, ч m области экспрессии т с нов сет мен тации, чокализоваппые в будущей зародышевой почоске, по мере своею формирования в цикле 14А смещаются к переднему нолю-су эмбриона Сдвит и областей экспрессии по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии тсиов pair-iule Смещения ядер в эюм районе эмбриона зпачи1с>лыю меньше, чем сдвит и областей экспрессии

5 Разработана математическая модель, коюрая правильно восироизвочи т временную динамику экспрессии (снов сеч мешации, размер перекрывания областей экспрессии соседимч i опои, а также сдвит и т раииц обчас1ей экспрессии тепов gap в цикле 14А

G Реконструированная в рамках модели tottoiрафия семи ючюв gap включас! в себя пять базовых рстуляюриых механизмов (1) активацию тепов gap под действием Bed и Cad, (2) автоак1ивацию тепов gap, (3) сичытую репрессию по принципу обратной связи ме-жду тепами gap с неперекрывающимися облас!ями экспрессии, (4) асимме тричпую репрессию между тепами gap, чьи области экспрессии перекрываются, (5) репрессию по принципу1 прямой связи lenoB gap в задней част эмбриона иод действием терминальною ши til 3ia юпография является внутренне непротиворечивой, достаточной д 1я обьяспспи i наблюдаемых каршн экспрессии тепов gap и в це том, coi |асусмся с чик'ратурными данными

7 Подтерждопа iiinoiejao юм 'по в будущем зародышевой подоске облает распределения коицеп[раций мРНК Кг, кш и qt локализуемся асиммсчрично опюапельпо об-ласюй распределения конципраций соопк 1С1вующих белков и сдвину 1ы oiноси 1елыю последних в направлении к переднему полюсу эмбриона

8 Показано, чю численное моделирование позволяе! соноС1авип> ipynny юппых взаимодействий со специфичным рое уляюрным процессом предсказано, чю сдвш и 1рапнц экспрессии 1 снов gap происходяi из-за асиммечричносш pel уля юрпых взаимодеистий между э[ими 1 снами, при коюрых i en, облас i1> экспрессии коюро] о расположена ближе к заднему концу эмбриона, репрессируеч [ен с перекрывающейся обласеыо экспрессии, но расположенной ближе к переднему концу Эш сдвш и пе завися i oi дейепшя мак1-рнпских i радистов н диффузии 11 роду к [ и в iciiob gap между ядрами

9 Создана база данных FlyEx (http //uiclim spbca.s m, http//flycx ams snnysb celu/flyex), являющаяся просфапстеппо-времоппым аыасом экспрессии ¡спои cei мешацни Б.иа пре'досеавляеч пользоваючю информацию о динамике формирования обласюй экспрессии lenoB Сс1меп1ации и позволяе! произвесш получение любых обьемов данных по запросу

4 Список публикаций по теме диссертации

(юзисы 42 докладов па конференциях в список пе включены) 4 1 Реферируемые журналы

|А1| Sinkova,S , Kosinan,D , Kozlov.K , Майн, Myasnikova,E , Samsonova,A , Spnov,A , Vaiiane)-Alonso,C-E , Samsonova,M , Reiintz,! 2008 Chaiactciization of the Dwsophila segment eletei-nnnation nioiphoine D< i> Biol, 313(2), 844-802

|A2| Суркова,С , Мясникова,Е , Райпиц, Дж , Самсонова, М Динамическая филырация вариабелыюс1 и кар i им экспрессии ли отческих iciiob cciMciiiannii у дрозофилы Биофшиьа, в нечат

|АЗ| Суркова,С , Мяспикова,Е , Козлов,К , Самсонова,А , Райниц Дж , Самсонова,М Меюд получения количес [венных данных из конфокальных изображений карпш экспрессии iciiob in situ Цитология, 50, 3, 170-185

|А4| Самсонова,М , Гурский,В , Козлов,К , Самсонов,A (200G) Сисюмиый подход к исследованию разви 1 ия opiaiHUMoii Пауто-пи i ш/ 'ч (ъ ш at домости СПбГТУ, 2, 222-234

|А5| Samsonova,M , Pisaiev,A , Kozlov,K , Poustelnikova,E , Tkachenko,A (200G) An nifoi-niation management system for collaboration witlnn ehstiibnteel working enviioinnent LNBI, 4075, U Lesci, F Naumann, aiiei В Eckman, eels, Beilm Heielelbeig, Spimgei-Veilag, 204-215

|AG| Soizano.C О S , Blagov,M , Tlievenaz,P, My,i.siiikova,E , Samsonova,M , anel Unsei,M (200G) Algoiitlmi foi splme-baseel elastic iegibtiation in application to confocal images of gene expiession Patttm Rttoqiution and Imai/< Anah/sib, 10, 1, 93-9G

|A7| Pisaiev,A , Blagov,M , Pnstehiikova,E , Mya.snikova,E , Samsonova,M (2005) A system foi on-lme piocessmg anel analysis of linages of gene expiession patterns Patttm Rfcoqnttion and 1тащ Analysis, 15, 2, 428-431

|A8| lanssens,H , Kosman,D , Vanano-Alonso,C-E , laegei,! , Samsonova,M , RciinU, I (2005) A high-thioughput methoel foi quantifying gene expiession elata fioin eaily Dwsophila embiyo D< о , Guu s Eool, 225(7), 374-381

|A9| Mya.snikova.E , Samsonova.M , Kosman,D , Renntz,! (2005) Removal of backgionnel signal fiom ra situ elata on the expression of segmentation genes in Diosophila D( о , G( ш s Eool, 215(G), 320-32G

|A10| Jaeger, J, Suikova, S, Blagov, M, Janssens, H, Kosinan, D, Kozlov, KN, Mann, Myasmkova, E , Vanano-Alonso, С -E , Samsonova, M , Shaip, D H , Remitz, 7 (2004) Dynamic contiol of positional mfoimation 111 the eaily Dmsophila embiyo Natmr, 430 3G8-371

|A11| Jacgci, J , Blagov, M , Kosman, D , Kozlov, К N , Manu, Myasmkova, E , Suikova, S , Vanano-Alonso, С -E , Samsonova, M , Sliaip,D H , Remitz, I (2004) Dynamical analysis of iegnlatory mteiactions m the gap gene system of Drosoplnla mdanoqasta Gnutifs, 167, 17211737

|A12| Poustclnikova, E , Pisarev, A , Blagov, M , Samsonova, M , Remitz, 1 (2004) A database foi management of gene expiession elata m situ Btomfoj matirs, 20, 14, 2212-2221

|A13] Samsonova, M , Pisaiev, A , Blagov,M (2003) Piocessmg of natuial language queues to a ielational database Bmmjoimain s, 19, Suppl 1, i241-i249

|A14| Pisaiev, A , Pustclmkova, E , Samsonova, M , Bauniann,P (2003) Mooshka a system foi management of multidimensional gene expiession elata m situ Infoi motion Si/st<ms, 28, 2G9-285 |A15| Myasmkova, E , Samsonova, A , Samsonova, M , Reuntz, 1 (2002) Suppoit vectoi iegicssion applied to the determination of the developmental age of a Diosophilu embiyo fiom lis segmentation gene e'xpicssion patterns Biomforrnatu s, 18, S87-S95

|A1G| Aizcnberg, I , Myasmkova, E , Samsonova, M , Remitz T (2002) Temporal classification of Diosophila segmentation gene expiession patterns by the multi-valued neural iecognition method Math( niatiral Bioscu nccs, 17G, 145-159

[A17| Kozlov, К , Myasmkova, E , Pisaiev, A , Samsonova M , Remitz, I (2002) A method foi two-dimensional registration and construction of the two-dimensional atlas of gene expiession patterns m situ In Sihcn Bioloqy, 2, 125-141, littp //www biomfo de/isb/2002/02/0011

[A18| Козлов,К H , Петухов,Л В , Самсонов,A М , Самсонова,М Г (2002) Градиентный мечод первою порядка для поиска фспомеполо1 ических парамефов в модечи кчпшх семей Тр СПбГТУ Прикладная мани шшшъа, 485, 73-83

|А19] Aizenbeig, I , Mya-snikova, Е , Samsonova, М , Remitz, 1 (2001) Application of the Ne'uial Networks Based on Multi-Valued Neurons to Classification of the Images of Gene Expiession Patterns Computational Intelligence Tlieoiy and Applications, Lirtarr Notts tn Computn Sritnri s (B Reusch - Ed ), 220G, Spnngcr, 291-303

|A20| Мясннкова E M , Самсопова, A A , Самсонова, M Г „ Pefiimm, Дж (2001) Пре>-сфапс1венная peine фация данных об экспрессии киов m s itii Mo m %у аярпп н биопо/нн, 35, Ь, 1-G

|А21| Myasmkova, Е , Samsonova, А , Kozlov, К , Samsonova, М , Remitz, I (2001) Registia-tion of the expiession patterns of Drowplnla segmentation genes by two independent methods Biomfoi matics, 17, 3-12

|A22| Kozlov, К , Myasmkova, E , Samsonova, M , Remitz, I , Kosman, D (2000) Method foi spatial te'gistiation of the expiession patterns of Drosophila segmentation genes using wavelets Вьгпк numt /1ЫШС mt nto/iosim, 5, 7, 112-119

|A23| Serov, V N , Spirov, A V , Samsonova, M G (1998) Giaplncal interface to the genetic network database GeNet Biomforrnatu s, 14, G, 54G-547

4 2 Главы в книгах

[A24| Samsonova,M G , Samsonov,A M , Gmsky,V V , Vanano-Alonso,C -E (2005) A survey of gene cncuit appioacli applied to modelling of segment determination m fimt fly In Multiple aspfcts of DNA and UN4 fwm Biophysics to Biomfor matics, S( ssion LXXXII (Eels D Chatenav,

5 Cocco, R Monasson, D Tlneffiy and J Dahbard) Elseviei, 2005, 305-323

|A25| Myasmkova,E , Samsonova,A , Suikova,S , Samsonova,M , Remitz,! (2005) Determination of the developmental age of a Diosoplitla embiyo fiom confocal images of its segmentation gene

expiession patterns In Вш/nfoi mafic s of G/ п/im/ R/qul/ition a/id Sti iietun II (Eds N Kolchanov and R Holestacelt) Spiingci Science < Business Media, Inc 2005, 4G7-478

|A2G| Pisaiev.A , Pejustehnko\a,E , kozlov,k Mva.siukova E , Samsonova,M , Reuntz, J (2005) IinageSeivci, a Tool foi Oil-Inn. Pi осе ssmg anel Analysis of Biological Images In Y/a/book Biotnfo/-matu s 21)1)4, R Hotestaeelt (eel ), M.ip.debuig IMBio, Iiiloiinationsiiianagcmeiit in <lei Biotcclmologie e V , 15-24

|A27| Spuov, A V , Samsonova, M G (1998) GeNet database as a tool foi analysis ofiegulatoiy genetic netwoiks In Infoi matwn Pio//ssinq in C/lls and Tissues, M Holcoinbe and R Paton (Eds), Plenum Pi ess, 285-294

|A28| Seiov, V N , Knillova, О V , Samsonova,M G (1999) NetWoik a tool foi visualization of genetic netwoik stiuctme and dynamics In Visual Hi [in s( atat/ons and lull i jrn tntmns, R Paton and I Neilson eds , Spiingci Veilag, 15G-1G0

4 3 Труды конференций

|A29| Matveeva.A „ Kozlov,K , Samsonova,M (2000) Methodology foi building of complex woik-Hows with PioStack package and 1SIMB10S In Pioe//dinqs of th/ 5th Iiittr national Co/if/// /и/ on Biomjoi matK s of Gt по/ш Rt/¡illation and Sti ш tin< (BGRS'2000), Inly 1G-22, 200G, Novosibnsk, Russia, v 2, 204-208

|A30| Suikova,S Yu , Samsonova,M G (2006) Dynamic filtiation of vanability within expiession patterns of zygotic segmentation genes m D/vsophda In Pixxt t dinqs of th< 5th Intn national Conf/r/a/i on Bioinfoi mat//s of G/пот/ R//julat/оп and Str u/tu/e (BGBS'2000), 16-22 luly 2006, Novosibnsk, Russia, v 2, 178-182

[A311 Samsonova,M , Poustclnikova,E , Pisaiev,A , My,usmkova,E , Kozlov,K , Reuntz, I (2005) A LIMS to suppoit quantitative data acquisition and liumeiical simulations of dynamics of segment deteiinniation in D/osophda eaily cmbiyo In P/vn/din/js of NETTAB 2005 uunkshop, Woihflows manaq/ m/ at ni ui ab/l/tl/s foi th< bioloqi/al mfoi /nation overflow, Seconel Univeisity of Naples, Naples, Italy, 5-7 Octobci, 2005,

|A32J Blagov M , Poustelnikova, E , Pisaicv, A , Myasnikova, E , Samsonova, M (2004) A system foi on-line piocessmg of linages of gene expiession patterns In Pioc//dinqs of th/ 4<l Ilit/ i national Cimfi и ш < on Bioinfo/niati/ s of G/пот/ R/qulation and Stiuctin/ (BGRS'2004J, 25-30 luly 2004, Novosibnsk, Russia, v 2, 161-164

|A33| Suikova, S Yu , Samsonova, M G (2004) Tempoial and spatial piecisiou m foiniation of segmentation gene expiession eloiiiams m Drosophda In Pi/K/z/hnqs of th/ 4d I/it/in/iti/mal С/mf/nnr/ on B/omfm m/itu s of Gt пот/ R//)idiit/on and St/urturt (BGRS'2004), 25-30 luly 2004, Novosibnsk, Russia, v 2, 142-145

|A34| Samsonova, M , Suikova, S , lacgci, I anel Reuntz, I (2004) Quantitative appioacli to the functional genonncs of development In Pioe//d/nqs of th/ 4th Int/inational Со/if//en// on Bioinfoi mat/еч of G/ пот/' R/qulat/on and Stiuetuu (BGRS'2004), 25-30 luly 2004, Novosibnsk, Russia v 2, 135-137

|A35| Pisaiev A , Blagov M , Samsonova M (2004) Methoel foi mtegiation of elatabases with common subject domains In P/o///d/nqs of th/ 4<l Int/rnat/onal Co/if/i/n// on Bioinfoi mat// s of G/nom/ R/q/dati/m and Still/tm/ (BGRS'2004), 25-30 luly 2004 Novosibnsk, Russia v 2, 131-134 [A36| Aizenbeig, I , Butakofl, С , Myasmkova, E , Samsonova, M , Reuntz, I (2002) Classification e)f the images of gene expulsion patterns using licuial lietwoik baseel oil multi-valued lieuions with the minimal nuinbei of inputs In SPIE Pio///ihnqs, Nassei M Nasiabaeh anel Aggelos К Katsaggelos eels, 4668, 10-19

|A37| Suikova, S Yu , Samsonova, MG, Myasmkova, EM (2002) Tempoial changes ill position of segmentation gene expiession domains ill D/osoph/la eaily cmbiyo III Pio////hnqs of th/ 4d Int/i national Conf/i/n// on Bio/nf/n mat//s of G/пот/ R/qulation and Sti a/tun (BGRS'2002),

14-20 Tuly 2002, Novosibirsk, Russia, v 3, 122-125

[A38| Aizcnbeig,I, Myasnikova,E , Samsonova,M (2001) Classification of the images of gene expiession patterns using ncuiai netwoiks ba.sed on multi-valued neurons In Piocudmqs 6th Int Conf on Artificial and Natural N< lira! Nitworks, 1WANN 2001, Gianada, Spam, June 2001, Spnngc r, Pait 2, 219-22G

|A39| Samsonova, M , Pusteluikova, Б , Pisaicv, A , Remitz, I (2000) Design of the integrate <1 atla.s of segmentation gene expiession m situ In Proceedings of tin Gtr man Confirma on Bioinfoi-matics 5 - 7 Oct 2000, Heidelberg, 125-132

|A40| Myasnikova, E , Samsonova, A , Samsonova, M , Remitz, J (2000) Spatial registration of in situ gene expression data In Computation in Cells Prvci edmqs of an EPSRC Emirqrnq Computing Paradiqms Workshop, Umv of Hcitfordsluie, UK Dept of Computer Science, Ttclmical report No 345, 21-26

|A41| Samsonova,M , Seiov,V , Trushkina, A (2000) Tools for visualization of genetic netwoik stiucture and dynamics In Computation m Cills Piottidmgs of an EPSRC Emirqmq Computing Paradigms Workshop, \}\uv of Hertfordshire, UK Dept of Computer Science, Technical repoit Nj 345, 61-66

[A42| Kozlov, К , Mya-smkova, E , Samsonova, M , Reinitz, 7 , Kosman, D (2000) Fa4 redundant dyadic wavelet tiansfoini ш application to spatial registration of the expression patterns of Drosoplula segmentation genes In Proceedings of tin 15th International Confirmee on Pattern Ri cognition, Barcelona, Stpt 2000, v 3, 463-46G

[A43| Myasnikova, E M , Kosman, D , Remitz, I , Samsonova, M G (1909) Spatio-tempoi il legistiation of the expression patterns of Drosoplula srgmentation genes In Procetdings of tin 7ih Int Confín mi on Intilhgtnt Systi ms for Molt culm Biologg, T Lengauer, R Sclmeidei, PBork, D Biutlag, I Gla-sgow, H -W Mewes and R Zmimei tds , AAAI press, 195-201

|A44| Samsonova, M , Serov, V N (1999) NetWoik an interactive interface to the tools for the analysis of genetic network structure and dynamics Iu Prom dings of Paeifii Symposium on Biocompittmg, 4, 102-111

|A45| Myasnikova, E , Kosman, D , Reinitz, I , Samsonova, M (1999) A method foi the spatiotemporal registration of the expression patterns of Drosophrla segmentation genes In Proceidmqs of tin 1st Conf menu on Modilhnq and Simulation In Biology, Midnini and Biomidical Enqineirmg, Noisy-lc-Giand, France ESIEE, 63-67

Список литературы

Белоусов, Л В (2005) Опшны общей эмбриологии "Наука", Изд-во Московско!о университета, Москва, Россия

Жимулсв, И Ф (2003) Обитая и моты/лярпая гпч тика Сибирское уииверси leiCKoe изд.1-i ел i»c i во, Новосибирск, Россия

Корочкип, Л И (2002) Био/ю?ия индивидуального jhiюития Изд-во Mockoiíckoi о уииверси км а, Москва, Россия

РагушмыП, А В , Лихошвай, В А , Ананько, Е А , Владимиров, Н В , Гунбин, К В , Лапин С А , Недосекина, Е А , Николаев, С В , Омельяичук, Л В , MaiyniKHii, Ю Г и Колчано!, Н А (2005) Новосибирская 1нколасиС1емиой комныоюрпой биоло! ии исюрический экскурс и перепек i ивы развишя Информационный Bicmum ВОГиС, 9(2) 232 261

Aegertcr-Wilmsen, Т , Acgerter, С М , and Bissehng, Т (2005) Model for the robust establishment of piecise propoitions m the early diosophila embryo J Thior Biol, 234(1) 13 9

Акаш, М (1987) The moleculai basis foi inctaineiic pattern 111 the diosophila cmbiyo Dim hp merit, 101 1 22

Beiginann, S , Sanellei, О , Sbeuo, H , Simula, S , Sche]tei, E , Slnlo, В Z , and Baikal, N (2007) Pie-steady-state decoding of the bicoul moiphogcn giadient PLoS Biol, 5(2) e4G

Blown, L G (1992) A suuey of image icgistiation techniques 4CM Computing Suimys, 24(4) 325 37G

Campos-Oi tega, I A and Haiteiistem, V (1085) Tin Embu/oiiit D< utlopmt nt of Drosoplula lnelanogabtu Spimgei, Heidelbcig, Gcimany

С1ш, К W (20(H) Efficit lit paiulltl simulatid aiaualiiiq Thi iiistfiui and (stimation of an optimal пишиj itqimi PliD thesis, State Umveisity of New Yoik at Stony Biook, Stony Biook, NY

Diambia, L and da Costa, F (2005) Complex netwoiks appioacli to gene expiession dnven plienotypc imaging Biomfoi mat к s, 21 384G 3851

Dnevei, W and Niisslem-Volhaid, С (1988a) The Bicoul piotcm dcteimmes position ill the diosophila cmbiyo in a conceiitiation-dependent inannei Ctll, 54 95 104

Dncvci, W and Nusslcm-Volhaid, С (1988b) A giadient of Bicoid piotcm m drosophila embiyos Ctll, 54 83 93

Eplniissi, A and St loluistoii, D (2004) Seeing is believing the bicoid lnoiphogen giadient matines Ctll, 11G(2) 143 52

Gilbcit, S F (2003) Di in lopmt ntal Bioloqy, St tn nth Edition Smaiiei Associates, Snneleilanel, Massachusetts 01373

Gonzalez, П С and Wooels, R E (2002) Digital niiat/i pions^mq Picnticc Hall, Uppci Saddle Rivci, N T , 2nd edition

Guidon, I В and Bounllot, P-Y (2001) Moipliogen giadient lnteipietation Natuте, 413 797 803

Holloway, D M , Hainson, L G , Kosinan, D , Vanaiш-Alonso, С E , anel Spnov, A V (200G) Analysis of pattern piecision shows that diosophila segmentation de\elops substantial lndepeiielence fiom giaehents of mateiiial gene pioelucts Dt и Dyn, 235(11) 2949 60

Holloway, D M , Hainson, L G , and Spnov, A V (2003) Noise ш the segmentation gene nctwoik of diosophila with implications foi mechanisms of body axis specification In Bezinkov, S M , F H M F , cditoi, Fiiftuatioiis and Ntnst in Biolotjiral, Biophysical, and Biomtdical Si/stt tns, volume 5110 of Piocttthnqs of thi SPIE, pages 180 191

Ни, M-K (1962) Visual pattern iecogiutiou by moment mvaiiants IRE tiansattions of inftn mation thttn I/. IT-8 179 187

Ingham, P W (1988) The moleculai genetics of cmbiyonic pattern foimation m drosophda Natuu , 335 25 34

Ingham, P W anel Maitmez-Aiias, A (1992) Boundancs anel hclels m caily embiyos Ctll, G8 221 235

Isalan, M , Lunelle, С , anel Sciiano, L (2005) Engiuccinig gene netwoikh to emulate eliosoplula einbijomc pattern foimation PLoS Biol, 3(3) eG4

Janssens, H , Hou, S , Jaeger, I , Kmi, A R , Myasmkova, E , Sliaip, D , and Rcimtz, I (2006) Quantitative and predictive model of transciiptional control of the diosoplnla melanoga.ster evi 11 skipped gene Nut Gtntt, 38(10) 1159 G5

Kei alien, S V , Fowlkes, C C , Luengo Hendnks, C L , SueUr, D , Knowles, D W , Malik, 1 , and Biggm, M D (200G) Thice-dimensional moiphology and gene expression 111 the diosoplnla blastoderm at cellular iesolution 11 dynamics Gtnoint Biol, 7(12) R124

Knkpatnck, S , Gelatt, C D , anel Vcccln, M P (1983) Optimization by simulated annealing Senna, 220 G71 G80

Kitano, H (2002) Systems biology a bnef oveiview St it nrr, 295(55G0) 1GG2 4

Kosmaii, D , Rcimtz, 1, anel Sliaip, D H (1997) Automated assay of gene expression it cellular resolution 111 Altman, R , Dunkci, K, Hunter, L, anel Klein, T, cditois, Piot tt tl 1 nys of the 1008 Pat 1 fie Symposium on Bioeompntmq, pages G 17, Smgipoic Woild Scientific Pie^s littp //www smi stanfoiel edu/proiects/hehx/psb98/kosman pelf

Kosman, D , Small, S , anel Rcimtz, T (1998) Rapid piepaiation of a panel of polyclonal antibodies to drosophila segmentation piotcTiis Dt mlopmtnt, Gtnts and Evolution, 208 290 294

Kozlov, K , Pisarev, A , Matveeva, A , Kaaneloip, J , anel Samsonova, M (2007) Image piocessmg package for quantification of biological images I11 Piott/dmqs of the 4th hit Symposium on Nttwoiks in Biomfoi matit s (ISNB 2007), page 204, Amstcielam, the Netheilands

Krishna, S , Banerjce, B , Ramaknslman, T V , anel Shivashankar, G V (2005) Stochastic simulations of the oiigms anel implications of long-tailed elistnbutions 111 gene cxpiession PNAS, 102 4771IJ477G

Lam, 1 anel Dclosme, I-M (1988a) All efficient simulated annealing schedule Denvatioii Technical Report 881G, Yale Electrical Engineering Dcpaitment, New Haven, CT

Lam, I and Delosme, I -M (1988b) A11 efficient simulated annealing schedule Implementation anel evaluation Technical Repoit 8817, Yale Electrical Engme'eiiiig Dcpaitment New Haven, CT

Lawiciicc, P A and Johnston, P (1989) Pattern formation 111 the diosoplnla cmbiyo allocation of cells to parasegments by uitn-skipptd anel fusln-tawzu Dt vdopint nt, 105 7G1 7G7

Luelwig, M Z , Palsson, A , Alekseeva, E , Bergman, C E , Nathan, 1 , anel Kicitman, M (2005) Functional evolution of a cis-iegulatoiy module PLoS Biology, 3 0588 0598

Martinez-Arias, A anel Lawrence, P (1985) Paiasegments anel compaitmeiits 111 the diosophi't1 cmbiyo Nature, 313 G39 G42

Mernll, P T , Sweeton, D , anel Wieschaus, E (1988) Requuemcnts foi autosomal gene activity ehiimg piecellular stages of diosoplnla mtlanotjastn Dt otlopmtnt, 104 495 509

Metropolis, N , Roscnbluth, A , Rosenblutli, M N , Telle. 1, A , anel Telloi, E (1953) Equation of state calculations by fast computing machines Tht Journal of Chtmienl Physns, 21 1087 1092

M|olsness, E , Sliaip, D H , anel Remitz, J (1991) A connectiomst model of development Tit Journal of Tht on tnal Biology, 152 429 453

Nussle 111-Volliard C, Fiohnliofei, H G, and Lelimaim, R (1987) Dettimmatioii of anteiopostcnoi polarity 111 drosophila Sennet, 238 1G75 1G87

Nusslcm-Volhaid C and Witschatis, E (1980) Mutations affecting segment liumbu and polanty ill diosoplnla Natuii 287 795 801

Oclioa-Espinosa, A , Yucd, G Kaplan, L , Paie, A , Puta, N , Obcistcm, A , Papatsenko, D , and Small, S (2005) The lole of binding site clnstei stiength in bicoid-dependent pattenmig m diosoplnla Plot Natl 4 nidSii USA, 102(14) 4900 5

Peieann, W and HaituisUin, V (2004) Digital thicc-dimensioiial models of diosoplnla dc\elopment Cuu Opm Giiut Dm, 14(4) 382 91

Ptikms, T I , Jaegci, 1 , Rcmitz, I and Glass, L (200G) Revcise engmecinig the gap gene netwoik of diosoplnla mclanogastei PLoS Cornput Dtol, 2(5) e51

Remit/, I , Mjolsniss, E , and Sliaip, D H (1995) Cooperative contiol of positional mfoimation in diosoplnla Iiv Undid and matt mal haiuhback Tin Join nal of Eipcimu ntal Zooloqij, 271 47 5G

Shin, I and Ca.stan, S (198G) An optimal lmcai opeiatoi foi edge detection In Piotiidings CVPR '80, Miami

Snnpson-Biose, M , Ticisman, I , and Dcsplan, C (1994) Symigy between the Hunchback and Bicoid moiphogcns is lequncd foi antcnoi patterning in diosoplnla Cill, 78 855 8G5

Smola, A and Scliolkopf, B (1998) A tutonal on suppoit vectoi iegicbsion

Vapmk, V (1995) Tin Natuii of Statist nal Lt anting Tlx oi i/ Spimgei,NY

Vincent, S , Rubeite, E , Giudei, N C , Chen, C K , Hacny, T , Scliuli, R , and Affoltei, M (1997) Dpp contiols tiaclieal cell lmgiation .ilong the doisovential body axis of the diosoplnla embiyo D< m lopmi nt, 124 2741 2750

Wolpeit, L (19G9) Positional mfoimation and the spatial pattern of cellulai diffcientiation Tin Join nal of Thurn tual Biology 25 1 47

Wolpeit, L (1989) Positional lnfoimation icvisitcd D< Of loiimi lit (Sapplt uu nt), 107 3 12

Yucel, G and Small, S (200G) Moiphogcns pucisc outputs fiom a vanable giadient Can Biol, 1G(1) R29 31

Zmzui, R P and Papatsenko, D (2007) Enhancei usponses to similaily distnbuted antagonistic giadicnts in development PLoS Coinpnt Biol, 3(5) e84

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 01 02 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 2,0 Тираж 100 Заказ 2573Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Самсонова, Мария Георгиевна

Введение

1 Современные представления о детерминации сегментов у дрозофилы. Обзор литературы.

1.1 Эмбриогенез дрозофилы.

1.2 Сеть генов сегментации.

1.3 Об использовании мутантов для анализа регуляторных взаимодействий

2 Материал и методы

2.1 Материал.

2.2 Методы обработки цифровых изображений

2.3 Извлечение характерных признаков из одномерных картин экспрессии

2.3.1 Сплайновая аппроксимация

2.3.2 Быстрое избыточное двоичное вейвлет-преобразование

2.4 Обобщение метода SVM на случай регрессионного оценивания

2.5 Метод генных сетей.

2.5.1 Базовая концепция модели.

2.5.2 Уравнения модели.

2.5.3 Оптимизация параллельным численным отжигом Лама

2.5.4 Биологический анализ генных сетей

2.6 Базы данных.

2.6.1 Реляционная модель данных и реляционные СУБД.

2.6.2 Информационные технологии создания интерфейсов.

3 Метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации

3.1 Сегментация изображений.

3.1.1 Приведение изображений в стандартную ориентацию

3.1/2 Построение гладкой маски эмбриона.

3.1.3 Получение количественных данных.

3.2 Удаление фонового сигнала

3.2.1 Определение неэкснрессируюгцих областей.

3.2.2 Выделение опорных точек.

3.2.3 Аппроксимация фонового сигнала.

3.2.4 Удаление фона.

3.2.5 Особые случаи.

3.2.6 Оценка точности метода.

3.3 Определение возраста эмбриона.

3.3.1 Формирование обучающей выборки эмбрионов.

3.3.2 Предсказание возраста эмбрионов.

3.4 Регистрация картин экспрессии генов у эмбрионов.

3.4.1 Аффинное преобразование.

3.4.2 Оценка точности метода регистрации.

3.5 Конструирование интегрированных картин экспрессии генов сегментации

4 Динамическая природа позиционной информации

4.1 Концепция позиционной информации.

4.2 Градиенты морфогенов.

4.3 Модель "французского флага".

4.4 Сдвиги областей экспрессии генов сегментации.

4.5 Динамическая позиционная информация.

5 Регуляторные взаимодействия в сети генов gap

5.1 Анализ регуляторных механизмов, контролирующих экспрессию генов gap.

5.1.1 In silico реконструкция сети генов gap.

5.2 Анализ полученных генных сетей.

5.2.1 Анализ коэффициентов матрицы регуляторных взаимодействий

5.2.2 Графический анализ регуляции в системе генов gap.

5.2.3 Пять базовых регуляторных механизмов позиционирования областей экспрессии генов gap.

5.3 Механизм сдвига границ областей экспрессии генов gap.Ill

6 Создание атласа экспрессии генов сегментации во времени и пространстве

6.1 Модель данных.

6.2 Архитектура системы.

6.2.1 Java-серверы приложений.

6.2.2 Визуализация количественных и преобразованных данных

6.2.3 Визуализация динамики экспрессии генов.

6.3 Объем данных.

6.4 Ве&-интерфейс.

6.5 Практическое использование FlyEx.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика экспрессии генов сегментации у дрозофилы"

За последние 25 лет биология развития добилась впечатляющих успехов. Применение генетических методов, а также методов функциональной геномики позволило клонировать большое количество генов, регулирующих процессы развития, выделить их продукты - РНК и белки и проанализировать функции всех этих молекул. Однако, несмотря на огромный объем полученной информации, картина того, каким образом гены контролируют фенотипы тканей, органов и, как следствие, развитие всего организма, до сих пор отсутствует.

Причинная связь между генотипом и фенотипом является сложной. Дело в том, что любая система (ткань, орган и т.н.) формируется в результате процессов и регуляторных механизмов, действующих на разных уровнях организации (от молекулярного до организменного). В каждом из этих процессов участвует большое число гетерогенных компонент (генов, белков, разных типов клеток и т.д.), которые вступают друг с другом в сложные взаимодействия, причём наличие ансамбля взаимодействующих компонент характерно для каждого уровня организации. На результаты таких взаимодействий (часто называемых "новыми сущностями "или "свойствами ансамбля") на любом уровне организации могут сильно влиять гетерогенность состава и взаимодействия биологических компонент на более низком и/или высоком уровнях организации.

Экспериментальная биология еще недавно была нацелена, главным образом, на изучение структуры и функции отдельных биологических компонент. Необходимость анализа свойств ансамблей, их синергии, а также гетерогенность биологических компонент, входящих в ансамбли на каждом уровне организации, требуют привлечения принципиально иных методов исследования. В последние годы в биологии развивается новое направление - системная биология, целью которой является получение информации о биологическом объекте как о системе взаимодействующих компонент и процессов. О важности системного подхода в современной молекулярной биологии можно судить но ряду детальных обзоров и коллективных монографий, см. например (Ратушный et al., 2005; Kolchanov and Hofestadt, 2005; Kitano, 2002).

Фундаментальным понятием биологин развития является морфогенетическое поле - совокупность клеток, в результате взаимодействия которых формируется орган. Эти взаимодействия приводят к тому, что каждая клетка поля становится детерминированной, выбирая один из многих возможных путей развития, а также занимает определенное положение относительно одной или нескольких точек формирующейся системы. Современные экспериментальные технологии позволяют регистрировать компоненты морфогенетических полей, однако чрезвычайная сложность процессов развития, протекающих в этих полях, требует применения, помимо молекулярно-биологических методов, новых подходов, использующих математическое моделирование, теорию вероятности и статистику, теорию распознавания образов, теорию оптимального управления и вычислительные методы.

В данной работе системный биологический подход применяется для изучения механизмов детерминации сегментов в раннем эмбриогенезе плодовой мушки Drosophila melanogaster.

Актуальность работы. Несмотря на большой объем информации о регуля-торных взаимодействиях генов сегментации (Akam, 1987; Ingham, 1988; Корочкин, 2002), знания о механизмах регуляции этих генов, и в особенности, о механизмах экспрессии генов gap, являются далеко не полными. Это, с одной стороны объясняется неполнотой экспериментальных данных о регуляторных взаимодействиях, с другой - методологическими трудностями, которые возникают, когда вывод о регуляторном взаимодействии у многоклеточного организма делается на основе качественного анализа экспрессии гена у мутантов. Кратко эти трудности можно обозначить как проблемы непротиворечивости, уникальности и полноты предполагаемого регуляторного механизма.

Для доказательства непротиворечивости гипотетического регуляторного механизма требуется учет вклада всех регуляторов исследуемого гена. Современные экспериментальные методы, однако, имеют ограниченную возможность одновременного анализа влияния всех регуляторов на данный ген, поскольку они основаны на анализе картин экспрессии у мутантов, а получение организмов с мутациями более чем в трех регуляторах часто является непростой задачей. Более того, генная сеть у мутантов по определению состоит из неполного, или дефектного набора регуляторных взаимодействий генов. Таким образом, выводы о структуре генной сети дикого типа приходится делать на основании данных многих экспериментов с мутантами. Непротиворечивость же выявленных взаимодействий может быть продемонстрирована только при проверке их в интактном развивающимся организме, содержащем полный набор регуляторов.

Другая проблема, возникающая при интерпретации картин экспрессии у мутантов состоит в доказательстве уникальности механизма взаимодействия, т.е. доказательстве того, что данное регуляторное взаимодействие является прямым, а не опосредованным. Такие доказательства требуют проведения дополнительных экспериментов.

И наконец, существует фундаментальная проблема демонстрации полноты выявленных регуляторных взаимодействий. Действительно, необходимость материнских генов и генов gap - физических компонент морфогенетического поля сегментации - для правильной экспрессии генов gap не означает достаточности этого набора генов. В принципе доказательство достаточности выявленного регулятор-ного механизма невозможно без реконструкции системы ab initio из отдельных, хорошо контролируемых компонентов. Очевидно, что современные экспериментальные методы не позволяют провести такую реконструкцию, и, следовательно, она должна быть проведена in silico с помощью математического моделирования и численных расчетов (Ратушиый et al., 2005).

Другой вопрос, один из самых важных в эмбриологии, состоит в выяснении механизма детерминации клеток и частей зародыша. В основе этого механизма лежит активация тех или иных генов в разных клетках, что приводит к возникновению пространственно неоднородной картины экспрессии генов ("узора"или так называемого паттерна). У дрозофилы детерминация сегментов определяет положение парасегментпых, а не сегментных границ. Образование иарасегмен-тов предшествует формированию сегментов на более поздних стадиях развития. В морфогенетическом поле сегментации сегментный препаттерн образуют полосы экспрессии генов segment-polarity (Lawrence and Johnston, 1989; Martinez-Arias and Lawrence, 1985; Ingham and Martinez-Arias, 1992; Жимулев, 2003).

Классическое объяснение механизмов детерминации было предложено в 1969 году Л.Волпертом, сформулировавшим теорию позиционной информации (Wolpert, 1969; Wolpert, 1989). Согласно этой теории судьба клетки определяется ее положением в определенном пространственном поле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеном. Считывание информации о градиенте морфогена и ее интерпретация приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогена.

У дрозофилы продукт материнского координатного гена bed является классическим примером морфогена (Driever and Niissleiii-Volhard, 1988b; Driever and Nusslein-Volhard, 1988a; Ephrnssi and St Johnston, 2004). Проведенные в последнее время генетические и теоретические исследования указывают на то, что действие одного лишь морфогена Bed недостаточно для возникновения прострвнственно неооднородной картины экспрессии генов в бластодерме дрозофилы. В нашей работе исследована динамика позиционирования областей экспрессии генов сегментации, и на основе полученных данных обсуждается адекватность концептуальной модели Л.Волперта для объяснения механизмов формирования сегментного пре-паттерна в бластодерме дрозофилы.

Понимание принципов организации и функционирования морфогепетического поля сегментации требует детального количественного описания динамики каждой из его компонент. Несмотря па высокую разрешающую способность, метод ДНК чипов так же, как и многие другие методы количественной оценки экспрессии генов (количественный PCR, CAT assays), имеет ограниченное применение для решения этой задачи. Дело в том, что все эти методы используют гомогенаты клеток и, таким образом, теряют информацию об экспрессии генов в пространстве. Перспективным является использование иммунофлуоресцентного маркирования биологических макромолекул в сочетании с лазерной конфокальной микроскопией, которая позволяет получать качественные цифровые изображения картин экспрессии генов, готовые для извлечения количественных данных об экспрессии путем компьютерной обработки.

Очевидно, что качество математического моделирования зависит от качества экспериментальных данных. Как было отмечено Х.Китано (Kitano, 2002) идеальный набор данных должен быть исчерпывающим по полноте оцениваемых компонент, измеряемых параметров и по охвату временной динамики, точным в количественном отношении, а также систематическим. Последнее означает, что способ получения данных разных типов должен допускать их согласованную интеграцию. Хотя эти требования очевидны, в настоящее время лишь немногие наборы данных им удовлетворяют и, поэтому, получение такого набора данных по экспрессии генов сегментации имеет важное значение.

Эффективное использование количественных данных но экспрессии генов сегментации требует организации набора данных в виде базы данных, что обеспечит эффективное хранение и выборку информации, а также облегчит анализ данных, нацеленный на выявление новых биологических закономерностей изучаемого процесса и формулировку новых гипотез для их направленной проверки в экспериментах. Отметим, что по своей сути такая база данных будет пространственно-временным атласом экспрессии генов, поскольку она хранит количественную информацию по экспрессии в разных точках морфогепетического ноля и в разные моменты времени.

Цель и задачи исследования состояли в том, чтобы проверить достаточность материнских градиентов Bed, Hb и Cad для правильного позиционирования областей экспрессии генов gap и выяснить роль взаимной репрессии генов gap в этом процессе. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработать новый конвейерный метод количественной оценки уровня экспрессии главных компонент морфогенетического поля сегментации у дрозофилы - генов сегментации - на основе изображений, полученных с помощью конфокальных микроскопов. Этот метод должен включать сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных.

2. Получить исчерпывающий по полноте, точный в количественном отношении и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого индивидуального эмбриона, а также эталонные, интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени;

3. Изучить динамику формирования областей экспрессии генов в морфогенети-ческом поле сегментации путем оценки положения каждой области в разные моменты времени;

4. Создать математическую модель механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле деления ядер 14А. Примененить эту модель для in silico реконструкции сети генов gap и выявления механизмов, обеспечивающих сдвиги границ областей экспрессии этих генов;

5. Для облегчения работы теоретиков и биологов с данными создать пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляционной базы данных, доступной в сети Интернет.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые

• разработай конвейерный метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации из конфокальных изображений картин экспрессии этпх генов. Метод включает 5 процедур, а именно, сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных, которые можно применять последовательно и по отдельности;

• получен полный, точный и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации;

• показано, что области экспрессии генов сегментации, локализованные в будущей зародышевой полоске, по мере своего формирования в цикле 14А смещаются к переднему полюсу эмбриона;

• предложена математическая модель для предсказания механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле 14А, правильно воспроизводящая временную динамику экспрессии этих генов, степень перекрывания соседних областей экспрессии, а также воспроизводящая сдвиги границ областей экспрессии генов gap в ходе цикла 14А;

• исследованы механизмы сдвигов центральной области экспрессии Кг, а также задних областей экспрессии kni, gt и hb по направлению к переднему концу эмбриона;

• создан пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляционной базы данных FlyEx, доступной по сети Интернет.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся

1. Компьютерная обработка цифровых изображений картин экспрессии генов, полученных с помощью конфокального микроскопа и нммунофлуоресцент-ного маркирования биологических макромолекул, может быть использована для получения количественных данных по экспрессии генов in situ.

2. Количественное описание пространственно-временной динамики компонент морфогенетического поля сегментации необходимо для понимания механизмов его функционирования.

3. Сдвиги областей экспрессии генов сегментации важны для позиционирования областей экспрессии генов-мишеней и играют важную роль в формировании сегментного препаттерна.

4. Материнские гены bed, cad и гены gap Кг, kni, gt, hb, til не только необходимы, но и достаточны для правильной экспрессии генов gap в будущей зародышевой полоске.

5. Позиционная информация в бластодерме дрозофилы задается динамически меняющейся во времени комбинацией концентраций продуктов материнских и зиготических генов. В каждый момент времени эта комбинация определяется не только материнскими морфогенами, но и сдвигами границ областей экспрессии генов сегментации из-за регуляторных взаимодействий. Это толкование подразумевает активный, а не пассивный способ интерпретации градиента морфогена и размывает границу между формированием и интерпретацией позицнонрюй информации.

Практическое значение работы. Научно-практическая значимость работы состоит в том, что в ней впервые разработан и успешно применен метод конвейерной обработки картин экспрессии генов сегментации с целью получения количественных данных по экспрессии генов. Метод был успешно адаптирован для обработки данных по экспрессии генов сегментации на уровне мРНК (Janssens et al., 2006), для обработки оптических срезов изображений картин экспрессии генов в ядрах эмбриона дрозофилы, а также для маскирования экспрессирующих областей и получения количествешшх данных по экспрессии генов в раннем развитии коралла Acropora millepora и морского анемона Nematostella vectensis (Kozlov et al., 2007). Все это позволяет считать разработанный метод важным инструментом извлечения количественной информации из изображений картин экспрессии генов. Отметим также, что в силу универсальности большинства процедур разработанный метод может с небольшими модификациями применяться для обработки широкого спектра биологических изображений и, таким образом, представляет интерес для широкого круга ученых в области молекулярной биологии.

В качестве одной из процедур конвейерного метода предложен новый метод определения возраста эмбриона в цикле развития 14А, основанный на анализе динамичных картин экспрессии гена eve, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возраста эмбриона, определенного в эксперименте. Этот метод позволяет автоматизировать процедуру предсказания возраста, делает ненужршм трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, является важным усовершенствованием метода определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.

Количественные данные по экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, уникальны по охвату временной динамики, точны, имеют клеточное разрешение и получены в результате систематических и масштабных экспериментов, проводимых в одной лаборатории и с использованием одних и тех же стандартизованных методов. Эта особенность сделала полученные данные исключительно востребованными мировым сообществом, использующим их как в теоретических исследованиях, так и для изучения механизмов сегментации, см. например, Holloway et al., 2003; Pereanu and Hartenstein, 2004; Diambra and da Costa, 2005; Aegerter-Wilmsen et al., 2005; Isalan et al., 2005; Ludwig et al., 2005; Holloway et al., 2006; Krishna ct al., 2005; Ochoa-Espinosa et al., 2005; Perkins et al., 2006; Yucel and Small, 2006; Zinzen and Papatsenko, 2007; Bergmann et al., 2007.

Созданный пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации FlyEx является открытым ресурсом, широко используемым мировым сообществом биологов и биоинформатиков. Так например, в 2006 году общее количество обращений к FlyEx составило более 260000.

В работе исследуется центральный вопрос эмбриологии - механизмы детерминации клеток и частей зародыша в морфогенетических полях. Помимо этого, выполненные исследования имеют важное значение для лучшего понимания медицинских аспектов развития, а совокупность разработанных методов и моделей формирует, в конечном итоге, методологическую базу для реконструкции генной сети организма при отсутствии или ограниченном использовании мутагенеза.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на конференциях: Computational Cell Biology Workshop [CSHL 2007] (Cold Spring Harbor, USA, 2007); Санкт-Петербургской международной конференции по нано-биотехнологии, пленарный доклад, (Санкт-Петербург, 2006); 3 Workshop on Data Integration for the Life Sciences [DILS2006] (Hinxton, UK); 1, 3, 4 и 5 International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure [BGRS'1998, 2002, 2004, 2006], в 2006 г. - приглашенный доклад (Новосибирск, 1998, 2002, 2004 и 2006); 3 и 4 TICSP Workshop on Computational Systems Biology, приглашенные доклады (Tampere, Finland, 2005 и 2006); 2, 3 и 4 International Symposium on Networks in Bioinformatics, в 2005 и 2006 г.г. - приглашенные доклады, [ISNB 2005, 2006, 2007] (Amsterdam, the Netherlands, 2005, 2006 и 2007); NETTAB 2005 workshop, Workflows management: new abilities for the biological information overflow (Naples, Italy, 2005); 2d Integrative Bioinformatics Workshop, приглашенный доклад, (Bielefeld, Germany, 2005); 42, 44, 45 и 46 Annual Drosophila Research Conferences, (Washington DC, San Diego, Washington DC и Chicago, USA, 2001, 2003, 2004 и 2005); Intl. Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, Russia, 2003); 7,10 и 11 Int. Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology [ISMB99, ISMB02, ISMB03], в 1999 г. - премия SGI за лучший доклад на конференции, (Heidelberg, Germany, 1999; Edmonton, Canada, 2002; Brisbane, Australia, 2003); Computation in Cells: EPSRC Emerging Computing Paradigms Workshop, приглашенный доклад, (Hertfordshire, UK, 2000) и т.д.

С использованием материалов диссертации автором сделано 2 приглашенных доклада в Lawrence Berkeley National Laboratory, USA (2002 и 2006 гг.), доклад на Московском семинаре но биоинформатике (2006), приглашенные доклады в 2003 г. в Genetics Department, Cambridge University (UK) и в Bioinformatics Research Centre, University of Glasgow (UK), приглашенные доклады в 2005 г. на Bioinformatics Colloquium, Georg-August-Universitat Gottingen (Germany) и на Waterman Seminars, the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK, Germany), приглашенный доклад в Laurence H. Baker Center for Bioinforraatics and Biological Statistics Seminar Series, Iowa University, USA (2001), а также 2 приглашенных лекции на the Les Houches Summer School "Multiple Aspects of DNA and RNA: from biophysics to bioinformatics"(2004). Также сделаны 3 приглашенных доклада на семинарах Dagstuhl: 3d Dagstuhl Seminar for Information and Simulation Systems for the Analysis of Gene Regulation and Metabolic Pathways (2001); Dagstuhl Seminar 04281 "Integrative Bioinformatics - Aspects of the Virtual Cell (2004), Dagstuhl Seminar 03051, "Information and Process Integration: A Life Science Perspective" (2003) и многих других семинарах. Сделан также доклад на семинаре, организованном фирмой Leica, "Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в биологии" (Санкт-Петербург,2006).

Кроме того результаты работы обсуждались на Санкт-Петербургском семинаре по компьютерной биологии, на семинарах кафедр эмбриологии и генетики Санкт-Петербургского государственного университета и были включены в лекцию на Международной школе-семинаре BGRS "Эволюция, системная биология и суперкомиьютерные вычисления в биоинформатике "в 2005 г. (Новосибирск, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ (все в соавторстве), в том числе 23 статьи в реферируемых научных журналах.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и библиографии (229 наименований). Ее полный объем составляет 165 страниц, количество рисунков 44.

Заключение Диссертация по теме "Биоинформатика", Самсонова, Мария Георгиевна

Выводы

1. Разработан оригинальный конвейерный метод количественной оценки уровня экспрессии генов сегментации на основе изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа. Этот метод включает такие процедуры как сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных.

2. Показано, что возраст эмбриона в цикле деления ядер 14А может быть предсказан с точностью до 2 минут развития на основании анализа высоко динамичной картины экспрессии гена even-skipped.

3. Получен полный, точный и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации. Интегрированные данные имеют пространственное разрешение в одно ядро и разрешение по времени в 15 минут развития для цикла 13 и около 6.5 минут развития для цикла 14А.

4. Показано, что области экспрессии генов сегментации, локализованные в будущей зародышевой полоске, по мере своего формирования в цикле 14А смещаются к переднему полюсу эмбриона. Сдвиги областей экспрессии по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии генов pair-rule. Смещения ядер в этом районе эмбриона значительно меньше, чем сдвиги областей экспрессии.

5. Разработана математическая модель, которая правильно воспроизводит временную динамику экспрессии генов сегментации, размер перекрывания областей экспрессии соседних генов, а также сдвиги границ областей экспрессии генов gap в цикле 14А.

6. Реконструированная в рамках модели топография сети генов gap включает в себя пять базовых регуляторных механизмов: (1) активацию генов gap под действием Bed и Cad; (2) автоактивацию генов gap; (3) сильную репрессию по принципу обратной связи между генами gap с неперекрывающимися областями экспрессии; (4) асимметричную репрессию между генами gap, чьи области экспрессии перекрываются; (5) репрессию по принципу прямой связи генов gap в задней части эмбриона под действием терминального гена til. Эта топография является внутренне непротиворечивой, достаточной для объяснения наблюдаемых картин экспрессии генов gap и, в целом, согласуется с литературными данными.

7. Подтверждена гипотеза о том, что в будущей зародышевой полоске области распределения концентраций мРНК Кг, kni, gt и hb локализуются асимметрично относительно областей распределения концентраций соответствующих белков и сдвинуты относительно последних в направлении к переднему полюсу эмбриона.

8. Показано, что численное моделирование позволяет сопоставить группу генных взаимодействий со специфичным регуляторным процессом: сдвиги границ экспрессии генов gap происходят из-за асимметричности регуляторных взаимодействий между этими генами, при которых ген, область экспрессии которого расположена ближе к заднему концу эмбриона, репрессирует ген с перекрывающейся областью экспрессии, но расположенной ближе к переднему концу. Эти сдвиги пе зависят от действия материнских градиентов и диффузии продуктов генов gap между ядрами.

9. Создана база данных FlyEx (http://urchin.spbcas.ru; http://flyex.ams.sunysb.-edu/flyex), являющаяся пространственно-временным атласом экспрессии генов сегментации. База предоставляет пользователю информацию о динамике формирования областей экспрессии генов сегментации и позволяет произвести получение любых объемов данных по запросу.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Самсонова, Мария Георгиевна, Санкт-Петербург

1. Белоусов, JI.B. (2005). Основы общей эмбриологии. "Наука", Изд-во Московского университета, Москва, Россия.

2. Вапник, В. Н., Червоненкис, А. Я. (1974). Теория распознавания образов. Наука, Москва.

3. Вапник, В. Н. (1979). Восстановление зависимостей по эмпирическим данным. Наука, Москва.

4. Закс,Л. (1976). Статистическое оценивание. "Статистика", Москва.

5. Жимулев, И.Ф. (2003). Общая и молекулярная генетика. Сибирское университетское издательство, Новосибирск, Россия.

6. Корочкин, JL И. (2002). Биология индивидуального развития. Изд-во Московского университета, Москва, Россия.

7. Мясникова, Е., Самсонова, А., Самсонова,М. Рейнитц,Д. (2001). Пространственная регистрация данных об экспрессии генов in situ. Молекулярная биология, 35:1110-1115.

8. Самсонова, М.Г., Гурский, В.В., Козлов, К.Н., Самсонов, A.M. (2006). Системный подход к исследованию организмов. Научно-технические ведомости СПбГТУ, 2:222-234.

9. Суркова, С.Ю., Мясникова, Е.М., Козлов, К.Н., Самсонова, А.А., Райииц, Д., Самсонова, М.Г. (2008). Метод получения количественных данных из конфокальных изображений картин экспрессии генов in situ. Цитология, 50:170-185.

10. Aegerter-Wilmsen, Т., Aegcrter, С. М., and Bisseling, Т. (2005). Model for the robust establishment of precise proportions in the early drosophila embryo. J Theor Biol, 234(l):13-9.

11. Aizenberg, I., Myasnikova, E., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2002). Temporal classification of drosopila segmentation gene expression patterns by the multi-valued neural recognition method. Mathematical Biosciences, 176:145-159.

12. Akam, M. (1987). The molecular basis for metameric pattern in the drosophila embryo. Development, 101:1-22:

13. Baldock, R., Bard, J., Brune, R., Hill, В., Kaufman, M., Opstad, K., Smith, D., Stark, M., Waterhouse, A., Yang, Y., and Davidson, D. (2001). The edinburgh mouse atlas: using the cd. Brief Bioinform, 2(2):159-69.

14. Bergmann, S., Sandler, O., Sberro, H., Shnider, S., Schejter, E., Shilo, B. Z., and Barkai, N. (2007). Pre-steady-state decoding of the bicoid morphogen gradient. PLoS Biol, 5(2):e46.

15. Berleth, Т., Burri, M., Thoma, G., Bopp, D., Richstein, S., Frigerio, G., Noll, M., and Niisslein-Volhard, C. (1988). The role of localization of bicoid rna in organizing the anterior pattern of the drosophila embryo. The EMBO Journal, 7:1749-1756.

16. Blair, S. S. (2007). Wing vein pattering in drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 23:293-319.

17. Boring, С. C., Squires, T. S., and Tong, T. (1993). Cancer statistics, 1993. CA Cancer J Clin, 43(l):7-26.

18. Bronner, G. and Jackie, H. (1991). Control and function of terminal gap gene activity in the posterior pole region of the drosophila embryo. Mechanisms of Development, 35:205-211.

19. Brown, L. G. (1992). A survey of image registration techniques. ACM Computing Surveys, 24(4):325-376.

20. Bullock, S. L. and Ish-Horowicz, D. (2001). Conserved signals and machinery for RNA transport in drosophila oogenesis and embryogenesis. Nature, 414:611-616.

21. Campos-Ortega, J. A. and Hartcnstein, V. (1985). The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. Springer, Heidelberg, Germany.

22. Capovilla, M., Eldon, E. D., and Pirrotta, V. (1992). The giant gene of drosophila encodes a b-ZIP DNA-binding protein that regulates the expression of other segmentation gap genes. Development, 114:99-112.

23. Casanova, J. (1990). Pattern formation under the control of the terminal system in the drosophila embryo. Development, 110:621-628.

24. Child, C. (1941). Patterns and Problems of Development. University of Chicago Press, Chicago.

25. Chu, K. W. (2001). Efficient parallel simulated annealing: The existence and estimation of an optimal mixing regime. PhD thesis, State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY.

26. Clyde, D. E., Corado, M. S. G., Wu, X., Pare, A., Papatsenko, D., and S., S. (2003). A self-organizing system of repressor gradients establishes segmental complexity in drosophila. Nature, 426:849-853.

27. Codd, E. F. (1990). The relational model for database management : version 2. Addison-Wesley, Reading, Mass.

28. Crick, F. (1970). Diffusion in embryogenesis. Nature, 225:420-422.

29. Crimmins, T. R. (1985). Geometric filter for speckle reduction. Applied Optics, 24:1438-1443.

30. Davidson, D. and Baldock, R. (2001). Bioinformatics beyond sequence: mapping gene function in the embryo. Nat Rev Genet, 2(6):409-17.

31. Davis, G. K. and Patel, N. H. (2002). Short, long and beyond: Molecular and embryological approaches to insect segmentation. Annual Reviews in Entomology, 47:669-699.

32. Dequin, R., Saumweber, H., and Sedat, J. (1984). Proteins shifting from the cytoplasm into tlie nuclei during early embryogenesis of drosophila melanogaster. Developmental Biology, 104:37-48.

33. Diambra, L. and da Costa, F. (2005). Complex networks approach to gene expression driven phenotype imaging. Bioinformatics, 21:3846-3851.

34. Driever, W. and Niisslein-Volhard, C. (1988a). The Bicoid protein determines position in the drosophila embryo in a concentration-dependent manner. Cell, 54:95-104.

35. Driever, W. and Niisslein-Volhard, C. (1988b). A gradient of Bicoid protein in drosophila embryos. Cell, 54:83-93.

36. Driever, W. and Niisslein-Volhard, C. (1989). The Bicoid protein is a positive regulator of hunchback transcription in the early drosophila embryo. Nature, 337:138-143.

37. Driever, W., Thoma, G., and Niisslein-Volhard, C. (1989). Determination of spatial domains of zygotic gene expression in the drosophila embryo by the affinity of binding sites for the Bicoid morphogen. Nature, 340:363-367.

38. Dubnau, J. and Struhl, G. (1996). RNA recognition and translational regulation by a homeodomain protein. Nature, 379:694-649.i

39. Dubois, L., Lecourtois, M., Alexandre, C., Hirst, E., and Vincent, J. P. (2001). Regulated endocytic routing modulates wingless signaling in drosophila embryos. Cell, 105(5):613-24.

40. Edgar, B. A., Odell, G. M., and Schubiger, G. (1989). A genetic switch, based on negative regulation, sharpens stripes in drosophila embryos. Developmental Genetics, 10:124-142.

41. Eldon, Е. D. and Pirrotta, V. (1991). Interactions of the drosophila gap gene giant with maternal and zygotic pattern-forming genes. Development, 111:367-378.

42. Entchev, E. V., Schwabedissen, A., and Gonzalez-Gaitan, M. (2000). Gradient formation of the tgf-beta homolog dpp. Cell, 103(6):981-91.

43. Ephrussi, A. and St Johnston, D. (2004). Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell, 116(2): 143-52.

44. Foe, V. E. (1989). Mitotic domains reveal early commitment of cells in drosophila embryos. Development, 107:1-25.

45. Foe, V. E. and Alberts, В. M. (1983). Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in drosophila embryogenesis. The Journal of Cell Science, 61:31-70.

46. Frasch, M., Hoey, Т., Rushlow, C., Doyle, Y., and Levine, M. (1987). Characterization and localization of the even-skipped protein of drosophila. The EMBO Journal, 6:749759.

47. Frasch, M. and Levine, M. (1987). Complementary patterns of even-skipped and fushi-tarazu expression involve their differential regulation by a common set of segmentation genes in drosophila. Genes and Development, 1:981-995.

48. Frigerio, G., Burri, M., Bopp, D., Baumgartner, S., and Noll, M. (1986). Structure of the segmentation gene paired and the drosophila PRD gene set as part of a gene network. Cell, 47:735-746.

49. Furriols, M. and Casanova, J. (2003). In and out of torso rtk signaling. The EMBO Journal, 22:1947-1952.

50. Gaul, U. and Jackie, H. (1987). Pole region-dependent repression of the drosophila gap gene kriippel by maternal gene products. Cell, 51:549-555.

51. Gaul, U. and Jackie, H. (1989). Analysis of maternal effect mutant combinations elucidates regulation and function of the overlap of hunchback and kriippel gene expression in the drosophila blastoderm embryo. Development, 107:651-662.

52. Gaul, U., Seifert, E., Schuh, R., and Jackie, H. (1987). Analysis of kriippel protein distribution during early drosophila development reveals posttranscriptional regulation. Cell, 50:639-647.

53. Gierer, A. and Meinhardt, Н. (1972). A theory of biological pattern formation. Kybernetik, 12:30-39.

54. Gilbert, S. F. (2003). Developmental Biology, Seventh Edition. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts 01373.

55. Gonzalez, R. C. and Woods, R. E. (2002). Digital image processing. Prentice Hall, Upper Saddle River, N.J., 2nd edition.

56. Goodwin, В. C. and Kauffman, S. A. (1990). Spatial harmonics and pattern specification in early drosophila development. I: Bifurcation sequences and gene expression. The Journal of Theoretical Biology, 144:303-319.

57. Gregor, Т., Bialek, W., de Ruyter van Steveninck, R. R., Tank, D. W., and Wieschaus, E. F. (2005). Diffusion and scaling during early embryonic pattern formation. Proc Natl Acad Sci USA, 102(51):18403-7.

58. Gregor, Т., Wieschaus, E. F., McGregor, A. P., Bialek, W., and Tank, D. W. (2007). Stability and nuclear dynamics of the bicoid morphogen gradient. Cell, 130(l):141-52.

59. Gurdon, J. B. and Bourillot, P.-Y. (2001). Morphogen gradient interpretation. Nature, 413:797-803.

60. Gursky, V. V., Jaeger, J., Kozlov, K. N., Reinitz, J., and Samsonov, A. M. (2004). Pattern formation and nuclear divisions are uncoupled in drosophila segmentation: Comparison of spatially discrete and continuous models. PhysicaD, 197:286-302.

61. Gutjahr, Т., Frei, E., and Noll, M. (1993). Complex regulation of early paired expression: Initial activation by gap genes and pattern modulation by pair-rule genes. Development, 117:609-623.

62. Harding, К., Hoey, Т., Warrior, R., and Levine, M. (1989). Autoregulatory and gap gene response elements of the even-skipped promoter of drosophila. The EMBO Journal, 8:1205-1212.

63. Harding, K. and Levine, M. (1988). Gap genes define the limits of antennapedia and bithorax gene expression during early development in drosophila. The EMBO Journal, 7:205-214.

64. Hartenstein, V., Lee, A., and Toga, A. W. (1995). A graphic digital database of drosophila embryogenesis. Trends Genet, ll(2):51-8.

65. Hecksher-Sorensen, J. and Sharpe, J. (2001). 3d confocal reconstruction of gene expression in mouse. Mech Dev, 100(1) :59-63.

66. Hoch, M., Gerwin, N., Taubert, H., and Jackie, H. (1992). Competition for overlapping sites in the regulatory region of the drosophila gene kriippel. Science, 256:94-97.

67. Hoch, M., Schroder, C., Seifert, E., and Jackie, H. (1990). Cis-acting control elements for kriippel expression in the drosophila embryo. The EMBO Journal, 9:2587—2595.

68. Hoch, M., Seifert, E., and Jackie, H. (1991). Gene expression mediated by cis-acting sequences of the kriippel gene in response to the drosophila morphogens Bicoid and Hunchback. The EMBO Journal, 10:2267-2278.

69. Houchmandzadeh, В., Wieschaus, E., and Leibler, S. (2002). Establishment of developmental precision and proportions in the early drosophila embryo. Nature, 415:798-802.

70. Howard, K. and Ingham, P. W. (1986). Regulatory interactions between the segmentation genes fushi tarazu, hairy, and engrailed in the drosophila blastoderm. Cell, 44:949-957.

71. Howard, K. and Struhl, G. (1990). Decoding positional information: Regulation of the pair-rule gene hairy. Development, 110:1223-1231.

72. Ни, M.-K. (1962). Visual pattern recognition by moment invariants. IRE transactions of information theory, IT-8:179-187.

73. Hiilskamp, M., Lukowitz, W., Beermann, A., Glaser, G., and Tautz, D. (1994). Differential regulation of target genes by different alleles of the segmentation gene hunchback in drosophila. Genetics, 138:125-134.

74. Hiilskamp, М., Pfeifle, С., and Tautz, D. (1990). A morphogenetic gradient of Hunchback protein organizes the expression of the gap genes kruppel and knirps in the early drosophila embryo. Nature, 346:577-580.

75. Hiilskamp, M., Schroder, C., Pfeifle, C., Jackie, H., and Tautz, D. (1989). Posterior segmentation of the drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature, 338:629-632.

76. Jackie, H., Rosenberg, U. В., Preiss, A., Seifert, E., Knipple, D. C., Kienlin, A., and Lehmann, R. (1985). Molecular analysis of kruppel, a segmentation gene of drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 50:465-473.

77. Jackie, H., Tautz, D., Schuh, R., Seifert, E., and Lehmann, R. (1986). Cross-regulatory interactions among the gap genes of drosophila. Nature, 324:668-670.

78. Jaeger, J., Sharp, D. H., and Reinitz, J. (2007). Known maternal gradients are not sufficient for the establishment of gap domains in drosophila melanogaster. Mech Dev, 124(2):108-28.

79. Janssens, H., Hou, S., Jaeger, J., Kim, A. R., Myasnikova, E., Sharp, D., and Reinitz, J. (2006). Quantitative and predictive model of transcriptional control of the drosophila melanogaster even skipped gene. Nat Genet, 38(10):1159-65.

80. Janssens, H., Kosman, D., Vanario-Alonso, С. E., Jaeger, J., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2005). A high-throughput method for quantifying gene expression data from early drosophila embryos. Dev Genes Evol, 215(7):374-81.

81. Jaynes, J. and Fujioka, M. (2004). Drawing lines in the sand: even skipped et al. and parasegment boundaries. Dev Biol., 269:602-622.

82. Kerrigan, L. A., Croston, G. E., Lira, L. M., and Kadonaga, J. T. (1991). Sequence-specific transcriptional antirepression of the drosophila kruppel gene by the GAGA factor. The Journal of Biological Chemistry, 266:574-582.

83. Kirkpatrick, S., Gelatt, C. D., and Vecchi, M. P. (1983). Optimization by simulated annealing. Science, 220:671-680.

84. Kitano, H. (2002). Systems biology: a brief overview. Science, 295(5560):1662-4.

85. Klingler, M. and Gergen, J. P. (1993). Regulation of runt transcription by drosophila segmentation genes. Mechanisms of Development, 43:3-19.

86. Kolchanov and Hofestadt (2005). Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. Springer Science+Business Media, Inc.

87. Kosman, D. and Small, S. (1997). Concentration-dependent patterning by an ectopic expression domain of the drosophila gap gene knirps. Development, 124:1343-1354.

88. Kosman, D., Small, S., and Reinitz, J. (1998). Rapid preparation of a panel of polyclonal antibodies to drosophila segmentation proteins. Development, Genes and Evolution, 208:290-294.

89. Kozlov, K., Myasnikova, E., Pisarev, A., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2002a). A method for two-dimensional registration and construction of the two-dimensional atlas of gene expression patterns in situ. In Silico Biology, 2:125-141.

90. Kozlov, K., Myasnikova, E., Samsonova, M., Reinitz, J., and Kosman, D. (2000b). Method for spatial registration of the expression patterns of drosophila segmentation genes using wavelets. Computational Technologies, 5:112-119.

91. Kraut, R. and Levine, M. (1991a). Mutually repressive interactions between the gap genes giant and kriippel define middle body regions of the drosophila embryo. Development, 111:611-621.

92. Kraut, R. and Levine, M. (1991b). Spatial regulation of the gap gene giant during drosophila development. Development, 111:601-609.

93. Krishna, S., Banerjee, В., Ramakrishnan, Т. V., and Shivashankar, G. V. (2005). Stochastic simulations of the origins and implications of long-tailed distributions in gene expression. PNAS, 102:4771Ц4776.

94. Macdonald, P. M. and Struhl, G. (1986). A molecular gradient in early drosophila embryos and its role in specifying the body pattern. Nature, 324:537-545.

95. Manu, Surkova, S., Spirov, A., Gursky, V., Janssens, H., Kim, A., Radulescu, O., Vanario-Alonso, C., Sharp, D., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2008). Canalization in the drosophila blastoderm. Nature, submitted.

96. Martinez-Arias, A. and Lawrence, P. (1985). Parasegments and compartments in the drosophila embryo. Nature, 313:639-642.

97. Meinhardt, H. (1977). A model of pattern formation in insect embryogenesis. The Journal of Cell Science, 23:117-139.

98. Meinhardt, Н. (1978). Space-dependent cell determination under the control of a morphogen gradient. The Journal of Theoretical Biology, 74:307-321.

99. Meinhardt, H. (1986). Hierarchical inductions of cell states: A model for segmentation in drosophila. The Journal of Cell Science (Supplement), 4:357—381.

100. Meinhardt, H. (1988). Models for maternally supplied positional information and the activation of segmentation genes in drosophila embryogenesis. Development (Supplement), 104:95-110.

101. Meinhardt, H. and Gierer, A. (2000). Pattern formation by local self-activation and lateral inhibition. Bioessays, 22(8):753-60.

102. Merrill, P. Т., Sweeton, D., and Wieschaus, E. (1988). Requirements for autosomal gene activity during precellular stages of drosophila melanogaster. Development, 104:495-509.

103. Metropolis, N., Rosenbluth, A., Rosenbluth, M. N., Teller, A., and Teller, E. (1953). Equation of state calculations by fast computing machines. The Journal of Chemical Physics, 21:1087-1092.

104. Mjolsness, E., Sharp, D. H., and Reinitz, J. (1991). A connectionist model of development. The Journal of Theoretical Biology, 152:429-453.

105. Mlodzik, M., Fjose, A., and Gehring, W. J. (1985). Isolation of caudal, a drosophila homeo box- containing gene with maternal expression, whose transcripts form a concentration gradient at pre-blastoderm stage. The EMBO Journal, 4:2961-2969.

106. Mlodzik, M. and Gehring, W. J. (1987). Expression of the caudal gene in the germ line of drosophila: formation of an RNA and protein gradient during early embryogenesis. Cell, 48:465-478.

107. Mohler, J., Eldon, E. D., and Pirrotta, V. (1989). A novel spatial transcription pattern associated with the segmentation gene, giant, of drosophila. The EMBO Journal, 8:1539-1548.

108. Murata, Y. and Wharton, R. P. (1995). Binding of Pumilio to maternal hunchback mRNA is required for posterior patterning in drosophila embryos. Cell, 80:747-756.

109. Myasnikova, E., Samsonova, A., Kozlov, K., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2001). Registration of the expression patterns of drosophila segmentation genes by two independent methods. Bioinformatics, 17:3-12.

110. Myasnikova, E., Samsonova, M., Kosman, D., and Reinitz, J. (2005). Removal of background signal from in situ data on the expression of segmentation genes in drosophila. Dev Genes Evol, 215:320-6.

111. Nauber, U., Pankratz, M. J., Kienlin, A., Seifert, E., Klemm, U., and Jackie, H. (1988). Abdominal segmentation of the drosophila embryo requires a hormone receptor-like protein encoded by the gap gene knirps. Nature, 336:489-492.

112. Niisslein-Volhard, C., Frohnhofer, H. G., and Lehmann, R. (1987). Determination of anteroposterior polarity in drosophila. Science, 238:1675-1687.

113. Niisslein-Volhard, C. and Wieschaus, E. (1980). Mutations affecting segment number and polarity in drosophila. Nature, 287:795-801.

114. Niisslein-Volhard, C., Wieschaus, E., and Kluding, H. (1984). Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in drosophila melanogaster. I. Zygotic loci on the second chromosome. Roux's Archives of Developmental Biology, 193:267-282.

115. Ochoa-Espinosa, A., Yucel, G., Kaplan, L., Pare, A., Рига, N., Oberstein, A., Papatsenko, D., and Small, S. (2005). The role of binding site cluster strength in bicoid-dependent patterning in drosophila. Proc Natl Acad Sci USA, 102(14):4960-5.

116. Pankratz, M. J., Busch, M., Hoch, M., Seifert, E., and Jackie, H. (1992). Spatial control of the gap gene knirps in the drosophila embryo by posterior morphogen system. Science, 255:986-989.

117. Pankratz, M. J., Hoch, M., Seifert, E., and Jackie, H. (1989). Kruppel requirement for knirps enhancement reflects overlapping gap gene activities in the drosophila embryo. Nature, 341:337-340.

118. Pereanu, W. and Hartenstein, V. (2004). Digital three-dimensional models of drosophila development. Curr Opin Genet Dev, 14(4):382-91.

119. Perkins, T. J., Jaeger, J., Reinitz, J., and Glass, L. (2006). Reverse engineering the gap gene network of drosophila melanogaster. PLoS Comput Biol, 2(5):e51.

120. Piatt, J. (1998). Fast training of support vector machines using sequential minimal optimization. In Scholkopf, В., Burges, C., and Smola, A., editors, Advances in Kernel Methods Support Vector Learning., pages 185-209. MIT Press, Cambridge.

121. Poustelnikova, E., Pisarev, A., Blagov, M., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2004). A database for management of gene expression data in situ. Bioinformatics, 20:22122221.

122. Press, W. H., Teukolsky, S. A., Vetterling, W. Т., and Flannery, B. P. (1992). Numerical Recipes in C. Cambridge University Press, Cambidge, U.K.

123. Pritchard, D. K. and Schubiger, G. (1996). Activation of transcription in drosophila embryos is a gradual process mediated by the nucleocytoplasmic ratio. Genes and Development, 10:1131-1142.

124. Reinitz, J., Kosman, D., Vanario-Alonso, С. E., and Sharp, D. H. (1998). Stripe forming architecture of the gap gene system. Developmental Genetics, 23:11-27.

125. Reinitz, J. and Levine, M. (1990). Control of the initiation of homeotic gene expression by the gap genes giant and tailless in drosophila. Developmental Biology, 140:57-72.

126. Reinitz, J., Mjolsness,' E., and Sharp, D. H. (1995a). Cooperative control of positional information in drosophila by bicoid and maternal hunchback. The Journal of Experimental Zoology, 271:47-56.

127. Reinitz, J. and Sharp, D. H. (1995b). Mechanism of eve stripe formation. Mechanisms of Development, 49:133-158.

128. Reinitz, J. and Sharp, D. H. (1996). Gene Circuits and Their Uses. In Collado, J., Magasanik, В., and Smith, Т., editors, Integrative Approaches to Molecular Biology, chapter 13, pages 253-272. MIT Press, Cambridge, Massachusetts, USA.

129. Reinitz, Л., Vanario-Alonso, С. E., and Sharp, D. II. (1995b). Gap gene expression patterns encode only one set of pair-rule stripes. Technical Report LAUR-95-3069, Los Alamos National Laboratory.

130. Rivera-Pomar, R. and Jackie, H. (1996). Prom gradients to stripes in drosophila embryogenesis: filling in the gaps. Trends Genet, 12(ll):478-83.

131. Rivera-Pomar, R., Lu, X., Perrimon, N., Taubert, H., and Jackie, H. (1995). Activation of posterior gap gene expression in the drosophila blastoderm. Nature, 376:253-256.

132. Rivera-Pomar, R., Niessing, D., Schmidt-Ott, U., Gehring, W. J., and Jackie, H. (1996). RNA binding and translational suppression by Bicoid. Nature, 379:746-749.

133. Rohr, К. В., Tautz, D., and Sander, K. (1999). Segmentation gene expression in the mothmidge clogmia albipunctata (diptera, psychodidae) and other primitive dipterans. Development, Genes and Evolution, 209:145-154.

134. Rothe, M., Nauber, U., and Jackie, H. (1989). Three hormone receptor-like drosophila genes encode an identical DNA-binding finger. The EMBO Journal, 8:3087-3094.

135. Rothe, M., Pehl, M., Taubert, H., and Jackie, H. (1992). Loss of gene function through rapid mitotic cycles in the drosophila embryo. Nature, 359:156-159.

136. Samsonova, M., Pisarev, A., and Blagov, M. (2003). Processing of natural language queries to a relational database. Bioinformatics, 19:241-249.

137. Sanchez, L. and Thieffry, D. (2001). A logical analysis of the drosophila gap-gene system. The Journal of Theoretical Biology, 211:115-141.

138. Sander, K. (1975). Pattern specification in the insect embryo. Ciba Found Symp, 0(29):241-63.

139. Scholkopf, В., Burges, C. J. C., and Smola, A. J. (1999). Advances in kernel methods : support vector learning. MIT Press, Cambridge, Mass.

140. Scholkopf, В., Smola, A., and Mtiller, K.-R. (1998). Nonlinear component analysis as a kernel eigenvalue problem. Neural Computation, 10:1299-1319.

141. Scholkopf, B. and Smola, A. J. (2002). Learning with kernels : support vector machines, regularization, optimization, and beyond. Adaptive computation and machine learning. MIT Press, Cambridge, Mass.

142. Schroder, C., Tautz, D., Scifert, E., and Jacklc, H. (1988). Differential regulation of the two transcripts from the drosophila gap segmentation gene hunchback. The EMBO Journal, 7:2881-2887.

143. Schulz, C. and Tautz, D. (1994). Autonomous concentration-dependent activation and repression of kriippel by hunchback in the drosophila embryo. Development, 120:30433049.

144. Schulz, C. and Tautz, D. (1995). Zygotic caudal regulation by hunchback and its role in abdominal segment formation of the drosophila embryo. Development, 121:1023-1028.

145. Schtipbach, T. and Wieschaus, E. (1986). Maternal effect mutations altering the anterior-posterior pattern of the drosophila embryo. Roux Archives of Developmental Biology, 195:302-317.

146. Slien, ,1. and Castan, S. (1986). An optimal linear operator for edge detection. In Proceedings CVPR '86, Miami.

147. Shermoen, A. W. and O'Farrell, P. H. (1991). Progression of the cell cycle through mitosis leads to abortion of nascent transcripts. Cell, 97:303-310.

148. Simcox, A. A. and Sang, J. Н. (1983). When does determination occur in drosophila embryos? Developmental Biology, 97:212-221.

149. Simpson-Brose, M., Treisman, J., and Desplan, C. (1994). Synergy between the Hunchback and Bicoid morphogens is required for anterior patterning in drosophila. Cell, 78:855-865.

150. Small, S., Blair, A., and Levine, M. (1996). Regulation of two pair-rule stripes by a single enhancer in the drosophila embryo. Developmental Biology, 175:314-324.

151. Smola, A. and Scholkopf, B. (1998). A tutorial on support vector regression.

152. Sonoda, J. and Wharton, R. P. (1999). Recruitment of Nanos to hunchback mRNA by Pumilio. Genes and Development, 13:2704-2712.

153. Sorzano, С. O. S., Blagov, M., Thevenaz, P., Myasnikova, E., Samsonova, M., and Unser, M. (2006). Registration in application to confocal images of gene expression. Pattern Recognition and Image Analysis, 16:93-96.

154. St Johnston, D. (2005). Moving messages: the intracellular localization of mrnas. Nat Rev Mol Cell Biol, 6(5):363-75.

155. St Johnston, D. and Niisslein-Volhard, C. (1992). The origin of pattern and polarity in the drosophila embryo. Cell, 68:201-219.

156. Steingrimsson, E., Pignoni, F., Liaw, G. J., and Lengyel, J. A. (1991). Dual role of the drosophila pattern gene tailless in embryonic termini. Science, 254:418-421.

157. Still, M. (2003). Graphics from the command line. IBM developer Works, July 16, 2003(http://www-128.ibm.com/developerworks/library/l-graf/?ca=dnt-428).

158. Struhl, G. (1989). Differing strategies for organizing anterior and posterior body pattern in drosophila embryos. Nature, 338:741-744.

159. Struhl, G., Johnston, P., and Lawrence, P. A. (1992). Control of drosophila body pattern by the hunchback morphogen gradient. Cell, 69:237-249.

160. Struhl, G., Struhl, K., and Macdonald, P. M. (1989). The gradient morphogen Bicoid is a concentration-dependent transcriptional activator. Cell, 57:1259-1273.

161. Surkova, S., Kosman, D., Kozlov, K. N., Manu, Myasnikova, E., Samsonova, A., Spirov, A., Vanario-Alonso, С. E., Samsonova, M., and Reinitz, J. (2007).

162. Characterization of the drosophila segment determination morphome. Dev. Biol., doi: 10.1016/j.ydbio.2007.10.037167.

163. Swantek, D. and Gergen, J. (2004). Ftz modulates runt-dependent activation and repression of segment-polarity gene transcription. Development, 131:2281-2290.

164. Tautz, D. (1988). Regulation of the drosophila segmentation gene hunchback by two maternal morphogenetic centres. Nature, 332:281-284.

165. Tautz, D., Lehmann, R., Schniirch, H., Schuh, R., Seifert, E., Kienlin, A., Jones, K., and Jackie, II. (1987). Finger protein of novel structure encoded by hunchback, a second member of the gap class of drosophila segmentation genes. Nature, 327:383389.

166. Tautz, D. and Sommer, R. J. (1995). Evolution of segmentation genes in insects. Trends in Genetics, 11:23-27.

167. Tchuraev, R. N. and Galimzyanov, A. V. (2001). Modeling of actual eukaryotic control gene subnetworks based on the method of generalized threshold models. Molecular Biology (Moscow), 35:1088-1094.

168. Teleman, A. A. and Cohen, S. M. (2000). Dpp gradient formation in the drosophila wing imaginal disc. Cell, 103(6):971-80.

169. Tremml, G. and Bienz, M. (1989). An essential role of even-skipped for homeotic gene expression in the drosophila visceral mesoderm. Embo J, 8(9):2687-93.

170. Turing, A. M. (1952). The chemical basis of morphogenesis. Transactions of the Royal Society London, Series B, 237:37-72.

171. Unser, M. (1996). A practical guide to the implementation of the wavelet transform. In Aldroubi, A. and Unser, M., editors, Wavelets in Medicine and Biology, chapter 2, pages 37-73. CRC Press LLC, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington D.C.

172. Unser, M., Aldroubi, A., and Schiff, S. (1994). Fast implementation of the continuous wavelet transform with integral scales. IEEE Trans. Signal Process., 42:3519-3523.

173. Vapnik, V. (1995). The Nature of Statistical Learning Theory. Springer, N.Y.

174. Warrior, R. and Levine, M. (1990). Dose-dependent regulation of pair-rule stripes by gap proteins and the initiation of segment polarity. Development, 110:759-767.

175. Weigel, D., Jiirgens, G., Klingler, M., and Jackie, II. (1990). Two gap genes mediate maternal terminal pattern information in drosophila. Science, 248:495-498.

176. Wieschaus, E. and Sweeton, D. (1988). Requirements for X-linked zygotic gene activity during cellularization of early drosophila embryos. Development, 104:483-493.

177. Wilkie, G. S. and Davis, I. (2001). Drosophila wingless and pair-rule transcripts localize apically by dynein-mediated transport of rna particles. Cell, 105(2):209-19.

178. Wolpert, L. (1969). Positional information and the spatial pattern of cellular differentiation. The Journal of Theoretical Biology, 25:1-47.

179. Wolpert, L. (1989). Positional information revisited. Development (Supplement), 107:3-12.

180. Wolpert, L. (1996). One hundred years of positional information. Trends in Genetics, 12:359-364.

181. Wu, X., Vasisht, V., Kosman, D., Reinitz, J., and Small, S. (2001). Thoracic patterning by the drosophila gap gene hunchback. Developmental Biology, 237:79-92.

182. Yasuda, G. К., Baker, J., and Schubiger, G. (1991). Temporal regulation of gene expression in the blastoderm drosophila embryo. Genes and Development, 5:18001812.

183. Yeo, E. (2006). Jmagick. http://www.yeo.id.au/jmagick/.

184. Yu, Y. and Pick, L. (1995). Non-periodic cues generate seven ftz stripes in the drosophila embryo. Mechanisms of Development, 50:163-175.

185. Yucel, G. and Small, S. (2006). Morphogens: precise outputs from a variable gradient. Curr Biol, 16(1):R29-31.

186. Zinzen, R. P. and Papatsenko, D. (2007). Enhancer responses to similarly distributed antagonistic gradients in development. PLoS Comput Biol, 3(5):e84.