Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация популяций и клонов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в южной части азиатского ареала

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация популяций и клонов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в южной части азиатского ареала"

На правах рукописи

Зацепина Ксения Геннадьевна

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ И КЛОНОВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PINUSSYLVESTRIS L.) В ЮЖНОЙ ЧАСТИ АЗИАТСКОГО АРЕАЛА

03.02.01 - «Ботаника»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 НОЯ 2014

Красноярск - 2014

005556035

005556035

Работа выполнена в Западно-Сибирском филиале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор сельскохозяйственных наук Тараканов Вячеслав Вениаминович

доктор биологических наук Банаев Евгений Викторович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией дендрологии

доктор биологических наук Горошкевич Сергей Николаевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт мониторинга климатических и экологических систем Сибирского отделения Российской академии наук, заведующий лабораторией денроэкологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический сад-институт Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится 27 января 2015 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.056.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук (ИЛ СО РАН) по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок №50, стр.28

Т/факс: (391) 243-36-86; адрес сайта Института http://www.forest.akadern.ru E-mail: institute forest@ksc.krasn.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://www.forest.akadem.ru Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН.

* о

Автореферат разослан « » ноября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Южные леса Сибири всё ещё фрагментарно охвачены исследованиями по таким важнейшим направлениям, как оценка популяционной дифференциации древесных растений, уточнение внутривидовой систематики и лесосеменного районирования, паспортизация деревьев на генетико-селекционных объектах и др. При этом работы по изучению внутривидовой изменчивости осуществляются преимущественно на территории Средней и Восточной Сибири [Ирошников, 1977 а, б; 1978; Сосна обыкновенная ..., 1988; Ларионова, 2002; Ларионова и др., 2007; Тихонова, 2004 а, б; Тихонова, Семериков, 2010; Милютин и др., 2013], в то время как исследования по изучению единого генетико-селекционного комплекса хвойных пород - преимущественно на юге Западной Сибири [Урусов, Алексеев, 1987; Демиденко и др., 1991; Тараканов и др., 2001]. Скоординированные исследования по комплексному изучению лесообразующих видов, особенно перспективному в зонах контакта ареалов внутривидовых таксонов и видов [Коропачинский, Милютин, 2006], практически не осуществляются.

В частности, в Алтайском крае, где наиболее ценной в экономическом и экологическом плане породой является сосна обыкновенная, имеется лишь приблизительная информация о её внутривидовой систематике и популяционной структуре [Правдин, 1964; Ирошников, 1977 а, б; Демиденко, Урусов, 1984; Кузьмина, Кузьмин, 2010; Милютин и др., 2013]. Особенно интересны и нуждаются в детальных исследованиях ленточные боры, в зоне распространения которых постулируется граница между сибирским Р. sylvestris L. s.sp. sibirica Ledebour и кулундинским Р. s. s.sp. kulundensis Sukaczew подвидами сосны [Правдин, 1964; Милютин и др., 2010]. Эта территория лишь фрагментарно представлена в обобщающих публикациях по генетической изменчивости сосны [Семериков и др., 1993; Петрова, Санников, 1996; Санников, Петрова, 2003], что не позволяет оценить реальный таксономический статус изученных популяций. Совершенно не изучены молекулярно-генетическими методами и объекты крупнейшего в Сибири генетико-селекционного комплекса сосны, созданного в Алтайском крае лесными селекционерами, что существенно снижает эффективность программ по рациональному использованию генетических ресурсов этого вида.

В связи с рассмотренным, в настоящей работе предпринята попытка решить некоторые из указанных проблем методами молекулярной генетики.

Цель исследования - изучить особенности популяционной дифференциации сосны обыкновенной P'mus sylvestris L. в южной части азиатского ареала.

Задачи исследования:

1. С использованием методов аллозимного и ДНК-анализов провести сравнительное изучение природных популяций сосны обыкновенной в степных и лесостепных борах юга Сибири;

2. Оценить степень дифференциации между сибирским Р. sylvestris L. s.sp. sibirica Ledebour и кулундинским Р. s. s.sp. kulundensis Sukaczew подвидам сосны (в понимании Л.Ф. Правдина);

3. Оценить степень дифференциации между природными и клоновыми популяциями Р. sylvestris L. в Алтайском крае;

4. Изучить эффективность поэтапной паспортизации деревьев, включающей «фенетический» и «генетический» этапы, на клоновой плантации Р. sylvestris L.

Научная новизна:

1. Впервые с использованием изоферментных и ДНК-маркеров оценена генетическая структура популяций сосны обыкновенной в ранее не исследованной части её ареала (Алтайский край);

2. На основе анализа изменчивости аллозимных локусов нескольких десятков популяций сосны обыкновенной из остепненных местообитаний юга Сибири впервые показано, что сибирский и кулундинский «подвиды» этого вида (Р. s. ssp. sibirica Leib, и Р. s. ssp. kulundensis Sukaczew) [Правдин, 1964] не достигают уровня подвидов;

3. Впервые для юга Сибири осуществлён сравнительный анализ генетической структуры клоновых плантаций плюс-деревьев и естественных насаждений сосны;

4. Впервые апробирован генетический этап 2-х этапной паспортизации деревьев на клоновых плантациях сосны, снижающий себестоимость этого мероприятия приблизительно в 3-4 раза; и оценена точность «фенетической» паспортизации, которая составляет около 97%.

, Теоретическое и практическое значение. Полученные данные о генетическом разнообразии и межпопуляционной изменчивости сосны обыкновенной в ранее не изученной части ареала вносят существенный вклад в изучение внутривидовой дифференциации этого вида. Выявленные закономерности в распределении наследственной изменчивости могут быть использованы при разработке программ по сохранению и рациональному использованию генофонда Р. sylvestris L. на юге Сибири. Большое практическое значение может иметь обоснование экономической эффективности двухэтапной паспортизации деревьев на клоновых плантациях, включающей «фенетический» и «генетический» этапы.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на 3-м международном совещании по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири (Красноярск, 2011), международной молодежной конференции «Биопространство» в рамках фестиваля науки (Томск, 2012), международном генетическом совещании-семинаре «Молекулярная генетика в практике лесного хозяйства: состояние, проблемы и перспективы применения» (Москва, 2014); всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Лесные

биогеоценозы бореальной зоны: география, структура, функции, динамика», (Красноярск, 2014).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 10 статьях, в т. ч. в 4-х статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы и пяти приложений. Работа изложена на 115 страницах, содержит 16 таблиц и 12 рисунков. Библиографический список включает 160 работ, 51 из которых на иностранном языке.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в сборе экспериментального материала в клоновых популяциях сосны в Алтайском крае, генетическом анализе всех образцов, интерпретации результатов и написании статей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сосна обыкновенная на юге Сибири характеризуется достаточно высоким уровнем наследственной изменчивости, сопоставимым с таковым для основной части её ареала; при этом географические комплексы популяций, относимые Л.Ф. Правдиным к сибирскому Р. sylvestris L. s.sp. sibirica Ledebour и кулундинскому Р. s. s.sp. kulundensis Sukaczew подвидам, не достигают уровня аллозимной дифференциации, характерного для различий подвидового ранга.

2. Паспортизацию плюсовых деревьев сосны и их клоновых потомств рационально осуществлять в несколько этапов с применением методов лесоводства, фенетики и молекулярной генетики, что существенно сокращает затраты на её проведение на стадии молекулярно-генетического анализа.

Благодарности. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю д.с.-х.н. В.В. Тараканову, а также д.б.н. B.JI. Семерикову и к.б.н. А.К. Экарту за всестороннюю помощь в работе над диссертацией. Особо благодарю к.б.н. А.Н. Кравченко, к.б.н. О.С. Дымшакову за помощь в проведении экспериментальных работ, к.б.н. С.А. Семерикову, к.б.н. А.Я. Ларионову, д.б.н., проф. Л.И. Милютина, д.б.н. В.А. Соколова и д.б.н. A.A. Коновалова за критические замечания и ценные указания при отработке методик, планировании исследований и обсуждении результатов работы. Также крайне признательна сотрудникам Западно-Сибирского филиала Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, лаборатории лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН и лаборатории молекулярной экологии Института экологии растений и животных УрО РАН за всестороннюю помощь. Благодарю к.с-х.н. Л.И. Кальченко, Р.В. Роговцева, к.б.н. И.В. и H.A. Тихоновых, к.б.н. А.П. Барченкова и к.с-х.н. С. Жамьянсурена за помощь при сборе экспериментального материала.

Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке ИП СО РАН № 53, РФФИ 11-04-92226-Монг_а и РФФИ 11-04-00033-а.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приводится анализ работ отечественных и зарубежных авторов по следующим направлениям: 1.1. Ботаническая характеристика сосны обыкновенной; 1.2. Ареал и внутривидовая изменчивость сосны обыкновенной на юге Сибири; 1.3. Единый генетико-селекционный комплекс сосны обыкновенной (ЕГСК) на юге Западной Сибири; 1.4. Генетические маркеры и их использование для дифференциации генофонда видов древесных растений; 1.5. Применение генетических маркеров для оптимизации работ по лесному селекционному семеноводству; 1.6. Изменчивость естественных и искусственных популяций сосны обыкновенной.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования являются естественные и искусственные популяции сосны обыкновенной Pinus sylvestris L. в южной части азиатского ареала: 1) 31 естественная популяция (ценопопуляция) в степной и лесостепной зонах Алтайского, Красноярского и Забайкальского краёв. Республик Тыва и Хакасия, а также в Монголии; 2) три клоновых плантации "плюсовых" деревьев в Алтайском крае; 3) семь "климатипов" в географических культурах, произрастающих в Сузунском лесничестве Новосибирской области. Акцент в исследованиях сделан на недостаточно изученную территорию ленточных боров Алтайского края, в пределах которых постулируется граница между кулундинским и сибирским подвидами сосны, и на клоновые плантации плюс-деревьев этого вида в Алтайском крае (рис. 1, табл. 1).

Изучение изоферментного полиморфизма сосны обыкновенной проводилось с использованием электрофореза в крахмальном геле. Гомогенизацию вегетативных почек проводили в 1 -2 каплях холодного экстрагирующего буфера. Разделение гомогенатов проводили методом горизонтального электрофореза при температуре 5° С в течение 6 часов в трех буферных системах [Markert, Faulhaber, 1965; Clayton, Tretiak, 1972]. Гистохимическое окрашивание ферментов проводилось по стандартным методикам с некоторыми модификациями [Brewer, 1970; Vallejos, 1983; Гончаренко, Падутов, 1988; Manchenko, 1994]. Локусы и аллели обозначали по Ф. Айала (1984). С использованием программы GenAIex 6 [Peakall, Smouse, 2006] вычислялись частоты аллелей и стандартные параметры генетической изменчивости. Для анализа структуры и степени подразделенное™ популяций сосны обыкновенной использовались F-статистики Райта. Также были рассчитаны генетические дистанции D М. Ней [Nei, 1972] между популяциями и матрицы значений D, которые были использованы для проведения кластерного анализа. Для анализа связи между географическими и генетическими расстояниями использовался тест Мантела [Mantel, 1967].

Рис. 1 Карта Алтайского края, а также южных частей Средней Сибири, Восточной Сибири и Монголии с указанием отобранных популяций.

Изучение генетической изменчивости сосны обыкновенной проводилось с использованием ДНК-анализа хлоропластных микросателлитных локусов (cpSSR). Выделение ДНК проводили по стандартному протоколу, разработанному для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ-метод). Было использовано 4 локуса: Pt 15169, Pt 71936, Pt 30204, Pt 26081 [Vendramin et al, 1996]. Продукты ПЦР разделялись в 6%-ном полиакриламидном денатурирующем геле и выявлялись посредством окрашивания нитратом серебра. Варианты размеров подсчитывались визуально. Наиболее короткому из фрагментов присваивался номер 1, фрагменту длиннее на один нуклеотид - номер 2, и т.д. Комбинация аллелей проанализированных локусов определялась как гаплотип. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием пакета программ Arlequin ver 3.1 [Excoffier et al, 2006]. При оценке изменчивости хлоропластных гаплотипов внутри популяций вычисляли: число гаплотипов (jV0), среднее значение генетических расстояний между индивидами в популяции (052л), нормированное число гаплотипов на размер выборки g минус единица (rg-l), гаплотипическое разнообразие (Не) [Nei, 1987].

ГЛАВА 3. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ PINUSSYLVESTRIS L НА

ЮГЕ СИБИРИ

3.1. Дифференциация популяций по аллозимным локусам. Для

электрофоретического анализа изоферментов у сосны обыкновенной использовали 11 ферментных систем (MDH, GOT, SkDH, 6-PGD, IDH, LAP, FDH, PGM, GDH, ADH, FE). Полностью мономорфными в исследованных популяциях сосны обыкновенной оказались лишь локусы Mdh-1, Lap-1, Idh и Pgm-2. Остальные локусы, хотя и в разной степени, обнаруживают изменчивость. Самое большее число аллельных вариантов ферментов (9 аллелей) имеет локус Skdh-1. В остальных локусах число аллелей варьирует от двух до пяти.

Произрастающая в южных районах Сибири и Монголии сосна обыкновенная характеризуется достаточно высоким в среднем уровнем генетического разнообразия (табл. 1). Наиболее значительно различаются по уровню изменчивости популяции, расположенные в южных районах Средней Сибири (Красноярский край, Тыва, Хакасия).

Максимальные значения гетерозиготности и эффективного числа аллелей (Но=0,280; Не=0,257; Ne=l,48) наблюдаются в степной популяции сосны из Минусинского бора, минимальные (Но=0,180; Не=0,183; Ne=l,32) - в горнотаежной популяции, расположенной на Куртушибинском перевале. В Алтайском крае различия между популяциями по уровню изменчивости выражены в меньшей степени.

Генетическое расстояние между популяциями О [>1е1, 1972] варьирует от 0,003 до 0,039, составляя в среднем 0,015. Степень дифференциации популяций сосны из разных регионов изученного ареала в среднем (0=0,016) несколько выше внутрирегиональной (0=0,010). Наиболее значительно различаются по генетической структуре популяции сосны из Монголии и Алтая (0=0,019).

Что касается различий между популяциями, формально относимыми к кулундинскому и сибирскому подвидам, то средняя генетическая дистанция между выборками внутри подвидов составила 0,014±0,0005, а между популяциями различных подвидов 0,016±0,0005. Таким образом, генетические различия между географическими комплексами популяций, относимых к кулундинскому и сибирскому подвидам, совпадают с таковыми между регионами (ландшафтными странами) и статистически значимо превышают различия между популяциями внутри подвидов. При этом они не достигают уровня, формально принятого для различий подвидового ранга [Гончаренко и др., 1989; Санников, Петрова, 2003].

Как видно на проекции изученных популяций сосны обыкновенной (рис. 2), популяции из южных районов Средней Сибири (юг Красноярского края, Хакасия и Тыва), Бурятии, Алтайского края и Монголии несколько отделены друг от друга пространственно, однако не формируют четко обособленных групп.

Рис. 2. Проекция изученных популяций сосны обыкновенной на плоскости двух координат по данным РСА-анализа матрицы генетических расстояний М. Ней 1972], вычисленных по изоферментным локусам.

Таблица 1. Список популяций, отобранных для анализа, их географические координаты н основные параметры генетической изменчивости, полученные с помощью методов изоферментого анализа и анализа изменчивости хлоропластных микросателлитных локусов. __________

Популяция Координаты И, м Р,% N3 N6 Но Не Р п гг1 Не

с.ш. в.д.

Алтайский край

Круглое 51° 18' 80° 2 Г 220 75,0 2,25 1.37 0.218 0.215 -0,018 23 18 4.9 9,5 0.976

Мирный 51° 28' 79° 56' 190 70,0 2.30 1.34 0.212 0.203 -0,029

Перешеечный 51° 44' 80° 5 Г 230 14 13 6,0 7,6 0,989

Михашовское 51° 49' 79° 47' 170 19 15 3.4 8,9 0,971

Сросты 51° 58' 81° 06' 180 75,0 2,40 1,36 0.221 0,224 0,019 22 16 5,0 9,1 0.970

Волчиха 52° 03' 80° 25' 220 23 21 3,2 10,3 0,992

Вострово 52° 07' 80° 36' 240 19 17 4,3 9,5 0,988

Крестьянка 52° 27' 81° 38' 200 75,0 2,25 1.37 0,227 0,222 -0,015 17 15 5.4 9,1 0.985

Мамонтове 52° 42' 81° 38' 210 75,0 2,20 1,37 0.228 0,215 -0,049 22 18 4.5 9,6 0.978

Ребриха 53° 03' 82° 20' 160 75,0 2,35 1,39 0,216 0,232 0,046

Боброека 53° 14' 83° 56' 210 75,0 2,20 1.36 0.238 0.214 -0,081

Макарове 53° 17' 82° 00' 170 60,0 2,25 1.40 0,216 0,226 0,044 22 16 3,2 9,1 0.970

Ларичиха 53° 52' 83° 10' 193

Среднее по региону 72,5 2,27 1,37 0,222 0,219 -0,010 16,6 4,43 9,2 0,980

Средняя Сиби рь (Красноярский край, Тыва, Хакасия)

Шира 54° 24' 89° 59' 350 80,0 2,20 1,37 0,217 0,224 0,008 23 16 4,0 8,9 0,964

Минусинск 53° 37' 91° 38' 280 70,0 2.25 1.48 0.280 0,257 -0,079 23 17 5.5 9,2 0,968

Танзыбей 53° 04' 92° 34' 500 75,0 2,30 1,40 0,252 0,235 -0,065 23 17 5,1 9,4 0,976

Куртушибинск 52° 18' 93° 37' 1300 70,0 2,00 1,32 0,180 0.183 -0,006

Шагонар 51° 31' 93° 14' 700 75,0 2,35 1.42 0,240 0.239 -0,022 23 18 4.0 9,5 0.976

Балгазын 51° 02' 95° 03' 875 75,0 2.20 1.47 0.255 0.259 0.026 23 20 6.0 9,9 0.984

Среднее по региону 74,2 2,22 1.41 0,237 0.233 -0,023 17,6 4,92 9,38 0.974

Восточная Сибирь

Ивоягинск 51° 48' 107° 16' 585 75,0 2.35 1.46 0.257 0.244 -0.049 21 18 3.6 9,7 0.986

Чикой 50° 17' 106° 51' 595 75,0 2.55 1,42 0,233 0.231 -0,017 24 17 4,0 9,2 0.967

Джида 50° 50' 105° 57' 870 70,0 2,35 1.41 0.220 0.232 0.015 24 15 4.4 8,5 0.949

Новоселенгинск 50° 58' 106° 36' 640 70.0 2,25 1.41 0.235 0.228 -0,040 24. 17 4.1 8.9 0.953

Среднее по региону 72,5 2.37 1,42 0,236 0.234 -0,023 16,6 4 9,13 0,967

Монголия (Восточный Хэнтзй)

Богда-Уул 47° 49' 106° 52' 1740 75,0 2,20 1,37 0,199 0,217 0,051 24 19 5,6 9,7 0.978

Баян-Адарг 48° 32' 111° 03' 1114 70,0 2,05 1,38 0.224 0.219 -0,025 22 18 4,1 9,5 . 0.978

Хшент-Уул 48° 45' 111° 36' 985 70.0 2,10 1.37 0.202 0,207 -0,006 23 19 4,0 9,8, 0.978

Баян-Уул 49° 06' 112° 58' 971 70.0 2,20 1,39 0.233 0.220 -0,061 24 17 3,4 9,0; 0,960

Ульхан-гр. с РФ 49° 30' 112° 34' 829 75,0 2,25 1,44 0,252 0,243 -0,043

Биндэр 48° 39' 110° 26' 1059 75.0 2,25 1,44 0.248 0.240 -0,035 24 19 5.4 9,8 0.982

Ульхан-1 49° 14' 112° 36' 1039 70,0 2,10 1.35 0,227 0,217 -0,041 23 15 2.5 8,9, 0,964

Ульхан-2 49° 13' 112° 37' 1012 75,0 2,25 1,45 0,237 0,248 0,022 24 18 5,5 9,4 0,975

Среднее по региону 72,5 2,17 1,40 0,228 0,226 -0,017 17,85 4,36 9,44 0,83

Среднее по всем популяциям 72,9 ±0,74 2,25 ±0,05 1,40 ±0,018 0,229 ±0,009 0,227 ±0,009 -0,017 ±0,007 17,08 4,44 9,28 0,936

Примечание: Ь - высота над уровнем моря, генетические параметры, полученные с помощью изоферментного анализа (Р - процент полиморфных локусоп, Ыа - среднее число аллелей на локус, Ые - эффективное число аллелей. Но - наблюдаемая гетерозиготность, Не -ожидаемая гетерозиготность, Р - индекс фиксации Райта) и анализа изменчивости хлоропластныхмикросателлитов (п - размер выборки, Ы0 -_2

число гаплотипов, - среднее значение генетических расстояний между индивидуумами в популяции, /у1 - нормированное число гаплотипов на размер выборки % минус единица. Не - гаплотипическое разнообразие).

Основные результаты данной главы сводятся к следующему.

1) Изученные популяции по основным характеристикам их аллозимного разнообразия в целом укладываются в пределы соответствующих показателей, приводимых для этого вида в литературе.

2) Внутри регионов менее дифференцированы популяции из ленточных боров Алтайского края и островных боров Монголии; более - популяции из Средней Сибири.

3) Наблюдается существенная дифференциация между регионами, относящимися фактически к различным ландшафтным странам на уровне, близком к географическим комплексам популяций.

4) Значительные генетические различия обнаружены между популяциями, формально (по Л.Ф. Правдину, 1964) относящимся к различным подвидам. Однако, в соответствии с классификацией С.Н. Санникова и соавторов [2003, 2012] эти различия не достигают подвидового уровня и соответствуют рангу локальных популяций. При этом следует иметь в виду, что они проявляются при сравнении комплексов популяций, растянутых по долготе более чем на 2 тыс. км.

3.2. Дифференциация популяций по хлоропластным микросателлитным ДНК-маркерам. Для более детальной характеристики генетической изменчивости сосны из ленточных боров Алтая с использованием высокоизменчивых микросателлитных локусов хлороплатной ДНК было исследовано 9 популяций. Для сопоставления данных были взяты популяции из Восточной Сибири и Монголии В результате исследования была выявлена высокая изменчивость, характерная как для сосны обыкновенной, как вида, так и для хлоропластных микросателлитов, как маркеров. Было обнаружено восемь и семь аллелей в локусах РН5169 и Р130204, соответственно и по пять аллелей в локусах П71936 и Р126081.

Сочетание аллелей четырех локусов рассматривалось как гаплотип. Всего было выявлено 136 гаплотипов. Из них 13 встретились 10 и более раз, 66 -менее 10 раз, но более одного (редкие), остальные - по одному разу. В среднем было обнаружено 17,08 гаплотипов на популяцию, большая часть индивидов в популяции имела уникальный для этой выборки гаплотип. Кластеризация популяций с помощью БАМОУА не выявила географической структуры. При любом числе групп популяций образовывался один кластер, включающий большую часть популяций и один или несколько кластеров, содержащих одну популяцию. 130°

Несмотря на отсутствие выраженной географической структуры, некоторые гаплотипы ограничены в своем распространении определенными регионами. Так, гаплотип 5646 с частотой более 1% встретился в популяциях из Алтайского края и Средней Сибири, а в популяциях из Бурятии и Монголии отсутствовал. Аналогично, другой гаплотип (6455) встретился в монгольских и бурятских популяциях, но полностью отсутствовал в сибирских. В качестве примера на рис. 3. приведены географические распределения частот двух редких гаплотипов, специфичных для основных регионов.

ю

Рис. 3. Расположение популяций Pinus sylvestris L., исследованных с помощью маркеров cpSSR. Частоты двух гаплотипов (5646, 6455), специфичных для двух регионов, представлены в виде круговых диаграмм. Последовательность цифр (аллелей) каждого гаплотипа соответствует данной последовательности локусов: Pt71936, Ptl5169, Pt30204, Pt26081.

Полученные данные во многом совпадают с выводами, сделанными на основе аллозимных исследований [Семериков и др., 1993; Санников и др., 2012], свидетельствующими об однородности генетической структуры сосны обыкновенной на основной части ее ареала. Тем не менее, как и аллозимные данные, маркеры ср8811 выявляют различия между большими географическими регионами, выражающиеся в наличии специфичных редких гаплотипов.

ГЛАВА 4. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОТОМСТВ ПРОСТРАНСТВЕННО УДАЛЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В УСЛОВИЯХ ГЕОГРАФИЧЕСКИХ КУЛЬТУР

Выращивание потомств из природных популяций в однородных экологических условиях - один из старейших методов анализа популяционно-географической изменчивости древесных растений. В нашей работе анализ географических культур использовался для расширения охвата исследований ареала сосны на юге Сибири по широте. При этом была косвенно оценена возможность трансформации генетической структуры исследуемых популяций в пунктах испытаний под влиянием дрейфа генов и отбора.

Анализ основных параметров генетической изменчивости показал, что изученные географические культуры сосны обыкновенной характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия. Во всех изученных культурах сосны наблюдаемое соотношение генотипов по большинству полиморфных локусов не отличалось от ожидаемого по Харди-Вайнбергу.

Генетическое расстояние О между климатипами варьирует от 0,000 до 0.014, составляя в среднем 0,007. Анализ значений Б показал, что, как и следовало ожидать, наиболее сильно дифференцированы потомства наиболее удаленных друг от друга по широте Семипалатинской и Енисейской популяций, относящиеся к различным подвидам [Правдин, 1964]. Также достаточно сильно по генетической структуре отличаются между собой климатипы из Енисейского, Кустанайского и Семипалатинского лесхозов (0=0,012). Объяснить различия между казахстанскими климатипами можно тем, что они находятся в зоне островного распространения сосны, в которой имеет место более выраженная пространственная изоляция. Вероятно, кулундинский подвид сосны обыкновенной, выделяемый Л.Ф. Правдиным для территории остепненных боров [Правдин, 1964], весьма неоднороден. Относительной пространственной изоляцией можно объяснить различия и между климатипами из Новосибирской области: Болотнинским (южная тайга) и Сузунским (лесостепь) (0=0,09). Различия между климатипами сибирского подвида из таежной зоны, как и следовало ожидать, значительно ниже. Другими словами, степень генетической дифференциации между потомствами географических популяций в целом коррелирует со степенью их пространственной удаленности, особенно по широте. Судя по статистике Райта /г,„ доля межпопуляционной изменчивости в среднем составляет 2,3%, варьируя по локусам в пределах 0,5-4,2%.

В целом полученные данные соответствуют картине межпопуляционных различий, выявленной как в весьма немногочисленных опубликованных работах для рассматриваемой и ' близлежащих территорий при изучении природных популяций сосны [Семериков и др., 1993], так и в наших исследованиях (см. гл. 3). Из этого следует, во-первых, что относительно слабая дифференциация кулундинского и сибирского "подвидов", выявленная нами при анализе популяций в южно-сибирской части ареала, не связана с особенностями выборки популяций вдоль границы "подвидов". Во-вторых, можно предположить, что выращивание потомств географических популяций в однородных условиях опыта (по крайней мере в первом поколении) не оказывает существенного влияния на генетическую структуру популяций.

ГЛАВА 5. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛОНОВЫХ И ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В АЛТАЙСКОМ КРАЕ

Из потомств плюсовых деревьев основных лесообразующих видов созданы тысячи гектаров лесосеменных и архивных клоновых плантаций, поэтому необходимо выяснить, насколько сильно влияет «плюсовая» селекция на генетическую гетерогенность искусственных популяций.

В качестве объектов исследования были выбраны три клоновые плантации и пять природных популяций сосны обыкновенной Pinus sylvestris L., сопоставимые по их популяционно-географическому происхождению.

На основании распределения наблюдаемых генотипов были рассчитаны частоты аллелей изоферментных локусов и стандартные показатели генетической изменчивости (табл. 2).

Сравнение полученных данных с литературными материалами свидетельствует, что изученные популяции сосны в целом характеризуются средним для вида уровнем генетического разнообразия [Глотов, 1983; Камалова и др., 1994; Шигапов, 1994, 1997; Санников, Петрова, 2003]. При этом, почти по всем показателям плантации и природные популяции оказываются очень близкими. Лишь по доле полиморфных локусов наблюдается недостоверная тенденция к ее повышению на 4,5% на клоновых плантациях в сравнении с популяциями (/=1,241; v=6; р> 0.10). Причём максимальная оценка 83,3% тоже относится к одной из плантаций. Возможно, увеличение полиморфности обусловлено некоторым смещением частот редких аллелей в выборке клонов.

Индексы фиксации Райта равны соответственно: Fis = 0,017, Fi, = 0,012, из чего следует, что популяции сосны, произрастающие в исследованной части ареала находятся в состоянии, близком к равновесному соотношению генотипов (согласно равновесию Харди-Вайнберга). Генетическое расстояние D [Nei, 1972] между популяциями варьирует от 0,0033 до 0,0175, что характерно для различий между географически близкими (смежными) популяциями. Но обращает на себя внимание то, что в целом степень различий между клоновыми плантациями существенно ниже, чем между природными популяциями.

В целом полученные результаты могут объясняться тем, что на клоновых плантациях представлены "смешанные" генофонды различных локальных популяций, что снижает "межплантационные" различия. Однако некоторые факты трудно объяснить с этих позиций. Первым из них является низкий уровень различий между плантациями ЛСП-80 и АК-96, которые основаны плюс-деревьями из различных лесосеменных районов. Второй интересный факт состоит в том, что плантация АК-96, основанная исключительно потомками плюс-деревьев из Ларичихинского лесничества, достоверно дистанцирована от природной популяции "Ларичиха" из этого же лесничества (0=0,0084). Из этих фактов допустимо предположение, что массовый отбор на скорость роста по крайней мере в некоторых ситуациях сопровождается изменением генетической структуры по аллозимным локусам. Для проверки этого предположения необходимы более детальные исследования.

Таблица 2. Показатели генетической изменчивости в исследованных популяциях.___

Объект 1 Р,% N. К - Но Не

Плантации

АК-96 83,3 2,389 1,369 0,217 0,217 -0,021

ЛСП-88 72,2 2,222 1,398 0,238 0,227 -0,033

ЛСП-80 77,8 2,056 1,359 0,211 0,221 0,017

Среднее 77,8± 2,222± 1,375± 0,222± 0,222± -0,012±

2,36 0.408 0,142 0,119 0,071 0,162

Природные популяции

Ларичиха 72,2 2,056 1,387 0,231 0,224 -0,012

Бобровка 77,8 2,222 1,385 0,225 0,226 -0,102

Мамонтове/ 77,8 2,222 1,404 0,244 0,230 -0,048

Ребриха 77,8 2,389 1,415 0,223 0,243 0,059

Макарово 61,1 2,278 1,425 0,224 0,236 0,060

Среднее 73,3± 2,233± 1,403± 0,229± 0,232± -0,009±

2,69 0,347 0,132 0,093 0,088 0,264

Среднее по всем 75,0± 2,229± 1,393± 0,227± 0,228± -0,010±

вариантам 2,58 0,357 0,149 0,104 0,091 0,234

Примечание: Р - полиморфность (процент полиморфных локусов); N0 - среднее число аллелей на локус; Ые - среднее эффективное число аллелей на локус; Но - средняя наблюдаемая гетерозиготность: Не - средняя ожидаемая гетерозиготность; р - индекс фиксации (коэффициент инбридинга).

ГЛАВА 6. ПАСПОРТИЗАЦИЯ ДЕРЕВЬЕВ НА КЛОНОВОЙ ЛЕСОСЕМЕННОЙ ПЛАНТАЦИИ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В АЛТАЙСКОМ КРАЕ

Для сокращения затрат на проведение индивидуального генотипирования разработан метод поэтапной паспортизации, включающий лесоводственный, фенетический и генетический этапы. Для генетической паспортизации привитых деревьев, отнесенных после фенетического анализа к различным

"фенетическим кластерам" [Кальченко, 2013], использовали метод аллозимного анализа. .. . г . ; . - .

В ходе генетического этапа для ускорения и удешевления процесса паспортизации был апробирован метод сопоставления многораметных (смешанных) и однораметных ("чистых", контрольных) образцов. Если все раметы имеют одинаковый генотип, то «смешанный» образец должен быть идентичен «контрольному». В случае проявления «загрязнения» в смешанном образце необходимо провести индивидуальные анализы.

Основные результаты сводятся к следующему:

1) По отношению к результатам аллозимного генотипирования доля безошибочно идентифицированных по фенам привоев составила 97,1 %.

2) Поэтапная паспортизация и метод «смеси» позволяют сократить затраты на аллозимный анализ при использовании крахмального геля по меньшей мере в 3 раза. Метод нуждается в дальнейшей доработке в связи с недостаточной изученностью влияния "разбавления" и взаимодействия аллозимов в смешанном образце, и неизученностью этого подхода в случае применения маркеров ДНК.

3) Практический итог проведенных исследований заключается в аллозимной паспортизации всех привитых деревьев и клонов, а также в корректировке схемы размещения клонов на исследуемой плантации. Доля неверно маркированных и не маркированных деревьев составила 11 %.

ВЫВОДЫ

1. Произрастающая в южных районах Сибири и Монголии Р. sylvestris L. характеризуется достаточно высоким уровнем генетического разнообразия, различные показатели которого варьируют среди изученных популяций в характерных для этого вида пределах: Р - 60-80%, Na - 2,00-2,55, Н0 - 0,1800,280. Наибольший вклад в дифференциацию вносят локусы Skdh-2 (12,8%) и Adh-2 (10,3%) На межпопуляционную составляющую изменчивости приходится около 4,5%.

2. Уровень аллозимной дифференциации между сибирским Р. sylvestris L. s.sp. sibirica Ledebour и кулундинским Р. s. s.sp. kulundensis Sukaczew подвидами (в понимании Л.Ф. Правдина) не достигает уровня, принятого для различий подвидового ранга.

3. В результате ДНК-анализа хлоропластных микросателлитов по 4 локусам (РИ5169, Pt71936, Pt30204, Pt26081) выявлена высокая изменчивость, характерная для сосны обыкновенной, как вида, а также и для хлоропластных микросателлитов, как маркеров. Наиболее изменчивыми оказались локусы Ptl 5169 и Pt30204 - в них обнаружено по 8 и 7 аллелей, соответственно, в локусе Pt71936 и Pt26081 обнаружено по 5 аллелей.

4. Клоновые плантации плюс-деревьев сосны на юге Западной Сибири (Алтайский край) сохраняют высокий уровень аллозимного полиморфизма, но в сравнении с природными популяциями отличаются пониженным уровнем межпопуляционной (межплантационной) изменчивости.

15

5. Сопоставление данных по фенетической паспортизации с данными генетического этапа исследований клоновой плантации сосны позволило оценить эффективность паспортизации деревьев по фенам генеративных органов, которая составила около 97 %. При этом себестоимость поэтапной паспортизации деревьев, включающей «фенетический» и собственно генетический (аллозимный) этапы, примерно в 3-4 раза ниже себестоимости генетической паспортизации, осуществляемой общепринятым методом.

6. Сравнительное изучение генетической структуры в природных популяциях сосны и в географических культурах этого вида на юге Западной Сибири свидетельствует о принципиальной близости соответствующих оценок аллозимной изменчивости, что позволяет сделать косвенное заключение о несущественной трансформации генофонда природных популяций в условиях географических культур.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

*3ацепина, К.Г. Генотипирование деревьев на клоновых плантациях лесообразующих видов хвойных в Западной Сибири / К.Г. Зацепина, А.К. Экарт. В.В. Тараканов // Хвойные бореальной зоны. - 2012. - Т. XXX. - № 1-2. -С. 67-71.

*Экарт, А.К. Генетическое разнообразие и дифференциация популяций сосны обыкновенной в Южной Сибири и Монголии / А.К. Экарт, А.Я. Ларионова, К.Г. Зацепина, А.Н. Кравченко, С. Жамъянсурен, И.В. Тихонова, В.В. Тараканов // Сибирский экологический журнал. - 2014. — №1. - С. 69-78.

*Семериков, В.Л. Полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластной ДНК сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в Азии и Восточной Европе / В.Л. Семериков, С.А. Семерикова, О.С. Дымшакова, К.Г. Зацепина, А.К. Экарт, В.В.Тараканов, И.В. Тихонова, А.И. Видякин, С. Жамьянсурен, Р.В. Роговцев, Л.И. Кальченко // Генетика. - 2014. - Т. 50. -№ 6. - С 660-669.

*3ацепина, К.Г. Генетическая дифференциация потомств пространственно удаленных популяций Pinus sylvestris L. в условиях географических культур / К.Г. Зацепина // Вестн. Том. гос. ун-та. - 2014. - № 382.-С. 221-224.

Зацепина, К.Г. Генотипирование деревьев на клоновых плантациях лесообразующих видов хвойных в Западной Сибири / К.Г. Зацепина, И.В. Тихонова, В.В. Тараканов, Л.И. Кальченко // Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири: материалы 3-го международного совещания (Красноярск, 2329 августа 2011 г.) - Красноярск, 2011. - С 49-50.

Тараканов, В.В. Оптимальная схема паспортизация деревьев на объектах генетико-селекционного комплекса сосны обыкновенной / В.В. Тараканов, Л.И. Кальченко, К.Г. Зацепина, А.К. Экарт, Д.Н. Шуваев // Сб. докладов. Первое международное совещание-семинар "Молекулярная генетика в практике

16

лесного хозяйства: состояние, проблемы и перспективы применения" (Москва, 28-29 мая 2014 г.). - М.: ФБУ "Рослесозащита", 2014. - С. 24-27.

Зацепнна, К.Г. Генетическая изменчивость клоновых и естественных популяций сосны обыкновенной в Алтайском крае / К.Г. Зацепина, А.К. Экарт, В.В. Тараканов, М.М. Белоконь, Ю.С. Белоконь, А.Я. Ларионова, Д.В. Политов, А.Н. Кравченко // Сб. материалов Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Лесные биогеоценозы бореальной зоны: география, структура, функции, динамика» (Красноярск, 16-19 сентября 2014 года). -Красноярск: ИЛ СО РАН, 2014. - С. 544-547.

Экарт, А.К. Генетическое разнообразие и структура южно-сибирских популяций сосны обыкновенной // Экарт А.К., Ларионова А.Я., Зацепина К.Г., Кравченко А.Н., В.В. Тараканов // Сб. материалов Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Лесные биогеоценозы бореальной зоны: география, структура, функции, динамика» (Красноярск, 16-19 сентября 2014 года). - Красноярск: ИЛ СО РАН, 2014. - С. 596-598.

Тараканов, В.В. Поэтапная паспортизация деревьев на объектах генетико-селекционного комплекса сосны обыкновенной / В.В. Тараканов, Л.И. Кальченко, К.Г. Зацепина, А.К. Экарт, Д.Н. Шуваев // Сибирский лесной журнал. - 2014. - №4. - С. 67-72.

Тихонова, И.В. О выборках в исследованиях внутривидового генетического разнообразия сосны обыкновенной / И.В. Тихонова, В.Л. Семериков, С.А. Семерикова, О.С. Дымшакова, К.Г. Зацепина. // Сибирский лесной журнал. - 2014. - №4.--С. 97-107.

* - в журналах списка ВАК

УОП ИЛ СО РАН Заказ № 64. Тираж 100 экз.