Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференциация культур микобактерий туберкулеза методами газожидкостной хроматографии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Дифференциация культур микобактерий туберкулеза методами газожидкостной хроматографии"

а '

министерство здравоохранения ссср

московская медицинская академия им. и.м. Сеченова

На правах рукописи

попов

Сергей Александрович

579.873.21:579.2221,088.3:543.544 576.8.078.2.852.211

дифференциация культур микоштерий туберкулеза методами гаэояидкосшй! ХРШТОТРМШ

Микробиология 03.00.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском Пне- , титуте туберкулеза шшистерства здравоохранения РСФСР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Официальные оппоненты: доктор медициной;« наук, профессор М.М. Дьа но доктор медицинских наук В.И. Голышевская

Ведущая органлаацня: Государственный научно-исследовательский стандартизации и контроля медико-биологических препаратов им. Л.А.Тараеевнча. 1,(3 СССР, р.'Москва,.

Защита состоится "'1XII1991 г. на заседании специализированного Совета Я>. О?1/. АГ /<5 в Ш.1А им. И.С. Сеченова {Иоскьа, у л, Б. Пироговская, 2/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

(Зубовская пл., д.6)

Автореферат разослан "

¿к. «31 г.

В.Ы. Должанокий

>'мекый секретарь

спеш» да к<! ■роваюкто Совету, к.м.н.

Ки ОНОВ А.Ю.

tU'JEKHifi

ягш

, l>

ГД*Л

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Экспресс-определение культур человеческого вида никобакте-туберкулеза и отделение ил от бычьего является первым и наиболее важным этапом работы -эпидемиологической и клинико-микробиологическом служб /Лисиченко Г.М., 1985; Курианбаев К.К.. 1990/. Возрастает число выявляет« форм микобактерий, не дающих однозначного ответа в иммунологических и биохимических диагнос-тикумах на принадлежность к человеческому виду. Увеличивается значение фильтрующихся и иорфологически измененных Форы в этнологии туберкулеза /Хоненко А.Г., 1982; Кривцова А.Е., 19S6; Го-лыиевская В.И., 1984; Tsukanura И,, 1988/. Кроне того, в зонах с повышенои радпацишieii бактериологическая диагностика туберкулеза занимает ведущее место.

Эффективность применения, противотуберкулезных препаратов зависит от своевременного их применения, однако до сегодняшнего дня для получения полной антибиограымы требуется 3 и более месяцев /Рудой Н.М., 1988/. При этом, получаемые результаты могут иметь разночтения /Ященко Т.Н., 1973/. Плеоморфный характер происходящих мутации приводит к глубокий перестройкам в метаболизме клеток /Бескровный П.С., 1982/, что непосредственно'отражается на их взаимоотношениях с макроорганизиоц на всех уровнях и поведении культур в тест-системах /Такауаша К., 1978; Уапо I., 1988/. •

S последнее время в эпидемиологической службе фтизиатрии серьезно ставится вопрос об описании региональных особенностей микобактерий туберкулеза /'Coilina С.Н., 1982/. Несмотря на получение в бактериологических лабораториях РС5СР 300-400 тыс. культур возбудителя, их картографирование до настояаего времени не проводилось и задача в широком масштабе не ставилась. Многие

уникальные свойства мшобактерин не учитываются в практической фтизиатрии /Сосновская Л.В., 1990; КоогегаоопЛ R.C., 1985; Jackett P.S., 1981/.

Выиеперечисленые проблемы связаны с тем, что' большинство рекомендованных бактериологической службе методов дают полуколичественные результаты. Многие на них недостаточно чувствительны и информативны, организационно громоздки. Бее это заставляет искать новью методические подходы изучения микобакте-рий, позволявшие осуществлять работы на всех уровнях их систематики. . Гаэожидкостная хроматография (ПШ в значительной мере отвечает этим требованиям и свободна от многих из из указанный недостатков. Ее отличает высокая чувствительность, больиая информативность, а также точность и воспроизводимость результатов, что дает возможность автоматизировать процесс анализа и его математическую интерпретацию.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Разработка комплексной методики видовой и итаммовой идентификации М.tuberculosis на основе методов газожидкостной хроматографии с математическим обеспечением, позволякщнм накапливать данные о молекулярном составе микробных клеток и проводить автоматизированную микробиологическую диагностику туберкулеза с характернзацней вьщелаемых культур. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Разработка эффективны*, высокочувствительных методов га-зозшдкостной хроиатографнн по определению веществ лиииднои природы, видоспецифкчньк для И.bovis и М.tuberculosis,

2. Выявление особенностей хроыатографических профилен лабораторных цтамшз микобактерий, получаемых в процессе- работы с культурами в зависимости от: - времени культивирования;

- типа питательной среды;

- наличия лекарственно» устойчивости.

3. Формализация полученных данных для проведения работ по видовой идентификации и определению' ытаммовои вариабельности инкобактерий с использованием ЭВМ.

НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Разработан метод ГЖХ-анализа вецеств лигшдной природы микробных клеток с ковш типом используемых производных и детектирования /Авт.свнд. I! 1168348/.

Метод чувствителен п избирателен в определении вецеств, ине-го'дт: больное число, йункцпональтк групп и обладаюцнх высокой метаболической аотивностыз /Авт.свнд. II 1334084/.

Сравнительное изучение микроорганизмов основано на данных, о молекулярном составе несвлоаньк компонентов [слеток, ранее не описанных в доступной литературе.

Реиена задача определения видовой и ытаимовой особенностей культур Н.1:иЬегси1оз1Б в динамике роста, выраженных на общепринятых лабораторных средах.

Показано принципиальное различие в молекулярном составе клеток НБТ, чувствительных и устойчивых к разным концентрациям стрептомицина как к одному но антибактериальных препаратов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты исследования закл&дыаа-гат основу для создания информационного банта данных, содеркаце-го характеристики молекулярного состава культур МВТ с учетом возраста, биологических особенностей культур, сред культивирования, принадлежности к лекарственно-резистентным формам.

Разработанные методологические подходы используктся для ав-токотизированной диагностики и определения динамики заболевания другими нозологическими йормаин: гепатитом, менингитом /Линберг Л.Ф., Попов С. А. 1985; 1988/.

ПОЛОЖЕНИЯ ВИШШЬЕ НА ЗАНИЖУ.

1. Разработана группа методов на основе гаоожидкостной хроматографии, позволяющая проводить экспресс-определение видовой принадлежности ыикобактерий туберкулеза, определение устойчивых культур к отдельный антибиотиковш препаратам, изучение молекулярных особенностей штаимовых вариантов данного вида шшо-бактернй.

2. Метаболические особенности штаммовых вариантов Н.tuberculosis в области низкошлекулярньи несвязаных компонентов клеток существенно зависят от состава культуральнои среды, возраста культуры, наличия и концентрации антибактериальных препаратов.

3. Формализация полученных данных при проведении работ по видовой и ташювой идентификации микобактерий позволяет в процессе накопления банка данных проводить автоматизированную мик-робислогическую диагностику туберкулеза.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1986), 1У Всесоюзной симпозиуме по применения) метематическик методов и ЭВМ в недикобпо логических исследованиях (Гагра, 1985),-UI Всероссийском съезде фтнзиаторов (Кемерово, 1987), Всероссийской конференции "Биология возбудителей заболеваний и их экспресс-диагностика" (Горький, 1386>, XII Московской конференции молодых ученых-фтизиаторов (Москва, 1987). •

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 11 работ, защищено 2. авторских свидетельства.

Внедрение. Результаты работы были внедрены в лаборатории молекуляоньк основ патогенеза ифекцноннои заболевании ПШШ эпидемиологии МЗ СССР. Акт о внедрени прилагается.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения (7 ), обзора литературы (25); собственных исследований (5 глав 106 стр.). заключения (20). библиографии (212 наим.-85 отеч,-26 стр.), 12 рисунков, 16 таблиц. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Материалы. В работе использовали культуры клеток М. bovis, ытаымы BCG-1 и Bovinus-8; М.tuberculosis, штамм H37Rv варианты 1/47, Praga. Т-2417-^3 (МНИИТ) чувствительные к стрептомицину, а также 3 варианта культуры T-24I7-53 устойчивых к стрептомицину в концентрации 5, 10, 50 мг/ыл, вариант Str-r итаюга H37Rv Н.tuberculosis - устойчивый к стрептомицину в концентрации 50 мг/мл (ГНИИСК ),ШП им.Л.Л.Тарасевича). Культуры микобактерий исследовались после 4-х недельного культивирования при стандартной посевной дозе, а также на стадиях роста в 1, 2, 3 иес. при низкой посевной дозе. Использовали плотные питательные среды: безаспарагиновые "Íwhh-2, Аникина Н6 (РН= 6,6-6,8); аспара-пш-содержацую Левенштейна-Йенсена <РН= 7,2-7,4); в том числе с добавкой стрептомицина в концентрации 5, 10, 50 нг/мл.

Хроматографическая техника: газовый хроматограф Tracör-560 с пламенно-ионизационным (ПИД) и электронно-захватньш (ЭЗД) детекторами; капиллярные колонки размером 50 м х 0.25 мм с непод-ви;шой жидкой фазой (№КФ) CS-10 и FS0T-1.

Реагенты: органические растворители особой чистоты, этери-фицирующие фторсодержаиие спирты, ацилирувпрге фторсодержащие реагенты. Приборы регистрации; микротекнгаса; ЭВМ "Hova-3". СМ-4.

Методы. Метилирование жирных кислот и силишрование оксисо-единений проводилось гю стандартный методикам /Knapp D.R.. 1979/. Зтерифицирование жирных кислот фторсодержащими реагента-

- б -

ии, ацилирование фторсодержащшш реагентами оксисоединенин, экстрактов из микобактерий и цельнокпеточного лнофилизата проводились по собственным методикам.

Хроматографирование стандартных соединении проводилось в изотермическом режиме, а веществ микобактерий в режиме линейного программирования температуры.

Первичная обработка хроматограим проводилась методом внутренней нормализации. Затем хроматограммы представляли в виде спектра, где по оси ординат - относительное процентное содержание вещества, а по оси абсцисс - закодированный номер пика. Преобразованные хроматографические профили подвергали статистической обработке и другим водам иатематичского анализа с использованием ЭВМ..

Мерой близости хроиатограиы служили коэффициент корреляции К и Евклидово расстояние R. Информационность хронатографическо-го профиля оценивалась величиной информационной энтрошш Шеннона /Корн Г., 1973/. При сравнении профилей в автоматизированном режиме использовалась специально адаптированная программа "Librara" в системе IHC0S 2000 DOS. В этом случае мерой близости профилей являлась их сходимость Rr.

Объем исследования: 250 посевов и пассажей культур иикобактерии : 800 анализов методами ПКХ по отработке базовьи методик; 1300 определений по адаптации разработанных методик и получении полных хроматографических профилей культур микобактерий; математическая обработка 420 хроматографических профилей с использованием ЭВМ. •

результаты и обсуждение;

ЯШРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ У. bovis и U.tuberculosis.

В основе видовой идентификации микобактерий методами гa tro-

жидкостной хроматографии лежит анализ жирных кислот клеточной стенки микроорганизмов. Проблем с определением больыинства видов условно-патогенных ннкобактерий, а также отделением их от группы патогенны* практически не возникает /Пинчук Л.М., 1980; Воробьев A.A.» Бздукианова Н.М., 1990; Ualero-Gueilen P.L., 1986/. Однако всеобще отмечается, что дифференциация последних затруднена. Таким образом, найдм ключевые отличия М.bovis и М. tuberculosis и сохраня преемственность результатов анализа для других видов, можно говорить о полной видовой идентификации ми-кобактерий.

Нами был исследован ряд фторсодержащих спиртов, как агентов этернфпкадии карбоксильной группы, в плане их хроматографичес-ких свойств. В виде фтор-производных становится доступным количественный анализ жирмокислотных соединении с 30-32 атомами углерода в цепи молекулы, улучшится условия разделения критических пар соединений. Принципиальное увеличение чувствительности (в 8-10 раз) достигнуто переходом к электроннооахватному детектировании. На модельном соединении был вняснен оптимальный способ защиты, сочетающий достижения обеих частей"исследования. Им оказалась дериватизация гексафторизопропашлои. В обцем; Случае это является новыествон в области DFX-анализа /A.C. II 1168846/.

При поиске маркерных вецеств, делающих доступным идентификацию культур визуальным способом,- необходимо учитывать динани-ку образванных критериев при вариациях состава питательной среды, времени культивирования клеточных культур. Эти ыоиенты не учитываются в болызинтсве работ и только в отдельньи публикациях, при строгом анализе надежности получаемых результатов, звучат как теоретически обоснованные /Larsson L., 1985/.

В силу вышеизложенного, исследование подверглись музейные

- а -

Таблица I.

Состав жирных кислот ыузейных культур H.bwis и tí.tuberculosis. (Рассчитано по площади пиков п=12, Р=0,05,"Н я)

У. содержание к общей сумме

Н | Кислота | H.bov is | Ы.tuberculosis

1. С Í2-.0 0,74 - 0.21 0,67 - 0.16

2. С 14:0 1,12 - 0.21 1,04 - 0.20

3. • С 15:0 1,01 - 0,13 1.04 - 0.12

4. с 16:0 49,32 - 5.01 45,79 - 4,41

5. с 17:0-изо 0,41 - 0,15 0,40 - 0,12

6. с 16:1 4,21 - 0.63 3.97 - 0,61

7. с 17:0 0,62 - 0,15 1.15 - 0.19

8. с 18:0-изо .0,05 - 0,01 0.10 - 0,03

9. с 17:1 0.09 - 0,02 0.07 - 0.02

Ю. с 18:0 7.80 - 0,81 6.80 - 0,60

И. с 19:0-изо 16.32 - 1,41 21.13 - 1,68

12. с 18:1 "11,03 - 1,18 11.52 - 1.11

13. с 19:0 0.11 - 0,02 0,34 - 0.05

14. с 20:0 0.62 - 0,07 0,56 - 0,07

15. с 22:0 0,39 - 0,08 0,42 - 0,08

16. с 22:1 ' 0,21 - 0,05 0,31 - 0,06

17. с 24:0 0.50 - 0,10 0,60 - 0,10

18. с 25:0 0.03 - 0,03 0,30 - 0,05

19. с 26^0 1,62 - 0,32 2,05 - 0.29

20. г 28:0 0,03 - 0.01 0,61 - 0,07

21. с 30:0 0,02 - 0,01 0,60 - 0,08

22. с 32:0 0,13 - 0.02 1,02 - 0,16

- э -

культуры итакмов M.bovis и субатаммы !137Rv М.tuberculosis, выращенные на питательных средах Девенштейна-Йенсена, Финна-2, Аникина 116. Состав жирных кислот сравнивался в фиксированном возрасте (4 нед.У при стандартном посеве. Кроме того, определялась динамика жирнокислотного спектра в зависимости от времени инкубирования при посеве культуры суспензией низкой плотности. Всего произведено более 80 определений.

Результат оказался следующим (Табл.1). За типнчньа"! спектр принимался состав жирньк килот микобактерий, выращенных на среде тинна-2 при стандартном посеве и времени выращшания 4 нед. В этих условиях все культуры М-. tuberculosis уверенно отличались от M.bovis более высоким содержанием кислот от октадокозановои до микоцерознновой (С28:0 - С32:0). Содержание их в первом случае составляло 0,2-1 '/., в то время как во втором они практически не определялись. При использовании питательных сред Левенш-тейна-Иенсена и Аникина HS .состав жирных кислот меняется на 8 -18 '/. при средней величине относительного стандартного отклоне-ння Sr=0,116 для М.tuberculosis и 5г=0,128 для M.bovis. Однако, во всех случаях выявленная разница в содержании микоцерозпновой и октадокозановой кислот сохраняла свое значение. Аналогичное заключение вытекает при сравнении культур с разным временем культивирования, хотя жирнокислотный спектр имел определенную динамику в части некоторых ненасыщенных соединений. Таким образом, относительно высокое содержание кислот С28;0 - С32:0, при описанных условиях их определения, можно считать хемотаксонони-ческим признаком Н.tuberculosis. При этом, критерием отличия этого вида от M.bovis является присутствие их в количестве 0,2 - 1,0 У. от общего содержания клеточных жирных кислот.

Разработанный метод имеет полную приеиотвенность но опреде-

лени» жирных кислот с меньшей молекулярной массой, что позволяет продолжить известный ряд ключевых и дополнителных признаков, опубликованный в литературе и полученный на большом эмпирическом материале /Пинчук Л.М., 1980; 1990 Воробьев А.А., Бадукша-шва Н.М., 1990 /.

ВЫЯВЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННО УСТОЙЧИВЫХ 40РН И.1иЬегси1ов15.

Из литературнш источников известно, что возникновение лекарственной устойчивости у микобактерий сопровождается изменениями по многим метаболическим системам клетки, и в частности, затрагивает синтез вецесте липидной и смеианой природы. В силу этого методы, должны обладать характеристиками профильного типа анализа, то есть, в качестве признака лекарственной устойчивости будут выступать не отдельные вещества или компоненты, а непосредственно хроматографический профиль или его преобразованный вид.

Так как адекватньи методик профильного анализа в доступной литературе нет, часть работы была посвящена решения этой проблеме.

Для расыирения диапазона анализа тяжелых полярных веществ был изучен ряд фторированных производных. Выяснено, что наилучшими экранирующими свойствами обладает пентафторпропионат (ГМЛ)-ацил. Разница индексов удерживания гидроксистеарата в виде традиционных производных (Ме-ТМС) и найденных (ПЙШ-ГИШ составляет 340 и 287 ед: при использовании неподвижных фаз ГЭОТ—I (универсальная неполярная) ч СБ-10 (высокополярная) соответственно." Это равнозначно расширению диапазона исследуемых соединений на 3-4 атона углерода. При увеличении количества функциональных группировок в молекуле зашита становится более эффективной. В этом случае выигрыш по сравнении с традиционной

- и -

запитой составит 500-600 ед.индекса.

Одновременное применение электронно-захватного детектирова-Ш1Я приводит к увеличении чувствительности к подобный соединений в 50-600 раз в зависимости от количества Функциональные группировок в молекуле. Предел детектирования составляет 5-10 нг вещества в водимом объеме.

Воспроизводимость результатов при профильном типе анализа составляет один из центральных моментов. Был найден оптимальный вариант сочетания температуры, экспозиции получения производных, других лабораторных процедур, позволивши"! сочетать достаточную насыщенность получаемого хроютографнческого профиля с воспроизводимостью адзое больней, чем в проготппньн работах /¿1аЬ!из Д., 1979; Нагсизоп Р., 1982/: достигнутая средняя величина относительного стандартного отклонения составила 5г=0,15.

Было выяснено, что хирнокислотный состав клеток с приобретение!! стрептоинщшо-устойчквости практически не меняется. В связи с этим при гидролизе их переводили в производные, к которым детектор не чувствителен. Остальные вещества обрабатывали фторсодержашшп реагентами. Это повысило информативность профиля, содержание которого составили различные оксикислоты, дполы, высшие спирты, моногшцериды, различные ноно- и дисахариды, их ацилпроизводные и другие продукты гидролиза клеток. При этон. вещества с большим содержанием функциональных группировок и обладающие высокой метаболической активностью приобрели значительное представительство в профиле в силу высокой селективности к нин детектора.

В данной части работы нами исследовались клонированные культуры М.ЬлЬегсиЛсшз Н37Ру Т 2417-53 устойчивые к 50 мкг/мл

í

Таблица 2.

Количественная оценка хроматографических профилен стрептоии-цино-устоичивой ii чувствительной форм М.tuberculosis, итаим H37Rv. (Рассчитано по плоцади пиков, п= 12; Р=0,05; М ♦ - ш).

II | Время злмиро-| 7, содержание! пика к общей сумме

пика|вання веществ I --------j----\---------------------------

i (мин,) | устойчивая форма ¡ чувствительная форма

1 1 7,11 i 0,26 0,026 ¡ 0,16 - 0,019

2 ! 11.06 i 0,22 — 0,023 | 0,25 - 0,025

3 1 ' 11,93 1 0,95 — 0,098 | 0.93 - 0,098 i

4 I 12,13 ¡ 3,36 0,32 . 1 5,17 - 0,48

5 1 13,43 1 0,45; 0,050 I 0,57 - 0,058

6 1 14,03 I 18,10; 1,52 | 21,13 - 1,93

7 1 17,61 i 0.81 0". 091 | 1,31 - 0,12

8 I 18,63 i 7,14'-- 0,53 ! 10.82 - 0,99

9 i 19,09 1 0,2? — 0,031 | 0,38 - 0,041

10 ! 23.40 ( 0,17 — 0,019 I 0,13 - 0,015

П 1 24,00 1 9,90 + - 0,95 1 10,87 - 0,91

12 i 24,27 i 0,095+- 0,01 1 0,14 - 0,016

J3 ! 24,65 ! 18,45 1,43 1 5,66 - 0,51

14 i 25,53 | 27,91 ♦ - 2,31 1 33,70 - 2,67

15 ! 26,57 i 5.66 ♦ - 0,52 ! 1,17 - 0,12

16 ! ' 29,43 1 0,98 0,099 1 0,73 - 0,076

17 ( "0,47 ¡ 1,74 ♦ - 0.16 1 2,68 - 0,25

'18 i 31,64 ! 1,40 «- 0,12 1 1,43 - 0,14

Vi i 32,69 1 0,62 ♦ - 0,088 I 1.41 - 0.14

20 i 36,57 1 0,38 — 0,032 ! 0,16 - 0.013

стрептомицина, полученные в лаборатории ШШГГ, а также рефе-ренс-культуры Str-r H37Rv из ГпППСК МБП им. Л. А. Тарасовича. Хроматографические профили культур получали при оговоренных выше стандартизированных условиям на среде Финн-2. Всего было проведено 84 анализа. Для получения рабочего профиля требовалось всего 50 мкг лшйнлизованной бактериальной массы.

В результате были выявлены характеристические профили устойчивых и чувствительных форм данного штампа (Табл.2). Покомпонентное сравнение профилей показало, что они нненгг множество отличий. Содержание различных веществ варьирует от 30 до 300%, что существенно больше, чем выявляемая разница внутри каждой из групп микобактерцй (в этом случае пределы вариаций . состаt ши 15-307.). . ;

I Так как суть профильного, анализа сводится к формализации отношений объект/профиль, образуюцу;ося совокупность профилей разбивали на группы или кластеры в зависимости от их степени близости. Последняя оценивалась математическими методами. В данном случае удобно пользоваться параметрическими методами статистического анализа. Коэффициент корреляции между образованными группами микобактерпй составил 0,932*-0,018, а Евклидово расстояние - 15,63 с радиусом каждой окружности 6,32. Это говорит о том, что имеющиеся группы данных не имеют точек пересечений. Выявленный масштаб различий превышает в 2-3 раза таковой, получаемый при определении межвидовых отличий на основе традиционных методов ГКХ. Например, коэффициент корреляции между хорошо разделяемыми группами ммкобактерий на основе жирно-кислотного анализа для групп М.tubercu1osis-Louis и H.avium-iiitracellulai-aa составляет 0,971 (Пинчук Л.М., 1982). Таким образом, описанная методика надежно регистрирует метаболические

изменения культур микобактерий туберкулеза под действием стрептомицина, как одного на основных противотуберкулезных препаратов. Дальнейшая работа по идентификации резистентных культур требует формализации результатов скришшговых исследований в системе базы данных.

ДИ'М£РЕЩ1АЩЫ ШГАМЮ8ЫХ ВАРИАНТОВ H.tuberculose.

Отправным моментом третьей части исследовании служили прямые и косвенные данные о наличии в клетках ШТ метаболически активных вецеств липкднои природы в свободном состоянии /Батраков С.Г., 1985; Yano 1., 1987; 1983/. Их относительная коцепт-рация в клетке невелика, однако чувствительность разаработанньгс методов позволяет ira определять в приемлемом количестве исходного материала.

Для получения максимально информативного профиля нами был проведен ряд исследований вариантов его получения при использовании различных, лабораторный процедур: изучали хлороформный, метанольный экстракты, цельноклеточный вариант. Информационность профилей оценивали величиной информационой энтропии Шеннона (Н(х)) /Уголев Д.А., 1982; Корн Г.. 1976/.

Всего изучено 38 хроматографических профиля культур, выращенных в стандартизированных условиях на среде Финн-2. Максимальную величину информационной энтропии (Н(х)= 3,2663347 для культуры 1/47) имел профиль, полученный по так называемому цельноклеточному варианту (прямая обработка лиошилизованной клеточной массы фторсодержащими реагентами).

Аналогичным образом было вьиснено влияние процедуры отмывки клеток физиологическим раствором для исключения возможного занесения в пробу частиц среды. Показано, что она снижает показатель Н(х) на 0,12.85056. Визуально, просишь попучзется более

Í5 -

бедный в области высокополярныч вецестз с относительно высокой молекулярной массой.

Различные питательные среды, являсь нагрузкой многих нета-болических систем клетки, создают метаболические профили с определенной информационной характеристикой. Это заставило провести соответствующее исследование. Изучались 22 культуры вьше-описанных вариантов итамиа H37Rv, чувствительных к стрептомицину, выращенных на питательных средах Левептейна-Йенсена, 4ин-на-2, Аникина Н6. В результате установлено, что близкие питательные среды (íiuina-2 и Аникина IÍ6) приводят к получении сходных метаболических профилен. Их отличительной чертой является наличие высокополярных с относительно больной молекулярной массой веществ, возможная природа которых относится к ацилзанецен-ным сахарам. Максимальной велнч!Шой Н(х) обладал профиль культур, выращенных на среде Аникина HS. Несколько меньшую информационную характеристику давала среда 4инна-2 и еще неньиуи - J!e-венштейна-Йенсена. Исходя из удобства работы, ira остановились на более плотной среде Финна-2.

Тцательная стандартизация условий заставляет более детально изучить вопрос влияния времени инкубирования на рисунок профиля. В сравнительных исследованиях использовали 32 профиля культур 1/47 и Praga, выращенных на среде <1мнна-2 с низкой посевной дозой и снятых через 4,8 и 12 нед. Выяснено, что более нолодые колонии продуцируют относительно больыее количество венеств с малой молекулярной массой, а к 8- 12-й неделе метаболический профиль приобретает относительна стабильность. Наиболее схожим профилен, к полученный в стандартных условиях, обладали именно зрелые колонии <3 нед,).

Детальная проработка методических и методологических вопро-

Таблица 3.

Коллчественая оценка содержания веществ, составляющих хро-ыатографический профиль субштамка 1/47 штамма H37Rv М. tuberculosis (среда'Змнн-2).

(Рассчитано по глоцади пиков, п= 6; Р= 0,05; И +- tn).

Н

пика

Время элшро-| У. содержание пика к общей сумме

вания веществ| ----------------------------------------

(мин.) i устойчивая форма | чувствительная форма

1 1 2.29 0,82 - 0.141 1.29 - 0.174

2 I 3.06 0.4? - 0.123 0.66 - 0,135

3 I 3.76 1.13 - 0,310 1,03 - 0,312

4 i 5,18 0.75 - 0,086 1.47 - 0,148

5 I 5,36 7.55 - 0.411 14,15 - 0,675

6 I 5,87 1.26 - 0.114 1,64 - 0,148

7 I 5.93 0,77 - 0.061 2,01 - 0.171

8 ¡ 6.03 1.49 - 0.125 5.86 - 1,431

9 I 6.8? 0.75 - 0.030 0.64 - 0,032

Ю | 10.25 1.0? - 0.041 0.50 - 0.028

И I 11,30 4.83 - 0.346 10.46 - 0,482

12 1 13,55 14.68 - 0.841 21.31 - 0.962

13 | 14.52 0,39 - 0.021 1.06 - 0.073

14 i 16,71 0,25 - 0.021 0.30 - 0.032

15 | 18.77 9.44 - 0.021 13,57 - 1.558

16 | 22.82 11,92 - 0.581 8,73 - 2.489

17 i 34.43 1.48 - 0.051 0,23 - 0.012

18 i 35.78 1.45 - 0.031 0.25 - 0.014

19 1 36,08 14.43 - 0.220 1.15 - 0,042

20 | 37.81 3.44 - 0,116 0,57 - 0.046

21 i 37.61 11.90 - 0.334 1.26 - 0,061

сов позволяет решать микробиологические вопросы на новом качественном уровне. Например, сравнение стрептомицино-устойчивых и чувствительных вариантов Н37{& (к концентрации препарата 50 мкг/мл) на материале в 24 культуры (в том числе 6 референс БЬг-г) позволило выявить специфический комплекс веществ, присущий устойчивым формам, и отсутствующий у чувствительных (Табл. 3). В итоге, довольно сложная математическая интерпретация результатов сводится к выявлении ключевого признака визуальньм способом с первичной обработкой профиля: показателен, устойчивости служит отношение процентного содержания веществ, выходящих в определенном интервале времени (34-3? иин.) и составляющих 10-30% от общего содержания веществ профиля. Информационная энтропия устойчивых и чувствительные культур отличалась на 0,2453281. Это на 2 порядка лучше» чем сравнение профилей гид-ролизатов клеток, полученных в равных культуральных условиях.

Другой возможностью является изучение динамики возникающей устойчивости в зависимости от концентрации препарата в среде культивирования. Так, выснено, что добавление в питательную среду стрептомицина в концентрациях от 5 до 50 мкг/мл приводит к пропорциональному угнетении большинства метаболических систем клеток. При этом вышеописанный характеристический комплекс сохраняет свое значение. Данное исследование выполнено на выборке из 16 культур, у которых устойчивость была достигнута субкультивированием в нашей лаборатории.

Наиблее сложной проблемой является дифференциация вариантов штамма, не отличающихся какими-либо явными биохимическими или биологическими свойствами. Тем не менее, разработанный метод, с соблюдением всех условий получения информативного профиля, позволяет проводить дифференциации вариантов штамма Н37Ку, напри-

мер, культур 1/47 и Praga . Множественные количественные отличия при общей качественной структуре профилей не позволяют проводить визуальную оценку. Информационная энтропия профилей данных культур в б определениях имела отличие на 0,0220849 (+0,0014276). Это является достаточной величиной для автоматиза-цш процесса диагностики на основе соответствующего программного обеспечения.

Проверка данного положения осуществлялась на пробной библиотеке хроыатографических спектров всех описанных вариантовкуль-туры Н37Рл>. За основу была принята программа типа "Библиотечный поиск". Адаптация программы проводилась учетом особенностей получения хроматографическш данных. Изучалась возможность работы с библиотекой как m основе профилей гидролизатов клеток, так и профилей несвязанных низкомолекулярных компонент клетки. Сравнение и идентификация культур проводилась в автоматизированном режиме. Компановка библиотек по заложенным признакам позволила выяснить влияние состава питательных сред и времени инкубирования культур на надежность диагностики. Последовательное усложнение задач идентификации, вызываемое добавлением в библиотеку спектров разновозрастных культур, а также культивированных на различных средах позволило определить рамки использования созданного комплекса автоматизированной диагностики. В результате выбора оптимальной структуры спектра и тщательной стандартизации условий его получения удалось разделить лабораторные культуры 1/47 и Praga. При автоматизированной идентификации в пер-зых трех рангах сходимости содержится правильный отает в 857. случаев. При обосновании правильности идентификации по первым двум рангам сходимости надежность идентификации достигает 90%.

Таким образом, в результате работы разработан комплекс ме-

тодпк для видовой и ытаимовой идентификации И.tuberculosis на основе методов гаоокидкостнои нроматографии с математическим обеспечением, позволяющим накапливать данные о молекулярном составе микробных клеток и проводить автоматизированную микробиологическую диагностику туберкулеза с характеризацией выделяемых культур.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны адекватные методики изучения низкомолекулярного состава микобактерий липидной и смешаной природы на основе высокочувствительной капиллярной газожидкостной хроматографии для определения:

- их видовой принадлежности;

- лекарственно-резистентных форы микобактерий туберкулеза;

- ытаммовьи особенностей Mycobacterium tuberculosis.

Методики защищены авторскими свидетельствами Н 1168846,

Н 1334084.

2. Адаптирование математические программы сравнения хроматографических профилей являются адекватными для автоматизации процесса идентифицирования микобактерий туберкулеза по вышеперечисленным признакам.

3. Дифференциация культур видов И.bovis и М.tuberculosis, полученных в вышеописанных условиях, достигается анализом вьющих жирных кислот клеточной стенки микобактерий. При этом критерием отличия М.tuberculosis является присутствие соединений с длиной цепи 28-32 углеродных атома с относительным содержанием 0,2-1,0 X.

4. Стрептомициьо-устойчивые и чувствительные формы М.tuberculosis, выращенные на обиепркнятш лаборагорнш средах, имеют сходни"! жирнокислотный состав, и их дифференциация достигается

сопоставлением хроиатографических профилей клеточного гидрош-зата. В описанных условиях работы коэффициент корреляции этих составляет величину 0,932+-0,016.

5. Метаболические особенности штаммовых вариантов М.tuberculosis в области низкомолекулярных несвязаных компонентов клеток существенно зависят от состава культуральной среды, возраста культуры, наличия лекарственных препаратов, их концентрации. При этой:

а) культивирование вариантов штамма М.tuberculosis H37Rv на кислых безаспарагиновых средах Íiihh-2 и Аникина Н6 приводит к возрастании процентного содержания тяжелых полярных веществ , практически ненаблюдаеыьи в составе клеток, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена;

б) присутствие в культуральной среде стрептомицина приводит к угнетении метаболической активности Н.tuberculosis, которое выражается в обеднеют хроматографического профиля; процесс находится в прямой зависимости от концентрации препарата в среде;

в) стрегггоыицшю-устойчивье варианты штамма H37Rv отличаются наличием в молекулярном составе полярных тяжелых веществ, процентное содержание которых в 10-15 раз превышает таковое у чувствительных форм; данная закономерность наблюдается вне зависи-моости от присутствия преперата в среде культивирования.

6. Надежность идентификации культур микобактерий туберкулеза в рамках иатематической программы типа "Библиотечный поиск" зависит от их биологических особенностей и среды культивирования. При этом:

а) все стрептомишшо-устойчивые варианты штамма имеют существенные отличия от любого из чувствительных вариантов вне заси-иости от периода инкубирования и используемой питательной upe-

ды;

б) питательные среды, близкие по своем/ составу, при их модифицировании, ведут к метаболический изменениям, не позволяющим корректно сравнивать близкородственные культуры;

в) вклмчение в банк данных кроматографических профилей культур микобактерий, имеющих разный возраст, приводит к ошибке идентификации близкородственных вариантов в третьем ранге сходимости,

7. Наиболее полная и объективная характеристика культур микобактерий достигается сочетанием методов видовой идентификации (на основе определения состава клеточных жирных кислот) и анализа несвязаных компонентов клетки с последующим сравнением полученных профилей математическими методами а рамках специализированной программы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Линберг Л.Ф., Попов С.А., Миримский A.C. Использование программ обработки масс-спектров для оценки динамики и автоматизированной диагностики по данньм хроматографического профиля плазмы крови./ Ш Всесоюзный симпозиум по применению математических методов и 38М в медикобиологических исследованиях. -М., МЗ СССР, АМН СССР.-1985.- С. 153-155.

2. Линберг Л.Ф., Попов С.А. Определение жирных кислот в Виде гексафторизопропиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии.// %рн. Аналит. Хим.-1987.- Т.62, HI.- С. 139-144.

3. Линберг Л.Ф., Миримский A.C., Попов С.А. и др. Применение газокромагографического профиля ттидоа сыворотки крови для компьютерной диагностики.// Вогчосы мед. хим.-1988.-Н4.-С. 86-90.

4. Попов С.А., Линберг Л.Ф. Способ газохроматографическо-

го анализа жирных кислот.// Авт. Свод. I11I68846 от 20.05.1985. Билл. откр. и изобр. -1985. -1127.

5. Попов С.А., Бессарабова Т.Н., Линберг Л.Ф., Uupvraciau'i А. С. Определение этамбутола в сыворотке крови.// Авт. Свид. IIT334084 от 01.05.1987.

6. Попов С.А. Дифференциация стрелтомицино-устойчивых и чувствительных культур микобактерий туберкулеза на основе методов газожидкостной хроматографии высокой чувствительности./ Проблемы и перспективы развития бактериологии во фтизиатрии.. Труды Ш1 ШИШ' ИЗ РСФСР. -Н., 1988.- С. 44-47.

7. Попов С.Л. Определение типа микробиологического материала методом высокочувствительной капиллярной газо;лщкостной хроматографии,// /Курн. Аналит. Хим.-Í989. - Т.64, НИ.- С. 20362103.

8. Попов С.А., Линберг Л.Ф., Левченко Т.Н. Исследование Mycobacterium tuberculosis методой капиллярной гавожидкостнои хроматографии с электроннозахватным детектором./ Сб. "Современные проблемы фтизиатрии", Москва, 22-23.06.1983.- ВИНИТИ, 11.05.86., ÍÍ3375-B86.- С. 62-67.

9. Попов С.А., Девятова А.И., .Линберг Л.Ф. Использование методов ГЖХ для исследования резистентных ытаимов микобактерий туберкулеза.// Биохии. и биофиз. микроорганизмов./ Мэжвуз. сб. Горьк. гос. ун-т, 1987.- С. 100-104.

10. Девятова А.П., Попов С.А., Левченко Т.Н. Современные методы исследования микобактерий./VI Всесоюзный съезд фтизиатров., Кемерово. - 1987.- С. 218-220.

П. Попов С.А. Газожидкостная хроматография в видовой идентификации микобактерий./XII конф. молодых ученых ттизио-пульмонологов г. Москвы, Носква,- 1990,- С.75-77.