Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дифференциация гемагглютининов H5 и H7 вируса гриппа A птиц на основе моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Дифференциация гемагглютининов H5 и H7 вируса гриппа A птиц на основе моноклональных антител"
УДК 619:578.832.1:616-097
На правах рукописи
Жиангерова Ольга Васильевна
'Дифференциация гемагглютининов Н5 и Н7 вируса гриппа А птиц на основе моноклональных антител"
03.00.06 - Вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Покров, 2009
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всеросснй ском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИ ИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).
Научный руководитель
доктор биологических наук,
старший научный сотрудник Новиков Борис Валентинович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, член - корреспондент РАСХН
Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно - исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН (ГНУ ВНИТИБП, г. Щелково)
Защита диссертации состоится «11» декабря 2009 г. в II30 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел./ факс: (49243) 62125. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ. Автореферат разослан октября 2009г.
И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор
Сафонов Георгий Анатольевич
доктор биологических наук, профессор
Перевозчикова Наталья Александровна
1. Обшая характеристика работы
Актуальность темы Несмотря на то, что грипп известен в мире с XIX века он остается одной из наиболее важных проблем в плане эпидемиологии, эпизоотологии болезней животных и человека, периодически вызывая опустошительные эпизоотии, эпидемии и пандемии.
Грипп птиц - острая вирусная высококонтагиозная болезнь, поражающая многие виды сельскохозяйственной, домашней, синантропной и дикой птицы. Возбудителем гриппа является РНК-содержащий вирус семейства ОЛогшхоушсЬе. Из трёх существующих типов вируса гриппа А, В и С, тип А является наиболее распространенным. Вирус гриппа птиц относится к типу А.
Схема диагностики гриппа птиц включает комплекс методов, направленных на выделение вируса и его идентификацию с использованием реакций диффузионной преципитации (РДП), связывания комплемента (РСК), нейтрализации (РН), торможения гемагглютинации (РТГА) и иммунофер-ментного анализа (ИФА), методов ПЦР-диагностики.
Классификация гриппа типа А основывается на антигенных различиях поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. В настоящее время установлено 16 подтипов вируса гриппа птиц по гемагглюти-нину и 9 подтипов по нейраминидазе. Наиболее патогенными считаются 5 и 7 подтипы, вызывающие опустошительные эпизоотии, хотя не все штаммы этих подтипов являются высоковирулентными для птиц. С 1996 г. отмечена межвидовая передача «птичьих» штаммов гриппа людям: Н7Ы7 (Великобритания, 1996), Н7ЫЗ (Чили, Канада, 2004), Н5М (Гонконг, 1997).
Определение подтиповой принадлежности вируса гриппа проводят в РДП, РТГА и реакции ингибирования нейраминидазной активности. В последние годы разработаны и применяются тест-системы определения подтипа на основе анализа нуклеотидной последовательности гена НА и ЫА (ПЦР, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени).
В настоящее время для диагностики большинства инфекционных болезней широкое применение нашли различные методы иммуноферментного анализа (ИФА). В основе принципиальных достоинств ИФА лежат строгая специфичность взаимодействия антител с антигеном и мощное усиление хи-
3
мических реакций ферментами. Основными достоинствами метода твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) являются высокая чувствительность, минимальные затраты антигенов и антител, исключение субъективизма и возможность количественной оценки в интерпретации результатов, автоматизация рабочего процесса, а следовательно, большая производительность метода.
Методы ИФА основаны на применении в качестве реагента как поли-так и моноклональных антител, выбор между которыми осуществляется в зависимости от соответствия специфичности антител требованиям теста.
Разработанный в 1975 г. Kohler и Milstein метод получения моноклональных антител (МКА) заданной специфичности открыл новую эру в биологической науке. С тех пор МКА завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в ветеринарии, медицине, молекулярной биологии и генетике. Являясь реагентами направленного действия, МКА позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур.
В связи с вышеизложенным разработка вариантов иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, специфичных к подтиповым антигенным детерминантам гемагглютинина, является актуальной и представляет значительную ценность для создания новых высокоэффективных методов как непосредственного выявления и типирования антигенов вируса, так и мониторинга гриппа птиц.
Поэтому представляется целесообразным проведение работы по получению МКА, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина высокопатогенных подтипов вируса гриппа птиц (Н5 и Н7) и разработке на их основе средств, методов диагностики и субтипирования вируса.
Цель и задачи исследования Целью наших исследований являлась разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики гриппа птиц на основе моноклональных антител, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипов.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
и Получить моноклональные антитела, специфичные к гемагглютини-нам 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
2. Изучить основные иммунохимические свойства полученных моно-клональных антител, специфичных к гемагглютининам 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
3. Разработать и испытать различные варианты иммуноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител для обнаружения и дифференциации гемагглютининов 5 и 7 подтипов и антител к ним.
4. Изучить циркуляцию антител к гемагглютининам 5 и 7 подтипов у различных видов дикой и синантропной птицы на территории РФ.
Научная новизна исследований Получены клоны гибридных клеток, которые секретируют МКА, специфичные к гемагглютинину Н5 и Н7 вируса гриппа птиц.
Установлено, что антигенные детерминанты вируса гриппа птиц, распознаваемые моноклональными антителами, специфичными к гемагглютинину 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц, являются подтипоспецифическими и позволяют определять подтип Н5, Н7 или смесь подтипов в экстраэмбриональных, культуральных жидкостях и суспензии проб органов птиц, зараженных вирусами гриппа птиц подтипов Н5 и Н7. На основе полученных моноклональных антител разработаны прямой гистохимический метод ИФА и «сэндвич»-вариант ТФ ИФА для обнаружения, идентификации и субтипиро-вания вируса гриппа птиц.
Практическая значимость результатов Депонированы в коллекции гибридом ГНУ ВНИИВВиМ 2 клона гибридом (4А6 и ЗВЗ) синтезирующие моноклональные антитела к гемагглютинину Н5 и 2 клона (ШЗ и 2Н7) к гемагглютинину Н7 вируса гриппа птиц.
Разработан метод выявления гемагглютининов вируса гриппа А птиц 5 и 7 подтипов в пробах органов больной и павшей птицы, экстраэмбриональной жидкости инфицированных эмбрионов кур, при выделении вируса на этой модели, прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА.
Разработан метод выявления гемагглютининов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов в пробах органов больной и подозреваемой в заражении птицы
иммуногистохимическим (ИГХ) методом на монослое перевиваемой линии клеток ПСГК.
Разработаны Методические рекомендации по выявлению антигенов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных антител.
Апробация и публикация результатов Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2005-2007 г.г.), научно-практической конференции (Улан-Удэ, 2008г.), международных научно-практических конференциях (Щелково, 2006; ГНУ ВНИИВВиМ, 2008г.).
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария».
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
]_. Характеристика новых клонов гибридом, стабильно секретирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипа вируса гриппа птиц.
2. Результаты разработки различных вариантов твердофазного имму-ноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител для выявления гемагглютинина 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
3. Результаты серологического мониторинга гриппа птиц в популяциях дикой и синантропной птицы в различных субъектах РФ.
Личный вклад соискателя Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по отдельным этапам работы оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: к.б.н. Е.Г. Анохина, к.в.н. О.В Капустина.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 158 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, дополнена
приложением. Список литературы включает 212 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками, 23 таблицами и 2 схемами.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
Вирусы: эталонные штаммы вирусов: гриппа птиц, болезни Ньюкасла, синдрома снижения яйценоскости 76, инфекционной бурсальной болезни получены из лаборатории Музейных штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВ-ВиМ.
Животные: эмбрионы кур 10-11-суточного возраста, мыши линии ВАЬВ/с 3-4 недельного возраста массой 10-15 г., мыши линии ВАЬВ/с взрослые рожавшие самки массой 20-30 г., мыши белые беспородные, массой 2030 г., петухи породы Леггорн массой 2,5-3 кг. Содержание и кормление осуществляли согласно принятым нормам.
Культуры клеток: почки собаки (спаниэля) - (МЭСК), катагт.№ 32 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ), полусуспензионная линия клеток мастоцистомы мыши (Р815), почки сибирского горного козерога (ПСГК), катал.№ 25 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ). В качестве партнера для слияния при получении гибридом использовали дефектную по ГГФРТ миеломную линию клеток Эр 2/0 -Ag 14.1.
Все культуры клеток получены в лабораториях «Биология и культивирование вирусов» и «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов» ГНУ ВНИИВВиМ.
Питательные среды, сыворотки, растворы, реактивы: питательная среда для культивирования клеточных культур Игла, ЭМЕМ; сыворотка плода КРС, физиологический раствор, дистиллированная вода, фосфатно-буферный раствор, гипериммунные моновалентные сыворотки кроликов, кур к эталонным штаммам вируса гриппа птиц, болезни Ньюкасла.
Получение вируссодержащего материала и определение его инфекционной активности Для получения вируссодержащего материала проводили заражение 9-11 суточных СПФ эмбрионов кур по общепринятой методике согласно рекомендациям МЭБ [0.1.Е.,2005]. Для получения культурального вируссодержащего материала проводили заражение суточной монослойной
культуры клеток МДСК, ПСГК по общепринятой методике согласно рекомендациям МЭБ.
Титрование вируса проводили на эмбрионах кур и культуре клеток МДСК, ПСГК по общепринятой методике согласно рекомендациям МЭБ. Титр вируса определяли по методу Рида и Менча и выражали в эмбриональных летальных дозах ЭЛД50/см3 (инфекционных - при отсутствии гибели КЭ, согласно паспортных данных на штамм) и тканевых цитопатических дозах ТЦДзо/см3.
Получение гибридом Гибридомы получали, используя модифицированный метод, описанный ранее Kohler G. [Kohler G,1976], Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили концентрированными антигенами вируса гриппа птиц (ВГП) 5 или 7 подтипа, полученными методом аффинной хроматографии. Исходная инфекционная активность материала составила не менее 8-9 lg ЭИД50/СКД гемагглютининирующая - не ниже 1:128-1:512.
Скрининг гибридных антителопродуцентов Исследование культу-ральных жидкостей гибридных клонов на наличие продукции специфических антител к антигенным детерминантам гемагглютинина проводили через 7 -10 дней с момента клонообразования трехкратно с трехдневным интервалом. Скрининг проводили методами непрямого ТФ ИФА; РЗГА и непрямого им-муногистохимического анализа на монослойных культурах клеток ПСГК, МДСК, адаптированного для скрининга МКА, специфичных к эпитопам гемагглютинина вируса гриппа птиц.
Клонирование миелом и гибридных антителопродуцентов Клонирование позитивных клонов гибридом проводили в полужидком агаре по методу Gooding [Gooding,1980] и методом предельных разведений.
Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител Классы и подклассы полученных МКА определяли с использованием набора для изотипирования антител мыши "Mouse Monoklonal Antibody Isotyping Kit" ("Sigma", США), согласно прилагаемой инструкции.
Полипептидную специфичность МКА определяли методом вестерн -блоттинга. Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле, с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Учет реакции прово-8
дили замером длины пробега антигенов, сравнивая с пробегом маркерных белков. Для расчета молекулярной массы использовали программу Mol-mas.bas.
Конъюгированпе моноклинальных антител с пероксндазой хрена
Синтез конъюгатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (тип VI, Sigma) осуществляли по методу перйодатного окисления фермента до альдегидной формы с последующим восстановлением боргидридом натрия по Tijssen [Tijssen, 1985].
Методы математического анализа При анализе и обработке результатов исследований использовались статистические методы, описанные Jla-киным [Лакин, 1990] с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1.).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Изготовление антигенсодержащих препаратов С целью изготовления частично очищенных концентрированных препаратов гемагглютинина вируса гриппа птиц высоковирулентных штаммов 5 и 7 подтипов 9-11 суточные СПФ эмбрионы кур инфицировали штаммами пятого A/tem/SouthAfrica/61 /H5N3, A/chick/US/Pennssylvaniay 1370/83/H5N2,
А/курица/Курган/01/05/Н5Ы1, А/chick/ Scotland/59/H5Nl, и седьмого подтипов A/FPV/Rostock/34/H7Nl, А/цыпленок/ Самарканд/68/Н7Ы2, A/FPV/Duch/27/H7N7, вируса гриппа птиц, различающихся по типу нейрами-нидазы и времени изоляции [О.I.E.,2005]. Полученный вируссодержащий материал в виде экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) с активностью в РГА не менее 1:128 - 1:512 ГАЕ, в ТФ ИФА (с МКА к NP гриппа) не ниже 1:640 -1:1280 осветляли методом низкоскоростного центрифугирования в течение 30 минут. Разделение поверхностного антигена и кора проводили высокоскоростным центрифугированием при ЗООООх g в течение 1 часа через «подушку» из 40% сахарозы. В результате получены неинфекционные специфические препараты поверхностных антигенов вируса гриппа птиц с титром ге-магглютинирующей активности в РГА 1:12800 - 1:128000.
Лизаты клеток чувствительных линий, инфицированных вирусом гриппа, содержат большие количества специфических вирусных белков, в
том числе и гемагглютинина вируса гриппа. С целью наработки культураль-ного вируссодержащего материала использовали перевиваемую культуру клеток МДСК. После проведения манипуляций по наработке, концентрированию и частичной очистке вируссодержащего материала активность препаратов, полученных из клеточных культур в ТФ ИФА, составила 1:1000 -1:16000.
Изготовленные антигены положительно реагировали в РТГА с моноспецифическими сыворотками к гемагглютинину гомологичного подтипа и не вступали в реакцию с сыворотками к гетерологичным подтипам.
Полученные результаты свидетельствует о высокой активности и специфичности изготовленных антигенов, что позволяет использовать их для иммунизации мышей, скрининга и сенсибилизации полистирола при постановке различных вариантов ТФ ИФА и серологических реакций.
Получение гибридом, секретирующих моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц Нами испытаны две схемы иммунизации мышей линии ВАЬВ/с, различающиеся по срокам и способам введения антигена. Мышей иммунизировали концентрированным частично очищенным антигеном цельного вируса с последующим введением антигенов поверхностных белков вируса гриппа птиц 5 или 7 подтипа. Разовая доза введения антигена соответствующего подтипа составляла 4-6 тыс. ГАЕ в объеме 0,05 см3/мышь. Учитывая изменчивость поверхностных гликопротеидов вируса гриппа птиц и факт значительного (84%) отличия ранее и вновь выделенных штаммов, с целью получения В-лимфоцитов, сенсибилизированных широким спектром антигенов гемагглютинина соответствующего подтипа, мышей иммунизировали смесью антигенов штаммов 5 или 7 подтипа вируса гриппа птиц, выделенных в начале-середине XX столетия и в настоящее время. Введение антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно и внутриселезеночно с использованием полного, неполного адьювантов Фрейнда и без адьюванта.
Иммунизацию мышей проводили согласно отработанной схеме, предусматривающей трехкратное введением антигена с интервалом 4 и 7 дней.
Внутриселезеночную инъекцию антигена в дозе 400 ГАЕ/мышь осуществляли за 3 дня до проведения опыта гибридизации.
Гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей и клеток мышиной миеломы Sp2/0-Agl4.1 в соотношении 10:1 проводили через 3-4 суток после внутриселезеночной инъекции антигенов вируса гриппа птиц согласно общепринятой методике Kohler & Milstein в модификации Fazekas & Schei-degger. Слияние клеток индуцировали 50% раствором ПЭГ-4000 и 10% ДМСО.
Через 7-10 суток после появления в лунках четко различимых клонов и в последующем с трехдневным интервалом проводили скрининг культураль-ных жидкостей клонов гибридом на наличие продукции специфических иммуноглобулинов к гемагглютинину соответствующего подтипа вируса гриппа птиц в непрямом варианте ТФ ИФА. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты проведения гибридизации, тестирования, кло-
нирования гибридом, продуцентов МКА к гемагглютининам вируса гриппа птиц Н5 и Н7.
п=3
№ Антиген Всего Общее ко- Количество положительных гибридом в не-
опыта для им- засеяно личество прямом варианте ТФ ИФА
муниза- лунок гибридных 1 клонирова- 2 клонирова- 3 клонирова-
ции клонов ние ние ние
Абсол". %" Абсол. % Абсол. %
1 480 450 230 51 145 32 30 7
2 Н5 480 560 250 45 110 20 17 3
3 480 685 373 55 160 23 20 5
1 480 396 160 40 95 24 78 20
2 Н7 480 490 215 44 150 31 53 11
3 480 630 310 49 240 38 41 7
Примечание:
* - абсол. - абсолютное число клонов; ** -%- процент от общего числа клонов.
Результаты представленные в таблице 1 показали, что из 1695 гибридных клонов (к антигенам Н5) и 1516 клонов (к антигенам Н7), полученных в результате трех опытов слияния иммунных спленоцитов соответствующего подтипа и миеломной линии Бр 2/0 Agl4, проведения трехкратного клониро-
вания в полужидком агаре, получено 67 и .172 позитивных клона, МКА которых реагировали в непрямом ГФ ИФА с антигенами ВГП Н5 и Н7, соответственно, и не вступали в реакцию с антигенами гетерологичного подтипа и антигенами клетки-хозяина.
При этом была обнаружена четко выраженная прямая зависимость стабильности гибридом от начала времени клонирования - раннее клонирование повышало их стабильность.
Скрининг МКА непрямым методом ИГХ ИФА С целью изучения иммунохимических свойств МКА позитивные в непрямом ТФ ИФА рекло-нированные клоны гибридом наращивали в культуральных флаконах увеличивающихся объемов. Культуральные жидкости тестировали на наличие штаммо - и подтипоспецифических свойств МКА к антигенам 5 или 7 подтипов в непрямом варианте ИФА на монослое перевиваемой культуры клеток ПСГК, инфицированной различными штаммами вируса гриппа и других болезней птиц.
Метод позволяет в короткий срок (24 часа) обнаружить минимальное количество антител в малом объёме (0,05-0,1 см3) ростовой гибридомной среды. Изучение в непрямом варианте ИГХ ИФА свойств МКА, секретируе-мых полученными гибридомами, позволило, провести отбор 28 клонов, МКА которых взаимодействовали со структурными компонентами ВГП 5 подтипа, и 41 клон, секретировавший МКА к антигенам ВГП птиц 7 подтипа.
В процессе изготовления антигена для иммунизации мышей разделения поверхностных антигенов не проводили, а нейраминидаза, как и гемагглюти-нин, связана с плазматическими мембранами. Поэтому с целью отбора полученных МКА, специфичных к антигенным детерминантам нейраминидазы, использовали метод ингибирования непрямого ТФ ИФА. В качестве положительного контроля использовали поликлональные антитела кроличьих сывороток, полученных Сургучевой И.М. к нейраминидазе типов N1, N2 и N3 (из музея штаммов микроорганизмов), в качестве антигенов использовали частично очищенный вируссодержащий материал штаммов подтипов, имеющих антигенную формулу НШ1, Н2№ и Н6Ы2. В результате проведенных исследований установлено, что МКА 11 клонов, специфичных к антигенным де-
терминантам гемагглютинина Н5 (1СЗ, 1Н8, 2Е2, 2С6, 2F10, ЗВЗ, 3D10, 4А6, 4G3, 5СЗ, 5Е8), не конкурировали с моноспецифическими сыворотками за связывание со специфическими сайтами нейраминидазы исследуемых подтипов. Число клонов, МКА специфичных к антигенам НА седьмого подтипа, также сократилось до 15 (1А8, 1ЕЗ, 1D3, 2ВЗ, 2Н7, ЗА10, ЗЕ11, 3F7, 3G9, 4А8, 4F5, 5А4, 5С2, 5В6, 5В8).
Изучение антигемагглютинирующих свойств полученных МКА
Наличие антигемагглютинирующих свойств полученных МКА, специфичных к эпитопам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц, определяли по их способности задерживать гемагглютинацию эритроцитов петуха после инкубирования 4 ГАЕ вируса соответствующего подтипа с культуральными или асцитическими жидкостями исследуемых гибридом.
Проведенные исследования, представленные в таблицах 2, 3 показали, что МКА каждого клона взаимодействуют со своим индивидуальным эпито-пом на молекуле гемагглютинина Н7 или Н5. Так клоны 1D3 (1:512-1:1024), 2Н7 (1:1024-1:2048), 1А8 (1:32-1:128), 2ВЗ (1:32-1:512), ЗЕ11 (1:64-1:512), 3F7 (1:8-1:64), 4А8 (1:128-1:1024), 4F5 (1:8-1:32), 5В8 (1:16-1:64) реагировали со всеми использованными в работе штаммами вируса гриппа птиц 7 подтипа. Антигенные детерминанты, выявляемые клонами 3G9 (1:64), 5А4 (1:128), являются штаммоспецифическими, поскольку имеется в наличии лишь у штамма A/FPV/Rostock/29/H7N7 и A/FPV/Rostock/34/H7Nl. Клоны 1ЕЗ (1:641:512) и 5В6 (1:32-1:128) не выявляли антигенные детерминанты штамма A/chick/Brescia/1902/H7Nl, тогда как МКА клона 5С2 (1:128) реагировали только со штаммом A/chick/Brescia/1902/H7Nl. МКА клона ЗА10 (1:32-1:64) не выявляли антигенные детерминанты штаммов A/FPV/Rostock/29/H7N7 и А/FPV/Rostock/ 34/H7N1.
Таблица 2. Результаты РТГА с МКА к гемагглютинину Н7.
11=3
Штаммы вируса Шифр клона
тз 2Н7 1А8 2ВЗ ЗЕ11 4А8 4Р5 5В8 309 5А4 1ЕЗ 5В6 5С2 ЗА10
А/РРУ/Ло5Юск/34/Н7Ы1 + + + + + + + + + + + + + - -
А/РРУЖойоск/29/Н7Ы7 + + + + + + + + + + + + + - -
А/сЫск/ВгеэЫа/1902/Н7Ы1 + + + + + + + + + - - - - + +
А/цыдленок/Самарканд/68/Н7Ы2 + + + + + + + + + - - + + - +
А/РРУ/ОисЬ/27/Н7Ы7 + + + + + + + + + - - + + - +
А/Шгкеу/Епё1апс1/63/Н7НЗ + + + + + + + + + - - + + - +
АЛеа1/Ма55ас1шз/1/80/Н7Ш + + + + + + + + + - - + + - +
Примечание: «+» - положительная реакция в РТГА - задержка гемагглютинации на два креста и выше; «-» отрицательная реакция - отсутствие задержки гемагглютинации
Таблица 3. Результаты РТГА с МКА к гемагглютинину Н5.
п=3
Штаммы вируса Шифр клона
4А6 звз 2¥\0 1СЗ !Н8 ЗОЮ 5СЗ 2Е2 2С6 403 5Е8
А/курица/Курган/Н5Ы1 + + + + + + + + - +
А/сЫск/8со11апс1/59/Н5Н I + + + + + + + - + -
А/сЫск/Ш/РеппзуКатаЛ 370/83/Н5Ы2 + + + + + + + + + - -
АЛет/ЭоиН! АЛка/б 1/Н5Ю + + + + + + + + + + +
Примечание: «+» - положительная реакция в РТГА - задержка гемагглютинации на два креста и выше; «-» отрицательная реакция - отсутствие задержки гемагглютинации.
Клоны гибридом 4А6 (1:1024-1:2048), ЗВЗ (1:512-1:1024), 2F10 (1:5121:1024), 1СЗ (1:64-1:128), 1Н8 (1:32-1:128), 3D10 (1:8-1:32), 5СЗ (1:32-1:128), реагировали со всеми использованными в работе штаммами вируса гриппа птиц 5 подтипа. Клон 2Е2 (1:128-1:512) не выявлял антигенные детерминанты A/chick/Scotland/59/H5N 1. МКА 2С6 (1:32-1:128) не реагировали с штаммом A/KypHua/KypraH/01/05/H5Nl. Клон 4G3 (1:64-1:128) выявлял антигенные детерминанты двух штаммов А/курица/Курган/01/05 H5N1 и A/tern/South Africa/61/H5N3. МКА клона 5Е8 (1:256) подавляли гемагглюти-нирующую активность только штамма A/tern/South Africa/61/H5N3. Таким образом, в результате проведенных исследований в РТГА были определены МКА к эпитопам гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц, обладающие подтипо- и штаммоспецифическими свойствами.
Таким образом, с целью изучения основных иммунохимические свойств были отобраны МКА клонов 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ, 1Н8, 3D10, 5СЗ, специфичные к антигенным детерминантам гемагглютинина вируса гриппа птиц подтипа Н5 клоны 1D3, 2Н7, 1А8, 2ВЗ, ЗЕ11, 3F7, 4А8, 4F5, 5В8, МКА которых специфичны к антигенным детерминантам гемагглютинина вируса гриппа птиц подтипа Н7.
Изучение свойств МКА методом ингибирования ТФ ИФА С целью выявления способности полученных МКА конкурировать с подтипоспеци-фическими иммуноглобулинами сывороток крови за связывание с подтипос-пецифическими эпитопами гемагглютининов Н5 и Н7 вируса гриппа птиц использовали метод ингибирования ТФ ИФА.
В результате проведенных исследований было установлено, МКА клонов 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ, 1Н8, 3D10, 5СЗ ингибируют специфические сыворотки, полученные к штаммам H5N1, H5N2 H5N3, а также сыворотки домашней птицы, вакцинированной инактивированной вакциной из штамма H5N1, H5N2, H5N3. МКА клонов 1D3, 2Н7, 1А8, 2ВЗ, ЗЕ11, 3F7, 4А8, 4F5, 5В8 ингибируют специфические сыворотки, полученные к штаммам H7N1, H7N2, H7N7 и H7N3.
Изучение вируснейтрализующих свойств полученных МКА Изучение вируснейтрализующих свойств МКА проводили микрометодом реакции нейтрализации на культуре клеток ПСГК.
Установлено, что МКА ни одного из клонов не задерживали проявления ЦПД в культуре клеток ПСТК, инфицированной как штаммами 5 или 7 подтипа, так и гетерогенными подтипами вируса гриппа птиц, по сравнению со специфической сывороткой к соответствующим подтипам.
Изготовление и контроль конъюгатов МКА с пероксидазой хрена Для изготовления конъюгатов были отобраны моноклональные антитела клонов 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ, 1Н8, 3D10, 5СЗ специфичных к Н5 и клонов 1D3, 2Н7, 1А8, 2ВЗ, ЗЕ11, 3F7, 4А8, 4F5, 5В8 специфичных к Н7, реагирующие со всеми изученными штаммами указанных подтипов, имеющие высокую специфичность и активность. Активность и специфичность полученных конъюгатов изучали методом перекрестного титрования со специфическим и гетерогенным антигеном в прямом варианте ТФ ИФА.
Результаты изучения активности полученных пероксидазных коньюга-тов в прямом варианте ТФ ИФА представлены в таблице 4.
Таблица 4. Активность полученных пероксидазных коньюгатов в прямом варианте ТФ ИФА
п=3
№ п/п Подтип ви- Шифр Изотип Титр немеченых Титр конъюгат;
руса ГП клона МКА МКА в прямом МКА в прямом 7
ТФ ИФА (х 1000)* ИФА**
Н5 Н7
1 Н5 1СЗ IgM 200-500 5120 50
2 1Н8 IgG2a 100-200 1280 100
3 2F10 IgGl 100-400 2560 25
4 ЗВЗ IgGl 200-500 2560 25
5 4А6 IgG2b 500-700 5120 25
6 5СЗ IgM 50-70 1280 50
7 Н7 1А8 IgG2b 200-500 25 512(
8 1D3 IgGl 500-700 50 512(
9 2ВЗ IgG2a 100-400 50 256(
10 2Н7 IgGl 700-1200 25 1024
11 ЗЕ11 IgG2b 400-600 25 256(
12 3F7 IgM 100-200 50 256(
13 4А8 IgG2b 700-800 25 1024
14 5В8 IgM 600-900 50 256(
Примечание: * - данные представляют собой обратные величины титров.
** - титр лучшего конъюгата из двух серий.
Таким образом, данные, представленные таблице 4 свидетельствуют, что конъюгаты, изготовленные на основе отобранных моноклональных антител к Н5 и Н7 активны в прямом ТФ ИФА специфичны (титр активности составил 1:1280-1:5120 и 1:2560-1:10240 соответственно) и могут быть использованы при отработке различных вариантов иммуноферментного анализа для выявления и дифференциации гемагглютининов 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц. Для проведения дальнейших исследований нами отобраны конъюгаты клонов 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ и 1D3, 2Н7, 1А8, 2ВЗ, ЗЕ11, 4А8, 5В8, имеющие высокий титр специфической реакции при минимальном фоновом уровне в разведениях 1:25-1:100.
Отработка оптимальных условий постановки нммуногистохими-ческого метода ТФ ИФА на основе моноклональных антител для обнаружения и дифференциации антигенных детерминант гемагглютинина Н5 и Н7 вируса гриппа птиц Изучение репродукции и выявления антигенов методами визуального определения вирусной инфекции (ИФА, МФА в культуре клеток, гибридизации in situ) позволяют с большей достоверностью использовать для этой цели перевиваемые культуры клеток.
Нами изучена возможность выявления вирусспецифических антигенов НА и NP в клетках перевиваемых линий MDCK; ПСГК; Р815 в разные сроки цикла репродукции вируса гриппа птиц. Культуры клеток указанных линий чувствительны ко всем штаммам изучаемых подтипов независимо от их вирулентности, в присутствии трипсина в поддерживающей среде.
В результате проведенных исследований определили, что штаммоспе-цифические и общие антигенные детерминанты гемагглютинина можно обнаружить на поверхности клеток уже через 4 часа после заражения. На ранних стадиях инфекции отмечали присутствие вирусоспецифических антигенов в ядрышках клеток. Максимальное выявление НА прямым ИГХ ИФА методом отмечается через 10-12 часов после инфицирования. Эти результаты доказывают, что структурные белки ВГП аккумулируются и могут быть выявлены в клетках до сборки вирионов, задолго до начала проявления ЦПД и накопления инфекционной активности вируса в культуральной жидкости.
Чувствительность прямого ИГХ ИФА на основе конъюгатов МКА к гемагглюгинину Н5, Н7 изучали при заражении культуры клеток ПСГК десятикратными разведениями вируса, содержащими различные дозы ГАЕ, начиная с 256 до 0,025 ГАЕ. В результате, даже при дозе заражения 0,025 ГАЕ -разведение вируса 10~4 (при исходном титре 6,0 ^ТЦД/клетку) через 12-18 часов культивирования удается выявить антигенные детерминанты НА вируса гриппа птиц соответствующего подтипа.
В результате исследований установлено, что конъюгаты МКА клонов (4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ, 1Н8, 3D10, 5СЗ - специфичные к Н5 и 1D3, 2Н7, 1А8, ЗЕ11, 3F7, 4А8, 4F5, 5В8 - специфичные к Н7) способны выявлять гемагглю-тинин гомологичного подтипа на поверхности и внутри клеток, до начала проявления первых признаков ЦПД. Полученные результаты подтверждены в РГА и РТГА с использованием в качестве антигенов культуральные жидкости инфицированных клеток ПСГК, полученные через 2-3 суток после заражения.
Изучение полипептидной специфичности полученных МКА Изучение свойств моноклональных антител в серологических реакциях дает лишь косвенную информацию об их полипептидной специфичности.
Специфичность связывания МКА клонов, 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ и клонов 1D3, 2Н7, 1А8, ЗЕ11, 4А8, распознающих, соответственно, антигенные детерминанты гемагглютинина 5 или 7 подтипов ВГП определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и метода иммуноблоттинга. Окончательный вывод о полипептидной специфичности МКА делали на основании сопоставления молекулярной массы преципитированных полипети-дов с молекулярными массами полипептидов гемагглютинина вируса гриппа А, определенными в электрофорезе.
Было показано, что МКА всех исследованных клонов связываются с антигенными детерминантами, расположенными на белке гемагглютинина вируса гриппа птиц пятого или седьмого подтипов, соответственно. Клоны ЗВЗ, 2F10, 4А8 преципитировали полипептид с М.м.50 кДа, а клоны 4А6, 2Н7,1А8 преци-питировали полипептид с М.м.25-27 кДа, соответствующие тяжелой и легкой цепи гемагглютинина. Также клоны 1СЗ, 1D3, ЗЕ11 преципитировали полипептид с М.м.80 кДа, соответствующей субъединице гемагглютинина.
Результаты изучения иммунохимических свойств полученных МКА к консервативным антигенным детерминантам гемагглютинина вируса гриппа Н5 и Н7, представлены в таблице 5.
Таблица 5. Иммунохимические свойства МКА к антигенным детерминантам гемагглютининов Н5 и Н7.
п=3
Наименование клона Подтип ВГП Класс Ig Титр в непрямом ТФ ИФА (xlOOO) Титр в РЗГА Непрямой конкурентный ИФА (% ингиби-ции)* ИГХ ИФА Вируснейт-рализующие свойства Westem-blott
4А6 Н5 Ig G2b 1:5001:700 1:10241:2048 60-80% + Не обладают 25 кДа
ЗВЗ IgGl 1:2001:500 1:5121:1024 60-80% + Не обладают 56 кДа
2F10 IgGl 1:1001:400 1:5121:1024 60-80% + Не обладают 56 кДа
1СЗ IgM 1:2001:500 1:641:128 60-80% + Не обладают 80 кДа
1D3 Н7 IgGl 1:5001:700 1:2561:1024 60-80% + Не обладают 80 кДа
2Н7 IgGl 1:7001:1200 1:10241:2048 60-80% + Не обладают 25 кДа
1А8 IgGl 1:2001:500 1:321:512 60-80% + Не обладают 25 кДа
4А8 Ig G2b 1:7001:800 1:1281:512 60-80% + Не обладают ' 56 кДа
ЗЕ11 Ig G2b 1:4001:600 1:641:512 60-80% + Не обладают 80 кДа
Примечание:*- представлены результаты ингибирования моноспецифических сывороток к подтипам вируса ГП Н5 или Н7;
«+» - специфическое диффузное или в виде гранул окрашивание цитоплазмы, или околоядерной зоны клеток.
Результаты, представленные в таблице 4 отчетливо демонстрируют, что МКА полученных клонов 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ, 1Н8, 3D10, 5СЗ - Н5 и 1D3, 2Н7, 1А8, 2ВЗ, ЗЕ11, 3F7, 4А8, 4F5, 5В8 - Н7, реагировали с консервативными детерминантами структурного гликопротеина - гемагглютинина, расположенные на тяжелой и легкой цепи гемагглютинина и имеющихся у всех изученных штаммов вируса, относящихся к соответствующему подтипу.
В отличие от поликлональных антител полученные МКА в используемых серологических реакциях не давали перекрестных реакций с антигенами
гетерологичных подтипов вируса гриппа птиц и вирусов, а также антигенами клеток хозяина. Исследуемые МКА специфичны к антигенным детерминантам гемагглютинина вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 в трех серологических реакциях и имели процент ингибирования более 60% с моноспецифическими сыворотками к гомологичным подтипам.
Определение оптимального варианта сочетания моноклональных реагентов при постановке двухсайтового "сэндвич" - варианта ТФ ИФА Основой разработки «сэндвич»-варианта ТФ ИФА для выявления любого растворимого белка служит использование моноклональных антител, взаимодействующих с разными или повторяющимися эпитопами одного вирусспецифи-ческого полипептида. Специфичность двухсайтового ТФ ИФА (ДАС-ИФА) напрямую связана с наличием МКА, направленных к разным далеко отстающим друг от друга эпитопам антигена. Для выполнения ДАС ИФА необходимо подобрать пары немеченных (улавливающих) и меченых (детектирующих) МКА. С этой целью проведен подбор рабочего разведения МКА для сенсибилизации и определение титра и рабочего разведения конъюгата МКА клонов. Результаты экспериментов показали, что методом ДАС ИФА антигены Н5 и Н7 ВГП наиболее эффективно выявляются при концентрации улавливающих МКА не менее 1 мкг/лунку. Рабочие разведения конъюгатов составили: ЗВЗ - 1:2000, ШЗ - 1:4000, 4А6 - 1:4000,2Н7 - 1:4000. В результате отобрано две пары улавливающих и детектирующих МКА (ЗВЗ и 4А6-ПХ, ШЗ и 2Н7-ПХ), наиболее эффективно выявляющих антигены НА 5 и 7 подтипов, соответственно. Незначительно уступает по чувствительности двухсайтовый «сэндвич»-вариант ТФ ИФА со следующим сочетанием МКА клонов: 4А6 и ЗВЗ-ПХ; 2Н7 и ШЗ-ПХ.
Результаты изучения влияния различных сочетаний МКА на чувствительность с двухсайтового сэндвич-варианта ТФ ИФА при выявлении Н5 и Н7 вируса гриппа птиц представлены в таблице 6.
Определение чувствительности и специфичности «сэндвич»-варианта ТФ ИФА проводили с использование подобранных пар МКА. Установлено, что сорбирующие антитела и конъюгаты на их основе реагировали только с антигенными детерминантами гемагглютинина соответствующего подтипа ВГП и не реагировали с антигеннородственными, гетерогенными антигенами
и нормальным антигеном. Результаты представлены в таблицах 7, 8.
Таблица 6. Выявление антигенов гемагглютининов 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц в двухсайтовом «сэндвич»-варианте ТФ ИФА.
Клоны гибридом сорбированные на полистироле Титр антигена вируса гриппа птиц при выявлении конъюгатами МКА
Н5 подтипа вируса ГП Н7 подтипа вируса ГП
4А6 ЗВЗ тз 2Н7
4А6 1:1024 1:4096 0 0
ЗВЗ 1:8192 1:1024 0 0
ЮЗ 0 0 1:512 1:16384
2Н7 0 0 1:8192 1:4096
Приведенные в таблицах 7 и 8 данные свидетельствуют, что монокло-нальные антитела, специфичные к антигенным детерминантам гемагглюти-нина вируса гриппа 5 и 7 подтипов взаимодействуют только с антигенами вируса гриппа соответствующего подтипа и не вступают в реакцию с антигенами вируса гриппа гетерологичного подтипа и гемагглютинирующего вируса болезни Ньюкасла.
В результате проведенных исследований получения и изучения свойств моноклональных антител, специфичных к антигенным детерминантам ге-магглютинина Н5 и Н7 было определено и подтверждено, что отобранные клоны МКА могут быть использованы для диагностики гриппа птиц соответствующих подтипов.
Серологический мониторинг гриппа птиц среди домашней, дикой и синантропной птицы С целью выявления распространения вируса гриппа А Н5 и Н7 среди дикой водоплавающей птицы, обитающих в различных районах территории Алтайского края и Тверской области нами исследовано более 700 проб сывороток от 29 видов домашней, дикой водоплавающей, береговой и синантропной птицы.
Результаты исследования показали, что у 24 видов птицы (339 сывороток - 66,7%) были обнаружены антитела к вирусу гриппа птиц. Из них положительными с антигенами подтипов Н5 и Н7 оказались 39 сывороток - 22,5% и 20 сывороток - 12%, соответственно. При циркуляции множества подтипов в 10% случаев выявляли одновременно антитела к 5 и 7 подтипу.
Буквенное и цифровое обозначение горизонтальных и вертикальных рядов 96 луночного планшета
№ пробы 1 2 3 4 5 6 № пробы 7 8 9 10 11 12
2 ГАЕ 1 ГАЕ 0,5 ГАЕ 0,25 ГАЕ 0,125 ГАЕ 0,062 ГАЕ 2 ГАЕ 1 ГАЕ 0,5 ГАЕ 0,25 ГАЕ 0,125 ГАЕ 0,062 ГАЕ
А 1 - - - - - - 9 - - - - -
В 2 ++ ++ ++ ++ ++ + 10 - - - - - -
С 3 ++ ++ ++ ++ + - и ++ ++ ++ ++ +
D 4 ++ ++ ++ ++ + - И - - - • -
Е 5 - - - - - - 13 - - - - -
F 6 - - - - - - и - - - - •
G 2 - - - - - - 15 - - - - -
Н 8 - - - - - - К! - - - - -
Буквенное и цифровое обозначение горизонтальных и вертикальных рядов 96 луночного планшета
№ пробы 1 2 3 4 5 6 № пробы 7 8 9 10 11 12
2 ГАЕ 1 ГАЕ 0,5 ГАЕ 0,25 ГАЕ 0,125 ГАЕ 0,062 ГАЕ 2 ГАЕ 1 ГАЕ 0,5 ГАЕ 0,25 ГАЕ 0,125 ГАЕ 0,062 ГАЕ
А 1 - - - - - - 9 ++ ++ ++ ++ ++ +
В 2 - - - - - - 10 ++ ++ ++ ++ ++ +
С 3 - - - - - - и - - - - - -
D 4 - - - - - - 12 - - - - -
Е 5 ++ ++ ++ ++ ++ + 13 - - - - - -
F 6 ++ ++ ++ ++ + - В - - - - - -
G 7 ++ ++ ++ -м- + - 15 - - - - -
Н 8 ++ ++ ++ ++ + - К1 - - - - - -
Примечание: + результат равный 2,1 0П4()<, ++ - результат более 2,1 ОП405
Аллантоисная жидкость незаряженных СПФ эмбрионов кур
2 - А курица Кур sau H5N1, активность в PIA - 6 Legi
3-A chick ■ I IS. Pennsylvania; 13 70 ,S3 H5N2, активность в / 'ГА
Log2
4_- A tern. South Africa'61 И5N3, активность в Pl'A - X Log2
5-A ТРУ, Rostock/34 'H7N1, активность в PIA - У Logj
6-/4 цыпленок Самарканд:68 H7N2, активность а PIA - Н Log2
7 - AFPV/Rostock/29'H7N7, активность в PIA - 7 Logj
8 - A Fpy,Duch'27 H7N7, активность в РРА - К Log:
9 - Суспензия проб органов цыплят, инфицированных I ООО LD штамма H7N3 вируса гриппа птиц 7 подтипа, активность а РРА -
10 - Суспензия проб органов цыплят, инфицированных 1000 LD штамма H7N2вируса гриппа птиц 7 подтипа, активность в ¡'¡'А - <-/Log2
11 - Суспензия проб органов цыплят, инфицированных I ООО LD штамма H5N1 вируса гриппа птиц 5 подтипа, выделенного на территории РФ, активность в РГА - 9 Log2,
12 - А утка Украина / 63'H3NX, активность а РГА • X [_оц2
13-/4 turkey Massachussets>37-10 65 H6N2. активность в PIA - .V
Log2
14- A turkey, Wisconsin.'I 66 H9N2, активность в PIA • У Log2
15 - Вирус болезни Ньюкасла, штамм La Sota, активность в РРА
- S Log2
К* - контроль конъюгата специфических МКА
Выводы
J^ Получены новые клоны гибридом, стабильно секретирующих моно-клональные антитела к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипа вируса гриппа птиц.
2. Моноклональные антитела клона 4А6 специфичны к антигенным детерминантам лёгкой цепи гемагглютинина Н5, клоны ЗВЗ и 2F10 - к тяжёлой цепи гемагглютинина Н5. Моноклональные антитела клонов 2Н7, 1А8 взаимодействуют с лёгкой цепью гемагглютинина Н7, клон 1D3 и 4А8 - с тяжелой цепью гемагглютинина Н7.
3. Моноклональные антитела, специфичные к гемагглютининам Н5 (клоны 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ) и Н7 (клоны 1D3, 2Н7, 1А8, 4А8, ЗЕ11) способны подавлять вирус - индуцированную гемагглютинацию эритроцитов, но не обладают вирус - нейтрализующими свойствами.
Л. Иммуногистохимический вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител специфичных к гемагглютининам Н5 и Н7 обеспечивает выявление указанных вирусных белков в перевиваемых клетках культур ПСГК, MDCK через 8-10 часов после инфицирования
5. Двухсайтовый сэндвич вариант твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител пар ЗВЗ и 4А6-ПХ, подтипа Н5 и пар 1D3 и 2Н7-ПХ подтипа Н7 позволяет выявлять гемагглютинин 5 И 7 подтипов вируса гриппа птиц с аналитической чувствительностью не менее 0,125 ГАЕ и превышает чувствительность рутинной реакции гемагглютина-ции в 8-16 раз.
¿.Установлена циркуляция антител к вирусу гриппа птиц в 339 случаях, к гемагглютинину Н5 в 39 случаях, к Н7 в 20 случаях. Одновременно к Н5 и Н7 установлено в 16 случаях. Видовых различий по циркуляции антител на территории Алтайского края и Тверской области не выявлено.
Практические предложения
Чувствительные, специфичные и экспрессные методы ИФА на основе МКА, позволяющие диагностировать и типировать грипп птиц пятого и седьмого подтипов.
2. Разработаны и предложены Методические рекомендации по выявлению антигенов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных антител, утвержденные директором института, которые могут быть использованы в лабораторной практики для выявления гемагглютинина Н5 и Н7 в ЭЭЖ ЭК, пробах органов больной и павшей птицы.
3. Разработаны методы выявления специфических антител в сыворотках крови птиц использованные для проведения серологического мониторинга гриппа птиц на территории Алтайского края и Тверской области.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Выявление специфических антител в сыворотках крови дикой и синан-тропной птицы / О.В. Капустина, А.Ю. Бондарев, Н.И. Елистратов, Б.В. Новиков // Проблемы профилактики и борьбы с особоопасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008. - С.114-118.
2. Жиангерова, О.В.Идентификация гемагглютинина вируса гриппа 5 серо-подтипа в перевиваемых культурах клеток с использованием моноклональных антител / О.В. Жиангерова, О.В. Капустина, Б.В. Новиков// Проблемы профилактики и борьбы с особоопасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2008г. - С.151-153.
3. Жиангерова, О.В. Выявление гемагглютинина вируса гриппа птиц подтипа Н5 иммуногистохимическим методом ИФА на основе моноклональных антител /О.В. Жиангерова, О.В. Капустина, Б.В. Новиков// Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Материалы международной научно-практической конференции. - Щелково, 2007г. -С. 63-67.
4. Жиангерова, О.В. Получение моноклональных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа птиц /О.В. Жиангерова, О.В. Капустина, Б.В. Новиков// Ветеринария. -№3. - 2009. - С.53-54.
5. Обследование диких птиц на грипп в лесостепной области Алтайского края/ А.Ю. Бондарев, П.И. Барышников, О.В. Жиангерова, Б.В. Новиков/ ГНУ ВНИИВВиМ, Институт ветеринарной медицины Алтайского государственного университета, Барнаул// Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных. Материалы научной - практической конференции, посвященной 70-летию образования кафедры паразитологии, эпизоотологии и ОВД факультета ветеринарной медицины Бурятской ГСХА им. В.Р. Филиппова,- Улан-Удэ, 2008г. - С.66-67.
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г.Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жиангерова, Ольга Васильевна
Оглавление
Оглавление.
Список сокращений.
Аннотация.
1. Введение.
1.1. Актуальность темы.
1.2. Цель и задачи исследований.
1.3. Научная новизна работы.
1.4. Практическая значимость результатов.
1.5. Апробация и публикация результатов.
1.6. Основные положения, выносимые на защиту.
1.7. Благодарности.
2. Обзор литературы.
2.1. История изучения вируса гриппа.
2.2. Морфологическая и биохимическая характеристики семейства ОНот1хоутйае.
2.2.1. Организация генома и репликация.
2.2.2 Патогенез, клинические признаки и патоморфологические изменения.
2.3 Диагностика гриппа птиц.
2.4. Получение моноклональных антител.
2.5. Использование МКА для изучения и диагностики гриппа.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциация гемагглютининов H5 и H7 вируса гриппа A птиц на основе моноклональных антител"
1.1. Актуальность темы
Грипп птиц — острая вирусная высококонтагиозная болезнь, поражающая многие виды сельскохозяйственной, домашней, синантропной и дикой птицы. Возбудителем гриппа является РНК-содержащий вирус семейства 011:огтхоутс1ае.
У существующих типов вируса гриппа тип А является наиболее распространенным и патогенным. Гриппом А болеют разнообразные виды животных: свиньи, лошади, семейство кошачьих, морские млекопитающие, птицы и человек. Вирус гриппа вызывает поражение респираторного и желудочно-кишечного трактов. Периодически вирус гриппа птиц вызывает опустошительные эпизоотии, эпидемии и пандемии [64, 65, 205].
В настоящее время ситуация по гриппу серьезно осложнилась, более чем в 50 странах мира были зарегистрированы массовые эпизоотии, сопровождающиеся гибелью и вынужденным убоем сотен тысяч и миллионов голов птицы. Эпизоотии, в основном, были обусловлены высоковирулентными штаммами гриппа птиц 5 и 7 подтипов.
В настоящее время определено 16 подтипов вируса гриппа птиц по гемагглю-тинину и 9 подтипов по нейраминидазе. Мониторинг подтиповой принадлежности вирусов гриппа птиц (ВГП) проводится постоянно, так как новые факты выделения их от птиц различных видов регистрируются ежегодно во многих регионах земного шара.
Схема диагностики гриппа птиц на сегодняшний день включает комплекс методов, направленных на выделение вируса и его идентификацию; детекцию вирусных антигенов и выявление специфических антител с помощью реакций диффузионной преципитации (РДП), связывания комплемента (РСК), нейтрализации (РН), торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментного анализа (ИФА) [44, 169].
Подтип антигенной формулы вируса определяют в РТГА и реакции ингиби-ции нейраминидазной активности. Кроме того, по последовательности нуклеотидов в геноме определяют принадлежность вируса к низко- или высокопатогенным его вариантам.
Большинство вышеперечисленных методов имеют ряд недостатков:
1. Высокая трудоемкость, продолжительность.
2. Недостаточная унифицированность, чувствительность и экспрессность.
При выявлении вируса гриппа с учетом существования низко- и высокопатогенных штаммов вируса гриппа 5 и 7 подтипов необходим метод экспресс - индикации подтипов гемагглютининов для принятия решения о проведении адекватных противоэпизоотических мероприятий.
В настоящее время при изучении свойств возбудителей различных болезней широкое применение нашли методы, связанные с использованием моноклональных антител (МКА). Разработанный в 1975 г. метод получения МКА сделал возможным получение биохимически гомогенных, специфичных к одной определенной антигенной детерминанте, стабильных по специфичности и авидности иммунных реагентов [148, 149, 169]. Такие свойства МКА позволяют использовать их для повышения чувствительности и специфичности серологических реакций и разработки высокоэффективных методов молекулярного анализа. Таким образом, МКА являются наиболее перспективными реагентами для разработки на их основе новых методов лабораторной диагностики вируса гриппа птиц.
Накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении методов иммуноферментного анализа для диагностики большого числа инфекционных болезней [66, 67, 98, 131, 143, 145].
В основе принципиальных достоинств метода лежат строгая специфичность взаимодействия антител с антигеном и мощное усиление химических реакций ферментами. Тесты включают два основных этапа, а именно - иммунологическую реакцию и ферментативную индикаторную реакцию для установления наличия или отсутствия взаимодействия антител с антигеном [102].
Главными достоинствами метода ТФ ИФА являются высокая чувствительность, минимальные затраты антигенов и антител, возможность количественной оценки в интерпретации результатов, исключение субъективизма, возможность ав
Введение10 томатизации рабочего процесса, а следовательно, большая производительность метода.
Поэтому разработка вариантов анализа на основе моноклональных антител, специфичных к подтиповым антигенным детерминантнам гемагглютининов, представляет значительную ценность для создания новых высокоэффективных методов, как непосредственного выявления и типирования вируса, так и мониторинга гриппа птиц на основе обнаружения специфических антител в сыворотках крови к гемагг-лютинину конкретного подтипа.
На основании вышеизложенного представляется целесообразным проведение работы по получению МКА, специфичных к антигенным детерминантам гемагглю-тинина высоковирулентного вируса гриппа птиц (Н5 и Н7) и разработке на их основе средств, методов диагностики и субтипирования вируса гриппа птиц.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Жиангерова, Ольга Васильевна
5. Выводы
JL Получены новые клоны гибридом, стабильно секретирующих монокло-нальные антитела к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипа вируса гриппа птиц.
2. Моноклональные антитела клона 4А6 специфичны к антигенным детерминантам лёгкой цепи гемагглютинина Н5, клоны ЗВЗ и 2F10 — к тяжёлой цепи гемагглютинина Н5. Моноклональные антитела клонов 2Н7, 1А8 взаимодействуют с лёгкой цепью гемагглютинина Н7, клон 1D3 и 4А8 - с тяжелой цепью гемагглютинина Н7.
3. Моноклональные антитела, специфичные к гемагглютининам Н5 (клоны 4А6, ЗВЗ, 2F10, 1СЗ) и Н7 (клоны 1D3, 2Н7, 1А8, 4А8, ЗЕ11) способны подавлять вирус - индуцированную гемагглютинацию эритроцитов, но не обладают вирус -нейтрализующими свойствами.
Иммуногистохимический вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител специфичных к гемагглютининам Н5 и Н7 обеспечивает выявление указанных вирусных белков в перевиваемых клетках культур ПСГК, MDCK через 8-10 часов после инфицирования.
Двухсайтовый сэндвич вариант твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител пар ЗВЗ и 4А6-ПХ, подтипа Н5 и пар 1D3 и 2Н7-ПХ подтипа Н7 позволяет выявлять гемагглютинин 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц с аналитической чувствительностью не менее 0,125 ГАЕ и превышает чувствительность рутинной реакции гемагглютинации в 8-16 раз.
6/Установлена циркуляция антител к вирусу гриппа птиц в 339 случаях, к ге-магглютинину Н5 в 39 случаях, к Н7 в 20 случаях. Одновременно к Н5 и Н7 установлено в 16 случаях. Видовых различий по циркуляции антител на территории Алтайского края и Тверской области не выявлено.
Практические предложения135
6. Практические предложения
1. Чувствительные, специфичные и экспрессные методы ИФА на основе МКА, позволяющие диагносцировать и типировать грипп птиц пятого и седьмого подтипов.
2. Разработаны и предложены Методические рекомендации по выявлению антигенов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных антител, утвержденные директором института, которые могут быть использованы в лабораторной практики для выявления гемагглютинина Н5 и Н7 в ЭЭЖ ЭК, пробах органов больной и павшей птицы.
3. Разработаны методы выявления специфических антител в сыворотках крови птиц использованные для проведения серологического мониторинга грипа птиц на территории Алтайского края и Тверской области.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жиангерова, Ольга Васильевна, Покров
1. Список использованной литературы
2. Брондз, Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании/Б.Д. Брондз. -М.: Наука, 1987,- С.133-214.
3. Боуэн, Т. Введение в ультрацентрифугирование/ Т. Боуэн. М.: Мир, 1973.248 с.
4. Виестур, У.Э. Гибридомы и моноклональные антитела / У.Э. Виестур, И.А. Шмите, A.B. Жилевич // Биотехнология, биологические агенты, технология, аппаратура. Рига: Зинанте, 1987.- С.63-81.
5. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИИТИБП, 1998.- 928с.
6. Вирусология / Б.Н. Филдс и др.. Т. 1.-М.: Мир, 1989.- 295с.
7. Вирусология: методы / Т. Баррет и др.. М.: Мир, 1988.- 344с.
8. Виткова, О.Н. Эпизоотическая ситуация по гриппу птиц и лабораторная диагностика гриппа птиц /О.Н. Виткова // Актуальные проблемы промышленного птицеводства грипп птиц. - СПб.: ЛЕНЭКСПО, 2005. - С. 17-19.
9. Воллер, А. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. Теория и практика /А. Воллер, А. Бидуэлл // Бюллетень ВОЗ.-1977.-№53. С. 38-45.
10. Джонс, Э.И. Иммунопероксидазные методы / Э.И. Джонс, Дж. Грегори, под ред. Кэгги Д.- М., 1991.- С. 239-267.
11. Дзантиев, Б.Б. Классификация и характеристика методов иммунофер-ментного анализа / Б.Б. Дзантиев, А.П. Осипов // Итоги науки и техники. Сер. «Биотехнология». Т. 20. -М., 1987. -С 56-117.
12. Жданов, В.М. Вирусология / В.М. Жданов, С.Я. Гайдамович. М.: Медицина, 1966. - 480с.
13. Список использованной литературы 137
14. Жиангерова, О.В. Получение моноклональных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа птиц / О.В. Жиангерова, О.В. Капустина, Б.В. Новиков // Ветеринария. 2009. - №3. - С. 53-54.
15. Жилинская, И.Н. Структура вируса гриппа / И.Н. Жилинская // Успехи современной биологии.- 1983.- Т.95, Вып.З.- С.373-382.
16. Изучение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к вирусам гриппа / A.A. Кущ, JI.A. Цой, Е.И. Иванова, З.И. Ровнова // Вопросы вирусологии.- 1985,- Т.ЗО, N1.- С.22 -24.
17. Иммунология / У. Пол и др.- Т. 3.-М.: Мир, 1987.- 356с.
18. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. -М.: Медицина, 1985. 302 с.
19. Иммуноферментный анализ/ пер. с англ.; под ред. Т. Нго, Г. Ленхоффа М.: Мир, 1988.-446с.
20. Искусственные антигены в биотехнологии: получение гибридом к М1-белку вируса гриппа / И.Г. Сидорович, А.Л. Лиознер, Г.А. Игнатьева, М.Е. Иващен-ко //Иммунология.- 1986. №1.- С. 51-53.
21. Использование иммуноферментного анализа для индикации и дифференциации вирусов гриппа А, В и С / С.Ф. Шендерович, Е.А. Говоркова, В.Т. Иванова, О.В. Любовцева, Л .Я. Закстельская // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология.- 1985.- №1.- С.85-90.
22. Список использованной литературы 138
23. Использование моноклональных антител для антигенного анализа вирусов гриппа А / М.С. Перейра, П. Чакраверти, П. Каннингам, Р.Дж. Уэбстер // Бюллетень ВОЗ.- 1985.- Т.63, №2.- С.30-35.
24. Карпухин, Г.И. Грипп:(Руководство) / Под ред. Г.И.Карпухина Л.: Медицина, 1986.-352с.
25. Кильбурн, Э.Д. Вирусы гриппа и грипп /Под ред. Э.Д. Кильбурна, Д.К.Львова.- М.: Медицина, 1978.- 585с.: ил.
26. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.- М.: Высшая школа, 1990. 352с.
27. Лурия, С. Общая вирусология/ С. Лурия, Дж. Дарнелл.- М.: Мир, 1970.-423с.
28. Майборода, Т.М. Иммуноферментные методы экспресс-диагностики вирусных инфекций / Т.М. Майборода // Этиология и диагностика гриппа и ОРЗ,-Л.:1986.- С.89-94.
29. Малахова, И.В. Хранение и восстановление гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к вирусным антигенам / И.В. Малахова, Е.В. Зорин, A.C. Новохатский // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1985.- № 3.-С.41-44.
30. Манько, В.М. Моноклональные антитела: Иммунобиотехнологические принципы получения и перспективы их применения // Гематология и трансфузиология. 1990. -№ 4. - С. 4-10.
31. Методы вирусологии и молекулярной биологии / Дж. Холпер и др.--М.: Мир, 1972.-444с.
32. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Б.В. Соловьев, В.Н. Фомина. М.: Агро-промиздат, 1986. - 351с.
33. Список использованной литературы 139
34. Моноюгональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа / пер.с англ.; под. ред. Р.Г. Кеннета, Т.Д. Макерна, К.Б. Бехтол М.: Медицина, 1983.-416с.
35. Моноклональные антитела к НП-белку и их использование для изучения вирусов гриппа А. /Д.К. Львов, А.Г. Букринская, С.С. Ямникова, А.Г. Красько, Н.Е. Вихрев, Б.С. Северин //Вопросы вирусологии. -1986. Т.31, №6.- С.655-657.
36. Новохатский, A.C. Клонирование гибридом методом предельных разведений / A.C. Новохатский, И.В. Малахова, Т.Т. Михеева // Вопросы вирусологии.-1985.-№5,- С.48-49.
37. Осидзе, Н.Г. Грипп птиц: этиология, патогенез, диагностики, специфическая профилактика, меры борьбы: автореф. дисс. докт.биол.наук / Осидзе Н.Г.Москва.- 1980.- 32 с.
38. Основы ветеринарии / Т.Е. Бурделев и др..- М.: Колос, 1978.-432с.
39. Первичная характеристика гибридом, полученных при слиянии клеток миеломы с лимфоцитами селезенки мышей, иммунизированных живым вирусом гриппа/ A.B. Ветласенин и др. // Этиология диагностика гриппа и ОРЗ: сб. науч. статей. Л., 1986.- С. 44-52.
40. Получение асцитных препаратов моноклональных антител / A.C. Новохатский и др. // Вопр. вирусол.- 1985.- Т.ЗО, №6.- С. 749-753.
41. Получение и свойства иммунопероксидазных конъюгатов / Е.М. Гаври-лова, Б.Б. Дзантиев, A.M. Егоров // Биохимия.- 1979.- Т.44, № 2.- С. 297-305.
42. Получение моноклональных антител к вирусам гриппа / С.С. Ямникова и др. // Вопросы вирусологии.- 1983.- Т.28, №1.- С. 21-24.
43. Правила по борьбе с гриппом птиц // Российская газета. 2006. - №191.
44. Список использованной литературы140
45. Рохлин, О.В. Моноклональные антитела в биотехнологии и медицине / О.В. Рохлин //Биотехнология.- 1984.- №4.- С.288-295.
46. Сафонов, Г.А. Разработка и усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики Ньюкаслской болезни и гриппа птиц: дисс. докт. биол. наук. / Сафонов Георгий Анатольевич.- Покров.- 1984.- 33 с.
47. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев.-М.: Колос, 1976.-303 с.
48. Сургучева, И.М. Анализ глипопротеидов вируса гриппа А птиц и усовершенствование средств диагностики /И.М. Сургучева/ Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук. -Покров, 1994
49. Сургучева, И.М. Анализ глипопротеидов вируса гриппа А птиц и усовершенствование средств диагностики /И.М. Сургучева/ Диссертация кандидата ветеринарных наук. Покров, 1994. - 142с.
50. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.: Колос, 1984.-376 с.
51. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. М.: Высшая школа, 1991.-288 с.
52. Фримель, X. Иммунологические методы /X. Фримель.- М.: Мир, 1992.-С. 9-18.
53. Харитоненков, И.Г. Использование иммуноферментных методов в вирусологии / И.Г. Харитоненков, M.JI. Христова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1985.- №6.- С.3-15.
54. Чурин, А.И. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ларинготрахеита птиц: получение и использование: автореферат диссертации кандидата биологических наук./ Чурин Александр Иванович Покров - 2007 - 27 с.
55. Список использованной литературы 141
56. Шитикова, Г.С. Моноклональные антитела в изучении этиологии гриппа / Г.С. Шитикова, А.А. Васильев, А.В. Ветласение // Этиология и диагностика гриппа и ОРЗ: сборник научных трудов.- JI, 1986.- С.9-17.
57. Эфрусси, Б.М. Гибридизация соматических клеток / Б.М. Эфрусси.- М.:-Мир, 1976.-С. 23-26.
58. Эффективность различных методов иммунизации при получении гибридом и моноклональных антител к вирусу гриппа птиц / С.А. Малоголовкин, И.М. Сургучева, И.М. Соловкина, А.А. Черных // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии
59. Adams, P. Methods of culture of cells / P. Adams.- 1983.- 210 p.
60. Alexander D.J. Avian paramyxoviruses / D.J. Alexader // Vet. Bulleten -1980.- Vol.50, №.9.- P.737-752.
61. Alexander D.J. The classification, host range and distribution of avian paramyxoviruses: Acute virus infections of poultry./ D.J. Alexader Ed. by J.B.McFerran and M.S.McNulty Brussels, 1985,- Martinus Nijhoff, Dordrecht Boston - Lancaster.- P.52-60.
62. Alexander, D.J. Resentzoonoses caused by influenza A viruses / D.J. Alexader, I.H. Brown //Rev. Sc. Tech.- 2000.- Vol. 19, № 1.- P. 197-225.
63. Alexander, D.J. A review of avian influenza in different bird spicies / D.J. Alexander // Veterinary Microbiology.- 2000.- Vol. 74, № 1-2.- P. 3-13.
64. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody against avian influenza virus / D.B. Snyder, W.W. Marquardt, F.S. Yancey, P.K. Savage // Avian Diseases. 1985.- Vol.29, №1.- P. 136-144.
65. Antigenic drift in type A influenza virus: Sequence differences in the hemagglutinin of Hong Kong (FI3N2) variants, selected with monoclonal hybridoma antibodies /
66. Список использованной литературы 142
67. W.G. Lawer, G.M. Air, R.G. Webster, W. Gerhard, C.W. Ward, T.A.A. Dopheide // Virology.- 1979.- Vol.29, №1.- P. 226-237.
68. Antigenic characterization of the internal proteins of newcastle disease virus by monoclonal antibodies / K. Nishicawa, N. Nadana, T. Morishima, T. Yoshida, M. Hamaguchi, T. Toyoda, Y. Nagai // Virus Res.- 1987.- Vol.7, №1.- P.83-92.
69. Antigenic variation in influenza A nucleoprotein detected with monoclonal antibodies / K.L. Van Wyke, W.S. Hinshaw, W.J. Bean // Virology.- 1980,- Vol.35, №1.-P.24-30.
70. Antigenic variation in the nucleoprotein of influenza A viruses / K.L. Van Wyke, V.S. Hinshaw, W.G. Bean, R.G. Webster // Abstract Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiology.- Washington, D.C.,- 1980.- P.266.
71. Assessment of the pathogenicity of an emerging influenza A H5 virus in ostriches (Struthio camelus) / A. Clavijo, J. Riva, J. Copps, Y. Robinson, E.-M. Zhou // Avian Pathology.- 2001.- Vol. 30, № 1.- P. 83-89.
72. Avian influenza: a new pandemic threat? / A. Trampuz, R.M. Prabhu, T.F. Smith, L.M. Baddour // Mayo Clin. Proc.- 2004.- Vol. 79, № 6.- P. 523- 530.
73. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam / T.T. Hien et al. // J. Med.- 2004.- Vol.350, № 12.- P. 1179-1188.
74. Avian H5N1 influenza in cats / T. Kuiken, G. Rimmelzwaan, D. van Riel, G. van Amerongen, M. Baars, R. Fouchier, A. Osterhaus // Science.- 2004.- Vol. 306.- P. 241.
75. Список использованной литературы143
76. Avian Influenza A virus in ducks migrating through / A. Wallensten, V.J. Munster, R.A.M. Fouchier, B. Olsen // Sweden International Congress Series.- 2004.- Vol. 263.- P. 71-72.
77. Avian influenza vims (H7 serotype) in a saker falcon in Italy / S. Magnino M. Fabbi, A. Moreno, G. Sala, A. Lavazza, E. Ghelfi, L. Gandolfi, G. Pirovano, F. Gasperi // Vet. Rec.- 2000,- Vol. 146, № 25.- P. 740.
78. Bancowski, R.A. Tissue culture system with newcastle disease virus and relationship of antigenicity to immunogenicity among strains. / R.A. Bancowski, J. Kinjo // Avian Diseases.- 1965.- Vol.9.- P.157-170.
79. Behn, I., Erfahrungen bei In-vivo-Kultur von Hybridomen/ I. Behn, U. Hommel // Allergie und Immunology.- 1989.- Vol.35, №.3.- P.226.
80. Biancifiori F. An occurence of newcastle disease in pigeons: virological and serological studies of the isolates. / F. Biancifiori, A. Fiorini // Сотр. Immunology Microbiology Infected Diseases.- 1983.- Vol.6.- P.247-252.
81. Birds, migration and emerging zoonoses. West Nile Virus, Lyme disease, influenza A and enteropathogens / K.D. Reed, J.K. Meece, J.S. Henkel, S.K. Shukla // Clinical Medicine & Research.- 2003.- Vol. 1.- P. 5-12.
82. Список использованной литературы 144
83. Bohn, W. Production of monoclonal antibodies to measles virus proteins by immunization of mice with heated and detergent-treated antigens / W. Bohn, G. Rutter, K. Mannweiger // Virology.- 1982,- Vol. 116, №.1.-P. 368-371.
84. Capua, I. Avian influenza and human health /1. Capua, D.J. Alexander // Ac-taTrop.- 2002.- №83.-P. 1-6.
85. Capua, I. The avian influenza epidemic in Italy, 1999-2000 a review / I. Capua, S. Marangon// Avian Pathology.- 2000.- Vol. 29, №4.- P. 289-294.
86. Capua, I. The 1999-2000 avian influenza (H7N1) epidemic in Italy /1. Capua, S. Marangon, F.M. Cancellotti //Vet. Res Comm.- 2003.-№ 27(Suppl. 1).- P. 123-127.
87. Characterization and evaluation of monoclonal antibodies developed for typing influenza A and influenza A viruses / H.H. Walls, M.W. Harmon, J.J. Slagle, C. Stockdale, A.P. Kendal // Clinical Microbiology.- 1986.- Vol.23, №.2.- P.240-245.
88. Characterization of a human H9N2 influenza virus isolated in Hong Kong / T. Saito, W. Lim, T. Suzuki, Y. Suzuki, H. Kida, S.-I. Nishimura, M. Tashiro // Vaccine.-2002.- Vol. 20, № 1-2.- P. 125-133.
89. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, HI 5 criteria for determination of influenza A subtypes / C. Rohm, N. Zhou, J. Süss, J. Mackenzie, R.G. Webster // Virology.- 1996.- Vol. 217, №2.- P. 508-516.
90. Список использованной литературы145
91. Characterization of highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat / T.M. Tumpey, D.L. Suarez, L.E.L. Perkins, D.A. Senne, J.-g. Lee, Y.-J. Lee, I.P. Mo, H.-W. Sung, D.E. Swayne // Virology.- 2002.- Vol. 76, № 12.- P. 63446355.
92. Clare, M.F. Characteristic of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses / M.F. Clare, A.N. Adams // Gen. Virology. -1977. -Vol.34.- P. 475-483.
93. Coinfection of wild ducks by influenza A viruses distribution patterns and biological significance / G.B. Sharp, Y. Kawaoka, D.J. Jones, W.B. Bean, S.P. Pryor, V. Hinshaw, R.G. Webster//Virology.- 1997.- Vol. 71, № 8.-P. 6128-6135.
94. Comparison of radioimunoprecipitation of antibody to immoblotting and ELISA for detection of antibody to ASF virus / C. Alcaraz, M. De Diego, M.J. Pastor, J.M. Escribano // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation.- 1990.- №2. P. 191196.
95. Список использованной литературы 146
96. Cross, K.J. Mechanism of cell entry by influenza viruses / K.J.Cross, L.M. Burleigh, D.A. Steinhauer // Expert review in molecular medicine. Электронный pe-сурс.- Режим доступа: http://www-ennm.cbcu.cam.ac.uk.
97. De Boer, G.F. Application of monoclonal antibodies in the avian leucosis virus gs-antigen ELISA / G.F. De Boer, A.D.M.E. Osterhaus // Avian Pathology.- 1985.-Vol.14, №1.- P.39-55.
98. Detection of influenza A virus by radioimmunoassay and enzyme-immuno assay from nasopharingeal specimens / H.K. Sarkkinen, P.E. Halonen, A.A. Salmi // Medicines Virology.- 1981. Vol.7, №.2.- P.213-220.
99. Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA / M. Munch, L.P. Nielsen, K.J. Handberg, P.H. Jorgensen // Archive Virology.- 2001.- Vol.146, №1.- P.87-97.
100. Easterday, B.C. Influenza / B.C. Easterday, V.S. Hinshaw, D.A. Halvorson // Diseases of poultry.- Iowa State University Press.- Ames.- Iowa, 1997.- P. 583-605.
101. Список использованной литературы 147
102. Ecological aspects of influenza A virus circulation in wild birds of the Western Palearctic / M. Delogu, M.A. De Marco, I. Donatelli, L. Campitelli, E. Catelli // Vet. Res. Corn.- 2003.- Vol. 21.- P. 101-106.
103. ELIS A test for the detection of influenza H7 antibodies in avian sera / G. Sala, P. Cordioli, A. Moreno-Martin, M. Tollis, E. Brocchi, A. Piccirillo, A. Lavazza // Avian Diseases.-2003.-Vol. 47, (3 Suppl).-P. 1057-1059.
104. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR / Y. Guan, J.S.M. Peiris, A.S. Lipatov, I.M. Ellis, K.C. Dyrting, S. Krauss, L.J. Zhang, R.G. Webster, K.F. Shortridge //PNAS.- 2002.- Vol. 99, № 13.- P. 8950-8955.
105. Epitope analysis of human cytomegalovirus glycoprotein complexes using murine monoclonal antibodies. / N.O. Lussenhop, R. Goertz, M. Wabuke-Bunoti, R. Gehrz, B. Kari // Virology.- 1988.- Vol.164.- P. 362-372.
106. Fazekas de St.Groth, S. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics / S. Fazekas de St.Groth, D. Scheidegger // Immunology Methods.- 1980.- Vol.35, №1.-P. 1-22.
107. Fukushi, H. Host species related antigenic group of avian influenza viruses possessing H4 hemagglutinin revealed by monoclonal antibodies / H. Fukushi, R. Yana-gawa, H. Kida // Archive Virology.- 1982.- Vol.72, № 3.- P.217-221.
108. Functional and antigenic domains of the matrix (M) protein of influenza A virus / Ye Zhiping, Pal Ranajit, W. Fox Jay, R. Wagner Robert // Virology.- 1987.- Vol.61, № 2.- P.239-246.
109. Список использованной литературы148
110. Gerhard, W. Antigenic drift in influenza A viruses. I. Selection and character-iztion of antigenic variants of А/ PR/8/34 (H0N1) influenza viruses with monoclonal antibodies / W. Gerhard, R.G. Webster//Exp. Medicine.- 1978.- Vol.148,№ 2.- P.383-392.
111. Gooding, J.V. Antibody production by hybridomas / J.V. Gooding // Immunology Methods.- 1980.- Vol.39, P. 285-308.
112. Heneen, W.K. Hela cells and their possible contamination of other cell lines: Karyotype stydies / W.K. Heneen // Hereditas.- 1976.- Vol.82.- P.217-248.
113. Highly pathogenic avian influenza // Manual of standards for diagnostics tests and vaccines / O.I.E. 05.2005.
114. High frequencies of antigen-specific hybridomas: dependence on immunization parameters and prediction by spleen cell analysis / C. Stahli, T. Staehelin, V. Mig-giano, J. Schmidt, P. Haring // Immunology Methods.- 1980.- Vol.32, №.3.- P. 297-304.
115. Hirst G.K. The quantitative determination of influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination / G.K. Hirst // Experimental Medicine- 1942.- Vol.75, №.1.- P.47-64.
116. Honmoto, T. Influenza: Lessons from past pandemics, warnings from current incidents / T. Honmoto, Y. Kawaoka // Nature Reviews Microbiology.- 2005.- Vol. 3,№ 8.-P. 591-600.
117. Horimoto, T. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses / T. Hori-moto, Y. Kawaoka // Clinical Microbiology Reviews.- 2001.- Vol. 14, № 1.- P. 129-149.
118. Список использованной литературыN9
119. Hofmann, Н. Tickborne encephalitis (ТВЕ) infection: antiviral antibodies in cerebrospinal Fluid / H. Hofmann, T. Popov-Kraupp // Zbl. Bacteriology Abt. La. -1983.-Vol.253, №3.- P. 205-211.
120. H3N2 influenza virus transmission from swine to turkeys, United States / Y.K. Choi, J.H. Lee, G. Erickson, S.M. Goyal, H.S. Joo, R.G. Webster, R.J. Webby // Emerging Infectious Diseases.- 2004.- Vol.10, № 12.- P. 2156-2160.
121. Immunogenic properties of small chain HA2 of the hemagglutinin of influenza viruses / H. Becht, PR.T.C. Huang, B. Fleischer, C.B. Boschek, R. Rott // General Virology.- 1984.-Vol.65, № 1.-P. 173-183.
122. Iorio, R.M. Monoclonal antibodies to newcastle disease virus: dlineation of four epitopes on the HN glycoprotein / R.M. Iorio, M.A. Bratt // Virology.- 1983.- Vol.48, №.2.- P. 440-450.
123. Is the gene pool of influenza viruses in shorebirds and gulls different from
124. Список использованной литературы150that in wild ducks? / Y. Kawaoka, T.M. Chambers, W.L. Sladen, R.G. Webster // Virology.- 1988.- Vol.163, № 1.- P. 247-250.
125. Isolation and identification of swine influenza recombinant A/Swine/Shandong/1/2003(H9N2) virus / C. Xu, W. Fan, R. Wei, H. Zhao// Microbes and Infection.- 2004.-Vol. 6, № 10.- P. 919-925
126. Isolation of a highly pathogenic influenza A virus of subtype H7N3 from a peregrine falcon (Falco peregrinus) / R.J. Manvell, P. McKinney, U. Wernery, K. Frost // Avian Pathology.- 2000.- Vol. 29, № 6.- P. 635-637.
127. Jeggo, M.H. Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques: current status and future prospects / M.H. Jeggo // Nucl. and related Techn. Anim. Prod, and Helth. Proc. Int. Symp.- Vienna, 17-21 March, 1986. Vienna. - 1986. - P.289-301.
128. Kanajima, S. Antigenic drift in influenza A/USSR/90/77 (H1N1) variants, selected in vitro with monoclonal antibodies / S. Kanajima, A.P. Kendal // Virology.- 1981.-Vol.l 13, № 2.- P. 656-662.
129. Kennedy, J.H., Enzym-linked immunosorbent assay / J.H. Kennedy, L. Kriska, P. Wilding // Clin.Chim.Acta. 1976.- Vol.70.- P. 1-31.
130. Kohler, G. Derivation of specific antibody producting tissue culture and tumor lines by cell fusion / G. Kohler, C. Milstein // Immunology.- 1976.- Vol. 6.-P. 511519.
131. Kohler, G. Coutinuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstein //Nature.- 1975,- Vol. 256.- P. 487-491.
132. Список использованной литературы151
133. Kohler, G. Immunoglobulin production by lymphocyte hybridomas / G. Kohler, H. Hengartner, M.J. Shulman // Immunology.- 1978. -Vol.8, № 2,- P. 82-88.
134. Koprowski, H. Production of antibodies against influenza virus by somatic cell hybrids between mouse myeloma and primed spleen cells / H. Koprowski, W. Gerhard, C.M. Croce // Procedure National Academy Science. USA.- 1977,- Vol.74.- P. 29852988.
135. Laemmli, U.K. Cleavage of structural protection during the assemble of the bacteriophage T4 / U.K.Laemmli // Nature. 1970,- Vol. 27.- P. 680-685.
136. Lee, P.J. When animal viruses attack: SARS and avian influenza / Lee P.J., Krilov L.R. // Pediatric Annals.- 2005,- Vol. 34, № 1p. 42-52.
137. Letchworth, G.J. Methods for production of monoclonal antibodies / G.J. Let-chworth, J.A. Appleton // Agriculture Handbook. U.S. Department of Agriculture.- 1986.-№ 630,- P. 50.
138. Lipkind M. Antigenic relationships between Avian paramyxoviruses. I. Quantitative characteristics based on hemagglutination and neuraminidase inhibition tests / M. Lipkind, E. Shihmanter // Archive Virology.- 1986.- Vol.89, N.l-4.- P. 89-91.
139. Lipkind, M. Further characterization of H7N7 avian influenza virus isolated from migrating starlings wintering in Israel / M. Lipkind, E. Shihmanter, D. Shoham // Zentrall Vetennarmed B.- 1982.- Vol. 29, № 7.- P. 566-572.
140. Long-term monitoring for avian influenza viruses in wild bird species in Italy / M.A. De Marco, E. Foni, L. Campitelli, E. Raffini, M. Delogu, I. Donatelli // Veterinary Res. Com.- 2003.- Vol. 27, № l.-P. 107-114.
141. Lubeck, M.D. Topological mapping of antigenic sites on the influenza A/PR/8/37 virus hemagglutinin using monoclonal antibodies / M.D. Lubeck, W. Gerhard// Virology.-1981.- Vol. 113, № 1.- P.64-79.
142. Mc.Quilling, J. Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of influenza A
143. Список использованной литературы 152and В infections by immunofluorescence / J. Mc.Quilling, C.R. Madeley, A.P. Kendal // Lancet.- 1985,- Vol. 2, № 8461.-P. 911-914.
144. Milstein, C. Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry / C. Milstein, A.C. Cuello //Nature.- 1983.- Vol. 305.- P. 537-540.
145. Monoclonal Antibodies / Baron D. et al..- New York: Springer Verlag,-1992.- 488 p.
146. Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of influenza A and В infections by immunofluorescence / J. Mc.Quilling, C.R. Madeley, A.P. Kendal // Lancet.- 1985.-Vol.2, №.8461.-P.911-914.
147. Monoclonal antibodies for rapid, strain-specific identification of influenza virus isolates / N.J. Schmidt, M. Ota, D. Gallo, V.L. Fox // Clinical Microbiology.- 1982.-Vol.16, №.4,- P.763-765.
148. Mouse mieloma proteins with antihapten antibody activity. The protein produced by plasma cell tumor MOPC-315 / H.N. Eisen, E.S. Simms, M. Potter // Biochemistry.- 1968.- Vol.7, №11,- P. 4126-4134.
149. Murphy, B.R. Orthomyxoviruses / B.R. Murphy, and R.G. Webster. // Fields virology, 3rd ed. Lippincott. Raven; Philadelphia, Pa, 1996.- P. 1397-1445.
150. New avian influenza A virus subtype combination H5N7 identified in Danish mallard ducks / K. Bragstad, P.H. Jorgensen, K.J. Handberg, S. Mellergaard, S. Corbet, A. Fomsgaard//Virus Research.-2005.-Vol. 109,-№2,-P. 181-190.
151. Nielsen, K.H. Uses of monoclonal antibodies in veterinary medicine / K.H. Nielsen, M.D. Henning // Genet. Eng. and Biotechnology- 1990,- Vol.10.- P. 14-18.
152. Neuraminidase inhibition test with fetuin as a substrate / H.M. Aymard, M.T. Coleman, W.R. Dowdle //Bulleten WHO.- 1973.- Vol.78.- P. 199-202.
153. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals / OIE.-6nded. Paris, 2008 - Vol.1 Chap. 2.3.4. - P. 465-481. Режим доступа: http://www.oie.int/eng/en index.htm
154. Optimierung der In-vivo-Produktion von Hybridomilinien durch Immunsuppression der Rezipienten /S. Witt, B. Ziegler, M. Ziegler// Allergie und Immunology.-1989.- Vol.35, № 3.- P.224-225.
155. Список использованной литературы 153
156. Oseltamivir reduces transmission, morbidity, and mortality of highly pathogenic avian influenza in chickens / A. Meijer, J. A. van der Goot, G. Koch, M. van Boven, T.G. Kimman//International Congress Series.- 2004,- Vol. 1263.- P. 495-498.
157. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model / G.F. Rimmelzwaan, T. Kuiken, G. van Amerongen, T.M. Bestebroer, R.A.M. Fouchier, D.M.E. Osterhaus // Virology.- 2001.- Vol. 75, № 14.- P. 6687-6691.
158. Pathogenesis of avian influenza A (H5NI) viruses in ferrets / L.A. Zitzow, T. Rowe, T. Morken, W.-J. Shieh, S. Zaki, J.M. Katz// Virology.- 2002.- Vol. 76, № 9.- P. 4420-4429.
159. Perkins, L.E.L. Varied pathogenicity of a Hong Kong-origin H5N1 avian influenza virus in four passerine species and budgerigars / L.E.L. Perkins, D.E. Swayne // Veterinary Pathology.- 2003.-Vol. 40, № 1.- P. 14-24.
160. Protein measurment with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosen-bough, A.L. Fan-, R.J. Paudal // Biology Chemistry.-1951.- Vol.193.- P. 265-275.
161. Rapid detection of influenza virus by shell vial assay with monoclonal antibodies / M.J. Espy, T.F. Smith, M.W. Harmon, A.P. Kendal // Clin. Microbiol.- 1986.-Vol. 24, №.4.- P.677-679.
162. Список использованной литературы 154
163. Replication and transmission of influenza viruses in Japanese quail / N.V. Makarova, H. Ozaki, IT. Kida, R.G. Webster, D.R. Perez // Virology.- 2003.- Vol. 310, № l.-P. 8-15.
164. Philpott, M. Neutralizing epitopes of the H5 hemagglutinin from a virulent avian influenza virus and their relationship to pathogenicity / M. Philpott, B.C. Easterday V.S. Hinshaw // Virology.- 1989.- Vol. 63, № 8.- P.3453-3458.
165. RT-PCR-ELISA as a Tool for Diagnosis of Low-Pathogenicity Avian Influenza / K. Dybkaer, M. Munch, K.J. Handberg, P.H. Jorgesen // Avian Diseases. -2003.-Vol.47.-P. 1075-1078.
166. Sanchez-Fauquier, A. Isolation of cross-reactive, subtype-specific monoclonal antibodies against influenza virus HA1 and HA2 hemagglutinin subunits / A. Sanchez-Fauquier, N. Villanueva, J.A. Melero // Archive Virology.- 1987.- Vol.97, № 3. P. 251266.
167. Schoemaker, H. The emergance of monoclonal antibody in diagnosis and therapy / H. Schoemaker, M. Wall, V. Zurawski //World Biotech. Rept.: Prac.Conf., London, May 1984. -N.-Y.- Pinner, 1984.- Vol.2.- P. 405-420.
168. Seo, S.H. Epidemiology of influenza virus in Korean poultry / S.H. Seo, H.S. Kim // International Congress Series.- 2004.- Vol. 263.- P. 758-761.
169. Список использованной литературы 155
170. Seroepidemiologacal evidence of avian H4, H5, and Н9 influenza A virus transmission to pigs in southeastern China / A. Ninomiya, A. Takada, K. Okazaki, K.F. Shortridge, H. Kida // Veterinary Microbiology.- 2002.- Vol. 88, № 2.- P. 107-114.
171. Sever, J.L. Application of microtechnique to viral serological investigators / J.L. Sever//Immunology.- 1962.- Vol. 88- P. 320-329.
172. Shulman, M. A bette cell line for making hybridomas secreting specific antibodies / M. Shulman, C.D. Wilde, G. Kohler // Nature.- 1978,- Vol. 276, № 5685.- P. 269270.
173. Sincovics, J.G. Monoclonal antibodies of hybridomas / J.G. Sincovics, G.R. Dreesman // Rev. Infectious Diseases.- 1983.- Vol. 5, № 1.- P. 9-34.
174. Suarez, D.L. Evolution of avian influenza viruses / D.L. Suarez // Veterinary Microbiology.- 2000.- Vol. 74, № 1-2.- P. 15-27.
175. Suarez, D.L. Immunology of avian influenza virus: a review / D.L. Suarez, S. Schultz-Cherry // Developmental and Comparative Immunology.- 2000.- Vol. 24, № 2-3.-P. 269-283.
176. Swenson, P.D. Rapid detection of influenza virus in cell culture by indirect immunoperoxidase staining with type-specific monoclonal antibodies / P.D. Swenson, M.H. Kaplan // Diagnostic Microbiology Infections Diseases.- 1987.- Vol.7, №.3.- P.265-268.
177. Time-resolved fluoroimmunoassay with monoclonal antibodies for rapid diagnosis of influenza infections / H.H. Walls, K.H. Johansson, M.W. Harmon, P.E. Ha-lonen, A.P. Kendal // Clinical Microbiology.- 1986.- Vol.24, №.6,- P.907-912.
178. Tjissen, P. Practice and theory of enzyme immunoassay // Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology.- Amsterdam; New York; Oxfort, 1985.- P. 194-280.
179. Tombin, P.K. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gel to nitrocellulose sheets / P.K. Tombin, T.Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. - V. 76, №9. - P. 4350 - 4354.
180. Use of enzyme-linked immunosorbent assay to detect serum antibody responses of volunteers who received attenuated influenza A virus vaccines / B.R. Murphy,
181. Список использованной литературы 156
182. E.L. Tierney, В.A. Barbouret al. // Infected and Immunology.- 1980.- Vol.29, № 2.-P.342-347.
183. Voller, A. Enzyme-Immunoassays in diagnostic medicine: Theory and Practice / A. Voller, D.E. Bidwell, A. Bartlett // Bull. Wild Hit. Organization.- 1976.- Vol. 53-P. 55-56.
184. Westerwoudt, R.J. Improved fusion methods. IV. Technical aspects / R.J. Westerwoudt//Immunology Methods.- 1985.- Vol. 77, № 2.- P. 181-196.
185. Webster, R.G. Analysis of antigenic drift in recently isolated influenza A (H1N1) viruses using monoclonal antibody preparations / R.G. Webster, A.P. Kendal, W. Gerhard // Virology.-1979.- Vol.96, № 1,- P.258-264.
186. Webster, R.G. Antigenic variation among type A influenza viruses / R.G. Webster, W.G. Lawer, G.M. Air // Genetics of influenza viruses / Ed. by Palese P., Kingsbury D.W.- Wien; New York: Springer, 1983.- P. 127-162.
187. Webster, R. Influenza: an emerging disease Электронный ресурс.- Режим доступа: http://www.cdc.ncidod/eid/vol4no3/Webster.Html.
188. Webster, R.G. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks / R.G. Webster, M.A. Yakhno, V.S. Hinshaw et al. // Virology.-1978.- Vol. 84.- P. 268-278.
189. Webster, R.G. Selection and analysis of antigenic variants of the neuraminidase of N2 influenza viruses with monoclonal antibodies. / R.G. Webster, V.S. Hinshaw, W.G.Laver//Virology.- 1982.-Vol.ll7,№ 1.-P.93-104.
190. Weiss S.H., Goedert J.J., Sarngadharan M.G. // J.A.M.A. 1985. - Vol. 253. -P. 221-225.
191. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. Режим доступаhttp://www.col.opsoms.org/prevencion/influenza/sanidadanimal/vigdxanimalOMS.pdf
192. Список использованной литературыС 157
193. Wild ducks are the reservoir for only a limited number of influenza A subtypes / G.B. Sharp, Y. Kawaoka, S.M. Wright, B. Turner, V. Hinshaw, R.G. Webster // Epidemiology Infected.- 1993.- Vol. 110,№ l.-P. 161-176.
194. Wiley, D.C. Structural identification of the antibody binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation / D.C. Wiley, I.A. Wilson, JJ. Skehel //Nature.- 1981.- Vol.289, № 5796,- P.373-378.
195. Yewdell, J.W. Antigenic variation in three distinct determinants of an influenza type A hemagglutinin molecule / J.W. Yewdell, R.G. Webster, W.U. Gerhard // Nature.- 1979,- Vol.279, № 5710.- Р.246-248/
-
Жиангерова, Ольга Васильевна
-
кандидата биологических наук
-
Покров, 2009
-
ВАК 03.00.06
- Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1
- Разработка набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур иммуноферментным методом
- Моделирование антигенного дрейфа вирусов гриппа А (HINI), выделенных от диких птиц
- Совершенствование иммунологических препаратов ранней этиологической диагностики вирусных ОРЗ на основе гибридомной технологии
- Особенности эволюции вирусов гриппа в период 1986-98 гг.
