Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в растениях Mesembryanthemun crystallinum L. в условиях засоления и при действии меди и цинка
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в растениях Mesembryanthemun crystallinum L. в условиях засоления и при действии меди и цинка"
На правах рукописи
АВДЕЕВА Анна Рамильевна
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ АКВАПОРИНОВ В РАСТЕНИЯХ МеэетЬгуаШкетит сгувШИпит Ь. В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА И ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ И ЦИНКА
03 00.12 - физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
□ОЗ168686
Москва - 2008
003168686
Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им К.А Тимирязева РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Холодова Валентина Павловна Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович
кандидат биологических наук, доцент Косулина Людмила Георгиевна
Ведущая организация: Российский Государственный Аграрный Университет - Московская сельскохозяйственная академия им К А Тимирязева
оо
Защита состоится 20 мая 2008 г в У ^ часов на заседании совета по защите
/3
докторских и кандидатских диссертаций Д 002210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул Ботаническая, 35
Факс (095) 977 8018, е-та11 ifr@ippras.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН
Автореферат разослан апреля 2008 г,
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,
кандидат биологических наук (/^ МИ Азаркович
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Растения постоянно поглощают и выделяют
воду На уровне клеток и органелл движение воды обычно занимает секунды
Но на тканевом или органном уровне ситуация может быть другой Перенос
воды на дальние расстояния по проводящим тканям в основном не встречает
препятствий между клетками Но транспорт воды на короткие расстояния,
который включает апопласт, симпласт и трансклеточный путь, в последних
двух случаях определяется транспортом через мембраны клеток В условиях,
когда возможен только «се1Но-се11» транспорт (симпласт, трансклеточный
путь), регуляция активности водных каналов оказывает наибольшее влияние на
гидравлические свойства ткани Присутствие аквапоринов в клеточных
мембранах дает организму возможность регулировать водный поток внутри и
между клетками Механизмы регуляции аквапоринов в процессе онтогенеза, а
также в ответ на действие факторов внешней среды включают
транскрипционный, трансляционный и посттрансляционный уровни Основное
внимание в исследованиях уделяется трансляционному и посттрансляционому
механизмам Тем не менее, дифференциальная экспрессия генов аквапоринов
также является важным механизмом регуляции в условиях водного дефицита,
однако изучена недостаточно
Факультативный галофит хрустальная травка (МезетЬгуапЛетит
сгузигШпит Ь) уже длительное время используется в качестве модели для
изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям Как оказалось,
соли тяжелых металлов (ТМ), так же как и засоление вызывают нарушения
водного статуса растений хрустальной травки Следует отметить, что лишь
очень небольшое число работ посвящено изучению воздействия тяжелых
металлов на аквапорины животных ^е1епта е! а1, 2003, 2004, Тпйо е1 а1,
2007), а исследования по воздействию солей меди и цинка на экспрессию генов
аквапоринов растений ранее не проводились.
Таким образом, остается открытым вопрос, в какой мере
дифференциальная экспрессия генов аквапоринов определяет стабилизацию
водного статуса растений хрустальной травки в условиях действия хлорида
натрия и солей тяжелых металлов
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось
выявление дифференциальной экспрессии генов аквапоринов в растениях
хрустальной травки и изучение роли этого процесса при адаптации растений к
3
хлоридному засолению и к избыточным концентрациям солей меди и цинка В связи с этим были поставлены следующие задачи
1 Исследовать воздействие хлорида натрия, повышенных концентраций меди и цинка на основные физиологические параметры, характеризующие водный статус растений, а также выяснить, сопровождаются ли такие изменения стресс-индуцированным формированием важного водосберегающего механизма - фотосинтеза САМ-типа
2 Выяснить, в какой мере реализуется дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в рамках суточных, онтогенетических и органных изменений водного статуса, вызываемых воздействием повышенных концентраций хлорида натрия и солей меди и цинка.
3. Сопоставить изменения основных физиологических параметров водною статуса растений с изменениями экспрессии генов аквапоринов при действии изучаемых стрессоров
4 Исследовать воздействие повышенных концентраций меди и цинка на изменение экспрессии индивидуальных изоформ аквапоринов на транскрипционном и трансляционном уровнях.
5 Оценить возможную роль аквапоринов в адаптации растений к повышенным концентрациям хлорида натрия и солей меди и цинка
Научная новизна. Впервые исследована дифференциальная экспрессия шести генов аквапоринов растений М сгузШИтит в различных органах, в суточной динамике, а также в ответ на действие факторов внешней среды различной природы, силы и продолжительности воздействия Обнаружено существование корреляций между изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов при воздействии повышенных концентраций хлорида натрия и солей тяжелых металлов Проведена оценка обогащенности мембран, изолированных из тканей растений хрустальной травки, подвергнутых воздействию тяжелых металлов, изоформами аквапоринов Р1Р-группы Впервые была исследована корреляция между накоплением транскриптов и белка Р1Р-аквапоринов при воздействии повышенных концентраций солей тяжелых металлов
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия хлорида натрия, солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса растений, а также о механизмах устойчивости к данным стрессорам имеют существенное значение для
4
выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов Полученные результаты создают основу для дальнейшего углубления исследований молекулярных механизмов регуляции трансклеточного потока воды и адаптивных свойств растительных клеток Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников С -Петербурге (С -Петербург, 2006), на годичном собрании Общества физиологов растений России и конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на международной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц, 20 рисунков, библиография содержит 184 название, в т.ч 176 на иностранных языках.
Объект и методы исследования
Объектом исследований служила хрустальная травка {Mesembryanthemum crystallinum L), для ее выращивания в водной культуре использовали модифицированную питательную среду Johnson (Winter, 1973) с железом в нитратной форме Растения выращивали в камере фитотрона при дневной температуре 23-25°С и ночной 18-20°С Для проведения опытов использовали растения М crystallinum в возрасте 4-10 недель Началом опыта являлся момент внесения C11SO4, ZnS04 и NaCl Использовали концентрации C11SO4 - 25 и 50 мкМ, ZnS04 - 250 и 500 мкМ, NaCl - 200 и 400 мМ. Продолжительность каждого эксперимента составляла 3, 9, 24, 72, 168 ч В каждой точке эксперимента фиксировали листья 3-4 ярусов снизу (не считая семядольных) и корни.
Общее содержание воды определяли высушиванием листьев при 70°С до
стационарного состояния Определение интенсивности транспирации листьев
5
проводили общепринятым гравитационным методом по Иванову (Пустовой и др, 1995) Для определения осмотического потенциала отжимали клеточный сок после замораживания-оттаивания растительных тканей Измерения проводили на осмометре Osmomat 030 фирмы «Gonotac» Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива по методу Bates et al. (1973) Определение содержания меди и цинка в тканях растений проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре Определение содержания ионов хлора проводили с помощью ионселективных электродов на ионаналайзере «Orion ЕА 940» фирмы «Orion» (США) Об индукции и развитии САМ судили по изменению характерной суточной динамики титруемой кислотности клеточного сока.
Выделение тотальной РНК из корней и листьев хрустальной травки проводили с использованием RNeasy Mini Kit фирмы QIAGEN Реакцию обратной транскрипции проводили, как указано в руководстве фирмы Fermentas ПЦР-анализ и электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле (11,3% в зависимости от размера продукта) проводили в присутствии бромистого этидия Для проведения лолимеразной цепной реакции были подобраны праймеры, приведенные в таблице 1 Для количественной оценки полученных результатов использовали программу ID-Scan
Таблица 1. Праймеры для проведения ОТ-ПЦР
транскршгг 5' - праймер 3' - праймер
МсР1Р1,4 GTCATGGTCGTTCTACAGAG GAGAAGACGGTGTAGACAAG
МсР1Р1,1 ACTGCTGGTATCTCAGGTGG GATGATAGCAGCACCGAGAC
МсР1Р2,1 CCAACACGAACGCTGACCAA GTGAACCATGAACACCGCGA
МсР1Р2,3 CTGCACTGCCGGTATCTCTG TTGCTGTAGCCGACGCTTAG
МсТ1Р1,2 TGGCAGAGTTCATCTCCACC TCCGATGAGTGGGCCGACCC
МсТ1Р2,2 GGCCAGATCACCATCCTCAC AAGTCACCACTGGCGAGAGC
АСТЗМ GTGATCTCCTTGCTCATACG GGnACTGGAATGGTnAAGG
РЕРс TGGATCCCATTACTACGCACC TCCAAGAGAGCTCGCCATTCT
Для получения микросомальных мембран соответствующие органы растений гомогенизировали в среде, содержавшей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-НС1 (рН 8.0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиоэритритол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 0,6%-ный (в/о) поливинилпирролидон Гомогенат фильтровали и центрифугировали при
lOOOOg 10 мин Из супернатанта осаждали микросомальные мембраны центрифугированием при lOOOOOg 30 мин Содержание белка определяли по методу Bradford (1976) Электрофоретическое разделение белков проводили в 12 5% ППА геле по методу Laemmli (1970) в камере Mini-Protean 3 Cell ("BioRad", США) На дорожку геля наносили 7-15 мкг белка Перед электрофорезом препараты мембранных белков смешивали в равных объемах с 2Х буфером для образца, содержащим 125 мМ Трис-HCl (рН 6 8), 4% (в/о) SDS, 20% (в/в) глицерин, 200 мМ ДТТ, 0 02% (в/о) бромфеноловый синий Для выравнивания содержания белка во все препараты добавляли IX буфер и проводили денатурацию белка при 96°С (5 мин) После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Nitrocellulose membrane, 0 45 micron ("Sigma-Aldrich"), используя Trans-Blot SD ("BioRad") no Towbm (1979) После переноса белков нитроцеллюлозную мембрану отмывали в среде PBST и блокировали 1 ч в той же среде с добавлением 3%-го (в/о) сухого обезжиренного молока при комнатной температуре Затем мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами в разведении 1 50 Антитела были получены против синтетической консервативной 20-аминокислотной последовательности аквапоринов Р1Р-семейства, конъюгировавной с БСА Сыворотка была любезно предоставлена д.б н М С Трофимовой (лаб мембран ИФР РАН) После инкубации с первичными антителами мембрану отмывали в PBST и инкубировали со вторичными козьими антикроличьими антителами (1 1000), конъюгированными с щелочной фосфатазой, в течение 1,5 ч После инкубации со вторичными антителами мембрану отмывали сначала в PBST, затем в растворе ДЭА, содержавшем 0 1 М диэтаноламин (рН 9 6) и 1 мМ MgCl2. Аквапорины визуализировали, используя цветную реакцию на щелочную фосфатазу в растворе, содержащем 1 5 мг BCiP, 3 мг NBT, 30 мл ДЭА
Результаты и обсуждение
Адаптация растений хрустальной травки к засолению. Известно, что при
засолении резко снижается доступность воды для растений Хрустальная травка
характеризуется высокой оводненностью тканей Закрытие устьиц является
одним из главнейших механизмов, позволяющих сохранять в жестких условиях
засоления нормальное тургорное давление При внесении соли в питательный
раствор наблюдалось заметное подвядание растений хрустальной травки в
течение первых 6 часов опыта, вместе с тем было отмечено значительное (в 3 -
7
6 раз в сравнении с контролем) снижение интенсивности транспирации уже через 3 часа после начала засоления Такие быстрые темпы снижения транспирации позволили опытным растениям уже в первые сутки практически полностью восстановить нормальное тургорное давление Оказалось, что солевой стресс сопровождался снижением основных показателей, характеризующих водный статус растений- оводненности, относительного содержания воды и осмотического потенциала листьев Падение оводненности наблюдалось уже при 3-часовом воздействии хлорида натрия (табл 2).
Таблица 2. Содержание воды в листьях растений хрустальной травки
Вариант Зч 9ч 24ч 72 ч Зч 9ч 24ч 72 ч
г НгО/г сухой массы ОСВ, %
Контроль 30,3 18,6 28,4 32,3 73,8 79,1 76,4 81,9
№С1200 мМ 18,2 17,5 21,2 24,6 67,9 69,3 66,5 79,3
ИаС1400 мМ 17,9 12 18,2 24,6 60,4 66,7 64,8 72,8
НСР0,05 09 1.2 1 1 1 1 06 05 05 04
Содержание воды в тканях листа опускалось до 17,5-18,5 г НгО/г сухой массы при контрольном значении 30,3 г Н20/г сухой массы Через 1-3 суток опыга наблюдалось постепенное восстановление показателей оводненности, которые превысили значения 24 г Н20/г сухой массы. В первые часы воздействия наблюдалось достоверное снижение относительного содержания воды (ОСВ) на 6% в случае умеренного засоления (200 мМ) и на 14% при солевом шоке более жестком воздействии (400 мМ) Такой уровень ОСВ сохранялся при 9- и 24-часовом стрессе Через 3 суток солевого стресса наблюдалось восстановление показателей ОСВ при умеренном засолении Трехчасовой стресс достоверно не повлиял на изменение осмотического потенциала (рис 1А) Однако уже после 9 часов воздействия №С1 в листьях растений наблюдалось снижение осмотического потенциала с -0,8 МПа до -1,2 МПа (при 200 мМ) до -1,6 МПа (при 400 мМ) Сутки засоления вызывали дальнейшее снижение величины осмотического потенциала до -1,5 МПа (в случае 200 мМ) и до -2,1 МПа (в случае 400 мМ) Снижение осмотического потенциала листьев растений хрустальной травки коррелировало с аккумуляцией ионов хлора и накоплением пролина.
8
В листьях растений контрольного варианта в течение суток эксперимента концентрация ионов хлора составила в среднем 15-19 мкэкв/г свежей массы (рис 1Б)
123456789 10
-0,5
-1,5 -2 -2,5
ш е щ
123456789 10
А Б
Рис. 1. Осмотический потенциал (А) и накопление ионов хлора (Б) в листьях М crystallmum при действии NaCl в течение 3 ч (№2-4), 9 ч (№5-7) и 24 ч (№8-10)
1,2,5,8-контроль 3,6,9-200 мМ NaCl 4,7,10-400мМ NaCl
Спустя 3 ч после добавления соли в питательный раствор содержание хлорид-ионов достоверно не превышало уровень контроля Однако 9-часовое засоление вызывало значительное по сравнению с контролем накопление ионов хлора, которое превысило контрольные показатели почти в 4 раза (при 200 мМ NaCl) и в 8,5 (при 400 мМ NaCl) раз Сутки воздействия сопровождались дальнейшей аккумуляцией хлорида в листьях, при этом значения составили 100 и 187 мкэкв/г свежей массы в варианте с 200 мМ и 400 мМ, соответственно, что превысило контрольные значения в 6 и в 12 раз Накопление таких высоких концентраций осмотически активных соединений и нормальное развитие растения возможно благодаря индукции в присутствии стрессора синтеза совместимых осмолитов, главным образом пролина Его аккумуляция за сутки солевого шока составила 13,20 мкмоль*г ~'св м , что почти в 13 раз выше контрольных показателей Пролин помогает выровнять возникающую разность осмотических потенциалов между компартментами клетки Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в корнях и листьях в суточной динамике. Нами была изучена экспрессия шести генов аквапоринов MIP А, MIP В, MIP С, MIP Н, MIP F, MIP К Анализ аминокислотных последовательностей (Kirch et al,, 2000) показал, что 4 из них локализованы на плазмалемме (MIP А, В, С, Н) и 2 - на тонопласте (MIP F, К) Работ по
классификации и созданию филогенетического древа аквапоринов хрустальной травки нет. Но Vera-Estrella et ai. (2004) используют новые названия для трех аквапоринов McMIPA, McMIPC, McMIPF в соответствии с номенклатурой, предложенной Johansson et al. (2001). Анализ последовательностей белков, а также порядок их регистрации позволили привести названия шести изучаемых аквапоринов в соответствие с новой номенклатурой (табл. 3).
Таблица 3. Названия аквапоринов хрустальной травки по новой классификации
Старое название Новое название комментарии
McMIPA McPIPl;4 Vera-Estrella et al,, 2004
McMIPB McPIPl;l Авдеева A.P., неопубл.данные
McMÍPC McPIP2;l Vera-Estrella et al., 2004
McMIPH McPIP2;3 Абдеева A.P., неопубл.данные
McMIPF McTIPl;2 Vera-Estrella et al,, 2004
McMIPK McTIP2;2 Абдеева A.P., неопубл:данные
Сравнение интенсивности экспрессии изученных генов в разных органах контрольных растений хрустальной травки показало (рис.2А), что значительные различия обнаружены по экспрессии гена МсР1Р2;1, существенно более высокая активность которого была характерна для корней.
МсРГР1;4
МсР1Р1;1
МсТ1Р2;2 «»»¡ДОИМ.
А Б i 2 3 В 1 2 3
Рис.2. А. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIPl;4 (PIP A); McPIPl;l (.PIP В); McPIP2;l (PIP С); McPIP2;3 (PIP Н); McTIPl;2 (TIP F) и McTIP2;2 (TIP К) в листьях (1) и корнях (2) растений M.crystallinum. Б,В. Уровень мРНК генов аквапоринов в корнях (Б) и листьях (В) растений M.crystallinum. 1, 2, 3 - контрольные варианты, 12.00 ч (1), 15.00 ч (2), 21.00 ч (3).
Аквапорин МсР1Р2;1 был назван корнеспецифичным (Fukuhara et al., 1999). Среди других изученных генов для МсР1Р1;1 и МсТ1Р1;2 было отмечено
некоторое, хотя и небольшое превышение содержания мРНК в листьях в сравнении с корнями.
Было обнаружено, что экспрессия генов аквапоринов МсР1Р1Д, МсР1Р2;1, МсР1Р2,3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 изменялась в течение суток в листьях, в то время как в корнях подобная динамика была характерна для МсТТР1,2 (рис 2) К 15 00 ч дня интенсивность экспрессии гена аквапорина МсТ1Р1,2 снижалась почти в 2 раза и оставалась на таком уровне до вечера Некоторое снижение уровня мРНК к 21 00 ч наблюдалось и для МсР1Р2;3 Напротив, в листьях обнаруженные суточные изменения содержания транскриптов были направлены в сторону повышения (рис2В). Так, количество мРНК МсР1Р1,1 значительно увеличивалось к 15 00 ч по сравнению с 12 00 ч, возрастая и к 2100 ч, затем оставалось на высоком уровне спустя сутки Подобная закономерность была обнаружена для аквапоринов МсР1Р2,1, МсР1Р2,3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2, содержание мРНК которых возрастало в 15 00 и оставалось выше дневного (12 00 ч) уровня Только для аквапорина МсР1Р2,3 к вечеру наблюдалось снижение количества транскриптов
Было установлено, что интенсивность и продолжительность засоления определяла дифференциальную экспрессию генов аквапоринов При умеренном засолении уровень мРНК Р1Р1-аквапоринов в корнях и в листьях незначительно отличался от контрольного на протяжении всех экспериментов Однако количество мРНК Р1Р2-изоформ в листьях к 3 часам засоления падало на 70% и ниже от уровня контроля и сохранялось на низком уровне в последующие 7 суток стресса В то же время количество мРНК аквапоринов тонопласта снижалось в первые часы воздействия в корнях и спустя сутки засоления восстанавливалось до уровня контроля у Т1Р2-изоформы и выше контроля - у Т1Р1-изоформы При этом в листьях интенсивность экспрессии генов Т1Р-аквапоринов несущественно отличалась от контроля на протяжении всего опыта
В случае солевого шока (400 мМ МаС1) дифференциальная экспрессия генов аквапоринов выражалась в том, что уровень мРНК МсР1Р1,1 в корнях и листьях падал через 9 часов воздействия, но восстанавливался в корнях к 3-м суткам засоления до контрольного, а в листьях продолжал снижаться (рис 3) Напротив, содержание транскриптов Р1Р2- и обеих Т1Р-изоформ в корнях не только не снижалось при солевом стрессе, но и в 2 раза превышало контроль на 3 сутки воздействия у Р1Р2- и на 1 сутки у Т1Р-аквапоринов (рис 4), стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне При этом в
и
листьях происходило резкое снижение уровня транскриптов мРНК Р1Р2-изоформ, которое не превышало 30% от контроля в последующие дни эксперимента Солевой шок вызывал постепенное понижение в содержании мРНК Т1Р-изоформ, незначительное - в случае МсТ1Р1;2
v 4 ~=
—i-
1 1- х
9 12 15
время воздействия
18 21 24
150
10 0
1 Г г
—McPIPI 4 A McPIP21
i—1- X I
1 2 3 4 6
время воздействия сут
3 6 9 12 15 18 21 24
время воздействия ч
0 1 2 3 4 5
время воздействия, сут
Рис. 3 Уровень мРНК генов аквапоринов McPIPl,4, McPIPl.l, МсР1Р2,1, МсРП>2,3, McTIPl ,2 и МсТ1Р2,2 в листьях растений М crystalhnum в ответ на солевой шок
Интересно, что характерный профиль экспрессии аквапоринов в листьях не обнаруживался в корнях, что отмечается в литературе (Yamada et al, 1997, Jang et al, 2004) Эти результаты подразумевают, что вклад отдельной изоформы аквапорина при водном стрессе различается в корнях и в листьях, а регуляция дифференциальной экспрессии аквапоринов включает интеграцию различных сигналов
-MCPIP1 1
-трри, шррг 1
MCPIP2 3
12 15 18 21 24 время воздействия, ч
6 9 12 15 время воздействия, ч
Рис. 4. Уровень мРНК генов аквапоринов МсР1Р1,4, МсР1Р1,1,МсР1Р2,1, МсР1Р2,3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 в корнях растений М сгуШаИтит в ответ на солевой шок
Проведенные исследования показали наличие корреляции между
изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией
генов аквапоринов при солевом стрессе Первые 3 ч солевого стресса
характеризовались достоверным снижением транспирации и содержания воды в
листьях Это сопровождалось down-регуляцией в первую очередь генов PIP-
аквапоринов, что вызывало снижение межклеточного транспорта воды и,
следовательно, устьичной проводимости для поддержания водного статуса
растений На организменном уровне это характеризовалось потерей
тургесцентности листьев Следующие 6 ч воздействия хлорида натрия
приводили к достоверному снижению ОСВ и осмотического потенциала на
фоне низкой оводненности и низкой транспирации Именно на этом этапе
начинали проявляться концентрационные различия воздействия соли Так,
достоверное снижение уровня экспрессии генов МсР1Р1,1; МсТ1Р1,2 и
МсТ1Р2,2 было показано только при воздействии 400 мМ NaCl Down-
регуляция генов аквапоринов, так же как и в первые часы воздействия,
наблюдалась у PIP-изоформ в листьях (преимущественно у PIP2) Таким
образом, острый водный дефицит приводил к сокращению межклеточного
водообмена в листьях, но не в корнях. Уменьшение водной проводимости
плазмалеммы способствовало сохранению воды в клетке в начальный период
стресса Интересно, что солевой шок приводил к постепенному сокращению
внутриклеточного водообмена в течение 7 суток в листьях за счет снижения
экспрессии ТЕР-изоформ, что, видимо, способствовало снижению водоотдачи в
тканях листа Напротив, содержание транскриптов PIP2- и обеих TIP-изоформ в
корнях не только не снижалось при солевом стрессе, но, напротив, в 2 раза
превышало контроль на 1 сутки у TIP- и на 3 сутки воздействия у PIP2-
аквапоринов, стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне
Подобное повышение активности аквапоринов связано, по-видимому, с
восстановлением массового поступления воды в растения, что отражалось и на
показателях оводненности листьев и ОСВ
Экспрессия генов аквапоринов в растениях хрустальной травки при
индукции водосберегающего механизма фотосинтеза САМ-типа в условиях
солевого шока. Растения 6-недельного возраста, на которых были проведены
основные эксперименты, осуществляли С3-тип фотосинтеза, о чем однозначно
свидетельствуют данные, представленные на рис 5, в соответствии с которыми
во всех контрольных вариантах, независимо от времени фиксации листьев,
отсутствовала мРНК ключевого фермента САМ-типа фотосинтеза - ФЕПК
13
(Рис 5,1,2,4,6) Однако в ответ на 3-х часовое засоление растения реагировали индукцией экспрессии гена, кодирующего данный фермент (Рис 5, 3), интенсивность которой усиливалась к 9 и, тем более, к 24 часам воздействия КаС1 Подобный подход дал возможность оценить стресс-зависимое изменение интенсивности экспрессии генов аквапоринов в процессе перехода растений на САМ-тип фотосинтеза
1 2 з" 4 * ' 5 б 7
Рис. 5. Влияние 400 мМ КаС1 на уровень мРНК гена фософоенолпируваткарбоксилазы в листьях растений М сгул/аИтит 1,2,4,6- контрольные варианты начало эксперимента -(1), 3 часа (2), 9 часов (4) и 24 часа (6) 3,5,7- продолжительность воздействия ИаС1400 мМ 3 часа (3), 9 часов (5) и 24 часа (7)
Существенно, что на самом раннем этапе ответа растений на солевой стресс, когда водосберегающий механизм фотосинтеза САМ-типа еще не сформирован, растения реагируют иншбированием интенсивности экспрессии генов аквапоринов, что направлено на понижение водопроницаемости клеточных мембран и, прежде всего, плазмалеммы, и более экономное расходование воды в условиях жесткого водного дефицита Характерно, что стресс-индуцируемое формирование САМ в меньшей степени отражается на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствует слабое влияние засоления на экспрессию генов аквапоринов тонопласта Полученные в настоящей работе результаты, а также доступные литературные данные позволяют высказать предположение, согласно которому стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к засолению, состоит в снижении интенсивности внутри- и межклеточного водообмена. Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит, очевидно, белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется в условиях солевого шока на уровне снижения интенсивности экспрессии кодирующих их генов
Адаптация растений хрустальной травки к действию токсических
концентраций меди и цинка. В литературе довольно часто отмечается факт
нарушения водного статуса при действии ТМ на растения, однако чаще всего
исследуются ответы на их долговременное воздействие. Между тем, нарушение
водного статуса растений, по-видимому, следует рассматривать как одно из
ранних проявлений токсического действия ТМ На растениях хрустальной
14
травки такой характерный признак неблагоприятных сдвигов как заметное подвядание листьев проявлялся на вторые-третьи сутки воздействия даже при умеренных концентрациях сернокислых солей меди и цинка
Оказалось, что рост растений на среде с ТМ приводил к сильному снижению содержания воды в листьях (табл 4)
Таблица 4. Содержание воды в листьях растений хрустальной травки
Вариант 1 день 3 дня 7 дней 1 день 3 дня 7 дней
% от свежей массы г НгО/г сухой массы
Контроль 96 93 96 75 96 78 31 57 29 77 30 06
CuS04 25 мкМ 96 83 95 63 93 42 30 55 21 88 14 20
CuS04 50 мкМ 95 73 94 88 91 15 22 42 18 53 10 30
ZnS04 250 мкМ 96 84 96 27 94 81 30 65 25 81 18 27
ZnS04 500 мкМ 96 71 95.85 93 85 30 44 23 10 15 20
НСРо 05 021 0 33 0 29 09 1 2 1 1
Падение оводненности особенно резко происходило при действии меди В
вариантах с умеренной концентрацией меди (25 мкМ) оводненность тканей
листа уже к третьим суткам воздействия снизилась почти в 1,5 раза Еще более
резкое падение оводненности отмечалось в вариантах с 50 мкМ сульфата меди
К 7 суткам эксперимента содержание воды в листьях растений этого варианта
снижалось в 3 раза Менее негативно на содержании воды в листьях растений
хрустальной травки сказывалось присутствие в среде цинка
На существенные структурные изменения, возникающие в клетках листьев
при росте растений хрустальной травки на среде с ТМ, указывает достоверное
снижение относительного содержания воды, наступающее уже на 1 сутки
воздействия (рис 6) Так, за 24 часа действия 25 мкМ Си804 ОСВ снизилось на
7% от контроля, а 50 мкМ Си504 - почти на 15%. Через 3 суток максимальное
снижение насыщенности, вызванное высокими концентрациями Си304 (50
мкМ), достигло 25%, 2пБ04 (500 мкМ) -15%
Значительное снижение осмотического потенциала клеточного сока (в 2
раза), происходящее в условиях сильного снижения оводненности листьев,
могло способствовать нормализации водного статуса растений Очевидно, что
синтез и аккумуляция пролина, концентрация которого к 7 суткам
эксперимента составляла 8,1 мкмоль*г_1св м (при воздействии 50 мкМ Си304)
15
по сравнению с 0,82 мкмоль*г 'св м. в контроле, способствовала снижению
осмотического потенциала.
Рис.6. Изменение относительного содержания воды в листьях хрустальной травки при 1- и 3-дневном воздействии солей меди и цинка
Среди ранних ответных реакций хрустальной травки особое внимание привлекает резкое снижение транспирации, наблюдаемое в течение первых суток роста растений при внесении в корнеобитаемую среду солей ТМ, особенно меди (рис. 7). А Б
Рис. 7. Транспирация растений М. с^аШпит при действии меди (А) и цинка (Б).
Уже 6-часовое воздействие СиБС^ в концентрации 50 мкМ снижало интенсивность транспирации на 37%, а через сутки - еще на 33%. Значительно более умеренным был ингибирующий эффект цинка. После 6 часов воздействия максимальной концентрации сульфата цинка снижение транспирации составило 18%, но спустя сутки воздействия это значение увеличилось до 47%. Более низкие концентрации ТМ оказывали меньший ингибирующий эффект. На третьи сутки воздействия ТМ интенсивность транспирации несколько восстановилась, оставаясь, тем не менее не ниже 66% от контроля в случае низких концентраций цинка. Однако более продолжительное пребывание растений в контакте с ТМ усиливало их ингибирующее действие, снижая гранспирацию до уровня около 40% от контроля практически при всех
испытанных вариантах действия ТМ Столь раннее и сильное снижение интенсивности транспирации несомненно свидетельствует о том, что ее регуляция инициировалась событиями, произошедшими к этому времени на уровне корня, а не непосредственно в листьях, поскольку существенное поступление цинка и меди в листья удавалось обнаружить не ранее 3 суток роста растений на среде с использованными концентрациями этих ТМ (табл 5)
Таблица 5 Накопление меди и цинка листьями растений хрустальной травки, мкг/г сухой
массы
Концентрация солей, мкМ 3 дня 7 дней
Контроль * 15 3
Си804 25 42 101
50 88 125
Контроль * 30 7
гп804 250 178 301
500 402 1235
НСРо 05 22 29
* Культуральная среда содержала 0 25 мкМ СиБОдИ 1 мкМ 2п504
С другой стороны, как показали данные настоящего исследования, значительных изменений водного статуса листьев, которые могли бы инициировать закрывание устьиц, в течение первых суток еще не обнаруживалось В дальнейшем транспирация растений хрустальной травки, подвергшихся воздействию ТМ, стабилизировалась на заметно более низком уровне, чем у контрольного варианта, что может рассматриваться как один из защитных механизмов на их токсическое действие С другой стороны, снижение транспирации может иметь у растений хрустальной травки особый эффект в связи с тем, что это - индуцибельное САМ-растение Являясь эффективной водосберегающей стратегией, САМ-фотосинтез способствует поддержанию водного статуса растений в жестких условиях, тем самым обеспечивая возможность нормального протекания физиологических процессов
Концентрация протона (рис 8) в листьях контрольных растений на протяжении всего эксперимента лежала в пределах 10 мкэкв/г свежей массы, что характерно для растений хрустальной травки при преимущественном
функционировании Сз-типа фотосинтеза Однако, действие меди в самой низкой из использованных концентраций - 25 мкМ уже к третьим суткам эксперимента достоверно повышало содержание протона в тканях листа почти до 30 мкзкв/г свежей массы. Такие значения показателя уже позволяют говорить о начале перехода растений на САМ-тип фиксации углекислоты
Рис 8 Действие меди (А) и цинка (Б) на интенсивность САМ у растений хрустальной травки на третьи (а) и седьмые (б) сутки эксперимента А - 1 - контроль, 2 - №С] (400 мМ), 3- Си304,25 мкМ, 4-50 мкМ
Б - 1 - контроль, 2 -№С1 (400 мМ), 3- гп804,250 мкМ, 4 - 500 мкМ
Сернокислая медь в концентрации 50 мкМ за тот же период вызывала увеличение концентрации протона до 37,5 мкэкв/г свежей массы Аналогичным образом, хотя и менее интенсивно на растения хрустальной травки действовал и сернокислый цинк (рис 8Б) В то время как величина титруемой кислотности листьев за семь суток у растений, подвергнутых действию меди достигала 73 мкэкв/г свежей массы при использовании 50 мкМ, в варианте с сернокислым цинком в концентрации 500 мкМ она составляла 55,4 мкэкв/г свежей массы, а в концентрации 250 мкМ - 38 4 мкэкв/г свежей массы Такое резкое усиление интенсивности САМ медью и цинком может быть, по-видимому, индуцировано не только изменением водного статуса растений, но и быть обусловлено возможным участием малата - первичного акцептора углекислого газа при САМ-пути - в связывании ТМ
Весьма важными представляются впервые полученные данные о влиянии ТМ на дифференциальную экспрессию генов аквапоринов Интересно, что при этом природа ТМ оказывала большее влияние на изменение содержания мРНК аквапоринов, чем их (солей ТМ) концентрации (рис 9,10)
Уровень экспрессии генов МсР1Р1,1, МсР1Р2,1 и МсР1Р2,3 в корнях и листьях растений сильно снижался через 1 сутки воздействия меди, и этот
пониженный уровень содержания мРНК сохранялся или даже еще бочее
снижался вплоть до полного прекращения экспрессии, как это было
обнаружено в отношении гена МсР1Р2,1 в листьях после 7 суток роста растений хрустальной травки на среде с ТМ (рис 9)
6 9 12 15 время воздействия
2 3 4 5 время воздействия сут
8 12 15 18 21 24 время воздействия, ч
1 2 3 4 5 6
время воздействия сут
Рис.9. Уровень мРНК генов аквапоринов МсР1Р1,4, МсР1Р1,1, МсР1Р2,1, МсР1Р2,3, МсТ1Р 1,2 и МсТТР2,2 в листьях растений М аухюШпит в ответ на действие 50 мкМ СиБОд
При этом, соли цинка не вызывали достоверного снижения через сутки эксперимента количества транскриптов МсР1Р2,1 в корнях и всех изоформ Р1Р-аквапоринов в листьях (рис 10) Однако, в последующие дни эксперимента различия в воздействии меди и цинка исчезали - через 7 суток происходило существенное снижение количества мРНК всех Р1Р-изоформ под действием ТМ Бо\УП-регуляция генов аквапоринов в данном случае коррелировала со снижением транспирации, показателей ОСВ и оводненности
Однако на 3 сутки воздействия происходила ир-регуляция генов Р1Р2-аквапоринов в корнях, особенно в случае воздействия меди (рис 11) В литературе по этому поводу существуют данные, которые подтверждают ир-регуляцию экспрессии генов аквапоринов в ответ на очень сильное стрессовое воздействие (Оакпеэ й а1, 2007, Уатас1а й а!, 1997) Видимо в таких жестких условиях, когда устьичная проводимость низкая, вода поступает слабо, повышение экспрессии аквапоринов способствует увеличению водной проницаемости плазмалеммы, что может помочь стабилизации водного статуса растения
Несколько другой профиль экспрессии наблюдался в отношении аквапоринов тонопласта. Сутки воздействия ТМ не вызывали достоверных изменений экспрессии гена МсТ1Р1;2, но значительно снижали количество транскриптов МсТ1Р2,2 в корнях и листьях растений хрустальной травки
0368 12 15 18 21 24 01234567
врем воздействия, ч врвеея ■оздвйвтамя, вут
3 в 9 12 15 18 21 враия воздействия ч
МСТ1Р1 2 --—МСТ1Р2-2
1 2 3 4 5 время есзлейсгвия суг
Рис 10. Уровень мРНК генов аквапоринов МсР1Р1,4, МсР1Р1,1, МсР1Р2,1, МсР1Р2,3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 в листьях растений М сгу5ЮП1пит в ответ на действие 500 мкМ гпБОд
Существенно, что в процессе адаптации на фоне пониженного межклеточного водообмена происходило урегулирование внутриклеточного движения воды в корнях, о чем свидетельствует стабилизация количества мРНК МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 на уровне контроля через 7 суток воздействия Если в корнях через 7 суток эксперимента количество мРНК обеих изоформ находилось на контрольном уровне, то в листьях напротив, происходило снижение количества транскриптов МсТ1Р1,2 йМсТ1Р2,2
Таким образом, первые существенные изменения уровня транскриптов как в корнях, так и в листьях были зафиксированы только через сутки воздействия ТМ Несмотря на то, что при стресс-реакции (в первые 24ч воздействия) разные гены аквапоринов реагировали неодинаково, адаптация приводила к сглаживанию различий и формированию единой стратегии выживания, которая заключалась в снижении межклеточного воообмена (т е водоотдачи) и «консервированию» воды внутри клетки в корнях и листьях растений при стабилизации внутриклеточный водообмена в корнях
9 12 15 18 21 24 время воздействия ч
1 2 3 4 5 6
ир«мя возда йс-гвия сут
12 15 18 21 24 время воздействия ч
1 2 3 4 5 6 7
время воздействия сут
Рис 11. Уровень мРНК генов аквапоринов МсР№1,4, МсР1Р1,1, МсР1Р2,1, МсР1Р2,3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 в корнях растений М сгу5(а11шит в ответ на действие 50 мкМ СиБС^
На этом фоне обращает на себя особое внимание факт резкого снижения экспрессии гена аквапорина тонопласта МсТ1Р2,2, зарегистрированный в клетках листьев уже через 3 часа действия ZnS04 и C11SO4 (рис 9,10) Такой большой размер ингибирования - снижение в 4-5 раз в сравнении с контролем - свидетельствует в пользу представления о том, что произошло оно в основной массе клеток листа Ингибирование экспрессии одного из генов аквапоринов может быть первым шагом на пути торможения водоотдачи листьями при воздействии на растения ТМ, что могло бы в какой-то степени компенсировать вызываемые ими нарушения водообмена Видимо, торможение водопоглотительной функции корневой системы в условиях подавления транспирации стало причиной ранней реорганизации сложной системы аквапоринов, модификация и адаптация которой особенно важна для условий низкой транспирации, когда апопластное тканевое движение воды сменяется по преимуществу симпластным
Известно, что количество транскриптов и белков аквапоринов не обязательно коррелирует между собой Поэтому казалось необходимым оценить воздействуют ли ТМ на уровень белков аквапоринов Обогащенность микросомальных мембран аквапоринами оценивали на основе интенсивности окраски при иммунологической идентификации изоформ, принадлежащих к PIPI- и Р1Р2-подсемействам Согласно полученным данным, количество белка
21
Р1Р-аквапоринов хрустальной травки в корнях после 3 суток воздействия ТМ увеличилось, то есть наблюдалась положительная корреляция между накоплением транскриптов и белка Р1Р-аквапоринов (рис 12) При этом, 7 суток воздействия ТМ приводили к снижению количества белка Р1Р-изоформ как в листьях, так и в корнях Причем в листьях наблюдалось более значительное снижение количества аквапоринов на фоне более низкого, чем в корнях контрольного уровня аквапоринов Эти результаты также не противоречили данным по содержанию мРНК Р1Р-аквапоринов, согласно которым ТМ вызывали снижение количества мРНК всех исследованных Р1Р-изоформ (за исключением МсР1Р1,4), причем в листьях такое снижение было более драматичным и, в случае МсР1Р2,1 приводило к полному ингибированию экспрессии гена этого аквапорина А Б В
К Си Ъъ — 94 94 - К Си Ъа К Си Ъп
- 67 67
_ 94—
43 _ —---: _
' ~ Г 1.1 -- Ь:-А
_ 43 43-'
30 _
— 30 30— ,
20 — 20_
Рис 12. Иммунологическая идентификация Р1Р-аквапоринов в препаратах мембранного белка А. в корнях растений М сгу$1а111пит при 3-суточном воздействии ТМ Б, В. в корнях (Б) и листьях (В) растений М сгуНаПтит при 7-суточном воздействии 50 мкМ СивОд (Си) и 500 мкМ 2пв04 (¿п) На каждую дорожку нанесено по 7 мкг мембранного белка
ВЫВОДЫ
1 Проведенные на растениях МезвтЪгуаЫкетит сгузгаПтит исследования позволили установить дифференциальную экспрессию генов аквапоринов МсР1Р1,1, МсР1Р2,1, МсР1Р2;3, МсТ1Р1,2 и МсТ1Р2,2 в различных органах, в суточной динамике, а также в ответ на действие стрессоров различной природы, интенсивности и продолжительности их воздействия
2 Исключением являлся ген аквапорина плазмалеммы МсР1Р1;4, конститутивная экспрессия которого не зависела от органной локализации, времени суток и характера стрессорного воздействия
3 Зафиксированы корреляции между изменениями основных физиологических параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов в условиях стресса Водный дефицит, вызванный засолением и действием меди и цинка, сопровождался снижением оводненности листьев, интенсивности транспирации, ОСВ, осмотического потенциала и приводил к down-регуляции генов PIP-аквапоринов в листьях (преимущественно Р1Р2-изоформ)
4 Стресс-индуцируемое формирование САМ-типа фотосинтеза уже на начальных этапах вызывало снижение трансклеточного переноса воды в суккулентных органах за счет ингибирования экспрессии генов аквапоринов плазмалеммы, но в меньшей степени отражалось на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствовало слабое влияние стрессоров на экспрессию генов аквапоринов тонопласта
5 Изменения в содержании белка PIP-аквапоринов в условиях действия ТМ соответствовали изменениям уровней их транскриптов Вероятно, регуляция водного статуса при его нарушении, вызванном воздействием солей меди и цинка, происходила на уровне транскрипции генов аквапоринов
6 Стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к повышенным концентрациям хлорида натрия и солей ТМ, состоит в снижении интенсивности водообмена в листьях и стабилизации внутриклеточного водообмена в корнях Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется или стабилизируется в условиях стресса на уровне изменения интенсивности экспрессии кодирующих их генов.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1 Trofimova М, Kholodova V, Bozhko К., Meshcheryakov А, Zhestkova I., Kuznetsov V, Abdeeva A, Kuznetsov VI Developmental and stress-regulated transition of Mesembryanthemum crystallmum from C3 to CAM photosynthesis aquaponn content and cell membrane water permability // Absracts of the ASPB, 2005.
2. Холодова В.П., Абдеева A P., Волков К С, Кузнецов Вас В , Кузнецов ВлВ Экспрессия генов аквапоринов при адаптации растений к хлоридному засолению и солям тяжелых металлов // Тезисы докладов, Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» Вологда, 2005. С 175
3 Abdeeva A, Kholodova V The role of aquaponns in Mesembryanthemum crystallmum under salinity // Abstracts of the I (IX) International Conference of Young Botanists m Saint-Petersburg St Petersburg, 2006 P 223
4. Абдеева A P , Волков К С, Холодова В П, Кузнецов Вл В Возможные механизмы стабилизации водного статуса при кросс-адаптации растений к засолению и тяжелым металлам // Тезисы докладов, Годичное собрание Общества физиологов растений России и конференция «Физиология растений -фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» Ростов-на-Дону, 2006 С 49
5 Абдеева А Р., Волков К С , Холодова В П, Кузнецов Вл В Изменение экспрессии генов аквапоринов при адаптации растений хрустальной травки к высоким концентрациям меди и цинка // Тезисы докладов, Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» Сыктывкар,2007 42 С 8
6 Волков К С , Абдеева А.Р , Холодова В П, Юдин А В , Кузнецов Вл В Протекторный эффект NaCl при адаптации растений хрустальной травки к действию высоких концентраций меди // Тезисы докладов, Международная конференция «Современная физиология растений- от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007 42 С 73
7 Кузнецов Вл В , Холодова В П, Волков К С, Абдеева А Р Стратегии и механизмы устойчивости растений к высоким концентрациям тяжелых металлов // Тезисы докладов, Международная конференция «Современная физиология растений от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007 4 2 С 218
8 Абдеева А Р, Холодова В П, Кузнецов Вл В Экспрессия генов аквапоринов в растениях хрустальной травки при индукции вобосберегающего механизма фотосинтеза САМ-типа в условиях солевого шока // Доклады Академии наук, 2008. Т 418 Ч 2 С 270-273
9 Холодова В.П., Абдеева АР., Кузнецов ВлВ Дифференциальная регуляция экспрессии генов аквапоринов как основа гомеостатирования водного режима растений в стрессовых условиях // Тезисы докладов, VI Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск, 2008
Подписано в печать 15 04 2008 Печать трафаретная
Заказ № 274 Тираж 75экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 3 б (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абдеева, Анна Рамильевна
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Механизмы адаптации растений к засолению.
1.2. Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов.
2.1. Структура аквапоринов.
2.2. Номенклатура аквапоринов растений.
2.3. Регуляция водной проницаемости мембран.
2.4. Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов как способ регуляции их активности.
2.5. Функции аквапоринов.
2.6. Молекулярные и клеточные аспекты экспрессии аквапоринов в ответ на засоление.
2.7. Чувствительность аквапоринов к тяжелым металлам.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования.
2.2. Выращивание хрустальной травки в водной культуре.
2.3. Условия проведения опытов.
2.4. Определение общего содержания воды в листьях.
2.5. Определение интенсивности транспирации.
2.6. Определение осмотического потенциала.
2.7. Определение содержания свободного пролина.
2.8. Измерение рН и буферной емкости.
2.9. Определение содержания ионов тяжелых металлов 63 в тканях растений.
2.10. Определение содержания ионов хлора в тканях растений.
2.11. Оценка интенсивности экспрессии генов аквапоринов.
2.12. Получение микросомальных мембран.
2.13. Определение содержания аквапоринов.
2.14. Математическая обработка данных.
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1. Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в различных органах и в суточной динамике.
3.2. Адаптация растений хрустальной травки к засолению.
3.2.1. Изменение водного статуса растений при засолении.
3.2.2. Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в ответ на засоление.
3.2.3. Экспрессия генов аквапоринов в растениях хрустальной травки при индукции водосберегающего механизма САМ-типа фотосинтеза в условиях солевого шока.
3.3. Адаптация растений хрустальной травки к действию токсичных концентраций меди и цинка.
3.3.1. Изменение водного статуса растений при действии высоких концентраций меди и цинка.
3.3.2. Аккумуляция меди и цинка.
3.3.3. Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в ответ на действие меди и цинка.
3.3.4. Изменение содержания аквапоринов в ответ на действие меди и цинка.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в растениях Mesembryanthemun crystallinum L. в условиях засоления и при действии меди и цинка"
Вода является универсальным растворителем и самой распространенной молекулой в живых организмах. Растения постоянно поглощают и выделяют воду. На уровне клеток и органелл движение воды обычно занимает секунды (Steudle et al., 1993). Но на тканевом или органном уровне ситуация может быть другой. Как известно, перенос воды на дальние расстояния по проводящим тканям в основном не встречает препятствий между клетками. Но транспорт воды на короткие расстояния, который включает апопласт, симпласт и трансклеточный путь, в последних двух случаях определяется транспортом через мембраны клеток. В условиях, когда возможен только «cell-to-cell» транспорт (симпласт+трансклеточный путь), регуляция активности водных каналов • оказывает наибольшее влияние на гидравлические свойства ткани. Именно аквапорины обеспечивают молекулярную основу быстрой и обратимой регуляции водного транспорта. Аквапорины играют существенно важную роль в процессе онтогенеза растений и в поддержании водного баланса в ответ на действие стрессоров различной природы (Maurel and Chrispeels, 2001).
Многие стрессоры вызывают сильные нарушения водного статуса растений. Засоление остается наиболее изученным среди них. Факультативный галофит хрустальная травка {Mesembryanthemum crystallinum L.) уже длительное время используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям. В исследованиях Холодовой В.П. (2005) было показано, что соли тяжелых металлов (ТМ) также оказывали негативное влияние на состояние водного статуса растений хрустальной травки.
Следует отметить, что очень небольшое количество работ посвящено изучению воздействия тяжелых металлов на аквапорины животных (Zelenina et al., 2003; 2004; Tritto et al., 2007), а исследования по воздействию солей меди и цинка на экспрессию аквапоринов растений ранее не проводились.
Дифференциальная регуляция экспрессии генов аквапоринов позволяет растениям неодинаково отвечать на действие различных стрессоров для поддержания их водного статуса. Экспрессия генов отдельных изоформ аквапоринов может стимулироваться, ингибироваться или оставаться на прежнем уровне. Так, в случае засухи наблюдалась down-регуляция некоторых PIP-генов в надземных частях растений, в то время как засоление вызывало ир-регуляцию тех же генов в корнях (Galmes et al., 2007; Jang et. al., 2004).
Таким образом, остается открытым вопрос в какой мере дифференциальная экспрессия генов аквапоринов определяет стабилизацию водного статуса растений хрустальной травки в условиях действия хлорида натрия и солей тяжелых металлов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление дифференциальной' экспрессии генов аквапоринов в растениях хрустальной травки и выяснение роли этого процесса при адаптации растений к хлоридному засолению, а также избыточным концентрациям меди и цинка.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать воздействие хлорида натрия, повышенных концентраций меди и цинка на основные физиологические параметры, характеризующие водный статус растений, а также выяснить, сопровождаются ли такие изменения стресс-индуцированным формированием важного водосберегающего механизма!—-фотосинтеза САМ-типа.
2. Выяснить, в какой мере реализуется дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в рамках суточных, онтогенетических и органных изменений водного статуса, вызываемых воздействием повышенных концентраций хлорида натрия и солей меди и цинка.
3. Сопоставить изменения основных физиологических параметров водного статуса растений с изменениями экспрессии генов аквапоринов при действии изучаемых стрессоров.
4. Исследовать воздействие повышенных концентраций меди и цинка на изменение экспрессии индивидуальных изоформ аквапоринов на транскрипционном и трансляционном уровнях.
5. Оценить возможную роль аквапоринов в адаптации растений к повышенным концентрациям хлорида натрия и солей меди и цинка.
Научная новизна. Впервые исследована дифференциальная экспрессия шести генов аквапоринов растений М. crystallinum в корнях и листьях, в суточной динамике, а также в ответ на действие факторов внешней среды различной природы, силы и продолжительности воздействия. Обнаружены корреляции между изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов при воздействии повышенных концентраций хлорида натрия и солей ТМ. Проведена оценка обогащенности мембран, изолированных из тканей растений хрустальной травки, подвергнутых воздействию тяжелых металлов, изоформами аквапоринов PIP-подсемейства. Впервые была исследована корреляция между накоплением транскриптов и белка PIP-аквапоринов при воздействии повышенных концентраций ТМ.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия хлорида натрия, солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса растений, а также о механизмах устойчивости к данным стрессорам имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов. Полученные результаты могут быть использованы для углубления дальнейших исследований молекулярных механизмов регуляции трансклеточного потока воды и адаптивных свойств растительных клеток. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников С.-Петербурге (С.Петербург, 2006), на годичном собрании Общества физиологов растений России и конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц, 20 рисунков; библиография содержит 184 название, в т.ч. 176 на иностранных языках.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Абдеева, Анна Рамильевна
выводы
1. Проведенные на растениях Mesembryanthemum crystallinum исследования позволили установить дифференциальную экспрессию генов аквапоринов McPIPl;l; McPIP2; 1; МсР1Р2;3; МсТ1Р1;2 и МсТ1Р2;2 в различных органах, в суточной динамике, а также в ответ на действие стрессоров различной природы, интенсивности и продолжительности их воздействия.
2. Исключением являлся ген • аквапорина плазмалеммы МсР1Р1;4, конститутивная экспрессия которого не зависела от органной локализации, времени суток и характера стрессорного воздействия.
3. Зафиксированы корреляции между изменениями основных физиологических параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов в условиях стресса. Водный дефицит, вызванный засолением и действием меди и цинка, сопровождался снижением оводненности листьев, интенсивности транспирации, ОСВ, осмотического потенциала и приводил к down-регуляции генов PIP-аквапоринов в листьях (преимущественно PIP2-изоформ).
4. Стресс-индуцируемое формирование САМ-типа фотосинтеза уже на начальных этапах вызывало снижение трансклеточного переноса воды в суккулентных органах за счет ингибирования экспрессии генов аквапоринов плазмалеммы, но в меньшей степени отражалось на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствовало слабое влияние стрессоров на экспрессию генов аквапоринов тонопласта.
5. Изменения в содержании белка PIP-аквапоринов в условиях действия ТМ1 соответствовали изменениям уровней их транскриптов. Вероятно, регуляция водного статуса при его нарушении, вызванном-воздействием солей меди и цинка, происходила на уровне транскрипции генов аквапоринов.
6. Стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к повышенным концентрациям хлорида натрия* и солей
ТМ, состоит в снижении интенсивности водообмена в листьях и стабилизации внутриклеточного водообмена в корнях. Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется или стабилизируется в условиях стресса на уровне изменения интенсивности экспрессии кодирующих их генов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
К настоящему времени зафиксированы суточные корреляции между экспрессией генов аквапоринов и регуляцией водного транспорта на клеточном и тканевом уровне (Henzler et al., 1999; Clarkson et al., 2000; Moshelion et al., 2002; Yamada et al., 1997).
Проведенные исследования показали наличие органной* специфичности, суточной динамики экспрессии некоторых изоформ аквапоринов хрустальной травки, а также корреляции между изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов при солевом стрессе.
Сравнение интенсивности экспрессии изученных генов в разных органах контрольных растений хрустальной травки показало, что значительные различия обнаружены по экспрессии гена МсР1Р2;1, существенно более высокая активность которого была характерна для корней. Аквапорин МсР1Р2;1 был назван корнеспецифичным (Fukuhara et al., 1999). Среди других изученных генов для МсР1Р1;1 и МсТ1Р1;2 было отмечено некоторое, хотя и небольшое превышение содержания мРНК в листьях в сравнении с корнями.
Было обнаружено, что экспрессия генов аквапоринов МсР1Р1;1; МсР1Р2;1; МсР1Р2;3; МсТ1Р1;2 и МсТ1Р2;2 изменялась в течение суток в листьях, в то время как в корнях подобная динамика была характерна для МсТ1Р1;2. К 15.00 интенсивность экспрессии гена аквапорина МсТ1Р1;2 почти в 2 раза снизилась и оставалась на таком уровне до вечера. Некоторое снижение уровня мРНК к 21.00 наблюдалось и для МсР1Р2;3. Напротив, в листьях обнаруженные суточные изменения количества транскриптов были направлены в сторону повышения. Так, количество мРНК МсР1Р1;1; МсР1Р2;1; МсР1Р2;3; МсТ1Р1;2 и МсТ1Р2;2 значительно увеличивалось к 15.00 по сравнению с 12.00, возрастая и к 21.00. Только для аквапорина МсР1Р2;3 к вечеру наблюдалось снижение количества транскриптов.
Дифференциальная экспрессия- генов аквапоринов наблюдалась не только в контрольных, но и в опытных вариантах. Первые 3 ч солевого стресса сопровождались достоверным снижением транспирации и содержания воды в> листьях. Это сопровождалось down-регуляцией в первую очередь генов PIP-аквапоринов, что помогало снизить межклеточный транспорт воды и, следовательно, устьичную проводимость для поддержания водного статуса растений. На организменном уровне это приводило к потере тургесцентности листьев. Следующие 6 ч воздействия хлорида натрия приводили к достоверному снижению OGB и осмотического потенциала на фоне низкой оводненности и низкой транспирации. Именно на этом этапе начинали проявляться концентрационные различия воздействия соли. Так, достоверное снижение уровня экспрессии генов МсР1Р1;1; МсТ1Р1;2 и МсТ1Р2;2 было показано только при воздействии 400 мМ NaCl. Down-регуляция генов аквапоринов, также как и в первые часы воздействия, наблюдалась у PIP-изоформ в листьях (преимущественно у PIP2). Таким образом, острый водный дефицит приводил к сокращению межклеточного водообмена в листьях, но не в корнях. Уменьшение водной проводимости плазмалеммы способствовало сохранению воды в клетке в начальный период стресса. Интересно, что солевой шок приводил к постепенному сокращению внутриклеточного водообмена в течение 7 суток в листьях за счет снижения экспрессии TIP-изоформ, что видимо способствовало снижению водоотдачи в тканях листа. Напротив, содержание транскриптов PIP2- и обеих TIP-изоформ в корнях не только не снижалось при солевом стрессе, но и в 2 раза превышало контроль на 1 сутки у TIP- и на 3 сутки воздействия- у Р1Р2-аквапоринов, стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне. Подобное повышение активности аквапоринов связано, по-видимому, с восстановлением массового поступления воды в растения, что отражается и на показателях оводненности листьев и ОСВ.
Как оказалось, интенсивность и продолжительность водного стресса влияли на соотношение корень/лист отдельных транскриптов. Водный дефицит короткой продолжительности приводил к увеличению данного соотношения. Очевидно, что при остром водном' дефиците функционирование конкретных аквапоринов важнее в корнях, чем в. листьях. Более продолжительный осмотический стресс приводил в случае умеренных концентраций NaCl (200 мМ) к восстановлению до контрольного уровня соотношения транскриптов корень/лист, а в случае высоких концентраций (400 мМ) — сохранялись повышенный значения данной пропорции. Интересно, что характерный профиль экспрессии аквапоринов в листьях не обнаруживался в корнях, что отмечается в литературе (Yamada et al., 1997; Jang et al., 2004). Эти результаты подразумевают, что вклад отдельной изоформы аквапорина'при водном стрессе отличается в корнях и в листьях, а регуляция дифференциальной экспрессии аквапоринов включает интеграцию различных сигналов.
Степень засоления также определяла дифференциальную1 экспрессию генов аквапоринов. При умеренном засолении уровень мРНК PIP1-аквапоринов в корнях и в листьях незначительно отличался от контрольного. В то время как количество транскриптов Р1Р21аквапоринов значительно повышалось в корнях на 3 сутки воздействия хлорида натрия. Однако в листьях к 3 часам засоления количество мРНК Р1Р2-изоформ падало и сохранялось на низком уровне в последующие 7 суток стресса. Напротив, количество мРНК аквапоринов тонопласта снижалось в первые часы воздействия в корнях и спустя сутки засоления восстанавливалось до уровня контроля у Т1Р2-изоформы и выше контроля - у TIP 1-изоформы. При этом в листьях интенсивность экспрессии генов TIP-аквапоринов несущественно отличалась от контроля на протяжении всего опыта.
В случае солевого шока (400 мМ NaCl) дифференциальная экспрессия генов аквапоринов выражалась в том, что уровень мРНК МсР1Р1;1 в корнях и листьях падал через 9 часов воздействия, но восстанавливался в корнях к 3-ьм суткам засоления до контрольного, а в листьях продолжал снижаться. Напротив, содержание транскриптов PIP2- и обеих TIP-изоформ в корнях не
113 только не снижалось при солевом стрессе, но и в 2 раза превышало контроль на 3 сутки воздействия у PIP2- и на 1 сутки у Т1Р-аквапоринов, стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне. При этом в листьях происходило резкое снижение количества транскриптов мРНК PIP2-изоформ, которое не превышало 30% от контроля- в последующие дни эксперимента. Солевой шок вызывал постепенное понижение в содержании мРНК TIP-изоформ, незначительное - в случае McTIPl ;2.
Существенно, что на самом раннем этапе ответа растений на солевой стресс, когда водосберегающий механизм* фотосинтеза. САМ-типа еще не сформирован, растения реагируют ингибированием интенсивности экспрессии генов аквапоринов, что направлено на понижение водопроницаемости клеточных мембран и, прежде всего, плазмалеммы, и более экономное расходование воды в.условиях жесткого водного дефицита. Характерно, что стресс-индуцируемое формирование САМ в меньшей степени отражается на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствует слабое влияние засоления-на экспрессию-генов? аквапоринов тонопласта. Полученные в настоящей работе результаты, а также доступные литературные данные позволяют высказать предположение, согласно которому стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к засолению, состоит в снижении интенсивности внутри- и межклеточного водообмена. Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит, очевидно, белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется в условиях солевого шока на уровне снижения интенсивности экспрессии кодирующих их генов.
В литературе довольно часто отмечается факт нарушения водного статуса при действии ТМ на растения, однако чаще всего исследуются ответы на их долговременное воздействие. Между тем, нарушение водного статуса растений, по-видимому, следует рассматривать как одно из ранних проявлений токсического действия ТМ. На растениях хрустальной травки такой характерный признак неблагоприятных сдвигов- как заметное подвядание листьев проявлялся на вторые-третьи сутки воздействия, даже при умеренных концентрациях сернокислых солей меди и цинка.
На: существенные структурные изменения, возникающие в клетках листьев при росте растений хрустальной травки на среде с ТМ указывает достоверное снижение относительного содержания воды, наступающее уже на 3 сутки воздействия; Значительное снижение осмотического потенциала клеточного сока, происходящее в условиях сильного снижения оводненности листьев, могло в некоторой степени способствовать нормализации водного статуса растений.
Среди ранних ответных реакций хрустальной травки особое внимание привлекает резкое снижение транспирации, наблюдаемое при внесении в корнеобитаемую среду солей ТМ, особенно меди. Столь, раннее и сильное: снижение интенсивности транспирации; несомненно, свидетельствует о том, что ее регуляция инициировалась событиями; произошедшими к этому времени на уровне корня, а не непосредственно; в листьях. Существенное поступление цинка и меди в листья удавалось обнаружить не ранее 3 суток роста на; среде с использованными концентрациями этих ТМ. С другой стороны, как показали данные настоящего исследования, значительных; изменений водного статуса листьев, которые могли бы инициировать, закрывание устьиц, в течение первых суток еще не обнаруживалось. В дальнейшем транспирация растений хрустальной травки, подвергшихся воздействию ТМ, стабилизировалась на заметно более низком уровне, чем у контрольного варианта, что может рассматриваться» как один из защитных механизмов на их, токсическое действие. С другой стороны, снижение транспирации может иметь у растений хрустальной травки особый эффект в связи с тем, что это - индуцибельное САМ-растение. Являясь эффективной водосберегающей стратегией, САМ-фотосинтез способствует поддержанию водного статуса растений в, жестких условиях, тем самым, обеспечивая возможность нормального протекания физиологических процессов.
Весьма важными представляются впервые полученные данные о влиянии ТМ на дифференциальную экспрессию генов аквапоринов. Интересно, что при этом природа ТМ оказывала большее влияние на изменение содержания мРНК аквапоринов, чем их (солей ТМ) концентрации.
Уровень экспрессии МсР1Р1;1, МсР1Р2;1 и МсР1Р2;3 в корнях и листьях растений сильно снижался через 1 сутки воздействия ТМ, и этот пониженный уровень содержания мРНК сохранялся или даже еще более снижался вплоть до полного прекращения экспрессии, как это было обнаружено в отношении гена МсР1Р2;1 в листьях после 7 суток роста растений хрустальной травки на среде с ТМ. При этом, соли цинка не вызывали достоверного снижения через сутки эксперимента количества транскриптов McPIP2; 1 в корнях и всех изоформ PIP-аквапоринов в листьях. Однако, в последующие дни эксперимента различия в воздействии меди и цинка исчезали — через 7 суток происходило существенное снижение количества мРНК всех PIP-изоформ под действием ТМ. Down-регуляция генов аквапоринов в данном случае коррелировала со снижением транспирации,, показателей OGB и оводненности. Однако на 3 сутки воздействия происходила ир-регуляция генов Р1Р2-аквапоринов, особенно в случае воздействия меди. В литературе по этому поводу существуют данные, которые подтверждают ир-регуляцию экспрессии генов аквапоринов в ответ на очень сильное стрессовое воздействие (Galmes et al., 2007; Yamada et al., 1997). Видимо в таких жестких условиях, когда устьичная проводимость низкая,, вода поступает слабо, повышение экспрессии аквапоринов способствует увеличению водной проницаемости плазмалеммы, что может помочь стабилизации водного статуса растения.
Несколько другой профиль экспрессии наблюдался" в отношении аквапоринов тонопласта. Сутки воздействия ТМ не вызывали достоверных изменений экспрессии гена МсТ1Р1;2, но значительно снижали количество транскриптов МсТ1Р2;2 в корнях и листьях растений хрустальной травки. Существенно, что в процессе адаптации на фоне пониженного
116 межклеточного водообмена происходило урегулирование внутриклеточного движения воды в корнях, о чем свидетельствует стабилизация количества мРНК МсТ1Р1;2 и МсТ1Р2;2 на уровне контроля через 7 суток воздействия. Если в корнях через 7 суток эксперимента количество мРНК обеих изоформ находилось на контрольном уровне, то в листьях напротив, происходило снижение количества транскриптов МсТ1Р1;2 иМсТ1Р2;2.
Таким образом, первые существенные изменения уровня транскриптов. как в корнях, так и в листьях были зафиксированы только через сутки воздействия. Несмотря' на то, что при стресс-реакции (в первые 24ч воздействия) разные гены аквапоринов реагировали неодинаково, адаптация приводила к сглаживанию различий и формированию единой стратегии выживания, которая заключалась в снижении межклеточного воообмена (т.е. водоотдачи) и «консервированию» воды внутри клетки в корнях и листьях растений при стабилизации внутриклеточный водообмена в корнях.
Согласно полученным данным, количество белка Р1Р-аквапоринов хрустальной травки в корнях после 3 суток воздействия ТМ увеличилось, то есть наблюдалась положительная корреляция между накоплением транскриптов и белка PIP-аквапоринов. При этом, 7 суток воздействия ТМ привели к снижению количества белка PIP-изоформ как в листьях, так и в корнях. Причем в листьях наблюдалось более значительное снижение количества аквапоринов на фоне более низкого, чем в корнях контрольного уровня аквапоринов. Эти результаты также не противоречили данным по содержанию мРНК PIP-аквапоринов, согласно которым ТМ вызывали снижение количества мРНК всех исследованных PIP-изоформ (за исключением МсР1Р1;4), причем в листьях такое снижение было более драматичным и, в случае МсР1Р2;1 приводило к полному ингибированию экспрессии гена этого аквапорина.
На этом фоне обращает на себя особое внимание факт резкого снижения экспрессии гена аквапорина тонопласта МсТ1Р2;2, зарегистрированный в клетках листьев уже через 3 часа действия ZnSC>4 и особенно сильно -CUSO4. Такой большой размер ингибирования - снижение в 4-5 раз в сравнении с контролем — свидетельствует в пользу представления о том, что произошло оно в основной массе клеток листа. Ингибирование экспрессии одного из генов аквапоринов может быть первым шагом на пути торможения водоотдачи листьями при воздействии на растения ТМ, что могло бы в какой-то степени компенсировать вызываемые ими нарушения водообмена. Видимо, торможение водопоглотительной функции корневой системы в условиях подавления транспирации стало причиной ранней реорганизации сложной системы аквапоринов, модификация и адаптация которой особенно важна для условий низкой транспирации, когда апопластное тканевое движение воды сменяется по преимуществу симпластным.
Остается открытым вопрос о том, каков путь столь быстрой передачи информации из корневой системы в листья.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абдеева, Анна Рамильевна, Москва
1. Барабой В.А. Петрина Л'.Г. (2003) Металлотионеины: структура и механизмы действия. Укр. биохим. журн. Т.75. С.28-36.
2. Божко К.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Изменение содержания аквапоринов в клеточных мембранах Mesembryanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ// Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 887-895.
3. Евсеева Т., Юранева И., Храмова* Е. (2003) Механизмы поступления, распределения и детоксикации тяжелых металлов у растений. http://ib.komisc.rU/t/ru/ir/vt/03-69/01 .html
4. Строгонов Б. П. (1973) Метаболизм растений в условиях засоления. М.: Наука. 51с.
5. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл.В. // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 848-858.
6. Холодова В.П., Мещеряков А.Б., Ракитин В.Ю., Карягин В.В., Кузнецов Вл.В: // Доклады академии наук. 2006. Т. 407. С. 282-285.
7. Холодова В.П:, Нетто Д.С., Мещеряков А.Б., Борисова Н.Н., Александрова С.Н., Кузнецов Вл.В. // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 376-384.
8. Шевякова Н. И, Ракитин В. Ю., Музычко JI. М., Кузнецов Вл. В. (1998) Стресс-индуцируемая аккумуляция пролина в связи с солеустойчивостью интакных растений и изолированных клеток. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 34. С. 320-325.
9. Adams P.,NelsonD., Yamada et al. //New Phytologist. (1998) V. 138. P.171-190.
10. Ahmad I., LarharF., Srewart G.R. (1979) Sorbitol: a compatible osmotic solute in Plantago maritime. New Physiol. V. 82. P. 671-678.
11. Alexandersson E., Fraysse L., Sjovall-Larsen S., Gustavsson' S., Fellert M., Karlsson M., Johansson U., Kjellbom P: (2005) Whole gene family expression and drought stress regulation of aquaporins. Plant Mol. Biol. V. 59 (3). P. 469-484.
12. Arazi Т., Sunkar R., Kaplan В., Fromm H. (1999) A tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni2+ tolerance and* Pb2+ hypersensitivity in transgenic plants. The Plant Journal. V. 20. P. 171-182.
13. Aroca R., Ferrante A., Vernieri P., Chrispeels M.J. (2006) Drought, abscisic acid and transpiration rate effects on- the regulation of PIP aquaporin gene expression and abundance in Phaseolus vulgaris plants. Ann. Bot. (Lond). V. 98 (6). P. 1301-1310.
14. Barkla B.J., Vera-Estrella R., Pantoja O., Kirch H.-H., Bohnert H.J. (1999) Aquaporin localization how valid are the TIP and PIP labels? Trends, in plant science. V. 4(3). P. 86-88.
15. Biela A., Grote K., Otto В., Hoth S., Hedrich R., Kaldenhoff R. (1999) The Nicotiana tabacum plasma membrane Aquaporin NtAQPl is mercury-insensitive and permeable for glycerol. The Plant Journal. V. 18. P. 565-570.
16. Bienert G.P., Moller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., Moller I.M., Schjoerring J.K., Jahn T.P. (2007) Specific Aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J. Biol. Chem. V. 282 (2). P. 1183-1192.
17. Bohert H: J., Nelson D. E., Jensen R. G. (1995) Adaptation to enviromental stresses. Plant Cell. V. 7. P. 1099-1111.
18. Borgnia M., Nielsen S., Engel A.,,Agre P. (1999) Cellular, and molecular biology of the aquaporin water channels. Annu Rev Biochem. V 68. P." 425-458.
19. Boursiac Y., Chen S., Luu D.T., Sorieul M., van den Dries N., Maurel C. (2005) Early Effects of Salinity on water Transport in Arabidopsis Roots. Molecular and Cellular Features of Aquaporin Expression. Plant Physiol. V. 139. P. 790805.
20. Bradford M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantification5 of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye-Binding. Anal. Biochem. V. 72. P. 248-254.
21. Bringezu K., Lichtenberger O., Leopold I., Neumann D. (1999) Heavy metal tolerance of Silene vulgaris. Journal of Plant Physiology. V. 154. P. 536-546.
22. Brune A., Urbach W., Dietz K-J. (1994) Compartmentation and transport of zinc in barley primary leaves as basic mechanisms involved in zinc tolerance. Plant Cell and Environment. V. 17. P: 153-162.ч
23. Chaumont F., Barrieu F., Herrman E.M., Chrispeels M.J. (1998) Characterization of a maize tonoplast Aquaporin expressed in zones of cell' division and elongation. Plant Physiol. V. 122. P. 1025-1034.
24. Chaumont F., Barrieu F., Wojcik E., Chrispeels M.J., Jung R. (2001) Aquaporins Constitute a Large and Highly Divergent Protein Family in Maize. Plant Physiol. V. 125. P. 1206-1215.
25. Chaumont F., Barrieu-F., Wojcik E., Jung R., Chrispeels M.J. (2000) < Plasma Membrane Intrinsic Proteins from Maize Cluster in Two Sequence Subgroups with-Differential Aquaporin Activity. Plant Physiol; V. 122.P. 1025-1034.
26. Cheng A., van Hoek A.N., Yeager M., Verkman A.S., Mitra A.K. (1997) Three-dimensional organization of a human, water channel. V. 387. P. 627-630.
27. Clarkson D.T., Carvajal M., Henzler Т., Waterhouse R. N., Smyth A.J. Cooke D.T., Steudle E. (2000) Root hydraulic conductance: diurnal aquaporinexpression and the effects of nutrient stress. J. Exp. Bot. V. 51 (342). P. 6170.
28. Clemens S. (2001) Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta. V. 212. P. 475-486.
29. Clemens S. (2006) Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie. V. 88. P. 1707-1719.
30. Colpaert J., van Assche J. (1992) Zinc toxicity in ectomycorrhizal Pinus sylvestris. Plant and Soil. V.143. P. 201-211.
31. Cushman J. C. and Bohnert H. J. (1997) Molecular genetics of Crassulacean Acid
32. De Vos C.H.R., Schat H., De Waal M.A.M., Vooijs R., Ernst W.H.O. (2000) Increased resistance to copper-induced damage of the root cell plasmalemma in copper tolerant Silene cucubalus. Physiologia Plantarum. V. 82. P. 523— 528.
33. Eckert M., Biela A., Siefritz F., Kaldenhoff R. (1999) New aspects of plant aquaporin regulation> and specificity. J. of Experimental Botany. V. 50. P. 1541-1545.
34. Edwards G., Walker D.! // СЗ, C4: Mechanisms, and Cellular and Environmental Regulation of Photosynthesis. University of California Press, Berkeley. 1983.
35. Fotiadis D., Jeno P., Mini Т., Wirtz S., Mtiller S.A., Fraysse L., Kjellbom P., Engel A. (2000) Structural Characterization of Two Aquaporins Isolated from Native Spinach Leaf Plasma Membranes. The Journal of Biological Chemistry. V. 276. P. 1707-1714.
36. Fray R.G., Wallace A., Grierson D., Lycett G.W. (1994) Nucleotide sequence and expression of a ripening and water stress-related cDNA from tomato with' homology to the MIP class of membrane channel proteins. Plant Mol. Biol. V. 24. P. 539-543.
37. Fricke W., Peters W.S. (2002) The biophysics of leaf growth in salt-stressed barley. A study at the cell level. Plant Physiol. V. 129. P. 374-388.
38. Fujiyoshi Y., Mitsuoka K., de Groot В., Philippsen A., Grubmiiller H., Agre P., Engel A. (2002) Structure and function of water channels. Current Opinion in Structural Biology. V. 12. P. 509-515.
39. Fukuhara Т., Kirch H.H., Bohnert H.J. (1999) Expression of Vpl and water channel proteins during seed germination. Plant, Cell and Environment. V. 22. P. 417-424.
40. Gao Y.P., Young L., Bonham-Smith P., Gusta L.V. (1999) Characterization, and Expression of Plasma and Tonoplast Membrane Aquaporins in Primed Seed of Brassica napus During Germination under Stress Conditions. Plant Mol. Biol. V. 40. P. 635-644.
41. Garcia-Hernandes M., Murphy A., Taiz L. (1998) Metallothioneins 1 and 2 have distinct but overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiol. V. 118. P: 387-397.
42. Galmes J., Pou A., Alsina M.M., Tomas M., Medrano H., Flexas J. (2007) Aquaporin expression in response to different water stress intensities and recovery in Richter-110 (Vitis sp.): relationship with ecophysiological status. Planta. V. 226. P. 671-681.
43. Gerbeau P., Amodeo G., Henzler Т., Santoni V., Ripoche P., Maurel C. (2002) The water permeability of Arabidopsis plasma membrane is regulated by divalent cations and pH. Plant J. V. 30. P. 71-81.
44. Giritch A., Ganal M., Stephan U.W., Baumlein H. (1998) Structure, expression and' chromosomal localization of the metallothionein-like gene family of tomato. Plant Molecular Biology. V. 37. P. 701-714.
45. Haberlandt G. (1884) Physiologische Pflanzenanatomie, 1st edn. Leipzig: Engelmann Verlag.
46. Hakman I., Oliviusson P. (2002) High expression of putative aquaporin-genes in cells with transporting and nutritive functions during seed development in Norway spruce (Picea abies). Journal of Experimental Botany. V. 53. P. 639649.
47. Hall J., Williams E. (2003) Transition metal transporters in plants. J. Exp. Botany, V. 54 (393). P. 2601-2613
48. Hall J.L. (2002) Cellular Mechanisms for Heavy Metal Detoxification and Tolerance. J. Exp. Botany. V. 53. P. 1—11.
49. Hartley J., Cairney J.W.G., Meharg A.A. (1997) Do ectomycorrhizal fungi exhibit adaptive tolerance to potentially toxic metals in the environment? Plant and Soil. V. 189. P. 303-319.
50. Harvengt P., Vlerick A., Fuks В., Wattiez R., Ruysschaert J.-M., Hombler F. (2000) Lentil seed aquaporins form a hetero-oligomer which is-phosphorylated by a Mg2+-dependent and Ca2+-regulated kinase. Biochem. J.V. 352. P: 183-190.
51. Hazama A., Kozono D., Guggino W.B., Agre P., Yasui M. (2002) Ion Permeation of AQP6 Water Channel Protein. The Journal of Biological Chemistry. V. 277 (32). P. 29224-20230.
52. Henzler Т., Ye Q.,. Steudle E. (2004) Oxidative gating of water channels (aquaporins) in Chara by hydroxyl radicals. Plant, Cell" and Environment. V. 27. P. 1184-1195.
53. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett G.S. (1995) Gadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatiri deficient. Plant Physiology. V. 107. P. 1059-1066.
54. Jang J.Y., Kim D.G., Kim Y.O., Kang H. (2004) An expression analysis of a gene family encoding plasma membrane Aquaporins in response to abiotic stresses in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. V. 54. P. 713-725.
55. Jang J.Y., Lee S.II., Rhee J.Y., Chung G.C., Ahn S.J., Kang I I. (2007) Transgenic Arabidopsis and tobacco plants overexpressing an aquaporin respond differently to various abiotic stresses. Plant Moll Biol. V. 64 (6). P. 621-632.
56. Jauh G.Y., Fischer A.M., Grimes H.D., Ryan C.A., Rogers J.C. (1998) 5-Tonoplast intrinsic protein defines unique plant vacuole functions. Proc. Natl. Acad. Sci USA. V. 95. P. 12995-12999.
57. Jauh G.Y., Phillips Т.Е., Rogers J.C. (1999) Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions. Plant Cell. V. 11(10). P. 1867-1882.
58. Jensen M. O., Tajkhorshid E., Schulten K. Electrostatic tuning of permeation and selectivity in aquaporin water channels. (2003) Biophys. J. V. 85. P. 28842899.
59. Jensen R.G., Adams P. et all. (1994) Water Availability and Osmotic Adjustment in the Ice Plant. Supplement to Plant Physiol. V.105. (1). P. 21.
60. Johansson I., Karlsson M., Johansson U., Larsson C., Kjellbom P. (2000) The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance. Biochimica et Biophysica Acta. V. 1465. P. 324-342.
61. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M., Larsson C., Kjellbom P. (1998) Water transport activity of the plasma membrane Aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell.' V. 10. P. 451-459.
62. Jung J.S., Preston G.M., Smith B.L., Guggino W.B., Agre P. (1994) Molecular structure of water channel through Aquaporin CHIP. J. Biol. Chem. V. 269. P. 14648-14654.
63. KaldenhofF R., Fischer M. (2006) Aquaporins in plants. Acta Physiol. V. 187. P. 169-176.
64. Kaldenhoff R., Grote K., Zhu J.-J., Zimmermann U. (1998) Plant J. V. 14. P. 121128.i
65. Kaldenhoff R., Rolling A., Richter G. A novel blue light- and' abscisic acid-inducible gene of Arabidopsis thaliana encoding an intrinsic membrane protein. (1993) Plant Mol. Biol. V. 23. P. 1187-1198.
66. Kaldenhoff R., Rolling A., Richter G. Regulation of the Arabidopsis thaliana Aquaporin gene AthH2 (PIPlb). (1996) J'. photochem;Photobiol. V. 36. P. 351-354.
67. Katsuhara M. (2007) Molecular mechanisms of water uptake and transport in plant roots: research progress with water channel aquaporins. Plant Root. V. 1. P. 22-26.
68. Kramer U., Cotter-Howells J.D., Charnock J.M., Baker A.J.M., Smith A.C. (1996) Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel. Nature. V. 379. P. 635-38.
69. Ma J.F., Tamai K., Yamaji N., Mitani N., Konishi S., Katsuhara M., Ishiguro M., Murata Y., Yano M. (2006) A silicon transporter in rice. Nature. V. 440. P. 688-691.
70. Ma S., Quist T.M., Ulanov A., Joly R., Bohnert HJ. (2004) Loss of. TIP 1;1 Aquaporin in Arabidopsis Leads to Cell and Plant Death. Plant J. Y. 40. P. 845-859.
71. Maeshima M., Mimura Т., Sato T. (1994) Distribution of vacuolar H4"-pyrophosphatase and the membrane integral protein in a variety of green plants. Plant Cell Physiol. V. 35. P. 323-328.
72. Mahalingam R., Federoff N. (2003) Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species. Physiologia Plantarum. V. 119. P. 5668.
73. Martinez-Ballesta M.C., Aparicio F., Pallas V., Martinez V., Carvajal M. (2003) Influence of saline stress on root hydraulic conductance1 and PIP expression-in Arabidopsis. J. Plant Physiol. V. 160. P. 689-697.
74. Martinez-Ballesta M.C., Martinez V., Carvajal M. (2000) Regulation of water channel activity in whole roots and in protoplasts from roots of melon plants grown under saline conditions. Aust. J. Plant Physiol.V. 27. P. 685-691.
75. Matre P., Morillon R:, Barrieu F., North G.B., Nobel P.S., Ghrispeels M. J. (2002) Plasma membrane aquaporins play a significant- role during recovery from water deficit. Plant Physiol. V. 130(4). P. 2101-2110.
76. Maurel C., Chrispeels M.J. (2001)'Aquaporins. A Molecular. Entry into Plant Water Relations. Plant Physiol. V. 125: P. 135-138.
77. Maurel C., Kado R. Т., Guern J., Chrispeels M. J. (1995) Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporin alpha-TIP. EMBOJ. V. 14. P. 3028-3035.
78. Maurel C., Tacnet F., GU9IU J., Guern J., Ripoche P. (1997) Purified vesicles of tobacco cell vacuolar and plasma membranes exhibit dramatically; different water permeability and water channel activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 94. P. 7103-7108.
79. Meharg A.A. (1993) The role of the plasmalemma in metal tolerance in angiosperms. Physiologia Plantarum. V. 88. P. 191-198.
80. Meharg A.A. (1994) Integrated tolerance mechanisms: constitutive and adaptive plant responses to elevated metal concentrations in the environment. Plant, Cell and Environment. V. 17. P. 989-993.
81. Meharg A.A., Macnair M.R (1990) An altered phosphate uptake system in arsenate-tolerant Holcus lanatus. New Phytologist. V. 116.- P. 29-35.
82. Meyer G., Schmitt J.M., Bohnert H.J. (1990) Direct screening of a small genome: estimation of the magnitude of plant gene expression during adaptation to high salt. Mol: Gen. Genet. V. 224. P. 347-356.
83. Mizutani M., Watanabe S., Nakagawa Т., Maeshima M. (2006) Aquaporin NIP2;1 is mainly localized to the ER membrane and shows root-specific accumulation in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell'Physiology.
84. Moshelion M., Becker D., Biela A., Uehlein N., Hedrich R., Otto В., Levi H., Moran N., Kaldenhoff R. (2002) Plasma membrane Aquaporins in the motor cells of Samanea saman: diurnal and circadian,regulation. Plant Cell. V. 14. P. 2301-2317.
85. Murphy A., Taiz L. (1995) Comparison of Metallothionein Gene Expression and Nonprotein-Thiols in Ten Arabidopsis Ecotypes. Plant Physiol. V. 109. P. 945-954.
86. Murphy A., Zhou J., Goldsbrough В., Taiz L. (1997) Purification and imunological identification of Metallothioneins 1 and 2 from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. V. 113. P. 1293-1301.
87. Nemeth-Cahalan K. L., Hall J.E. (2000) pH and calcium regulate the water permeability of aquaporin 0. J. Biol. Chem: V. 275: P. 6777-6782.
88. Nemeth-Cahalan K. L., Kalman K., Hall J.E. (2004) Molecular basis of pH and1. Л I
89. Ca regulation of Aquaporin water Permeability. J. Gen. Physiol. V. 123. P. 573-580.
90. Niemietz C.M., Tyerman S.D. (1997) Characterization of water channels in wheat root membrane vesicles. Plant Physiol. V. 115. P. 561-567.
91. Palmier R.D. (1994) Regulation of metallothionein genes by heavy metals appears to be mediated by a zinc-sensitive inhibitor that interact with a constitutively active transcription factor, MTF-1. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 12191223.
92. Paul . M.J., Cockburn W. (1989) Pinnitol, a compatible solute in Mesembryanthemum crystallinum L. J. Exp. Bot. V. 40. P. 1093-1098.
93. Persans M.W., Yan X., Patnoe J-M.M.L., Kramer U., Salt D.E. (1999) Molecular dissection of the role of histidine in nickel hyperaccumulation in Thlaspi goesihgense (Halacsy). Plant Physiology. V. 121. P ■ 1117-1126.
94. Phillips A.L., I-Iuttly A.K. (1994) Cloning of two gibberellin-regulated cDNAs from Arabidopsis thaliana by subtractive. hybridization: expression of- the tonoplast water channel, y-TIP, is increased by GA3. Plant Mol. Biol. V. 24; P. 603-615.
95. Poolman В., Spitzer J. J., Wood J.M. (2004) Bacterial osmosensing: roles of membrsne structure and electrostatics in lipid-protein and protein-protein interactions. Biochemica and Biophysica Acta. V. 1666. P. 88-104.
96. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B., Agre P. (1993) The mercurysensitive residue at cysteine 189 in the CH1P28 water channel. J. Biol. Chem. V. 268. P. 17-20.
97. Rauser W.E. (1995) Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis and function. Plant Physiology. V.109. P. 1141-1149.
98. Rauser W.E. (1999) Structure and fimction^^of metal chelators produced by plants -the case for organic acids, amino acids, phytin and metallothioneins. Cell: Biochemistry and Biophysics. V. 31. P. 19—48
99. Ruggiero C., Angelino G., Maggio A. (2006) Developmental regulation^of water uptake in wheat. J. Plant Physiol.
100. Sairam R.K., Tyagi A. (2004) Physiology and molecular biology of salinity stress; tolerance in plants. Current Sci. V. 86 (3). P. 407-421.
101. Sakr. (2003) Plant Physiol.V. 133. P. 630-641.
102. Salt D.E., Kramer U. (2000) Mechanisms of metal hyperaccumulation in plants. In: . Raskin I, Ensley В (eds) Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, P. 231-246.
103. Salt D.E., Rauser W.E. (1995) MgATP-dependent transport of phytochelatins across the tonoplast of oat roots. Plant Physiology. V. 107. P. 1293-1301.
104. Santoni V., Verdoucq L., Sommerer N., Vinh J., Pflieger D., Maurel G. (2006) Methylation of Aquaporins in plant plasma membrane. Biochem. J. V. 400. P. 189-197.
105. Schat H., Llugany M., Vooijs R., Hartley-Whitaker J., Bleeker P. (2002) The role of phytochelatins in constitutive and adaptive heavy metal tolerance in hyperaccumulator and non-hyperaccumulator metallophytes. Journal of
106. Experimental Botany. V. 53. P. 2381-2392.i
107. Schuurmans J.A., van Dongen J.T., Rutjens B.P., Booman A., Pieterse C.M., Bortslap A.C. (2003) Members of Aquaporin Family in The Developing Pea Seed Goat Include Representatives of the PIP, TIP, and NIP Subfamilies. Plant Mol. Biol. V. 53. P. 633-645.
108. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (1997) Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiol. V. 115. P: 327-334.
109. Shiratake K., Goto H., Maeshima M., Yamaki S. (2001) Fluctuations of the protein levels of H^-pumps and water channels of tonoplast and plasma membrane during grape berry development. J Japan Soc Hort Sci. V. 70. P. 287-293.
110. Shiratake K., Martinoia E. (2007) Transporters in fruit vacuoles. Plant Biotechnology. V. 24. P. 127-133.
111. Steffens J.C. (1990) The heavy metal-binding peptides of plants. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. V.41.P. 553-575.
112. Steudle E., Murrmann M., Peterson* C.A. (1993) Transport of water and solutes across maize roots modified by puncturing the endodermis. Further evidence for the composite transport model of root. Plant Physiol. V. 103. P. 335-349.
113. Su J., Chen P.L., Wu R. (1999) Transgene expression of mannitol-l-phosphste dehydrogenase enhanced the salt stress tolerance of the transgenic rice seedlings. Sci Agric. Sin. V. 32. P. 101-103.
114. Suga S., Imagawa S., Maeshima M. (2001) Specificity of the accumulation of mRNAs and,proteins of the plasma membrane and* tonoplast aquaporins in radish organs. Planta. V. 212. P. 294-304.
115. Szarek S.R., Ting I.P. // Photosynthetica. 1977. V. 11. P. 330-342.
116. Takano J., Wada M., Ludewig U., Schaaf G., von Wiren N.,Fujiwara T. (2006) The Arabidopsis major intrinsic protein NIP5;1 is essential for efficient boron uptake and plant development under boron limitation. Plant Cell. V. 18. P. 1498-1509.
117. Thomas J.C., Sepahi M., Arendali В., Bohnert H.J. (1996) Enhancement of seed germination in high salinity by engeneering mannitol expression > ,in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Environ. V. 18. P. 801-806.
118. Tornroth-Horsefield S., Wang Y., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorshid E., Neutze R., Kjellbom P. (2006) Structural mechanism of plant Aquaporin gating. Nature. V. 439. P. 688-694:
119. Tournaire-Roux C., Sutka M., Javot H. (2003) Cytosolic pH regulates root water transport during anoxic stress through gating of aquaporins. Nature. V. 439." P. 393-397.
120. Tyerman S.D., Bohnert H.J., Maurel C., Steudle E., Smith J.A.C. (1999) Plant aquaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J', of Experimental Botany. V. 50. P. 1055-1071.
121. Tyerman S.D:, Niemietz C.M., Bramley H. (2002) Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ: V. 25. P. 173-194.
122. Uehlein N., Kaldenhoff R. (2007) Aquaporins and Plant Leaf Movements. Ann Bot. (Lond).
123. Uehlein N., Lovisolo C., Siefrits F., Kaldenhoff R. (2003) The tobacco aquaporin
124. NtAQPl is a membrane C02 pore with physiological functions. Nature. V.425. P. 734-737.
125. Veenhoff L.M., Heuberger E.H., Poolman B'. (2002) Quaternary structure andfunction of transport proteins. Trends Biochem Sci. V. 27. P. 242-249. Vera-Estrella R., Barcla B.J., Bohnert H.J., Pantoja O. (2004) Novel Regulation of
126. Verkman A. S. (2005) More than just water channels: unexpected cellular roles of Aquaporins. Journal of Cell Science. V. 118. P. 3225-3232.
127. Verkman A.S., Mitra A.K. (2000) Structure and function of aqauporin water channels. Am J.Physiol. Renal- Physioh V. 278: P. F13-F28.
128. Wallace I.S., Roberts D.M. (2004) Homology modeling of representative subfamilies of Arabidopsis major intrinsic proteins. Classification based on the aromatic/arginine selectivity filter. Plant Physiol. V. 135. P. 1059-1068.
129. Walz Т., Hirai Т., Murata K., Heymann J.B., Mitsuoka K., Fujiyoshi Y., Smith B.L., Agre P., Engel A. (1997) The three-dimensional structure of Aquaporin-1. Nature. V. 387. P. 624-627.
130. Wang N. Proton blockage mechanism of Aquaporins.
131. Wayene R., Tazawa M. (1990) Nature of the water channels in the internodal cells of Nitellopsis. Journal of Membrane Biology. V. 116. P. 31-39.
132. Werner M., Uehlein N., Proksch P., Kaldenhoff R. (2001) Characterization of two tomato aquaporins and expression during the incompatible interaction of tomato with the plant parasite Cuscuta reflexa. Planta. V. 213. P. 550-555.
133. Wiggins P. M. (1990) Role of water in some biological processes. Microbiol. Rev. V. 54. P. 432-449.
134. Wu A.H., Zhang S.Q., Deng X.P., Shan L., Liu X.F. (2006) Expression of ZmPIPl subgroup genes in maize roots under water shortage. Zhi Wu Sheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao. V. 32 (5). P. 557-562.
135. Xiang C., Oliver D.J. (1998) Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis. The Plant Cell. V. 10. P. 1539-1550.
136. Xie J., Wehner T.C., Wolenberg K., Purugganan M: D., Conkling M.A.(2003) Intron and Polypeptide Evolution of Conserved NPA to NPA Motif Regions in Plant Aquaporins. J. Amer. Soc. Hort. Sci. V. 128 (4). P. 591-597.
137. Yamada S., Katsuhara M., Kelly W.B., Michalowski C.B., Bohnert H.J. (1995) A Family of Transcripts Encoding Water Channel Proteins: Tissue-Specific Expression in the Common Ice Plant. Plant Cell. V. 7. P. 1129-1142.
138. Yamada S., Komori Т., Myers P.N., Kuwata S., Kubo Т., Imaseki H. (1997) Expression of plasma membrane water channel genes under water stress in Nicotiana excelsior. Plant Cell Phusiol. V. 38. P. 1226-1231.
139. Yasiu M., Hazama A., Kwon Т.Н., Nielsen S., Guggino W.B., Agre P. (1999) Rapid gating and anion permeability of an intracellular Aquaporin. Nature. V. 402(6758). P. 184-187.
140. Ye Q., Steudle E. (2006) Oxidative gating of water channels (aquaporins) in corn roots. Plant cell Environ. V. 29 (4). P. 459-470.
141. Zelenina M., Bondar A.A., Zelenin S., Aperia A. (2003) Nickel and Extracellular Acidification Inhibit the Water Permeability of Human Aquaporin-3 Lung Epithelial Cells. The Journal of Biological Chemistry. V. 278 (32). P. 3003730043.
142. Zelenina M., Tritto S., Bondar A.A., Zelenin S., Aperia A. (2004) Copper Inhibits the Water and Glycerol Permeability of Aquaporin-3. The Journal of Biological Chemistry. V. 279 (50). P. 51939-51943.
143. Zenk M.H. (1996) Heavy metal detoxification in higher plants—a review. Gene. V. 179. P. 21-30.
144. Zhu B.C., Su J., Chang M.C., Verma D.P.S., Fan Y.L., Wu R. (1998) Over expression of a delta-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water and salt stress in transgenic rice. Plant Sci. V. 139. P. 4148.
145. Zhu C., Schraut D., Hartung W., Schaffner A.R. (2005) Differential responses of maize MIP genes to salt stress ad ABA. J. Exp. Bot. V. 56. P. 2971-2981.
-
Абдеева, Анна Рамильевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.12
- Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L.
- Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток
- Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки
- Агроэкологическая солеустойчивость огурцов и томатов и реакция их изолированных структур на засоление
- Участие аквапоринового гомолога aqpZ в реакции цианобактерии Synechocystis на гиперосмотический стресс
