Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток"

На правах рукописи

Божко Кира Николаевна

Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток

03.00.12. - Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Лаборатории мембран растительных клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Трофимова Марина Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

Новикова Галина Викторовна

Бабаков Алексей Владимирович

Ведущее учреждение:

Кафедра физиологии растений Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «26» апреля 2005 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. КА Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., 35. Факс: 07(095)9778081

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений имени К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « » марта 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Открытие аквапоринов у представителей всех царств живой природы стало источником новой информации о механизмах проницаемости клеточных мембран для воды (Verkman and Mirta 2000). Чрезвычайно высокое разнообразие и многочисленность аквапоринов у отдельных видов растений поставило вопрос об их функциональной роли (Maurel 1997; Hill et al. 2004). Имеющиеся в настоящее время данные показывают, что выяснение особенностей функционирования и способов регуляции активности аквапоринов весьма перспективно для понимания механизмов, определяющих динамику транспорта воды в растениях при нормальных и стрессовых условиях окружения. Вместе с тем, несмотря на интенсивно ведущиеся в настоящее время работы по выявлению аквапоринов в растениях, мало известно о функциональной активности этих белков в их нативном окружении в биологических мембранах и способах ее регуляции. Основные доказательства в пользу постулируемой функции аквапоринов как водных каналов получены с использованием модельной системы, представленной ооцитами Xenopus. Применение такого подхода далеко не всегда позволяет выявить активность исследуемых белков, причем в особенности это касается аквапоринов плазмалеммы (Chaumont et al. 2000; Fetter et al. 2004).

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании участия аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран растений. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить препараты микросомальных, плазматических и вакуолярных мембран из растений с различной эффективностью использования воды.

2. Оценить величину осмотической водной проницаемости этих мембран.

3. Определить содержание аквапоринов PIP-типа в мембранных препаратах с различной водной проницаемостью.

Научная новизна. Исследована осмотическая водная проницаемость клеточных мембран, изолированных из тканей этиолированных проростков кукурузы и растений Mesembryanthemum crystallinum на стадиях онтогенеза с различной способностью к индукции САМ. Проведена оценка обогащенности исследованных мембран изоформами аквапоринов PIP-группы. Впервые проведено сопоставление

водной проницаемости плазмалеммы из различных тканей этиолированных проростков кукурузы с их обогащенностью аквапоринами, что позволило установить существование положительной корреляции между этими величинами. Это свидетельствует о том, что функциональная активность аквапоринов является важнейшим фактором, определяющим осмотическую водную проницаемость мембран. Впервые усыновлено, что снижение водной проницаемости плазмалеммы листьев М. crystallinum при переходе на САМ, индуцированном процессом онтогенеза или засолением, происходит за счет уменьшения содержания в ней некоторых изоформ аквапоринов. Снижение водной проницаемости тех же мембран из корней под влиянием тех же факторов не сопровождалось заметным изменением количества аквапоринов PIP-группы. Вместе с тем, выявлен достаточно заметный уровень содержания этих белков во фракциях внутриклеточных мембран. Это подтверждает возможность регулирования степени обогащенности мембран аквапоринами за счет функционирования системы везикулярного транспорта. На основе полученных данных сделан вывод об участии аквапоринов в перераспределении интенсивностей водных потоков в растении при переходе на САМ посредством регуляции осмотической водной проницаемости мембран.

Теоретическая и практическая значимость работы. Сопоставление кинетических параметров трансмембранного переноса воды и относительного содержания аквапоринов в мембранных препаратах позволило получить новую информацию об активности аквапоринов и их роли в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток в оптимальных и стрессовых условиях. Полученные результаты могут быть использованы для развития исследований молекулярных механизмов эндогенной регуляции трансмембранного потока воды и адаптивных свойств растительных клеток, а также при поиске средств водообеспечения у растений. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов.

Апробация работы. Основные результаты были представлены на международном симпозиуме "Plant under Environmental Stress" (Москва, 2001), на I-ой молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2001), на 5-ом съезде Общества физиологов

растений России (Пенза, 2003), на международной конференции «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2004), на XVII- ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005) и других научных мероприятиях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, включает таблицу, 25 рисунков; библиография содержит 183 источника.

Объекты и методы исследования

В исследованиях использовали 7-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта Нард 150 и растения хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum L.). Кукурузу выращивали в темноте в полукондиционируемой камере при 25°С. Для экспериментов использовали корни, мезокотили и колеоптили.

М. crystallinum выращивали на питательной среде Джонсона, модифицированной по Winter (1973) в камере фитотрона при температуре 23-25°С и относительной влажности воздуха ~55% в дневное время суток. Ночью температуру и влажность воздуха поддерживали на уровне 15-17°С и ~70%, соответственно. В экспериментах были использованы растения М. crystallinum трех возрастов: 4-5-недельные с С3-типом фотосинтеза; 6-7-недельные и 8-9-недельные с САМ-метаболизмом. Часть 4-5-недельных растений подвергали в течение 3 ч. или 2 недель солевому стрессу путем внесения 400 мМ NaCl в питательный раствор.

Об индукции и развитии САМ судили по изменению характерной суточной динамики титруемой кислотности клеточного сока. Для ее определения из первичных листьев брали высечки диаметром 1 см утром, перед началом дневного освещения, и через 12 ч, в конце светового периода. Вытяжку клеточного сока получали экстракцией из высечек листьев 20%-ным водным раствором метанола при 100°С в течение 20 мин. Вытяжку титровали ЮмМ раствором NaOH до рН 7.0. Расчет содержания протонов [ИГ] проводили с учетом массы свежей ткани.

Мембраны выделяли из корней и надземных частей проростков кукурузы или корней и листьев растений хрустальной травки. Для получения микросомальных мембран растительный материал гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-HCl (рН 8.0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиоэритритол, 1 мМ фенилметил-сульфонилфторид и 0.6%-ный (в/о) поливинилпирролидон, и осаждав центрифугированием.

Микросомальные мембраны фракционировали с использованием водной двухфазной полимерной системы: 6.2%-ный декстран Т500 (в/в) - 6.2%-ный полиэтиленгликоль 3500 (в/в) (Larsson et al. 1994). Метод позволяет получать высокоочищенную фракцию плазмалеммы и обогащенную тонопластом фракцию, содержащую также относительно невысокий процент мембран ЭПР и аппарата Гольджи. В серии экспериментов использовали очищенный препарат тонопласта, который получали по методу Maeshima и Yoshida (1989) с разделением микросомальных мембран флотацией на сахарозной подушке. Мембраны замораживали и хранили при -70°С до использования.

Содержание белка определяли по методу Bradford (1976) с использованием 0.05%-ного (в/о) Тритона Х-100 для солюбилизации мембранных белков и БСА в качестве стандарта.

Чистоту изолированных мембранных фракций оценивали по активности специфических маркерных ферментов: Ка3УО4-чувствительной Н+-АТФазы для плазмалеммы, ККОз-ингибируемой Н+-АТФазы для тонопласта, цитохром с -оксидазы для внутренних мембран митохондрий и цианид-нечувствительной НАД Н-цитохром с - редуктазы для мембран ЭПР (Briskin et al. 1987).

Для определения коэффициента осмотической водной проницаемости мембран (Рос) везикулы подвергали осмотическому сжатию и регистрировали кинетику светорассеяния с помощью приставки к спектрофотометру Hitachi-557 («Hitachi», Япония), позволяющей проводить измерения методом остановленного потока. Кинетические кривые, характеризующие временной ход светорассеяния везикулярной суспензии, аппроксимировали экспоненциальной зависимостью. Коэффициент осмотической водной проницаемости мембран (Рос) рассчитывали в соответствии с van Heeswijk и van Os (1986) из уравнения: P0C=V k/(A Vw Cc), где V -объем и А - площадь поверхности везикулы, к - экспоненциальная константа

скорости, Vw - парциальный молярный объем воды (18 моль/см3) и Сс - молярность наружного раствора сахарозы.

Электрофоретическое разделение мембранных белков проводили в 13% ПАА геле по методу Laemmli (1970). Перед электрофорезом препараты мембран смешивали в равных объемах с 2Х экстрагирующим буфером, содержащим 125 мМ Трис-HCl (рН 6.8), 4% (в/о) SDS, 20% (в/в) глицерин, 200 мМ ДТТ, 0.02% (в/о) бромфеноловый синий. Денатурацию мембранного белка из тканей кукурузы проводили при 56°С в течение 5 мин., из корней и листьев М. crystallinum - при 96°С 5 мин. Далее белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super («Amersham», Великобритания), используя Multiphor II Electrophoresis Unit («LKB», Швеция). После переноса белков нитроцеллюлозную мембрану отмывали в среде PBST, содержащей 10 мМ фосфатный буфер рН 7.4, 2.7 мМ КС1 и 137 мМ NaCl и 0.5% (в/о) Tween-20, и блокировали в той же среде с добавлением 2% (в/о) сухого обезжиренного молока в течение 1 ч. при 18°С. Далее мембрану инкубировали с сыворотками, содержащими антитела, полученные против конъюгата БСА с консервативной аминокислотной последовательностью аквапоринов PIP-типа, или антитела против последовательностей белков MIP А , MIP В и MIP С М. crystallinum, любезно предоставленные проф. HJ. Bohnert (University of Arizona, США), в течение ночи при 4°С. После инкубации мембрану отмывали от первичных антител в PBST и инкубировали с вторичными козьими антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой («Promega», США), в течение 1.5 ч. Аквапорины визуализировали, используя цветную реакцию на пероксидазу в растворе, содержащем 26 мг 2,4-хлорнафтол, 7 мл метанола, 45 мл Н2О и 40 мкл 20% Н2О2, согласно (Каравайко и др. 1995).

Результаты и обсуждение Осмотическая водная проницаемость мембран, изолированных из этиолированных проростков кукурузы. Оценка осмотической водной проницаемости изолированных мембран требует применения подходов, позволяющих регистрировать очень быстрые осмотические изменения объема мембранных везикул. Один из таких подходов состоит в регистрации кинетики изменения светорассеяния мембранных везикул методом остановленного потока (Verkman 1995), который

позволяет быстро (< 1 мсек) переводить везикулы, нагруженные раствором сахарозы с концентрацией Св, в среду с другой концентрацией этого осмотика Сс и тем самым создавать трансмембранный осмотический градиент определенной величины и направления. В нашей работе именно этот метод был использован для измерения водной проницаемости микросомальных, внутриклеточных и плазматических мембран, изолированных из корней, мезокотилей и колеоптилей кукурузы, с целью выяснения механизмов трансмембранного транспорта воды.

Для оценки осмотической водной проницаемости изолированных мембран была исследована кинетика изменения светорассеяния суспензии мембранных везикул в ответ на их осмотическое сжатие (рис.1 и 2). Видно, что наблюдаемые амплитуда и скорость изменения светорассеяния везикулярных суспензий пропорциональны величине трансмембранного осмотического градиента.

0.34 ["

и

& 0.18

^ 0.14 —■----'-•-'-----1

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Время, мс

Рис. 1. Кинетика изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы корней кукурузы.

Мембраны (200 мкг белка/мл) в среде содержащей 100 мМ сахарозу, смешивали со средой того же состава с другой концентрацией сахарозы. Конечная концентрация осмотика в наружной среде после смешивания составила: 100 (1), 200 (2), 300(3) и 400 (4) мМ.

Кинетические кривые изменения светорассеяния суспензий везикул плазмалеммы (рис. 1) и внутриклеточных мембран (рис. 2) корней этиолированных проростков кукурузы, обусловленного их осмотическим сжатием хорошо аппроксимировались простыми экспоненциальными зависимостями ^>0.98) с существенно различающимися константами скорости.

0.40

U 0.20 I ■ _,_,_,_,_,_

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Время, мс

Рис. 2. Кинетика изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул внутриклеточных мембран корней кукурузы. Мембраны (250 мкг белка/мл) в среде, содержащей 100 мМ сахарозу, смешивали со средой того же состава с другой концентрацией сахарозы. Конечная концентрация осмотика в наружной среде после смешивания составила 100 (1), 200 (2), 300 (3) и 400 (4) мМ.

Согласно полученным нами данным электронномикроскопического анализа средний диаметр везикул плазмалеммы составляет 150 ± 52 нм, а внутриклеточных мембран - 175 ± 54 нм. Константы скорости и величины диаметров были использованы для расчета коэффициентов осмотической водной проницаемости исследуемых мембран (Рос). Рассчитанное значение этого параметра для внутриклеточных мембран (165 ± 7 мкм сек-1) превышало соответствующую

величину для плазмалеммы (11 + 2 мкм сек-1). Столь существенное различие в коэффициентах водной проницаемости мембран может указывать на функционирование в них различных механизмов транспорта воды.

Достаточно высокая величина рассчитанной водной проницаемости внутриклеточных мембран, по-видимому, отражает процесс облегченной диффузии воды через главную составляющую этих мембран - тонопласт. Гораздо более высокая водная проницаемость тонопласта, по отношению к соответствующей величине для плазмалеммы выявлена и для некоторых других растительных объектов. Близкие значения водной проницаемости, полученные с использованием такого же метода измерения, обнаруживают и вакуолярные мембраны, изолированные из корней пшеницы (86 мкм сек-1) (Niemietz and Tyerman 1997) и клеток суспензионной культуры табака (660 мкм сек-1) (Maurel et al. 1997). Высокие значения водной проницаемости, измеренные в работе (Maurel et al. 1997), по-видимому, обусловлены функциональной однородностью исходного растительного материала, использованного для получения вакуолярных мембран. Хотя обстоятельное объяснение физиологического значения такого различия в водной проницаемости основных клеточных мембран высших растений еще отсутствует, предполагается, что оно может лежать в основе буферной роли вакуоли в осморегуляции растительной клетки, т.е. различия в объемах цитозоля и вакуоли компенсируются разной интенсивностью трансмембранных потоков воды при осмотическом стрессе.

Относительно низкая водная проницаемость плазмалеммы (11 мкм сек"1), измеренная в наших экспериментах, может объясняться низким содержанием аквапоринов или отсутствием их в этой мембране. С другой стороны, нельзя исключить и ту возможность, что низкая водная проницаемость плазмалеммы обусловлена слабой активностью локализованных в ней аквапоринов из-за пребывания водных каналов большинства этих белков в закрытом состоянии. По имеющимся в литературе данным (Johansson et al. 1998), одним из факторов, контролирующих открывание водных каналов аквапоринов может быть фосфорилирование/ дефосфорилирование этих белков.

Ингибирование водной проницаемости мембран соединениями ртути.

Выявление активности аквапоринов в клеточных мембранах in vitro может

базироваться на чувствительности трансмембранных потоков воды к ртуть -содержащим соединениям. Соединения ртути могут обратимо блокировать трансмембранный водный поток путем связывания с сульфгидрильными группами цистеиновых остатков, расположенных в районе водной поры (Daniels et al. 1994; Agre et al. 1998). Связывание ртути может вызывать конформационные перестройки в молекулах аквапоринов (Barone et al. 1997).

Концентрационные зависимости ингибирующего действия ртутьсодержащих соединений хлорида ртути (HgCl2) и n-сульфофенилмеркуриохлорида (ПХМБС) на водную проницаемость плазмалеммы и внутриклеточных мембран корней кукурузы представлены на рис. 3 и 4. Коэффициент осмотической водной проницаемости (Рос) внутриклеточных мембран, рассчитанный на основе аппроксимации кинетических кривых экспоненциальными зависимостями, значительно уменьшался с ростом концентрации в среде как одного, так и другого ингибитора. Ингибирующее действие ПХМБС (рис. 4, кривая 1) проявлялось в диапазоне концентраций, на порядок превышающих HgCl2 (рис. 3, кривая 1).

Значительное замедление в присутствии как Щ02, так и ПХМБС кинетики осмотического сжатия везикул внутриклеточных мембран свидетельствует о снижении их водной проницаемости. Проще всего это можно объяснить инактивацией аквапоринов из-за связывания ртути с SH-Iруппами их цистеиновых остатков. Инактивация может быть следствием конформационной перестройки,

и

происходящей как в молекулах аквапоринов в результате блокирования 8Н-групп цистеинов, контролирующих проводимость их водного канала, так и, возможно, в других мембранных белках. Таким образом, изменение параметров трансмембранного осмотического водного транспорта под влиянием ртутьсодержащих соединений свидетельствует в пользу участия в нем аквапоринов.

Рис. 4.

Концентрационная зависимость влияния ПХМБС на осмотическую водную проницаемость внутриклеточных мембран (/) и плазмалеммы (2) корней 7- дневных этиолированных проростков кукурузы.

lg[nXMBC],M

Отсутствие влияния выбранных реагентов на кинетику осмотического сжатия везикул плазмалеммы и даже ускорение этого процесса относительно высокими концентрациями HgCl2 являются неожиданными (рис.3, кривая 2). Эти наблюдения трудно объяснить в рамках традиционных представлений о природе ингибирующего действия ртути на трансмембранные потоки воды в клеточных мембранах. Следует обратить внимание, что величина осмотической водной проницаемости плазмалеммы гораздо меньше, чем соответствующая величина для внутриклеточных мембран. Это, скорее всего, обусловлены низким содержанием в плазмалемме аквапоринов и/или инактивацией их в условиях in vitro. Кроме того, аквапорины, локализованные в этой мембране, могут быть не чувствительны к действию ртути. Вместе с тем, аномальный эффект высоких концентраций ртути на водную проницаемость плазмалеммы может быть также следствием особого действия ингибитора, как это недавно продемонстрировано в случае аквапорина AQP-6 в эпителиальных клетках крысы (Yasui et al. 1999; Hasama et al. 2002), где при высоких концентрациях HgCl2 в среде наблюдалась активация водного транспорта. Таким

образом, неэффективность ингибирующего действия ртути на трансмембранный поток воды еще не может служить индикатором отсутствия в мембранах аквапоринов. Если ограничиться полученными результатами, то вряд ли можно заключить, что аквапорины не включаются в транспорт воды через плазмалемму корней кукурузы. Тем не менее, независимо от природы наблюдаемого стимулирующего эффекта действия ионов ртути, устойчивость потока воды через плазмалемму к умеренно низким концентрациям ингибитора в целом позволяет говорить о низкой активности аквапоринов в этой мембране по отношению к соответствующей активности их во внутриклеточных мембранах.

Из сказанного выше следует вывод о том, что плазмалемма и внутриклеточные мембраны из корней кукурузы заметно различаются по вкладу аквапоринов в их осмотическую водную проницаемость, если судить об этом по чувствительности трансмембранного движения воды к выбранным ртутьсодержащим реагентам.

Содержание аквапоринов в плазматических мембранах с различной водной проницаемостью. Для получения ответа на вопрос о размерах пула аквапоринов в плазмалемме был проведен вестерн-блот анализ с использованием антител против конъюгата БСА с пептидом, в котором состав аминокислот и их последовательность (-DYKEPPPAPLFEPGELSSWS-) соответствовали консервативной области, локализованной в N-концевом домене аквапоринов растений, принадлежащих PIP1- и PIP2- подсемействам.

Проведенный иммунологический анализ белкового спектра микросомальных, вакуолярных и плазматических мембран корней кукурузы показал, что плазмалемма наиболее обогащена аквапоринами PIP-типа, в тонопласте они практически отсутствуют, но обнаруживаются в микросомальных мембранах (рис. 5). Из полученных результатов иммунодетекции можно сделать вывод о весьма низкой функциональной активности аквапоринов, локализованных в плазмалемме корней, поскольку эти мембраны обнаруживали слабую водную проницаемость.

Для установления связи между активностью аквапоринов и водной проницаемостью мембран из корней, мезокотилей и колеоптилей этиолированных проростков кукурузы, были изолированы плазматические мембраны. Оценка

осмотической водной проницаемости мембран, сделанная на основе аппроксимации кинетических кривых сжатия везикул показала, что водная проводимость плазмалсммы колеоптилей значительно превышает таковую мезокотилей и корней (рис. 6).

скорость сжатия, с

Рис. 6. Экспоненциальная скорость осмотического сжатия везикул плазматических мембран, полученных из колеоптилей (1), мезокотилей (2) и корней (3) 7- дневных этиолированных проростков кукурузы. Величина осмотического градиента - 200 мМ сахарозы.

Для выяснения причин, лежащих в основе различий в водной проницаемости плазматических мембран из разных частей проростков кукурузы, были предприняты исследования по определению содержания в этих мембранах аквапоринов (рис. 7). С помощью вестерн-блот анализа Р1Р-аквапоринов было установлено, что обогащенность этими белками плазмалеммы из корней (рис. 7 А, дорожка 1) и

мезокотилей (дорожка 2) значительно уступает плазмалемме колеоптилей, где их содержание достигает достаточно высокого уровня (дорожка 3). Иммунодетекция аквапоринов плазматические мембран показала не только их наличие в плазмалемме, но и прямую зависимость осмотической водной проницаемости от обогащенности аквапоринами тканей исследованных органов, что особенно ярко видно при сопоставлении величины Рос и результата иммунологического анализа плазмалеммы колеоптилей.

Рис. 7. ДДС-ПААГ электрофорез (вверху) мембранных белков и вестерн-блот анализ (внизу) аквапоринов PIP-семейства в препаратах: плазматических (А), и микросомальных (Б) мембран из корней (1), мезокотилей (2) и колеоптилей (3) 7- дневных этиолированных проростков кукурузы.

На трек нанесено 7 мкг белка плазмалеммы и 15 мкг белка микросом

Представленные на рис. 7 Б результаты иммунодетекции аквапоринов семейства PIP, демонстрируют их присутствие в микросомальных мембранах. Следует отметить, что в микросомальной фракции, согласно активности маркерных ферментов (Briskin et al. 1987), содержание плазматических мембран, как правило, не превышает 20% Судя по интенсивности окрашивания, содержание аквапоринов плазмалеммы, выявляемое в микросомальной фракции заметно выше. Вероятно, это связано с тем, что во фракции внутриклеточных мембран присутствуют везикулы, транспортирующие аквапорины. Это предполагает возможность везикулярного транспорта аквапоринов в растительных клетках как способа обогащения ими клеточных мембран.

Таким образом, можно заключить, что аквапорины в той или иной степени обеспечивают осмотическую водную проницаемость мембран растительных клеток

Через изменение их количества и активности осуществляется регуляция интенсивности трансмембранного потока Н2О. Один из возможных путей аквапорин-опосредованной регуляции трансмембранной водной проводимости растительных мембран, скорее всего, связан с изменением содержания этих белков на единицу площади мембраны и в реализации этого пути может принимать участие везикулярный транспорт (Briskin et al. 1987).

Функциональная роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембранМеэетЬгуапТкетыт crystallinum при переходе с С-типа фотосинтеза на САМ. Предположение о важной роли регуляции водной проницаемости мембран при адаптации растений к стрессорным условиям пока не имеет достаточных экспериментальных доказательств. Для исследования участия аквапоринов в регуляции водной проницаемости мембран была измерена скорость осмотической водной проницаемости и обогащенность аквапоринами мембран Mesembryanthemum crystallinum L. (сем. Aizocacea). Этот вид проявляет генетически детерминированный переход с Сз-типа фотосинтеза на САМ, который реализуется в условиях стресса, а также на поздних стадиях генеративного развития. Для растений засушливых местообитаний переход на САМ является адаптивным механизмом, позволяющим не только эффективно ассимилировать СО2, но и регулировать водный обмен в целом, снижая интенсивность транспирации. Поэтому САМ часто определяют как водосберегающую стратегию адаптации, позволяющую минимизировать общие потери воды (Luttge 1993).

Для исследований были выделены две возрастные группы растений, различающихся по способности к индукции САМ и интенсивности протекания этого процесса. Согласно измерениям суточной разности титруемой кислотности клеточного сока для растений 4-5-недельного возраста она не превышала 1 мкэкв Н+/г сырой массы, что характеризует их как растения с Сз-типом фотосинтеза. Для 8-9-недельных растений разница между значениями этого параметра, определенного утром и вечером, достигала примерно 50 мкэкв Н+/г сырой массы, что характерно для сформированного САМ (Adams et al. 1998; Winter and Gademan 1991). В другой серии экспериментов 4-5-недельные растения подвергали 2-недельному солевому воздействию (400 мМ NaCl). Измерения титруемой кислотности клеточного сока в

конце этого периода показали, что суточная разница титруемой кислотности составляла для контрольных растений около 20, а для засоленных - около 100 мэкв Н+/г сырой массы. Таким образом, стресс-индуцируемый переход на САМ был более выраженным по сравнению с онтогенетически регулируемым.

Из всех групп растений, протестированных на развитие САМ, были получены клеточные мембраны, представленные микросомальными мембранами, плазмалеммой и внутриклеточными мембранами. Анализ активности маркерных ферментов показал, что после разделения микросомальных мембран в двухфазной полимерной системе верхняя фаза содержит высокоочищенную плазмалемму (таблица). Нижняя фаза значительно обогащена тонопластом, но содержит также мембраны эндоплазматического ретикулума и небольшую примесь плазмалеммы.

Удельные активности маркерных ферментов в мембранных фракциях из листьев Mesembryanthemum crystallinum, полученных методом разделения в двухфазной полимерной системе

Маркерные ферменты МФ ВФ НФ

КазУ04-чувсхвительная Н+-АТФаза (мкмоль Р, мг'белка ч"1) 0,3 2,0 0,1

КМОз-чувствительная Н'-АТФаза (мкмоль Р, мг"'белка ч'1) 3,5 Отс. 6,9

НАД Н-редуктаза (нмоль цит с мг'белка ч'1) 175 30 150

Цит с-оксидаза (нмоль цит с мг'белка ч"1) 32 16 50

Примечание: МФ-микросомальная фракция; ВФ-препарат плазмалеммы из верхней фазы, НФ-препарат внутриклеточных мембран из нижней фазы, обогащенный тонопластом; Отс-отсутствие активности

На рис. 8 приведены результаты измерений скорости осмотического сжатия мембранных везикул из корней и листьев растений с С3-типом фотосинтеза и САМ, переход к которому был индуцирован онтогенетически или засолением. Кривые, отражающие сжатие везикул микросомольных мембран, изолированных из корней М crystallinum, хорошо аппроксимировались суммой двух экспонент. Значение средневзвешенной константы скорости осмотического сжатия для этих мембран уменьшалось примерно в 3 раза при переходе растений на САМ (рис. 8.). Изменения кинетики светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы и внутриклеточных мембран, изолированных из листьев, хорошо апроксимировались

одноэкспоненциальными зависимостями с близкими значениями константы скорости процесса. Из этого следует, что величины водной проницаемости этих мембран сопоставимы. С переходом растений на САМ этот параметр уменьшался как в листьях, так и в корнях М. crystallinum независимо от индуцирующего фактора (Рис. 8).

А Б В

44

36

Возраст растений, недели

Рис. 8. Изменения скорости осмотического сжатия плазматических (А) и внутриклеточных (Б) мембран листьев и микросомальных (В) мембран корней растений М. crystallinum разного возраста. Величина осмотического градиента ЮСмМ сахарозы.

1 - контроль, 2 - засоление (24 ч, 400 мМ NaCl).

Представленные данные позволяют заключить, что с возрастом растений и переходом их на САМ при засолении увеличивается сопротивление мембран водному потоку. Это означает, что дневное подавление транспирации при формировании САМ сопровождается снижением интенсивности трансмембранного транспорта воды.

Полученные данные достаточно хорошо согласуются с результатами Rygol et al. (1989), которые использовали зонд давления для изучения осмотической водной проницаемости мембран клеток мезофилла у растений с NaCl-индуцированным САМ. Вместе с тем, для С3-растения Arabidopsis thaliana, как было показано Morillon и Chiispeels (2001), в условиях подавленной транспирации активность трансмембранного переноса воды, напротив, возрастала. По-видимому, регуляция

водной проницаемости мембран может носить не только компенсаторный характер, но и указывать на изменение водного статуса растения в целом

Обогащенность исследуемых мембран аквапоринами оценивали на основе интенсивности окраски при иммунологической идентификации изоформ М1Р А, М1Р В и М1Р С (Рис. 9.). Основные белковые полосы на иммуноблотах были локализованы

Рис. 9. ДДС-ПААГ-электрофорез мембранных белков и иммунологическая идентификация М1Р А (А), М1Р В (В), М1Р С (С) в препаратах мембранного белка из С3 и САМ- растений М Сгу$1аШпыт

Мембраны из корней (1-4) и листьев (5-8) четырех-(1,2,5,6) и девятинедельных (3,4,7,8) растений. На каждую дорожку нанесено по 7 мкг мембранного белка.

в интервале масс ди- и тримеров аквапоринов: 43-67 кД, в то время как массы мономеров аквапоринов имеют значения 20-30 кД. Наблюдаемая агрегация, по-

видимому, достаточно характерна для интегральных мембранных белков в ДДС-буфере (Veenholfet al. 2002).

Согласно полученным данным, с переходом на САМ MIP А и MIP В в мембранах из листьев практически исчезали (рис. 9, дорожки 5-6 и 7-8), в то время как их содержание в мембранах корней заметно не изменялось (Рис. 9., дорожки 1-2 и 3-4). Относительное содержание MIP А во внутриклеточных мембранах из корней и листьев значительно превосходило его содержание в плазмалемме. MIP С обнаруживался во всех исследуемых препаратах мембран, причем обогащенность плазмалеммы этой изоформой всегда превосходила таковую внутриклеточных мембран. Возраст растений практически не влиял на содержание MIP С. Полученные данные позволяют заключить, что переход М. crystallinum с Сз-типа фотосинтеза на САМ сопровождается резко выраженным снижением содержания в листьях всех трех исследованных изоформ аквапоринов.

В настоящее время саму возможность изменения осмотической водной проницаемости биологических мембран связывают с присутствием в их составе белков - аквапоринов. Для М. crystallinum охарактеризовано 14 генов, кодирующих изоформы белков, гомологичных аквапоринам плазмалеммы и тонопласта (Yamada et al. 1995; Kirch et al. 2000). Проведенная в данной работе иммунологическая идентификация трех изоформ с использованием антител, полученных на специфические последовательности аквапоринов плазмалеммы MIP A, MIP В и MIP С, выявила присутствие этих белков во всех препаратах исследуемых клеточных мембран. При этом только М1Р С преимущественно выявлялся во фракции плазмалеммы, для двух других изоформ иммунологическое окрашивание проявлялось и во фракции внутриклеточных мембран. Появление иммуноокрашивания в этой фракции может быть связано, с одной стороны, с недостаточно полным выделением плазмалеммы из микросомальной фракции. Вместе с тем, принимая во внимание результаты работы (Barkla et al. 1999), этот факт можно объяснить иммунной реакцией аквапоринов, локализованных в везикулах эндомембранной системы, доставляющих к плазматической мембране наряду с аквапоринами другие, необходимые для ее биогенеза компоненты, или транспортирующих подлежащий утилизации мембранный материал от плазмалеммы в литичесую вакуоль. Анализ

активности маркерных ферментов (таблица) не подтвердил существенной примеси плазмалеммы во фракциях используемых нами внутриклеточных мембран.

Характер изменений в содержании изоформ в мембранах листьев у растений, переход которых на САМ был индуцирован засолением или онтогенетическим развитием, оказался близким (рис. 10). В микросомальных мембранах, изолированных из листьев растений, подвергнутых 2-недельному солевому воздействию и проявлявших выраженный САМ, содержание исследуемых изоформ резко снижалось. В мембранах же, изолированных из корней тех же растений, напротив, наблюдалось некоторое усиление окраски при иммунодетекции, особенно выраженное у М1Р В, что свидетельствовало об увеличении его содержания. После кратковременного действия солевого стресса (3 ч, 400 мМ №С1) каких-либо существенных изменений в содержании изоформ в мембранах еще не наблюдалось.

Рис. 10. Влияние засоления 400 мМ №С1 в течение 3 ч (1) и 14 суток (3) на относительную обогащенность аквапоринами микросомальных мембран из корней (А) и листьев (Б) растений М. сгу$1аШпыт пяти (1, 2) и семинедельного (3, 4) возраста.

Контроль - четные дорожки.

Наиболее важным, на наш взгляд, является заметное снижение содержания всех исследованных изоформ аквапоринов в мембранах из листьев САМ-растений. Это было свойственно растениям, перешедшим на САМ как в результате естественного старения (рис. 9), так и в ответ на солевой стресс (рис. 10). Нельзя при этом исключать, что засоление лишь стимулировало изменения в содержании аквапоринов, наблюдаемые в ходе онтогенеза. Таким образом, можно предположить, что уменьшение водной проницаемости мембран, обусловленное снижением в них содержания аквапоринов, является важной особенностью перехода растений на САМ. Аналогичные результаты о низком суммарном содержании аквапоринов в клеточных

мембранах облигатного САМ - растения Graptopetalum paraguayense по сравнению с мембранами, изолированными из С3-растения, были сообщены ранее (Oshima et al. 2001). Авторы высказывают предположение о существовании корреляции между развитием суккулентности и снижением интенсивности трансмембранных водных потоков в растении, проявляющейся в низком содержании в клеточных мембранах аквапоринов.

Принципиально иная картина наблюдалась в мембранах, изолированных из корней растений разного возраста. В этом случае практически не обнаруживалось изменений в содержании тех же изоформ, выявляемых в мембранах с антителами к MIP A, MIP В и MIP С (рис. 9). Это происходило на фоне снижения осмотической водной проницаемости микросомальных мембран (рис. 8.). Нельзя исключить, что снижение их осмотической водной проницаемости обусловлено действием регуляторного механизма, способного приводить к увеличению пула «закрытых» молекул аквапоринов, например, в результате их дефосфорилирования (Johansson et al. 2000)

Согласно результатам работы, все исследуемые нами изоформы аквапоринов MIP A, MIP В и MIP С присутствуют в клеточных мембранах корней и листьев М. crystallinum Переход растений хрустальной травки на САМ-тип фотосинтеза сопровождается уменьшением их содержания в мембранах листьев, но не корней. Сопоставление этих результатов с данными о функциональной активности аквапоринов, основанной на оценке осмотической водной проницаемости мембран, позволяет заключить, что регуляция активности одних и тех же изоформ этих белков в разных органах и тканях растения, осуществляется разными путями. В одном месте она реализуется через изменение уровня экспрессии генов аквапоринов. Это позволяет изменять их содержание в мембранах. В другом - за счет механизма посттрансляционной модификации, в том числе, фосфорилирования-дефосфорилирования, результатом действия которого будет смещение равновесия между пулами с открытой (активной) и закрытой (неактивной) формами молекул.

выводы

1. Осмотическая водная проницаемость плазматических мембран, изолированных из разных тканей этиолированных проростков кукурузы увеличивается в ряду: корень < мезокотиль < колеоптиль.

2. В той же последовательности возрастает интенсивность взаимодействия антител к консервативной последовательности аквапоринов Р1Р-типа с мембранным белком с молекулярной массой, характерной для аквапоринов. Сопоставление скорости осмотического сжатия везикул с результатами иммуноанализа выявляет положительную корреляцию между водной проницаемостью мембран и их обогащенностью аквапоринами.

3. Ртутьсодержащие соединения обратимо и с различной степенью эффективности снижают осмотическую водную проницаемость мембран. Степень подавления трансмембранного переноса воды ингибиторами этого типа может служить показателем вклада аквапорин-опосредованной компоненты в общий поток воды через мембраны.

4. У растений Mesembryanthemum crystallinum, способных в процессе своего жизненного цикла переходить на водосберегающую стратегию фотосинтеза (САМ), такой переход сопряжен с уменьшением осмотической водной проницаемости клеточных мембран.

5. Такой характер изменений не зависит от фактора, индуцирующего переход на САМ - стадии онтогенетического развития или солевого стресса. Предполагается, что снижение водной проницаемости мембран имеет адаптивное значение, состоящее в необходимости минимизации общих потерь воды растением.

6. В плазматических мембранах, изолированных из корней и листьев Mesembryanthemum crystallinum, выявлен ряд изоформ аквапоринов Р1Р-типа: М1Р А, М1Р В и М1Р С. Обнаружена заметная гетерогенность их содержания в зависимости от органа, из которого изолированы мембраны.

7. С переходом на САМ в плазмалемме листьев, но не корней, снижается содержание всех трех изоформ аквапоринов. При этом снижение обогащенности мембран изоформой М1Р С минимально. Осмотическая водная

проницаемость мембран из растений, полностью перешедших на САМ, снижается как в корнях, так и в листьях. Согласно этим фактам, регулирование активности одних и тех же изоформ аквапоринов в различных органах и тканях осуществляется разными путями.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Божко К.Н. Измерение водной проницаемости мембран корней кукурузы. Тез. 1-ой молодежной научной конференции // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. Москва. 2001. С. 5.

2. Trofimova M.S., Zhestkova I.M., Bozhko K.N., Sorokin E.M. Osmotic water peimeability ofplant cell membranes, isolated from maize roots. // Int. Symposium "Plant under Environmental Stress". Moscow. 2001. P. 302.

3. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Божко К.Н., Сорокин Е.М. Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости растительных мембран. // V съезд Общества физиологов растений России. Пенза. 2003. С. 165.

4. Божко К.Н. Изменение содержания аквапоринов Mip A, Mip В и Mip С в клеточных мембранах Mesembryanthemum crystallinum L. при переходе на САМ. // V съезд Общества физиологов растений России. Пенза. 2003. С. 250.

5. Божко К.Н., Ампилогова Я.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С. Водная проницаемость плазматических мембран, изолированных из корней, мезокотилей и колеоптилей проростков кукурузы, и содержание в них аквапоринов. // Международная конференция «Проблемы физиологии растений Севера». Петрозаводск. 2004. С. 21.

6. Божко К.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С, Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Изменение содержания аквапоринов в клеточных мембранах Mesembryanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ. // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 887-885.

7. Ампилогова Я.Н., Божко К.Н. Водная проницаемость плазмалеммы корней, мезокотилей и колеоптилей кукурузы и содержание в них аквапоринов. // XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва. 2005. С. 84.

Подписано в печать 22.03.2005 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №140

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл. 13. т. 264-30-73 www.blok01centre.narod.ra Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

'il

t X в» -г A

/ в» -jT л / .

W ;

\ S 5 ï /

850

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Божко, Кира Николаевна

Введение

ОГЛАВЛЕНИЕ

Цель работы.

Задачи.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Структура аквапоринов, механизм функционирования и разнообразие.

Открытие аквапоринов.

Структура аквапоринов.

Механизм функционирования.

Олигомеризация.

Генетическое разнообразие изоформ аквапоринов, классификация.

Локализация аквапоринов в растении.

1.2 Функциональная активность аквапоринов.

Особенности трансмембранного транспорта воды.

Оценка функциональной активности аквапоринов.

Осмотическая водная проницаемость плазмалеммы.

Осмотическая водная проницаемость тонопласта.

1.3 Регуляция функциональной активности аквапоринов растений.

Транскрипционная регуляция.

Посттрансляционная регуляция.

1.4 Роль аквапоринов в ответе растения на водный стресс.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Осмотическая водная проницаемость мембран, изолированных из этиолированных проростков кукурузы.

3.2. Ингибирование водной проницаемости мембран соединениями ртути.

3.3. Содержание аквапоринов в плазматических мембранах с различной водной проницаемостью.

3.4. Функциональная роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран МеьетЪгуаЫЪетит сгу$1аШпит при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости мембран растительных клеток"

Выяснение факторов, контролирующих перенос воды через клеточные мембраны растений, представляет собой важное направление исследований в рамках общей проблемы, касающейся механизмов транспорта воды в клетках и тканях высших растений и их водного обмена в целом. Хотя в физиологии растений это направление исследований давно стало классическим, оно в сильной степени было стимулировано в последние годы после обнаружения в мембранах животных и растительных клеток аквапоринов - интегральных белков, облегчающих пассивный трансмембранный перенос молекул воды. Водная проницаемость мембран может изменяться либо в результате изменения активности таких белков, то есть вероятности нахождения их водной поры в открытом состоянии, либо за счет вариации количества аквапоринов на единицу площади мембраны. Имеющиеся в настоящее время данные показывают, что исследования, связанные с идентификацией, выяснением особенностей функционирования и способов регуляции активности аквапоринов, весьма актуальны для понимания механизмов, определяющих динамику транспорта воды в растениях в нормальных и стрессовых условиях их окружения. Вместе с тем, несмотря на интенсивно ведущиеся в настоящее время работы по идентификации аквапоринов в растениях, мало известно о функциональной активности этих белков в их нативном окружении в растительных мембранах. Основные доказательства в пользу постулируемой функции аквапоринов как водных каналов получены с использованием модельной системы, представленной ооцитами Xenopus, обладающими низкой водной проницаемостью их плазматической мембраны, способными к экспрессии растительных аквапоринов и обнаруживающими в этом случае гораздо более высокие скорости осмотического набухания. Однако, несмотря на широкое применение этого подхода, его использование далеко не всегда позволяет выявить функциональную активность этих белков, причем в особенности это касается аквапоринов плазматических мембран растений. В то же время, имеющиеся в литературе данные показывают, что функциональная идентификация растительных аквапоринов в их нативном окружении в растительных мембранах сильно осложняется явной ограниченностью традиционных методических подходов для изучения их водной проницаемости in vivo, необходимостью использования в этой связи изолированных мембранных везикул и методов быстрой кинетики для регистрации осмотических изменений их объема, а также тем фактом, что далекими от ясности остаются механизмы эндогенной регуляции функциональной активности таких белков.

Цель работы

Исследовать участие аквапоринов в регуляции осмотической водной проницаемости клеточных мембран растений.

Задачи

1. Получить препараты микросомальных, плазматических и вакуолярных мембран из растений с различной эффективностью использования воды.

2. Оценить величину осмотической водной проницаемости этих мембран.

3. Определить содержание аквапоринов Р1Р-типа в мембранных препаратах с различной водной проницаемостью.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Божко, Кира Николаевна

Выводы

1. Осмотическая водная проницаемость плазматических мембран, изолированных из разных тканей этиолированных проростков кукурузы увеличивается в ряду: корень < мезокотиль < колеоптиль.

2. В той же последовательности возрастает интенсивность взаимодействия антител к консервативной последовательности аквапоринов Р1Р-типа с мембранным белком с молекулярной массой, характерной для аквапоринов. Сопоставление скорости осмотического сжатия везикул с результатами иммуноанализа выявляет положительную корреляцию между водной проницаемостью мембран и их обогащенностью аквапоринами.

3. Ртутьсодержащие соединения обратимо и с различной степенью эффективности снижают осмотическую водную проницаемость мембран. Степень подавления трансмембранного переноса воды ингибиторами этого типа может служить показателем вклада аквапорин-опосредованной компоненты в общий поток воды через мембраны.

4. У растений Ме$етЪгуап1Ъетит сгу$1аШпит, способных в процессе своего жизненного цикла переходить на водосберегающую стратегию фотосинтеза (САМ), такой переход сопряжен с уменьшением осмотической водной проницаемости клеточных мембран.

5. Такой характер изменений не зависит от фактора, индуцирующего переход на САМ - стадии онтогенетического развития или солевого стресса. Предполагается, что снижение водной проницаемости мембран имеет адаптивное значение, состоящее в необходимости минимизации общих потерь воды растением.

6. В плазматических мембранах, изолированных из корней и листьев МезетЪгуаЫкетит сгу$1аШпит, выявлен ряд изоформ аквапоринов Р1Р-типа: М1Р А, М1Р В и М1Р С. Обнаружена заметная гетерогенность содержания этих изоформ в зависимости от органа, из которого изолированы мембраны.

7. С переходом на САМ в плазмалемме листьев, но не корней, снижается содержание всех трех изоформ аквапоринов. При этом снижение обогащенности мембран изоформой М1Р С минимально. Осмотическая водная проницаемость мембран из растений, полностью перешедших на САМ, снижается как в корнях, так и в листьях. Согласно этим фактам, регулирование активности одних и тех же изоформ аквапоринов в различных органах и тканях осуществляется разными путями.

Заключение

Проведенное исследование включало три основных этапа: 1) на основе определения коэффициента осмотической водной проницаемости мембран и его сопоставления со значением, характерным для липидного бислоя (меньше 1 мкм/с) получить доказательства активности аквапоринов в исследуемых мембранах; 2) с применением иммунологических методов непосредственно идентифицировать присутствие этих белков в исследуемых мембранах; 3) экспериментально подтвердить, что изменение водного статуса влечет за собой изменение водной проводимости мембран и, в конечном счете, уменьшение или увеличение вклада трансмембранного пути транспорта воды в растениях. Экспериментальный подход, используемый для функциональной идентификации аквапоринов, основан на определении коэффициента осмотической водной проницаемости мембран, величина которого зависит как от активности аквапоринов, так и от обогащенности мембран этими белками.

Расчет коэффициентов осмотической водной проницаемости мембран, сделанный на основе данных оценки констант скоростей процесса сжатия показал, что водная проницаемость внутриклеточных мембран из корней кукурузы примерно в 20 раз превышает соответствующую величину для плазмалеммы. В противоположность этому плазмалемма и внутриклеточные мембраны из листьев М. сгуьгаЩгшт мало различались по величине осмотической водной проницаемости. Как на том, так и на другом объекте коэффициенты осмотической водной проницаемости мембран на 1-2 порядка превышали значения, характерные для липидного бислоя.

Для выяснения причин, лежащих в основе различий в проницаемости плазмалеммы и внутриклеточных мембран, были предприняты исследования по определению содержания аквапоринов в плазмалемме. С этой целью использовался метод вестерн-блот анализа. Антитела были получены против пептида, в котором состав аминокислот и их последовательность соответствовали консервативной области в аквапоринах, принадлежащих Р1Р-семейству растений. Показана высокая специфичность антител по отношению к плазмалемме и полное отсутствие какого-либо их взаимодействия с белками тонопласта. Интенсивность окрашивания при иммунологической идентификации аквапоринов свидетельствует о достаточно высокой степени обогащенности ими плазмалеммы. Это предполагает, что низкая величина осмотической водной проницаемости плазмалеммы обусловлена не отсутствием аквапоринов в мембране, а их слабой функциональной активностью.

В качестве экспериментального подхода для решения задач третьего этапа проводилось сравнение водной проводимости клеточных мембран Сз- и САМ-растений, а также вестерн-блот анализ содержания в них трех изоформ аквапоринов М. сгузШШпит. Установлено, что содержание изоформ М1Р А, М1Р В и М1Р С в клеточных мембранах, изолированных из тканей этого растения, существенно снижается в листьях при переходе на САМ, но остается практически неизменным в корнях. Вместе с тем, осмотическая водная проницаемость тех же мембран из корней и листьев М. сгу$1аШпит снижалась в 2-3 раза в САМ-растениях по сравнению с соответствующей величиной этого параметра в Сз-растениях. Это было свойственно растениям, перешедшим на САМ как в результате естественного старения, так и в ответ на солевой стресс. Совокупность изложенных данных свидетельствует о том, что регуляция активности аквапоринов в разных органах и тканях растения осуществляется разными путями. В одном месте она реализуется через изменение уровня экспрессии генов аквапоринов. Это позволяет изменить их содержание в мембране. В другом - за счет механизмов посттрансляционной модификации. Результатом действия таких механизмов будет смещение равновесия между пулами молекул с открытой (активной) и закрытой (неактивной) формами молекул. Принцип зависимости способа регулирования от тканевой и органной принадлежности клетки может действовать по отношению ко всем изоформам аквапоринов, по-крайней мере, отличных от исследованных нами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Божко, Кира Николаевна, Москва

1. Adams P., Nelson D.E., Yamada S., Chmara W., Jensen R.G., Bohnert H.J. and Griffits H. (1998) Growth and development of Mesembryanthemum crystallinum (Aizocacea). New Phytol. V. 138. P. 171-190.

2. Agre P., Bonhivers M. and Borgina M.J. (1998) The aquaporins, blueprints for cellular plumbing systems. J. Biol. Chem. V. 273. P. 14659-14662.

3. Agre P., Sasaki S. and Chrispeels M.J. (1993) Aquaporins: a family of water channel proteins. Am. J. Physiol. V. 265. P. F461.

4. Amodeo G., Dorr R., Vallejo A., Stuka M. and Parisi M. (1999) Radial and axial water transport in the sugar beet storage root. J. Exp. Bot. V50. P. 509-516.

5. Amodeo G., Stuka M., Dorr R. and Parisi M. (2002) Protoplasmic pH modifites water and solute transfer in Beta vulgaris root vacuoles. J. Membr. Biol. V. 187. P. 175-184.

6. Azad A.K., Sawa Y., Ishikawa T. and Shibata H. (2004) Phosphorylation of plasma membrane aquaporin regulates temperature-dependent opening of tulip petals. Plant Cell Physiol. V. 45. P. 608-617.

7. Azaizeh H. and Steudle E. (1991) Effects of salinity on water transport of excised maize (Zea mays L.) roots. Plant Physiol. V. 97. P. 1136-1145.

8. Azaizeh H., Gunse B. and Steudle E. (1992) Effects of NaCl and CaCh on water transport across root cells of maize (Zea mays L.) seedlings. Plant Physiol. V.99. P. 886-894.

9. Barkla B.J., Vera-Estrella R., Pantoja O., Kirch H.H. and Bohnert H.J. (1999) Aquaporin localization How valid are the TIP and PIP labeles? Trends Plant Sci. V. 4. P. 86-88.

10. Barrieu F., Chaumont F. and Chrispeels M.J. (1998) High expression of the tonoplast aquaporin z/nTIPl in epidermal and conducting tissues of maize. Plant Physiol., V.l 17. P. 1153-1163.

11. Barrieu F., Marty-Mazars D., Thomas D., Chaumont F. Charbonnier M. and Marty F. (1999) Desiccation and osmotic stress increase the abundance of mRNA of the tonoplast aquaporin BobTIP26-l in cauliflower cecils. Planta. V. 209. P. 77-86.

12. Biela A., Grote K., Otto B., Hoth S., Hedrich R. and Kaldenhoff R. (1999) The Nicotiana tabacum plasma membrane aquaporin MAQP1 is mercury-insensitive and permeable for glycerol. Plant J. V. 18. P. 565-570.

13. Birner T.P. and Steudle E. (1993) Effects of anaerobic conditions on water and solute relations, and on active transport in roots of maize (Zea mays L.). Planta. V. 190. P. 474-483.

14. Blumwald E. (2000) Sodium transport and salt tolerance in plants. Curr. Opin. Cell Biol. V. 12. P. 431-434.

15. Bohnert H.J., Nelson D.E. and Jensen R.G. (1995) Adaptation to environment stress. Plant Cell. V. 7. P. 1099-1111.

16. Borgina M.J. and Agre P. (2001) Reconstitution and functional comparison of purified GlpF and AqpZ, the glycerol and water channels from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 98. P. 2888-2893.

17. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal. Biochem. V. 72. P. 248-254.

18. Braun T., Philippsen A., Wirtz S., Borgina M.J., Agre P., Kuhlbrandt W., Engel A. and Stahlberg H. (2000) The 3.7 A projection map of the glycerol facilitator GlpF: a variant of the aquaporin tetramer. ENBO Rep. V. 1. P. 183-189.

19. Bray E.A. (1993) Molecular responses to water deficit. Plant Physiol. V. 103. P. 1035- 1040.

20. Brinckmann E., Tyerman S.D., Steudle E. and Schulze E.D. (1984) The effect of different growing conditions on water relations parameters of leaf epidermis cells of Tradescantia virginiana L. Oecologia. V. 62. P. 110-117.

21. Briskin D.P. Leonard R.T. and Hodges T.K. (1987) Isolation of the plasma membrane: membrane markers and general principles. Methods Enzymol. V. 148. P. 542-558.

22. Cantrill L.C., Overall R.L. and Goodwin P.B. (1999) Cell-to-cell communication via plant endomembranes. Cell Biol. Int. V. 23. P. 653-661.

23. Carter S.G. and Karl D.W. (1982) Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. J. Biochem. Biophys. Meth. V. 7. P. 7-13.

24. Carvajal M., Cooke D.T. and Clarkson D.T. (1996) Response of wheat plants to nutrient deprivation may involve the regulation of water-channel function. Planta. V. 199. P. 372-381.

25. Carvajal M., Martinez V. and Alcaraz C.F. (1999) Physiological function of water channels is affected by salinity in roots of paprika pepper. Physiol. Plant. V. 105. P. 95-101.

26. Carvajal M., Cerda A. and Martinez V. (2000) Does calcium ameliorate the negative effect of NaCl on melon root water transport by regulating aquaporin activity? New Phytol. V. 145. P. 439-447.

27. Chaumont F., Loomis W.F. and Chrispeels M.J. (1997) Expression of an Arabidopsis plasma membrane aquaporin in Dictyostelium results in hypoosmotic sensitivity and developmental abnormalities. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 94. P. 6202-6209.

28. Chaumont F., Barrieu F., Herman E.M. and Chrispeels M.J. (1998) Characterization of a maize tonoplast aquaporin expressed in zones of cell division and elongation. Plant Physiol. V. 117. P.1143-1152.

29. Chaumont F., Barrieu F., Jung R. and Chrispeels M.J. (2000) Plasma membrane intrinsic proteins from maize cluster in two sequence subgroups with differential aquaporin activity. Plant Physiol. V. 122. P. 1025-1034.

30. Chaumont F., Barrieu F., Wojcik E., Chrispeels M.J. and Jung R. (2001) Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize. Plant Physiol. V. 125. P. 1206-1215.

31. Cheeseman J.M. (1988) Mechanisms of salinity tolerance in plants. Plant Physiol. V. 87. P. 547-550.

32. Cheng A., van Hoek A.N., Yager M., Verkman A.S. and Mitra A.K. (1997) Three -dimentional organization of a human water channel. Nature. V. 387. P. 627-630.

33. Chrispeels M.J., Crawford N.M. and Schroeder J.I. (1999) Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cells. Plant Cell. V. 11. P. 661-675.

34. Clarkson D.T., Carvajal M., Henzler T., Waterhouse R.N., Smyth A.J., Cooke D.T. and Steudle E. (2000) Root hydraulic conductance: diurnal aquaporin expression and the effects of nutrient stress. J. Exp. Bot. V. 51. P. 61-70.

35. Cosgrove D.J. and Steudle E. (1981) Water relations of growing pea epicotyl segments. Planta. V. 153. P. 343-350.

36. Daniels M.J., Mirkov T.E. and Chrispeels M.J. (1994) The plasma membrane of Arabidopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is homolog of the tonoplast water channel protein TIP. Plant Physiol. V. 106. P. 1325-1333.

37. Daniels M.J., Chrispeels M.J. and Yeager M. (1999) Projection structure of a plant vacuole membrane aquaporin by electron cryo-crystallography. J. Mol. Biol. V. 294. P. 1337-1349.

38. Dean R.M., Rivers R.L., Zeidel M.L. and Roberts D.M. (1999) Purificatin and functional reconstitution of soybean nodulin 26. An aquaporin with water and glycerol transport properties. Biochemistry. V. 38. P. 347-353.

39. Denker B.M., Smith B.L., Kuhajada F.P. and Agre P. (1988) Identification, purification and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules. J. Biol. Chem. V. 263. P. 15634-15642.

40. Dordas C., Chrispeels M.J. and Brown P.H. (2000) Permeability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from squash roots. Plant Physiol. V. 124. P. 1349-1361.

41. Engel A., Fijiyoshi Y. and Agre P. (2000) The importance of aquaporin water channel protein structures. EMBO J. V. 19. P. 800-806.

42. Everard J.D. and Drew M.C. (1987) Mechanisms of inhibition of water movement in anaerobically treated roots of Zea mays L. J. Exp. Bot. V. 38. P.l 154-1165.

43. Fetter K., van Wilder V., Moshelion M. and Chaumont F. (2004) Interactions between plasma membrane aquaporins modulate their water channel activity. Plant Cell. V. 16. P. 215-228.

44. Fleuratlessard P., Frangne N., Maeshima M., Ratajczak R., Bonnemain J.L. and Martinoia E. (1997) Increased expression of vacuolar aquaporin and H+-ATPase related to motor cell function in Mimosa pudica. Physiol. Plant. V. 114. P. 827-834.

45. Fotiadis D., Jeno P., Mini Т., Wirtz S., Muller S.A., Fraysse L., Kjellbom P. and Engel A. (2001) Structural characterization of two aquaporins isolated from native spinach leaf plasma membranes. J. Biol. Chem. V. 276. P. 1707-1714.

46. Frangne N., Maeshima M., Schaffner A.R., Mandel T., Martinoia E. and Bonnemain J.L. (2001) Expression and distribution of a vacuolar aquaporin in young and mature leaf tissues of Brassica napus in relations to water fluxes. Planta. V. 212. P. 270-278.

47. Fray R.G., Wallace A., Grierson D. and Lycett G.W. (1994) Nucleotide sequence and expression of a ripening and water-stress related cDNA from tomato with homology to the MIP class of membrane channel proteins. Plant Mol. Biol. V. 24. P. 539-543.

48. Fu D., Libson A., Miercke L.J.W., Weitzman C., Nollert P., Krucinski J. and Stroud R.M. (2000) Structure of a glycerol conducting channel and the basis for its selectivity. Science. V. 290. P. 481-486.

49. Fujiyoshi Y., Mitsuoka K., de Groot B.L., Philippsen A., Grubmuller H., Agre P. and Engel A. (2002) Structure and function of water channels. Curr. Opin. Cell. Biol. V. 12. P. 509-515.

50. Gerbeau P., Giiclu J., Ripoche P. and Maurel C. (1999) Aquaporin Nt-TIPa can account for the high permeability of tobacco cell vacuolar membrane to small neutral solutes. Plant J. V. 18. P. 577-587.

51. Gerbeau P., Amodeo G., Henzler T., Santoni V., Ripoche P. and Maurel C. (2002) The water permeability of Arabidopsis plasma membrane is regulated by divalent cations and pH. Plant J. V.30. P. 71-81.

52. Grote K., Trzebiatovski P. and Kaldenhoff R. (1998) RNA levels of plasma membrane aquaporins in Arabidopsis thaliana. Protoplasma. V. 204. P. 139-144.

53. Guenter J.F. and Roberts D.M. (2000) Water-selective and multifunctional aquaporins from Lotus japonicus nodules. Planta. V. 210. P. 741-748.

54. Guerrero F.D. and Crossland L. (1993) Tissue-specific expression of a plant turgor-responsive gene with amino acid sequence homology to transport-facilitating proteins. Plant Mol. Biol. V.21.P. 929-935.

55. Guerrero F.D., Jones J.T. and Mullet J.T. (1990) Turgor responsive gene transcription and RNA levels increase rapidly when pea shoots are wilted. Sequence and expression of three inducible genes. Plant Mol. Biol. V. 15. P. 11-26.

56. Harvent P., Vlerick A., Fuks B., Wattiez R., Ruysschaert J.-M. and Homble F. (2000) Lentil seed aquaporins form a hetero-oligomer which is phosphorylated by a Mg -dependent and Ca2+-regulated kinase. J. Biochem. V. 352. P. 183-190.

57. Hazama A., Kozono D., Guggino W.B., Agre P. and Yasui M. (2002) Ion permeation of AQP6 water channel protein. Single-channel recordings after Hg 2+ activation. J. Biol. Chem. V277. P. 29224- 29230.

58. Van Heeswijk M.P.E. and van Os C.H. (1986) Osmotic water permeabilities of brush border and basolateral membrane vesicles from rat renal cortex and small intestine. J. Membr. Biol. V. 92. P.193-193.

59. Heitman J. and Agre P. (2000) A new face of the Rhesus antigen. Nat. Genet. V.26. P. 258259.

60. Heymann J.B. and Engel A. (2000) Structural clues in the sequences of the aquaporins. J. Mol. Biol. V. 295. P. 1039-1053.

61. Jauh G.Y., Fischer A.M., Grimes H.D., Ryan C.A. and Rogers J.C. (1998) Delta-tonoplast intrinsic protein defines unique plant vacuole functions. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 12995-12999.

62. Jauh G.Y., Phillips T.E. and Rogers J.C. (1999) Tonoplast intrinsic protein isoforms as markers for vacuolar functions. Plant Cell. V. 11. P. 1867-1882.

63. Javot H. and Maurel C. (2002) The role of aquaporins in root water uptake. Ann.Bot. V. 90. P. 301-313.

64. Javot H., Lauvergeat V., Santoni V., Martin-Laurent F., Giiclu J., Vinh J., Heyes J., Frank K.I., Schaffner A.R., Bouchez D. and Maurel C. (2003) Role of a single aquaporin isoform in root water uptake. Plant Cell. V. 15. P. 509-522.

65. Johanson U. and Gustavsson S. (2002) A new subfamily of major intrinsic proteins in plants. Mol. Biol. Evol. V. 19. P. 456-461.

66. Johansson I., Larsson С., Ek B. and Kjellbomm P. (1996) The major integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putative aquaporins and are phosphorylated in response to Ca2+ and apoplastic water potential. Plant Cell. V. 8. P. 1181-1191.

67. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M.J., Larsson C. and Kjellbomm P. (1998) Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell. V. 10. P. 451-459.

68. Johansson I., Karlsson M., Johanson U., Larsson C. and Kjellbom P. (2000) The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance. Biochim. Biophys. Acta. V. 1465. P. 324-342.

69. Joly R.J. (1989) Effects of sodium chloride on the hydraulic conductivity of soybean root systems. Plant. Physiol. V. 91. P. 1262-1265.

70. Jung J.S., Preston G.M., Smith B. L., Guggino W.B. and Agre P. (1994) Molecular structure of the water channels through aquaporin CHIP: the hourglass model. J. Biol. Chem. V. 269. P. 14648-14654.

71. Каравайко H.H., Земляченко Я.В., Селиванкина С.Ю. и Кулаева О.Н. (1995) Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, участвующего в активации транс-зеатином синтеза РНК in vitro. Физиология растений. Т. 42. С. 547-554.

72. Kaldenhoff R., Grote К., Zhu J.J. and Zimmerman U. (1998) Significance of plasmalemma aquaporins for water-transport in Arabidopsis thaliana. Plant J. V. 14. P. 121-128.

73. Karlsson M., Johansson I., Bush M., McCann M.C., Maurel C., Larsson C. and Kjellbom P. (2000) An abundant TIP expressed in mature highly vacuolated cells. Plant J. V. 21. P. 83-90.

74. Karlsson M., Fotiadis D., Sjovall S., Johansson I., Hedfalk K., Engel A. and Kjellbom P. (2003) Reconstitution of water channel function of an aquaporin overexpressed and purified from Pichiapastoris. FEBS Lett. V. 537. P. 68-72.

75. Kirch H.H., Vera-Estrellla R., Golldack D., Quigley F., Michlowski C.B., Barkla B.J.and Bohnert H.J. (2000) Expression of water channel proteins in Mesembryanthemum crystallinum. Plant Physiol. V. 123. P. 111-124.

76. Knepper M.A. and Inou T. (1997) Regulation of aquaporin -2 water channel trafficking by vasopressin. Curr. Opin. Cell. Biol. V. 9. P. 560-564.

77. Koefoed-Johnsen V. and Ussing H.H. (1953) The contributions of diffusion and flow to the passage of D2O through living membranes. Acta Physol. Scand. V. 28. P. 60-76.

78. Kong Y. and Ma J.( 2001) Dynamic mechanisms of the membrane water channel aquaporin-1 (AQP1). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 98. P. 14345-14349.

79. Macey R. I. (1984) Transport of water and urea in blood cells. Am. J. Physiol. V. 246. P. C195-C203.

80. Maeshima M. and Yoshida S. (1989) Purification and properties of vacuolar membrane proton-translocating inorganic pyrophosphatase from mung bean J. Biol. Chem. V. 264. P. 20068-20073.

81. Malz S. and Sauter M. (1999) Expression of two PIP genes in rapidly growing internodes of rice is not primarily controlled by meristem activity or cell expansion. Plant Mol. Biol. V. 40. P. 985-995.

82. Mariaux J.B., Bockel C., Salamini F. and Bartels D. (1998) Desiccation- and abscisic acid-responsive genes encoding major intrinsic proteins (MIPs) from the resurrection plant Craterostigmaplantagineum. Plant Mol. Biol. V. 38. P. 1089-1099.

83. Martinez-Ballesta M.D.C., Martinez V. and Carvajal M. (2000) Regulation of water channel activity in whole roots of melon plants grown under saline conditions. Aust. J. Plant Physiol. V. 27. P. 685-691.

84. Maurel C., Kado R.T., Guern J. and Chrispeels M.J. (1995) Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporin a-TIP. EMBO J. V. 14. P. 3028-3035.

85. Maurel C. (1997) Aquaporins and water permeability of plant membranes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 48. P. 399-429.

86. Maurel C., Tacnet F., Gu^lii J., Guern J. and Ripoche P. (1997) Purified vesicles of tobacco cell vacuolar and plasma membranes exhibit dramatically different water permeability and water channel activity. Plant Biol. V. 94. P. 7103-7108.

87. Morillon R. and Lassalles J.P. (1999) Osmotic water permeability of isolated vacuoles. Planta. V. 210. P. 80-84.

88. Morillon R., Catterou M., Sangwan R.S., Sangwan B.S. and Lassales J. -P. (2001) Brassinolide may control aquaporin activities in Arabidopsis thaliana. Planta. V. 212. P. 199204.

89. Morillon R. and Chrispeels M.J. (2001) The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmotic water permeability of leaf cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 98. P. 14138-14143.

90. Munns R. (1993). Physiological processes limiting plant growth in saline soils: Some dogmas and hypotheses. Plant Cell Environ. V. 16. P. 15-24.

91. MurataK., Mitsuoka K., Hirai T., Walz T., Agre P., Heymann J.B., Engel A. and Fijiyoshi Y. (2000) Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. V. 407. P. 599-605.

92. Nielsen S. and Agre P. (1995) The aquaporin family of water channels in kidney. Kidney Int. V. 48. P. 1057-1068.

93. Niemietz C.M. and Tyerman S.D. (1997) Characterization of water channels in wheat root membrane vesicles. Plant Physiol. V. 115. P. 561-567.

94. Niemietz C.M. and Tyerman S.D. (2002) New potent inhibitors of aquaporins: silver and gold compounds inhibit aquaporins of plant and human origin. FEBS Lett. V. 531. P. 443-447.

95. North G.B. and Nobel P.S. (2000) Heterogeneity in water availability alters cellular development and hydraulic conductivity along roots of a desert succulent. Ann.Bot. V. 85. P. 247-255.

96. Olbrich K., Rawicz W., Needman D. and Evans E. (2000) Water permeability and mechanical strength of polyunsaturated lipid bilayers. Biophys. J. V. 79. P. 321-327.

97. Otto B. and Kaldenhoff R. (2000) Cell-specific expression of the mercury-insensitive plasma membrane aquaporin NtAQPl from Nicotiana tabacum. Planta. V. 211. P. 167-172.

98. Park J.H. and Saier M.N. (1996) Phylogenetic characterization of the MIP family of transmembrane channel proteins. J. Membr. Biol. V. 153. P. 171-180.

99. Passioura J.B. and Tanner C.B. (1985) Oscillations in apparent hydraulic conductance of cotton plants. Australian J. Plant Physiol. V. 12. P. 455-461.

100. Passioura J.B. (1988) Water transport in and to roots. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 39. P. 245-265.

101. Preston G.M., Carroll T.P., Guggino W.B. and Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science. V. 256. P. 385-387.

102. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B. and Agre P. (1994) Membrane topology of aquaporin CHIP-analysis of functional epitope-scanning mutants by vectorial proteolysis. J. Biol. Chem. V. 269. P. 1668-1673.

103. Quigley F., Rosenberg J.M. Shahar-Hill Y. and Bonhert H.J. (2002). From genome to function: The Arabidopsis aquaporins. Genome Biol. V. 3. P. 1-17.

104. Radin J.W. and Mathews M.A. (1989) Water transport properties of cortical cells in roots of nitrogen- and phosphorus deficient cotton seedlings. Plant Physiol. V. 89. P. 264-268.

105. Ramahaleo T., Morillon R., Alexandre J. and Lassalles J.P. (1999) Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiol. V. 119. P. 885-896.

106. Ren G., Reddy V.S., Cheng A., Melnyk P. and Mitra A.K. (2001) Visualization of a water-selective pore by electron crystallography in vitreous ice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 98. P. 1398-1403.

107. Rivers R.L., Dean R.M., Chnady G., Hall J.E., Roberts D.M. and Zeidel M.L. (1997) Functional analysis of nodium 26, an aquaporin in soybean root nodule symbiosomes. J. Biol. Chem. V. 272. P. 16256-16261.

108. Robinson D.G., Haschke H.P., Hinz G., Hoh B., Maeshima M. and Marty F. (1996a) Immunological detection of tonoplast polypeptides in the plasma membrane of pea cotyledons. Planta. V. 198. P. 95-103.

109. Robinson D.G., Sieber H., Kammerloher W. and Schaffner A.R. (1996b) PIP1 aqaporins are concentrated in plasmalemmasomes of Arabidopsis thaliana mesosophyll. Plant Physiol. V. 111. P. 645-649.

110. Ruiter R.K., Vaneldik G.J., Vanherpen M.M.A., Schrauwen J.A.M. and Wullems G.J. (1997) Expression in anthers of two genes encoding Brassica oleracea transmembrane channel proteins. Plant Mol. Biol. V. 34. P. 163-168.

111. Rygol J., Zimmerman U. and Balling A. (1989) Water relations of individual leaf cells of Mesembryanthemum crystallinum plants grown at low and high salinity. J. Membr. Biol. V. 107. P. 203-212.

112. Sarda X., Tousch D., Ferrare K., Legrand E., Dupuis J.M., Casse F. and Lamaze T. (1997) Two TIP-like genes encoding aquaporins are expressed in sunflower guard cells. Plant J. V. 12. P.1103-1111.

113. Schaffner A.R. (1998) Aquaporin function, structure, and expression: are there more surprises to surface in water relations? Planta. V. 204. P. 131-139.

114. Scheuring S., Ringler P., Borgina M., Stahlberg H., Muller D.J., Agre P. and Engel A. (1999) High resolution AFM topographs of the Escherichia coli water channel aquaporin Z. EMBO J. V. 18. P. 4981-4987.

115. Shi L.B., Skach W.R. and Verkman A.S. (1994) Functional independence of monomeric CHIP28 water channels revealed by expression of wild type-mutant heterodimers. J. Biol. Chem. V. 269. P. 10417-10422.

116. Sidel V.W. and Solomon A.K. (1957) Entrance of water into human red cells under an osmotic pressure gradient. J. Gen. Physiol. V. 41. P. 243-257.

117. Siefritz F., Tyree M.T., Lovisolo C., Schubert A. and Kaldenhoff R. (2002). PIP1 plasma membrane aquaporins in tobacco: From cellular effects to function in plants. Plant Cell V. 14. P. 869-876.

118. Spencer R.H. and Rees D.C. (2002) The alpha-helix and the organization and gating of channels. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. V. 31. P. 207-233.

119. Steudle E. and Frensch J. (1996). Water transport in plants: Role of the apoplast. Plant Soil V. 187. P. 67-79.

120. Steudle E. and Peterson C.A. (1998) How does water get through roots? J. Exp. Bot. V. 49. P. 775-788.

121. Steudle E. (2000a) Water uptake by roots: an integration of views. Plant and Soil. V. 226. P. 45-56.

122. Steudle E. (2000b) Water uptake by roots: effects of water deficite. J. Exp. Bot. V. 51. P. 847875.

123. Steudle E. (2001) The cohesion-tension mechanism and the acquisition of water by plant roots. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 52. P. 847-875.

124. Suga S., Imagawa S. and Maeshima M. (2001) Specificity of the accumulation of mRNAs and proteins of the plasma membrane and tonoplast aquaporins in radish organs. Planta. V. 212. P. 294-304.

125. Sun T.-X., van Hoek A., Huang Y„ Bouley R., McLaughlin M. and Brown D. (2002) Aquaporin-2 localization in clatrin-coated pits: inhibition of endocytosis by dominantnegative dynamin. Am. J. Physiol. Renal Physiol. V. 282. P. F998-F1011.

126. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Андреев И.М., Свинов М.М., Бобылев Ю.С. и Сорокин Е.М. (2001) Осмотическая водная проницаемость вакуолярных и плазматических мембран, изолированных из корней кукурузы. Физиология растений. Т. 48. С. 341-348.

127. Thomas D., Bron P., Ranchy G., Duchesne L., Cavalier A., Rolland J.P., Raguenes-Nicol C., Hubert J.F., Haase W. and Delamarche C. (2002) Aquaglyceroporins, one channel for two molecules. Biochim. Biophys. Acta. V. 1555. P. 181-186.

128. Tournaire-Roux C., Sutka M., Javot H., Gout E., Gerbau P., Luu D.T., Bligny R. and Maurel C. (2003) Cytosolic pH regulates root water transport during anoxic strssthrough gating of aquaporins. Nature. V. 425. P. 393-397.

129. Tyerman S.D., Bohnert H.J., Maurel C., Steule E. and Smith J.A.C. (1999) Plant aquaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J. Exp. Bot. V. 50. P. 1055-1071.

130. Tyerman S.D., Niemietz C.M. and Bramley H. (2002) Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. V. 25. P. 173-194.

131. Vera-Estrella R., Barkla B.J., Bohnert H.J. and Pantoja O. (2004) Novel regulation of aquaporin during osmotic stress. Plant Physiol. V. 135. P. 2318-2329.

132. Verbavatz J.M., Brown D., Sabolic I., Valenti G., Ausiello D.A., Van Hoek A.N., Ma T. and Verkman A.S. (1993) Tetrameric assembly of CHIP28 water channels in liposomes and cell membranes: a freeze-fracture study. J. Cell Biol. V. 123. P. 605-618.

133. Verkman A.S. (1995) Optical metods to mesure membrane transport processes. J. Membr. Biol. V.148.P. 99-110.

134. Verkmann A.S., Van Hoek A.N. Ma T., Frigeri A., Skach W.R., Mitra A., Tamaropoo B.K. and Farinas A. (1996) Water transport across mammalian cell membranes. Am. J. Physiol. V 270. P. C12-C30.

135. Verkmann A.S. and Mitra A.K. (2000) Structure and function of aquaporin water channels. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. V. 278. P. F13-F28.

136. Veenholf L.M., Heuberger E.H.L.M. and Poolman B. (2002) Quanternary structure and function of transport proteins. Trends Biochem. Sci. V. 27. P. 242-249.

137. Walz T., Smith B.L., Zeidel M.L., Engel A. and Agre P. (1994) Biologically active two-dimensional crystals of aquaporin CHIP. J. Biol. Chem. V. 269. P. 1583-1586.

138. Wan X., Steudle E. and Hartung W. (2004) Gating of water channels (aquaporins) in cortical cells of young corn roots by mechanical stimuli (pressure pulses): effect of ABA and of HgCl2. J. Exp. Bot. V. 396. P. 411-422.

139. Weaver C.D., Shomer N.H., Louis C.F. and Roberts D.M. (1994) Nodulin 26, a nodule specific symbiosome membrane protein from soybean, is an ion channel. J. Biol. Chem. V. 268. P. 17858-17862.

140. Weig A., Deswarte C. and Chrispeels M.J. (1997) The Major Intrinsic Protein family of Arabidopsis has 23 members that form three distinct groups with functional aqiaporins in each group. Plant Physiol. V. 117. P. 1347-1357.

141. Weig A.R. and Eisenbarth D.A. (2000) Role of aquaporins during elongation growth of castor bean seedlings. Molecular Biology and Physioligy of Water and Solute Transport. Eds S. Hohmann and S. Nielsen. N.Y.: Kluwer/Plenum. P. 357-364.

142. Weig A.R. and Jakob C. (2000) Functional identification of the glycerol permease activity of Arabidopsis thaliana NLM1 and NLM2 proteins by heterologous expression in Sachharomyces cerevisiae. FEBS Lett. V.481. P. 293-298.

143. Winter K. (1973) CO2 Fixirungsreaktionen bei der Salzpflanze Mesembryanthemum crystallinum unter variirten Aussenbedingungen. Planta. V. 114. P. 75-85.

144. Yamada S., Katsuhara M., Kelly W.B., Michalowski C.B. and Bohnert H.J. (1995) A familiy of transcripts encoding water channels proteins: tissue-specific expression in the common ice plant. Plant Cell. V. 7. P. 1129-1142.

145. Yamada S., Komori T., Myers P.N., Kuwata S., Kubo T. and Imaseki H. (1997) Expression of plasma membrane water channel genes under water stress in Nicotiana excelsior. Plant Cell Physiol. V.38.P. 1226-1231.

146. Yamamoto Y.T., Taylor C.G., Acedo G.N., Cheng C.-L. and Concling M.A. (1991) Characterisation of c «--acting sequences regulating root-specific gene expression in tobacco. Plant Cell. V. 3. P. 371-382.

147. Yasui M., Hasama A., Kwon T.H., Nielsen S., Guggino Wm.B. and Agre P. (1999) Rapid gating and anion permeability of an intracellular aquaporin. Nature. V. 402. P. 184-187.

148. Ye Q., Wiera B. and Steudle E. (2004) A cohesion|tension mechanism explaines the gating of water channel (aquaporins) in Chara internodes by high concentration. J. Exp. Bot. V. 55. P. 449-461.

149. Zardoya R. and Villalba S. (2001) A Phylogenetic framework for the aquaporin family in eukaryotes. J. Mol. Evol. V. 52. P. 391-404.

150. Zeidel M.L., Ambudkar S.V., Smith B. L. and Agre P. (1992) Reconstitution of functional water channels in liposomes containing purified red cell CHIP28 protein. Biochemistry. V. 25. P. 7436-7440.

151. Zeidel M.L., Nielsen S., Smith B. L., Maunsbach A.B. and Agre P. (1994) Ultrastructure, pharmacologic inhibition, and transport selectivity of aquaporin channel-forming integral protein in proteoliposomes. Biochemistry. V. 33. P. 1606-1615.

152. Zhang W.H. and Tyerman S.D. (1999) Inhibition of water channels by HgCh in intact wheat root cells. Plant Physiol. V. 120. P. 849-857.

153. Выражаю искренную глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук М.С. Трофимовой за неоценимую поддержку, участие и руководство работой.

154. Приношу большую благодарность О.И. Клычникову за помощь в освоении метода вестерн-блот анализа.

155. Приношу искренную благодарность В.П. Холодовой за поддержку в выполнении работы.

156. Выражаю искренную глубокую признательность И.Е. Мошкову и Г.В. Новиковой за интерес к работе, советы и помощь при проведении иммунодетекции аквапоринов.