Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Редокс-регуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы растительных клеток
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации по теме "Редокс-регуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы растительных клеток"
На правах рукописи
□озовз юз Ампилогова Янина Николаевна
Редокс-регуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы растительных клеток
03 00 12 - Физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 з МАЙ 2007
Москва 2007
003063103
Работа выполнена в Лаборатории мембран растительных клеток Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН, г Москва
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Трофимова Марина Сергеевна
Официальные оппоненты
доктор биологических наук
доктор биологических наук, профессор
Новикова Галина Викторовна
Бабаков Алексей Владимирович
Ведущее учреждение:
Кафедра биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета им М В Ломоносова
Защита диссертации состоится « 29 » мая 2007 г в 11 часов на заседании диссертационного совета К 002 210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, г Москва, Ботаническая ул, 35 Факс (495) 977 80 18, электронная почта т-агагкопсЬгйшргаа щ. 1А-@фг>га5 ги
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН
Автореферат разослан « Л » апреля 2007г
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат биологических наук
МИ Азаркович
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Исследование водного обмена в растениях привело к формированию композитной модели транспорта воды по тканям растения, в основу которой положено существование двух путей ее переноса, различающихся сопротивлением потоку (Steudle, 1994) Первый - внеклеточный, или апопластный, по которому поглощенная корнем вода диффундирует по межклетникам и клеточным стенкам, встречая на своем пути незначительное сопротивление Второй -межклеточный, включает перенос воды через мембраны и плазмодесмы живых клеток Трансмембранный путь, по сравнению с другими, характеризуется высоким сопротивлением водному потоку Основной его характеристикой является величина осмотической водной проницаемости мембран Она отражает интенсивность совокупного потока воды через лшшдный матрикс мембран и аквапорины - белки, функционирующие как водные каналы Присутствие в мембранах аквапоринов позволяет рассматривать трансмембранный путь как регулируемое русло транспорта воды в растении, роль и вклад которого в общий поток возрастает при изменении условий окружающей среды (Steudle & Henzler, 1995, Maurel, 1997)
Молекулярная организация аквапоринов допускает множество способов регулирования их активности Получен ряд доказательств в пользу того, что фосфорилирование является универсальным механизмом регуляции большинства аквапоринов растений (Maurel et al, 1995, Johansson et al, 1998, Guenther et al, 2003) Показано также, что существуют другие возможности посирансляционной модификации этих белков через их метилирование, гликозилирование, протонирование и формирование гетероолигомеров (Verkman and Mitra, 2000, Luu and Maurel, 2005) В последнее время заметен интерес к выяснению роли цистеиновых остатков в аквапоринах Причиной такого внимания является эффективное ингибирование аквапорин-опосредованной водной проницаемости мембран соединениями ртути и серебра (Niemietz and Tyerman, 2002), а также данные анализа структуры тетрамера аквапорина SoPIP2,l, согласно которым аквапорины Р1Р-типа содержат 2 пары высококонсервативных цистеинов, локализованных в различных участках петель А и С (Kukulski et al, 2005) Высокая консервативность этих остатков позволила предположить их регуляторную функцию Поскольку цистеин обладает редокс-акгивностыо (Gilles et al, 2003, Hancock et al, 2006), можно полагать, что редокс-состояние SH-rpyim в аквапоринах контролируется клеткой, и изменение концентрации эндогенных редокс-регуляторов в цитозоле или апопласте влияет на активность аквапоринов в плазмалемме Такая возможность экспериментально не проверялась Необходимым этапом в исследовании механизмов регулирования
осмотической водной проницаемости является выяснение того, обладают ли аквапорины чувствительностью к изменениям редокс-условий среды Плазматическая мембрана, которая находится на границе раздела сред с высоким и низким восстановительным потенциалом, может быть сенсором изменений этого параметра как в апопласте, так и в цитозоле Таким образом, многие цистеин-содержащие белки, в том числе аквапорины, могут быть мишенями для эндогенных систем редокс-регуляции
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось выяснение роли дитиол-дисульфидных переходов в мембранных белках, в том числе аквапоринах, в регулировании осмотической водной проницаемости плазмалеммы Были поставлены следующие задачи
1 Из корней и побегов 7-дневных проростков гороха, выращенных в темноте или на свету в оптимальных условиях или подвергнутых кратковременному охлаждению, выделить плазматические мембраны с измененным балансом окисленных и восстановленных тиоловых групп
2 Сравнить осмотическую водную проницаемость этих мембран путем измерения кинетики осмотического сжатия везикул с применением метода остановленного потока
3 Определить методом вестерн-блот анализа содержание аквапоринов Р1Р-типа в препаратах получаемых мембран
4 Исследовать влияние низкой положительной температуры на фазовое состояние липидного матрикса плазмалеммы на основе оценки анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена
5 Провести сравнительное определение содержания тиоловых групп в мембранных препаратах при помощи флуоресцентного красителя монобромо бимана
6 Проанализировать возможность активации НАДФН-оксидазной системы плазмалеммы при действии низкой положительной температуры на проростки
7 Оценить влияние ингибиторов протеиновых фосфатаз сершг-треонинового и тирозинового типов на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы
Научная новизна. Исследована осмотическая водная проницаемость плазмалеммы, изолированной из корней и побегов проростков гороха, выращенных в оптимальных условиях и подвергнутых кратковременному охлаждению Проведена оценка количества тиоловых групп мембранных белков и содержания аквапоринов Р1Р-типа в получаемых препаратах мембран С применением модификаторов редокс-состояния БН-групп, обнаружено, что осмотическая водная проницаемость плазмалеммы корней гороха чувствительна к изменению редокс-условий среды введение окислителей
тиоловых 1ругш приводит к ее увеличению, а восстановителей - к уменьшению Эти эффекты не обусловлены изменением баланса между мономерной и олигомерной формами аквапоринов, а скорее всего, связаны с обратимым внутримолекулярным образованием дисульфидной связи между парой цистеинов, локализованных на обращенной в апопласт петле С У проростков, подвергнутых охлаждению, установлен более высокий, по сравнению с контролем, уровень осмотической водной проницаемости Такой же высокий уровень проводимости мог быть достигнут при помощи ингибиторов тирознновых фосфатаз Показано, что выращивание проростков гороха на свету приводит к уменьшению содержания аквапоринов РТР-типа в плазмалемме и внутриклеточных мембранах побегов Эти данные свидетельствуют о том, что одной из причин торможения роста в этих условиях, является снижение экспрессии генов РГР-аквапоринов
Теоретическая и практическая значимость работы Совокупность полученных в работе результатов указывает на существование различных путей регулирования осмотической водной проницаемости плазмалеммы при оптимальных и неблагоприятных условиях существования растений В первом случае способом регулирования этого параметра может быть изменение активности аквапоринов в результате изменения статуса БН-групп определенных цистеиновых остатков в их молекуле Во втором случае ее регуляция, возможно, связана с участием компонентов НАДФН-оксидазной системы, приводящей к продукции перекиси водорода, и ингибированию определенного типа протеинфосфатаз, что вероятно приводит к увеличению времени жизни фосфорилированного, т е активного состояния аквапоринов Полученные результаты найдут применение в дальнейших исследованиях молекулярных механизмов эндогенной регуляции трансмембранного транспорта воды и водного обмена в растениях Теоретические обобщения и экспериментальные данные работы могут быть использованы в вузовских курсах лекций для студентов биологических факультетов
Апробация работы Основные результаты были представлены на международной конференции "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия" (Вологда, 2005), на 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на конференции "Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии" (Ростов-на-Допу, 2006), на региональной конференции "Вторые чтения, посвященные памяти Ефремова СИ" (Орел, 2006), на институтских и лабораторных семинарах Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных
результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 112 страницах, включает 5 таблиц, 23 рисунка, библиография содержит 203 источника
Объект и методы исследования
В исследованиях использовали 7-дневные проростки гороха (Pisum sativum L ) сорта Орловчанин Горох выращивали на пластиковых решетках с отверстиями так, чтобы корни были погружены в водопроводную воду, в темноте (или при постоянном освещении) в камере при 25°С В некоторых экспериментах 6-дневные проростки гороха перемещали с 25°С на 8°С в последние 20 ч роста
Для получения микросомальных мембран растительный материал гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-HCl (рН 8 0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиотреитол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 0 6% поливинилпирролидон Микросомальные мембраны осаждали центрифугированием 30 мин при 100000 g Плазматические мембраны получали путем разделения микросомальных мембран б двухфазной полимерной системе (Larsson et al, 1994) В серии экспериментов микросомальные мембраны разделяли на фракции, обогащенные плазмалеммой, тонопластом и мембранами эндоплазматического ретикулума путем флотации в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (Sazuka et al, 2004)
В исследованиях действия редокс-модификаторов SH-rpyim дитиотреитол, трибутилфосфин или диамид вносили только в среду гомогенизации непосредственно перед выделением мембран Аналогичный прием использовали в экспериментах с применением ингибиторов протеин-фосфатаз - кантаридина и фениларсин оксида
Содержание белка определяли по Bradford (1976) с использованием 0 05%-ного (в/о) Тритона Х-100 для солюбилизации мембранных белков и БСА в качестве стандарта
Степень обогащения мембранных фракций устанавливали по активности специфических маркерных ферментов (Briskm et al, 1987)
Осмотическую водную проницаемость оценивали по величине константы скорости сжатия везикул плазмалеммы при генерации осмотического градиента В экспериментах регистрировали кинетику изменений светорассеяния (ААц5) суспензии после увеличения концентрации сахарозы в среде с 01 до 03 М Определение изменений АА515 проводили по методу остановленного потока как описано в работе Трофимовой с соавт (2001) На рисунках приведены характерные экспериментальные кривые, в таблицах - средние значения константы скорости, полученные на суспензиях мембран независимых выделений
Электрофоретическое разделение мембранных белков проводили в 12 5 % ПАА-геле по методу Laemmh (1970) Белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Super («Amersham», Великобритания) по методу Towbin (1979) Мембрану блокировали в среде, содержащей PBST и 2%-е (в/о) сухое обезжиренное молоко, и далее ипкубировали с сывороткой, содержащей антитела против конъюгата БСА с пептидом, соответствующим консервативной аминокислотной последовательности аквапоринов Р1Р-типа
(DYKEPPPAPLFEPGELSSWS) Для иммунодетекции аквапоринов в блотах использовали антикроличьи антитела, коньюгированные с пероксидазой («Promega», США), и 1-хлор-4-нафтол в качестве хромогена (Божко и др, 2004) Гели и блоты сканировали
Состояние липидного бислоя оценивали по величине стационарной анизотропии флуоресценции встроенного в мембраны липофильного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена как в работе Бобылева с соавт (1994)
Содержание SH-rpyim определяли по интенсивности флуоресценции связавшегося с ними красителя монобромобимана (Kosower et al, 1981) При расчетах содержания SH-групп в мембранах в качестве стандарта использовали восстановленный глутатион.
Активность супероксид-продуцирующих ферментов плазмалеммы определяли спектрофотометрическим методом по скорости восстановления нитросинего тетразолия до формазана в присутствии НАДФН в качестве субстрата (Gestelen et al, 1997) Супероксид-продуцирующие ферменты идентифицировали по молекулярной массе белков, окрашиваемых формазаном, в 7 5 % ПАА-геле как в работе Roet et al (2006)
Спектр фосфорилированных белков плазмалеммы выявляли после их элекгрофоретического разделения в 12 5% ПАА-геле с использованием набора для флуоресцентного окрашивания Pro-Q Diamond ("Molecular Probes", США)
Результаты и обсуждение
1. Осмотическая водная проницаемость плазмалеммы корней и побегов 7-дневных этиолированных проростков гороха
Сопоставление кинетических параметров трансмембранного переноса воды и относительного содержания аквапоринов в мембранных препаратах позволяет судить об активности аквапоринов и их роли в регуляции осмотической водной
проницаемости мембран растительных клеток в оптимальных и стрессовых условиях Приведенные ниже эксперименты были выполнены на плазматических мембранах, изолированных из побегов и корней 7-дневных этиолированных проростков гороха, выращенных при температуре 25 °С На рис 1 представлены кинетики изменения
0 03
I-
о с с
I-
с о
СГ Ф
0 02
<
0 01
О 1 2
Время,с
Рис 1 Кинетика изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы побегов (1) и корней (2) 7-дневных этиолированных проростков гороха
Сплошная линия - характерная экспериментальная кривая, пунктир - ее экспоненциальная аппроксимация
интенсивности светорассеяния везикул плазмалеммы, изолированной из побегов (кривая 1) и корней (кривая 2) в ответ на их осмотическое сжатие После аппроксимации этих кривых экспонентами были определены параметры наблюдаемых процессов Оказалось, что константа скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы побегов составляла в среднем 6 0 с"1, что в 2-2 5 раза превышает значения, полученные для плазмалеммы корней В основе существенного различия водной проницаемости мембран побегов и корней может лежать степень их обогащенности аквапоринами Однако результаты иммунодетекции аквапоринов в этих мембранах, представленные на рис 2, указывают на то, что по обогащенности аквапоринами плазмалемма побегов (дорожка 2) немного уступает плазмалемме корней (дорожка 1) Об этом свидетельствует уменьшение интенсивности окрашивания в области ~30 кД и ~56 кД, которые соответствуют мономерной и димерной формам аквапоринов растений PIPI- и Р1Р2-семейств
кД 67
Рис.2, Иммунодетекция Р(Р-аквапорчнов в 43 препаратах плазмалеммы корней (1) и побегов (2) 7-дневных этиолированных проростков гороха. Положение мономерной и димерной форм указано стрелками; на дорожку наносили но 15 мкг белка
20
При сопоставлении результатов иммунодетекции со скоростью осмотического сжатия везикул плазмалеммы побегов и корней можно предположить разную активность аквалоринов в этих мембранах. Выявление активности аквапоринов в клеточных мембранах может базироваться на чувствительности осмотической водной проницаемости мембран к действию соединений ртути и серебра (ЬИепнеи апс1 Туегтап, 2002). Как видно из рисунка 3, константа скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы побегов значительно (на 40-50%) уменьшалась под влиянием
1 2
контроль
AgN03
HgCI2
Рис. 3. Действие SH-реагеигов на константу скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы побегов (1) и корней (2) 7-дневньгх проростков гороха. Перед осмотическим сжатием суспензию везикул плазмалеммы (150 мкг белка/ мл) в среде со 100 мМ сахарозой предынкубировали в течение 5 мин в присутствии 25 мкМ HgCb или 20 мкМ AgNOi.
как одного, так и другого ингибитора, а константа скорости сжатия везикул плазмалеммы корней оставалась неизменной при тех же концентрациях ингибиторов По совокупности приведенных данных можно сделать вывод о том, что, несмотря на относительно небольшой пул аквапоринов, водный поток через плазмалемму побегов оказывается значительным, благодаря пребыванию всего этого пула или большей его части в активном состоянии Отсутствие ингибкрования осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней может быть показателем, с одной стороны, инактивации аквапоринов в условиях in vitro. с другой -нечувствительностью их к ионам ртути и серебра из-за недоступности их цистеинов для взаимодействия с этими реагентами
В плазмалемме корней и побегов оценивали содержание SH-групп с применением флуоресцентного красителя монобромобимана, флуоресценция которого индуцируется при связывании с сульфгидрильными группами В предварительных экспериментах исследовали кинетику связывания монобромобимана с восстановленным глутатионом, выбор которого в качестве стандарта был определен наличием в этом трипептиде единственной SH-группы Концентрационная зависимость связывания монобромобимана с восстановленным глутатионом использовалась для расчета количества мембранесвязанных SH-групп
Время, мин
Рис 4 Кинетика связывания монобромобимана с плазмалеммой корней (1) и побегов (2) 7-дневных этиолированных проростков гороха
Мембраны (50 мкг белка/мл), полученные при гомогенизации растительного материала в среде с дитиотреитолом, инкубировали в гипотоническом буфере с 0 1 М сахарозой в присутствии монобромобимана в конечной концентрации 50 мкМ
На рис 4 представлена кинетика связывания монобромобимана с плазмалеммой корней и побегов этиолированных проростков гороха При расчете количества SH-групп оно составило 120 и 60 нмоль/мг белка для плазмалеммы корней и побегов, соответственно Таким образом, низкая активность аквапоринов в препаратах плазмалеммы корней не может быть обусловлена окислением части SH-групп их цистеиновых остатков
2. Влияние редокс-модификаторов SH-групп на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы клеток корней этиолированных проростков
гороха
В настоящее время интенсивно исследуются обратимые переходы дитиол-дисульфид в белках, поскольку такой молекулярной перестройке отводится ведущая роль в системе регулирования активности белков и физиологических процессов (Hogg, 2003, Ghezzi et al, 2005) Поэтому в последующих экспериментах нами была предпринята попытка подтвердить возможность таких переходов в белках плазмалеммы и оценить их роль в трансмембранном транспорте воды Дальнейшие эксперименты были выполнены на плазматических мембранах, полученных в присутствии в среде гомогенизации окислителя SH-групп диамида и двух восстановителей -S-S-связей трибугилфосфина и дитиотреитола, последний использовался для получения контрольных мембран Оценка осмотической водной проницаемости данных мембран обнаружила, что константа скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы, полученной в присутствии диамида, увеличивалась по сравнению с контролем и составляла 7 с"1, в то время как эффект трибугилфосфина проявлялся в том, что осмотическое сжатие везикул плазмалеммы замедлялось, и константа скорости наблюдаемого процесса была равной 1 8 с"1 Сопоставляя эти данные с содержанием SH-групп мембран, снова была выявлена отрицательная корреляция (Табл 1) Таким образом, получено экспериментальное подтверждение, что плазмалемма адекватно реагирует на наличие в среде окислителя и восстановителя SH-групп, изменяя баланс между SH- и -S-S-связями
Поскольку PIP-аквапорины в мембране существуют в виде тетрамеров, мономеры которых взаимодействуют через дисульфидные мостики (Qi et al, 1995, Kukulski et al, 2005), можно полагать, что под влиянием диамида и трибутилфосфина в мембранах изменилось равновесие между количеством мономерной и олигомерной формами аквапоринов Для проверки этой возможности в денатурирующих условиях при наличии и отсутствии дитиотреитола в буфере для образца был проведен электрофоретический анализ (рис 5а) и последующая иммунодетекция аквапоринов в
Табл. 1. Влияние редокс-реагентов, введенных в среду гомогенизации при получении плазматических мембран из корней 7-дневных этиолированных проростков гороха, на осмотическую водную проницаемость и содержание тиоловых групп.
Концентрация редо кс-реагентов. мМ Содержание тиоловых групп, нмоль/мг белка Константа скорости осмотического сжатия везикул, с"1
Трибу тилфосфин, 2 210=56 1.8 ±0,2
Дитиотреитол, 5 120±25 2.6 ±0.4
Диамид, 3 28±5 7±1
мембранах, полученных с тр и бу г илфосф и но м (рис, 56, дорожки 1 и 2) к диамидом (рис. 56, дорожки 3 и 4). При денатурации мембранных белков перед их электрофоретическим разделением в отсутствие дитиотреитола интенсивность окрашивания полос, молекулярная масса которых соответствует мономерам (30 кД),
1 2 3 4 1 2 3 4
Рис 5. Электрофоретическое разделение (а) и иммунодетекция (б) аквапоринов Р1.Р-типа в плаэмалемме, полученной из корней 7-дневных этиолированных проростков гороха с введением в среду гомсгекимцни трггбутшгфссфетна (1,2) или тамила (3, 4). Электрофорез проводили в отсутствие (2, 4) или в присутствии (1, 3) 100 мМ дитиотреитола в ДДС-буфере для образца. Положение мономеркой и димерной форм указано стрелками; на дорожку наносили по 15 мкг белка
заметно слабее по сравнению с днмерной формой (56 кД) Картина была практически одинаковой в обоих препаратах мембран (рис 56, дорожки 2 и 4), т е олигомерная форма аквапоринов оказывалась доминирующей При включении дитиотреитола в денатурирующий буфер, судя по иммуноокрашиванию, доля олигомеров уменьшалась, а доля мономеров заметно возрастала Это наблюдалось с мембранами, изолированными как в присутствии диамида, так и трибутилфосфина (рис 56, дорожки 1 и 3) По нашему мнению, изменение соотношения мономер-димер стало результатом восстановления дитиотреитолом тех -S-S-связей, которые экспонировались при денатурации белка Это те связи, которые участвуют во взаимодействии между мономерами аквапоринов Вместе с тем, поскольку в нативных мембранах они были недоступны ни для диамида, ни для трибутилфосфина, можно полагать, что за более высокую осмотическую проводимость, обнаруженную в мембранах, обработанных диамидом, отвечают не эти -S-S-связи, а связи локализованные в другой зоне молекулы аквапорина (Kukulski et al, 2005)
Поскольку, согласно представленным результатам внесение в среду окислителя тиоловых групп приводит к увеличению, а восстановителей - к уменьшению осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней, можно предположить, что существует эндогенный механизм регулирования трансмембранной водной проводимости, работа которого обеспечивается редокс-переходом мембранных белков Изменения осмотической водной проницаемости при дитиол-дисульфидном переходе не связаны с олигомеризацией аквапоринов, а могут быть обусловлены, как мы полагаем, дитиол-дисульфидными переходами или в мономере аквапорина, или в соседних с ним белках плазмалеммы
3. Осмотическая водная проницаемость и содержание аквапоринов PIP-типа в плазмалемме побегов проростков гороха, выращенных при постоянном
освещении
В качестве воздействия, позволяющего изменить редокс-статус мембранных белков в условиях /я vivo, нами был выбран свет Сравнительный анализ мембран из 7-дневных этиолированных и зеленых проростков гороха показал, что содержание тиоловых групп в плазмалемме корней обоих вариантов не изменилось, а их содержание в плазмалемме зеленых побегов по сравнению с этиолированными уменьшилось в 2 раза Оценка констант осмотического сжатия везикул соответствующих плазматических мембран выявила, что выращивание проростков при постоянном освещении не отразилась на их осмотической водной проницаемости (Табл 2) Представленные данные можно объяснить тем, что в 7-дневных проростках метаболические процессы, происходящие в корнях, обеспечиваются за счет запасных
веществ семени, а не трофических потоков, идущих из фотосинтезирующих побегов Вследствие этого не наблюдается каких-либо изменений осмотической водной проницаемости плазмалеммы и редокс-статуса ее мембранных белков Однако выращивание проростков на свету, сопровождающееся уменьшением длины надземных органов в 2-3 раза, приводило к изменению редокс-статуса белков плазмалеммы побегов
Табл 2 Осмотическая водная проницаемость и содержание тиоловых групп в плазмалемме клеток побегов 7-дневных проростков гороха, выращенных в темноте или на свету
Режим выращивания Содержание тиоловых групп, нмоль/мг белка Константа скорости осмотического сжатия везикул, с-1
темнота 60±10 б 2±0 6
свет 30±5 6 1±0 9
Иммунодетекция аквапоринов Р1Р-типа показала, что их содержание выше в плазмалемме побегов этиолированных проростках по сравнению с зелеными Одной из причин разного содержания аквапоринов в плазмалемме может быть различие в интенсификации везикулярного мембранного транспорта этих белков в этиолированных и зеленых проростках Если это действительно так, то распределение аквапоринов между плазмалеммой и внутриклеточными мембранами должно быть разным в двух вариантах Поэтому для проверки данного предположения были получены мембранные фракции, обогащенные тонопластом (А), плазмалеммой (В), эндомембранами (С) Результаты иммунодетекции аквапоринов Р1Р-типа в этих мембранах представлены на рис 6 Видно, что аквапорины выявляются во всех фракциях, причем значения молекулярной массы несколько варьируют, что может указывать на присутствие в мембранах разных изоформ этих белков Наиболее обогащенной аквапоринами оказалась фракция В, которая также характеризуется самой высокой активностью ванадат-ингибируемой АТФазы - маркерного фермента плазмалеммы Однако избранный нами критерий для оценки везикулярного транспорта аквапоринов по изменению их распределения между плазмалеммой и внутриклеточными мембранами, указывает на то, что изменяется не соотношение, а общее содержание этих белков в мембранах
кД А В С М А В С М
_ ••«*» ~~~~ г--»
67 43
20 -
ч_. „_л. „_;
—у——V"-
1 2
Рис. 6. Иммунодетекция Р1Р-аквапоринов в мембранных фракциях из клеток побегов 7-дневных этиолированных (1) и дезтиолированных (2) проростков гороха Фракции, собранные после флотации микросомальных мембран (М) в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, обогащены тонопластом (А), плаз мал ем мой (В), мембранами эндоплазм атическ-ого ретикулума (С) На дорожку наносили 15 мкг белка
Таким образом, действие света на рост проростков, которое сопровождается уменьшением длины побегов, приводит к общему уменьшению содержания с нше знрова! пгых Р1Р-аквапоринов в плазмалемме и внутриклеточных мембранах надземных органов, что указывает на прямую связь ростовых процессов с экспрессией генов аквапоринов.
4. Влияние выращивания растений при низкой положительной температуре на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней гороха и содержание
Р1Р- аквапоринов
Следующим этапом исследования стало изучение возможности включения ЭИ-редокс-регуляции аквапорин-опое ре до ванной водной проводимости плазмалеммы корней проростков гороха в условиях низкой положительной температуры. Такой подход бьш обоснован тем, что в этих условиях высока вероятность ш-раничения транспорта воды через липндный матрикс плазмалеммы и столь же велика вероятность активации ее переноса через аквапорины С этой целью бьши получены плазматические мембраны из проростков гороха, которые перемещали с 25°С на 8°С в последние 20 ч роста.
Было установлено, что осмотическая водная проницаемость этих мембран увеличилась примерно в 1.6 раза по отношению к контролю (25°С), о чем свидетельствует константа скорости процесса сжатия везикул (Табл.З). Однако вестерн-блот анализ белков плазмалеммы того и другого варианта не выявил
Табл. 3. Осмотическая водная проницаемость и содержание тиоловых групп в плазыалемме клеток корней 7-дневньк проростков гороха, выращенных при 25"С или подвергнутых действию низкой положительной температуры (8°С) в течение последних 20 ч.
Режим вьфащивания Содержание тиодовых групп, нмоль/мг белка Константа скорости осмотического сжатия везикул, с'1
25° С 125 ±25 2.6 ±0.4
8"С 55 ±7 4.2±0.6
различий в содержании аквапоринов РФ-типа, о чем свидетельствует одинаковая интенсивность иммуноокрашиванкя полос, молекулярная масса которых соответствует их мономерной (- 30 кД) и димерной 56 кД) формам (рис. 7).
Рис. 7. Иммунодетекния РГР-аквашриное в плазмалемме, полученной из корней 7-дневны к этиолированных проростков гороха, выращенных при 25°С (2) или подвергнутых действию низкой положительной температуры (85С) в течение последних 20 ч (1).
Логично предположить, что увеличение осмотической водной проницаемости плазмалеммы из корней охлажденных проростков обусловлено изменением в составе мембранных липидов в сторону преобладания ненасыщенных жирных кислот. Поэтому дальнейшие эксперименты были выполнены с целью определения фазового состояния мембранных липидов. На рис. 8 представлена температурная зависимость анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена, встроенного в везикулы плазмалеммы из корней контрольных (кривая 1) и охлажденных (кривая 2) проростков . Видно, что на обеих кривых значения анизотропии плавно снижаются по шкале температур среды измерения. Такой характер изменений указывает на некоторое промежуточное фазовое состояние лшшдного бислоя, что является характерным для биологических мембран. Кроме того, можно видеть, что величина
£
о
в;
^ 020 О
о. ь о
«о
X 015 <
0,10
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Температура, °С
Рис 8 Температурная зависимость анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена, встроенного в плазмалемму, полученную из корней 7-дневкых этиолированных проростков гороха, выращенных при 25°С (1) или подвергнутых действию низкой положительной температуры (8°С) в течение последних 20 ч (2)
анизотропии, практически одинакова для обоих вариантов Таким образом, суточное пребывание проростков при низкой положительной температуре не вызвало изменений баланса липидов с насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами, а значит водная проницаемость лшшдного матрикса в обоих вариантах мембран осталась на том же уровне
При определении содержания 8Н-групп, доступных для связывания с монобромобиманом в плазмалемме, обнаружено их резкое уменьшение в «холодовом» варианте (см Табл 3) Снижение количества БН-групп в мембранах охлажденных проростков при увеличении осмотической водной проводимости косвенно указывает на то, что активация аквапоринов может быть сопряжена с образованием дополнительных -Б-Б-связей в их мономерах В связи с этим, можно было ожидать, что максимально полное восстановление мембранных вН-групп приведет к снижению осмотической водной проводимости до величин, соизмеримых с контрольным вариантом В предпринятых экспериментах из среды гомогенизации был исключен дитиотреитол, как достаточно мягкий протектор восстановленных БН-групп, и введен трибутилфосфин, обладающий мощной редокс-активностью Как оказалось, эта добавка практически не повлияла ни на содержание БН-групп в мембранах, ни на уровень их осмотической водной проводимости
Таким образом, не отрицая возможности регулирования этого параметра путем изменения редокс-состоятгия определенных цистеиновых остатков в молекуле аквапоринов, мы не получили подтверждения этому в условиях выращивания проростков при понижешгой температуре, что предполагает функционирование в этих условиях иного способа регулирования
5. НАДФН-оксидазная активность плазмалеммы
Одной из ранних ответных реакций растений на низкую температуру является генерация активных форм кислорода, в том числе перекиси водорода, которая в настоящее время рассматривается как вторичный посредник в трансдукции стрессовых сигналов (Mittler, 2002)
Показано, что локализованная в плазмалемме НАДФН-оксидазная система является одним из продуцентов супероксида и перекиси водорода, которая запускает МАПК-каскад, и, в конечном счете, активирует экспрессию генов белков, необходимых для адаптации к новым условиям Вместе с тем, в последнее время формируется гипотеза о существовании более короткого регуляторного пути с участием НАДФН-оксидазы, который может использоваться для оперативного реагирования на нарушения осмотического и ионного гомеостаза Согласно этой гипотезе, образующаяся в экстраклеточном пространстве с помощью НАДФН-оксидазы при участии сулероксиддисмутазы перекись водорода может окислять тиоловые группы цистеиновых остатков, находящихся в специфическом окружении в молекулах белков и вызывать инактивацию последних Круг таких белков достаточно ограничен и пока в полной мере не идентифицирован Установлено, что одной из мишеней для действия перекиси водорода являются протеинфосфатазы тирозинового типа, при инактивации которых их белки-субстраты сохраняют фосфорилированное состояние и функциональную активность в течение продолжительного времени (Gupta et al, 1998, 2002, Xu et al, 1998)
С целью проверки возможного участия НАДФН-оксидазной сигнальной системы в регуляции осмотической водной проницаемости мембран при низкой положительной температуре были проведены эксперименты по сопоставлению уровня НАДФН-оксидазной активности плазмалеммы, полученной из корней этиолированных проростков гороха, выращенных при 25°С (контроль) или подвергнутых действию низкой положительной температуры (8°С) в течение последних 1 5 или 20 ч Измерения показали, что независимо от температуры выращивания, мембраны всех вариантов обладают супероксид-продуцирующей активностью, причем в контрольном варианте и при кратковременном охлаждении
m
1
I
0
контроль ''о 8 С
20 ч 8°С
Рис. 9. НАДФН-оксидазная активность плазм алеммы, полученной из корней 7-дневньгх этиолированных проростков гороха, выращенных при 25°С (контроль) или подвергнутых действию низкой положительной температуры (8°С) в течение последних 1.5 или 20 ч.
(1.5 ч) ее уровень был примерно а три раза выше, чем в плазмалемме растений после 20-часового охлаждения (рис. 9). Высокую активность в контрольных растениях можно объяснить тем, что при получении мембран корни проростков отрезались и помещались в холодную среду гомогенизации. Возможно, что даже кратковременного воздействия низкой положительной температуры оказалось достаточно для активации НАДФН-оксидазной системы. Измерение осмотической водной проницаемости гошмалеммы проростков, подвергнутых кратковременному охлаждению (1.5 ч), показало, что она увеличивается по сравнению с контрольным вариантом. Эти результаты могут свидетельствовать в пользу тощ что в регулировании осмотической водной проницаемости ппазмалеммы корней при низкой положительной температуре принимает участие НАДФН-оксидазная система.
6. Роль дефосфорилирования в регуляции осмотической водной проницаемости
Известно, что активация PIP-аквапоршюв осуществляется фосфорилированием одного или двух сериновых остатков (Johnson and Chrispeels, 1992), а дефосфорилирование приводит к их инактивации.
пл азмал сммы
В проведенных нами экспериментах обнаружено, что при действии низкой положительной температуры на проростки гороха увеличивается осмотическая водная проницаемость и активируется НАДФН-оксидаза плазмалеммы корней, продуцирующая совместно с супероксиддисмутазой перекись Известно, что перекись водорода вызывает ингабирование тирозиновых протеинфосфатаз (РТР) и фосфатаз двойной специфичности (DsPTP) (Gupta and Luán, 2003), которые являются компонентами НАДФН-оксидазной системы регулирования Таким образом, ингибирование этих фосфатаз может привести к изменению водной проводимости мембраны в том случае, если аквапорины является их мишенями и поэтому сохраняют активность из-за невозможности их дефосфорилирования
Поэтому дальнейшие эксперименты были выполнены на плазматических мембранах, полученных из корней контрольных растений при введении в среду гомогенизации ингибиторов серин-треониновых фосфатаз - кантаридина и тирозиновых фосфатаз - фениларсин оксида
На рис 10 представлена кинетика сжатия везикул плазмалеммы, полученной в присутствии кантаридина (кривая 1) и фениларсин оксида (кривая 2) После аппроксимации этих кинетических зависимостей было обнаружено, что константа скорости сжатия везикул плазмалеммы, выделенной в присутствии фениларсин оксида, приблизительно в 3 раза превышала константу скорости сжатия
Время с
Рис 10 Кинетика изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы, полученных из корней 7-дневных этиолированных проростков гороха в присутствии в среде гомогенизации ингибитора серин-треониновых протеинфосфатаз кантаридина (1) или тирозиновых - фениларсин оксида (2) в конечной концентрации 20 и 100 мкМ, соответственно
везикул плазмалеммы, получешюй с кантаридином Эти данные указывают на возможное участие тирозиновых фосфатаз в процессах, приводящих к изменениям в осмотической водной проницаемости плазмалеммы
Заключение
Известно, что транспорт воды через растительные клетки и ткани может лимитироваться скоростью ее переноса через клеточные мембраны и их осмотическая водная проницаемость выступает фактором, ограничивающим скорость дальнего транспорта воды в растениях Модификация водной проницаемости мембран может лежать в основе механизма, обуславливающего поддержание потока воды при изменении движущих сил транспорта воды в растении в условиях стресса Из-за присутствия аквапоринов в клеточных мембранах их водная проницаемость может варьировать либо в результате активации таких белков, обусловленной открыванием/закрыванием гидрофильной поры, либо за счет изменения их содержания в мембране Такое поведение аквапоринов определяет, в основном, механизмы регулирования осмотической проницаемости мембран
В настоящее время интенсивно исследуются обратимые переходы дитиол-дисульфид в белках с ферментативной и иной функцией, поскольку редокс-регуляции отводится ведущая роль в системе механизмов регулирования физиологических процессов В настоящей работе исследована возможность таких переходов в плазмалемме и оценена их роль в трансмембранном транспорте воды Впервые показано, что плазмалемма обладает чувствительностью к изменению редокс-условий среды и адекватно реагирует на наличие в среде окислителя или восстановителя БН-групп, изменяя баланс дитиол-дисульфид Следствием изменения этого баланса является модификация осмотической водной проводимости - увеличение при возрастании количества -Б-Б-связей и, наоборот, снижение при увеличении количества -БН-групп Очевидно, что вклад аквапоринов Р1Р-типа в изменение количественных соотношений между этими группами может быть значительным, поскольку эти белки являются мажорными компонентами мембран Сама по себе способность плазмалеммы реагировать на изменение окислительно-восстановительных условий среды предполагает возможность участия эндогенных систем, таких как глутатион, тиоредоксин, протеин-дисульфидизомераза, в регулировании осмотической водной проницаемости путем изменения редокс-статуса БН-групп цистеинов в аквапоринах
В условиях окислительного стресса, индуцированного снижением температуры выращивания проростков, зарегистрировала активность систем генерации активных форм кислорода В этих же условиях наблюдалось возрастание осмотической водной
проницаемости плазмалеммы Эти результаты могут отражать ситуацию, которая возникает в устойчивых к действию низких температур растениях снижение проводимости апопластного пути транспорта воды в результате Н202-зависимой стимуляции суберинизации клеточной стенки, компенсируется увеличением проводимости трансмембранного пути транспорта воды Такое заключение согласуется с композитной моделью транспорта воды по тканям растений
Выводы
1 Плазмалемма побегов этиолированных проростков гороха обладает высокой осмотической водной проницаемостью по сравнению с плазмалеммой корней, но более низкой обогащенностью аквапоринами Р1Р-типа Это предполагает более высокий уровень активности аквапоринов в плазмалемме клеток побегов
2 Сопоставление констапт скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы корней и побегов с содержанием БН-групп мембранных белков выявило отрицательную корреляцию между этими параметрами, т е при высокой водной осмотической проницаемости баланс дитиол-дисульфид смещен в сторону окисленного состояния БН-групп
3 На препаратах плазмалеммы, полученных в присутствии редокс-реагентов в среде гомогенизации, обнаружено, что окислители тиоловых групп увеличивают, а восстановители - уменьшают ее осмотическую водную проницаемость
4 Изменения в осмотической водной проницаемости плазмалеммы при дитиол-дисульфидных переходах под влиянием БН-модификаторов не связаны с олигомеризацией аквапоринов Р1Р-типа
5 Ингибирование роста растяжением при выращивании проростков на свету сопровождается уменьшением содержания Р1Р-аквапоринов в плазмалемме и внутриклеточных мембранах побегов гороха Одной из причин этого может быть снижение активности экспрессии генов аквапоринов
6 Кратковременное воздействие низкой положительной температуры на проростки гороха приводит к увеличению осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней и уменьшению количества БН-групп в мембране, в то время как содержание аквапоринов Р1Р-типа остается на прежнем уровне
7 Увеличение осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней проростков гороха, подвергнутых кратковременному действию низкой положительной температуры, не сопровождается изменением фазового состояния липидного матрикса мембран
8 Исследовано влияние ингибиторов различных типов протеинфосфатаз на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней проростков гороха и установлено существенное повышение ее уровня под влиянием ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз фениларсин оксида
9 В неблагоприятных условиях регулирование осмотической водной проницаемости плазмалеммы клеток корней может быть опосредовано участием компонентов НАДФН-оксидазной системы как продуцента перекиси водорода и интбированием этим агентом тирозиновых протеинфосфатаз Это может способствовать сохранению аквапоринов в активном состоянии из-за невозможности их дефосфорилирования
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1 Божко КН, Ампилогова ЯН, Жесткова ИМ, Трофимова МС Водная проницаемость плазматических мембран, изолированных из корней, мезокотилей и колеоптилей проростков кукурузы, и содержание в них аквапоринов Международная научная конференция "Проблемы физиологии растений Севера" Петрозаводск, 2004, с 21
2 Ампилогова Я Н, Божко К Н Водная проницаемость плазмалеммы корней, мезокотилей и колеоптилей кукурузы и содержание в них аквапоринов XVII зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" Москва, 2005, с 85
3 Ампилогова Я Н, Жесткова И М, Трофимова М С Определение содержания тиоловых групп в плазматических мембранах корней и стеблей гороха при ингибировании их осмотической водной проницаемости Тезисы Годичного собрания ОФР России и Международной конференции "Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия" Вологда, 2005, с 8
4 Ампилогова Я Н, Жесткова И М, Трофимова М С Редокс-модуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы, изолированной из корней и стеблей проростков гороха Физиология растений 2006 Т 53 С 703 -710
5 Ампилогова Я Н Влияние низкой положительной температуры на осмотическую водную проницаемость и содержание аквапоринов в плазмалемме корней проростков гороха Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников Санкт-Петербург, 2006, с 128
6 Ампилогова ЯН Осмотическая водная проницаемость плазмалеммы корней гороха чувствительна к редокс-модуляции БН-групп мембранных белков
Региональная конференция "Вторые чтения, посвященные памяти Ефремова СИ" Орел, 2006, с 68-72 7 Ампилогова Я Н, Жесткова И М, Трофимова М С Редокс-модуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней этиолированных проростков гороха Тезисы Конференции "Физиология растений -фундаментальная основа современной фитобиотехнологии" Ростов-на-Дону, 2006, с 57
Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук Трофимовой Марине Сергеевне за поддержку, внимание и бесценную помощь, как в научной работе, так и в жизненных ситуациях
Автор выражает искреннюю признательность кандидату биологических наук Жестковой Инне Матвеевне за помощь в освоении методов исследования при выполнении работы и написании статей и тезисов Также приносит благодарности всему коллективу Лаборатории мембран растительных клеток за поддержку и дружеское отношение
Автор искренне благодарен доктору биологических наук Новиковой Галине Викторовне за проявленный интерес к работе, советы и предоставление набора для флуоресцентного окрашивания Pro-Q Diamond ("Molecular Probes", США) при выявлении фосфорилированных белков Также благодарен за всевозможную техническую помощь доктору биологических наук Мошкову Игорю Евгеньевичу
Подписано в печать 23 04 2007 г Исполнено 23 04 2007 г Печать трафаретная
Заказ № 429 Тираж 100 экз
Типография «11-й ФОРМАТ » ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 \vwvv autoreferat ги
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ампилогова, Янина Николаевна
Введение.
Цель работы.
Задачи.
Глава 1. Обзор литературы.
1. Осмотическая водная проницаемость биологических мембран.
1.1 Определение осмотической водной проницаемости мембран.
1.2 История открытия аквапоринов.
1.3 Оценка осмотической водной проницаемости мембран.
1.4 Осмотическая водная проницаемость липидного бислоя.
1.5 Структура аквапоринов.
1.6 Функции аквапоринов.
1.7 Номенклатура аквапоринов растений.
1.8 Регуляция осмотической водной проницаемости мембран.
2. Редокс-регуляция и окислительный стресс.
2.1 Окислительный стресс в растениях.
2.2 Оксидазная активность плазмалеммы и НАДФН-оксидаза.
2.3 Химия редокс-сигналинга-химия тиоловых групп цистеинов.ЗЗ
2.4 Аквапорины, как белки, содержащие цистеины, и ингибирова-ние их активности соединениями ртути.
2.5 Растения и низкотемпературный стресс.
Глава II. Материалы и методы исследования.
Глава III. Результаты и обсуждение.
1. Осмотическая водная проницаемость плазмалеммы корней и побегов 7-дневных этиолированных проростков гороха.
2. Влияние редокс-модификаторов SH-групп на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы клеток корней этиолированных проростков гороха.
3. Осмотическая водная проницаемость и содержание аквапоринов PIP-типа в плазмалемме побегов проростков гороха, выращенных при постоянном освещении.
4. Влияние выращивания растений при низкой положительной температуре на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней гороха и содержание PIP-аквапоринов.
5. НАДФН-оксидазная активность плазмалеммы.
6. Роль дефосфорилирования в регуляции осмотической водной проницаемости плазмалеммы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Редокс-регуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы растительных клеток"
Исследование водного обмена в растениях привело к формированию композитной модели транспорта воды по тканям растения, в основу которой положено существование двух путей ее переноса, различающихся сопротивлением потоку (Steudle, 1994). Первый - внеклеточный, или апопластный, по которому поглощенная корнем вода диффундирует по межклетникам и клеточным стенкам, встречая на своем пути незначительное сопротивление. Второй - межклеточный, включает перенос воды через мембраны и плазмодесмы живых клеток. Трансмембранный путь, по сравнению с другими, характеризуется высоким сопротивлением водному потоку. Основной его характеристикой является величина осмотической водной проницаемости мембран. Она отражает интенсивность совокупного потока воды через липидный матрикс мембран и аквапорины - белки, функционирующие как водные каналы. Присутствие в мембранах аквапоринов позволяет рассматривать трансмембранный путь как регулируемое русло транспорта воды в растении, роль и вклад которого в общий поток возрастает при изменении условий окружающей среды (Steudle & Henzler, 1995; Maurel, 1997).
Молекулярная организация аквапоринов допускает множество способов регулирования их активности. Получен ряд доказательств в пользу того, что фосфорилирование является универсальным механизмом регуляции большинства аквапоринов растений (Maurel et al., 1995; Johansson et al., 1998; Guenther et al., 2003). Показано также, что существуют другие возможности посттрансляционной модификации этих белков через их метилирование, гликозилирование, протонирование и формирование гетероолигомеров (Verkman and Mitra, 2000; Luu and Maurel, 2005). В последнее время заметен интерес к выяснению роли цистеиновых остатков в аквапоринах. Причиной такого внимания является эффективное ингибирование аквапорин-опосредованной водной проницаемости мембран соединениями ртути и серебра (Niemietz and Tyerman, 2002), а также данные анализа структуры тетрамера аквапорина SoPIP2;l, согласно которым аквапорины PIP-типа содержат 2 пары высококонсервативных цистеинов, локализованных в различных участках петель
А и С (Kukulski et at., 2005). Высокая консервативность этих остатков позволила предположить их регуляторную функцию. Поскольку цистеин обладает редокс-активностью (Gilles et al., 2003; Hancock et al., 2006), можно полагать, что редокс-состояние SH-групп в аквапоринах контролируется клеткой, и изменение концентрации эндогенных редокс-регуляторов в цитозоле или апопласте влияет на активность аквапоринов в плазмалемме. Такая возможность экспериментально не проверялась. Необходимым этапом в исследовании механизмов регулирования осмотической водной проницаемости является выяснение того, обладают ли аквапорины чувствительностью к изменениям редокс-условий среды. Плазматическая мембрана, которая находится на границе раздела сред с высоким и низким восстановительным потенциалом, может быть сенсором изменений этого параметра как в апопласте, так и в цитозоле. Таким образом, многие цистеин-содержащие белки, в том числе аквапорины, могут быть мишенями для эндогенных систем редокс-регуляции.
Цель работы
Основной целью исследования являлось выяснение роли дитиол-дисульфидных переходов в мембранных белках, в том числе аквапоринах, в регулировании осмотической водной проницаемости плазмалеммы.
Задачи
1) Из корней и побегов 7-дневных проростков гороха, выращенных в темноте или на свету в оптимальных условиях или подвергнутых кратковременному охлаждению, выделить плазматические мембраны с измененным балансом окисленных и восстановленных тиоловых групп.
2) Сравнить осмотическую водную проницаемость этих мембран путем измерения кинетики осмотического сжатия везикул с применением метода остановленного потока.
3) Определить методом вестерн-блот анализа содержание аквапоринов Р1Р-типа в препаратах получаемых мембран.
4) Исследовать влияние низкой положительной температуры на фазовое состояние липидного матрикса плазмалеммы на основе оценки анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена.
5) Провести сравнительное определение содержания тиоловых групп в мембранных препаратах при помощи флуоресцентного красителя монобромобимана.
6) Проанализировать возможность активации НАДФН-оксидазной системы плазмалеммы при действии низкой положительной температуры на проростки.
7) Оценить влияние ингибиторов протеиновых фосфатаз серин-треонинового и тирозинового типов на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы.
Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ампилогова, Янина Николаевна
Выводы
1.) Плазмалемма побегов этиолированных проростков гороха обладает высокой осмотической водной проницаемостью по сравнению с плазмалеммой корней, но более низкой обогащенностью аквапоринами PIP-типа. Это предполагает более высокий уровень активности аквапоринов в плазмалемме клеток побегов.
2.) Сопоставление констант скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы корней и побегов с содержанием SH-групп мембранных белков выявило отрицательную корреляцию между этими параметрами, т.е. при высокой водной осмотической проницаемости баланс дитиол-дисульфид смещен в сторону окисленного состояния SH-rpynn.
3.) На препаратах плазмалеммы, полученных в присутствии редокс-реагентов в среде гомогенизации, обнаружено, что окислители тиоловых групп увеличивают, а восстановители - уменьшают ее осмотическую водную проницаемость.
4.) Изменения в осмотической водной проницаемости плазмалеммы при дитиол-дисульфидных переходах под влиянием SH-модификаторов не связаны с олигомеризацией аквапоринов PIP-типа.
5.) Ингибирование роста растяжением при выращивании проростков на свету сопровождается уменьшением содержания PIP-аквапоринов в плазмалемме и внутриклеточных мембранах побегов гороха. Одной из причин этого может быть снижение активности экспрессии генов аквапоринов.
6.) Кратковременное воздействие низкой положительной температуры на проростки гороха приводит к увеличению осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней и уменьшению количества SH-групп в мембране, в то время как содержание аквапоринов PIP-типа остается на прежнем уровне.
7.) Увеличение осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней проростков гороха, подвергнутых 1фатковременному действию низкой положительной температуры, не сопровождается изменением фазового состояния липидного матрикса мембран.
8.) Исследовано влияние ингибиторов различных типов протеинфосфатаз на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней контрольных проростков и установлено существенное повышение ее уровня под влиянием фениларсин оксида - ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз.
9.) В неблагоприятных условиях регулирование осмотической водной проницаемости плазмалеммы клеток корней может быть опосредовано участием компонентов НАДФН-оксидазной системы как продуцента перекиси водорода и ингибированием этим агентом тирозиновых протеинфосфатаз. Это может способствовать сохранению аквапоринов в активном состоянии из-за невозможности их дефосфорилирования.
Заключение
Известно, что транспорт воды через растительные клетки и ткани может лимитироваться скоростью ее переноса через клеточные мембраны и их осмотическая водная проницаемость выступает фактором, ограничивающим скорость дальнего транспорта воды в растениях. Модификация водной проницаемости мембран может лежать в основе механизма, обуславливающего поддержание потока воды при изменении движущих сил транспорта воды в растении в условиях стресса. Из-за присутствия аквапоринов в клеточных мембранах их водная проницаемость может варьировать либо в результате активации таких белков, обусловленной открыванием/закрыванием гидрофильной поры, либо за счет изменения их содержания в мембране. Такое поведение аквапоринов определяет, в основном, механизмы регулирования осмотической проницаемости мембран.
В настоящее время интенсивно исследуются обратимые переходы дитиол-дисульфид в белках с ферментативной и иной функцией, поскольку редокс-регуляции отводится ведущая роль в системе механизмов регулирования физиологических процессов. В настоящей работе исследована возможность таких переходов в плазмалемме и оценена их роль в трансмембранном транспорте воды. Впервые показано, что плазмалемма обладает чувствительностью к изменению редокс-условий среды и адекватно реагирует на наличие в среде окислителя или восстановителя SH-групп, изменяя баланс дитиол-дисульфид. Следствием изменения этого баланса является модификация осмотической водной проводимости - увеличение при возрастании количества -S-S-связей и, наоборот, снижение при увеличении количества -SH-групп. Очевидно, что вклад аквапоринов PIP-типа в изменение количественных соотношений между этими группами может быть значительным, поскольку эти белки являются мажорными компонентами мембран. Сама по себе способность плазмалеммы реагировать на изменение окислительно-восстановительных условий среды предполагает возможность участия эндогенных систем, таких как глутатион, тиоредоксин, протеин-дисульфидизомераза, в регулировании осмотической водной проницаемости путем изменения редокс-статуса SH-ipynn цистеинов в аквапоринах.
В условиях окислительного стресса, индуцированного снижением температуры выращивания проростков, зарегистрирована активность систем генерации активных форм кислорода. В этих же условиях наблюдалось возрастание осмотической водной проницаемости плазмалеммы. Эти результаты могут отражать ситуацию, которая возникает в устойчивых к действию низких температур растениях: снижение проводимости апопластного пути транспорта воды в результате Н202-зависимой стимуляции суберинизации клеточной стенки, компенсируется увеличением проводимости трансмембранного пути транспорта воды. Такое заключение согласуется с композитной моделью транспорта воды по тканям растений.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ампилогова, Янина Николаевна, Москва
1. Бобылев Ю.С., Тимонина В.Н., Сорокин Е.М. (1992) Лабильность мембранной системы хлоропластов при адаптации растений к температуре. Физиология растений, 39, 541-551.
2. Божко К.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. (2004) Изменение содержания аквапоринов в клеточных мембранах Mesembryanthemum crystallinum при переходе с Сз-типа фотосинтеза на САМ. Физиология растений, 51,887-895.
3. Геннис Р. (1997) Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 624 с.
4. Нобел П. (1973) Физиология растительной клетки. М.: Мир, 288 с.
5. Сорокин Е.М., Трофимова М.С., Жесткова И.М. (2001) Рассеяние света везикулами в осмотических процессах. Вестник Нижегородского университета. Серия Биология, с.95-98.
6. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Андреев И.М., Свинов М.М., Бобылев Ю.С., Сорокин Е.М. (2001) Осмотическая водная проницаемость вакуолярных и плазматических мембран, изолированных из корней кукурузы. Физиология растений, 48,341-348.
7. Aduayom I., Denizeau F. And Jumarie С. (2005) Multiple effects of mercury on cell volume regulation, plasma membrane permeability, and thiol content in the human intestinal cell line Caco-2. Cell Biol. Toxicol., 21,163-179.
8. Allen R.G., Tresini M. (2000) Oxidative stress and gene regulation. Free Radic. Biol. Med., 28,463-499.
9. Amicucci E., Gaschler K., Ward J.M. (1999) NADPH oxidase genes from tomato (Lycopersicon esculentum) and Curly-leaf pondweed. Plant Biol., 1, 524-528.
10. Asada K., Takahashi M. (1987) Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. In: Photoinhibition, Kyle D.J., Osmond C.B., Arntzen C.J.(eds.) Elsevier: Amsterdam, pp. 227-287.
11. Azad A.K., Sawa Y., Ishikawa Т., Shibata H. (2004) Phosphorylation of plasma membrane aquaporin regulates temperature-dependent opening of tulip petals. Plant Cell Physiol., 45,608-617.
12. Ballatori N., Jacob R., Barrett C., Boyer J.L. (1988) Biliary catabolism of glutathione and differential reabsorption of its amino acid constituents. Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 254, G1-G7.
13. Ballatori N., Boyer J.L. (1996) Disruption of cell volume regulation by mercuric chloride is mediated by an increase in sodium permeability and inhibition of an osmolyte channel in skate hepatocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol., 140,404-410.
14. Barkla B.J., Vera-Estrella R., Kirch H.H., Bohnert H.J. (1999) Aquaporin localization how valid are the TIP and PIP labels? Trends Plant Sci., 4, 86-88.
15. Barnes D. M., Sykes D. В., Miller D. S. (1999). Multiple effects of mercuric chloride on hexose transport in Xenopus oocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1419,289-298.
16. Biela A., Grote K„ Otto В., Hoth S., Hedrich R., Kaldenhoff R. (1999) The Nieotiana tabacum plasma membrane aquaporin AfrAQPl is mercury-insensitive Mid permeable for glycerol. Plant J., 18,565-570.
17. Bienert G.P., Moller A.L.B., Kristiansen K.A., Schulz A., Moller M., Schjoerring J.K., Jahn T.P. (2007) Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J. Biol. Chem., 282,1183-1192.
18. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72,248-254.
19. Branco-Price C., Kawaguchi R., Ferreira R.B., Bailey-Serres J. (2005) Genome-wide analysis of transcript abundance and translation in Arabidopsis seedlings subjected to oxygen deprivation. Ann. Bot. (London), 96,647-660.
20. Bray E.A. (2002) Classification of genes differentially expressed during water-deficit stress in Arabidopsis thaliana: an analysis using microarray and differential expression data. Ann. Bot. (London), 89, 803-811.
21. Bray E.A. (2004) Genes commonly regulated by water-deficit stress in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot., 55,2331-2341.
22. Briskin D.P., Leonard R.T., Hodges Т.К. (1987) Isolation of the plasma membrane: membrane markers and general principles. Methods Enzymol., 148,542-558.
23. Brown D. (2003) The ins and outs of aquporin-2 trafficking. Am. J. Physiol., 284, F893-F901.
24. Burke-Wolin Т., Abate C.J., Wolin M.S., Gurtner G.H. (1991) Hydrogen peroxide-induced pulmonary vasodilation: role of guanosine 3',5-cyclic monophosphate. Am. J. Physiol., 261, L393-L398.
25. Cathcart M.K. (2004) Regulation of superoxide anion production by NADPH oxidase in monocytes/macrophages: contributions to atherosclerosis. Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol., 1,23-28.
26. Chaumont F., Barrieu F., Herman E.M., Chrispeels M.J. (1998) Characterization of a maize tonoplast aquaporin expressed in zones of cell division and elongation. Plant Physiol., 117,1143-1152.
27. Chaumont F., Barrieu F., Jung R., Chrispeels M.J. (2000) Plasma membrane intrinsic proteins from maize cluster in two sequence subgroups with differential aquaporin activity. Plant Physiol., 122,1025-1034.
28. Chaumont F., Barrieu F., Wojcik E., Chrispeels M.J., Jung R. (2001) Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize. Plant Physiol., 125, 1206-1215.
29. Chaumont F., Moshelion M., Danielst M.J. (2005) Regulation of plant aquaporin activity. Biol. Cell, 97,749-764.
30. Cheng A., van Hoek A.N., Yager M., Verkman A.S., Mitra A.K. (1997) Three-dimentional organization of a human water channel. Nature, 387,627-630.
31. Cooper G.J., Boron W.F. (1998) Effect of PCMBS on C02 permeability of Xenopus oocytes expressing aquaporin 1 or its C189S mutant. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 44, C1481-C1486.
32. Cooper G.J., Dixit R., Nasrallah J., Boron W.F. (2000) The permeability of MIPs to gases. In: Molecular Biology and Physiology of Water and Solute Transport, Hohmann S., Nielsen S. (eds.) New York: Plenum Publishers, pp. 275-282.
33. Dainty J. (1963) Water relations of plant cells. Adv.Bot.Res., 1,279-326.
34. Daniels M., Chaumont F., Mirkov E., Chrispeels M. (1996) Characterization of a vacuolar membrane aquaporin in Arabidopsis and identification of a unique mercury sensitivity site in aquaporins. Plant Cell, 8, 587-599.
35. Daniels M.J., Mirkov Т.Е., Chrispeels M.J. (1994) The plasma membrane of Arabidopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is a homologue of the tonoplast water channel protein TIP. Plant Physiol., 106, 1325-1333.
36. Davidson J.F., Schiestl R.H. (2001) Mitochondrial respiratory electron carriers are involved in oxidative stress during heat stress in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol, 21, 8483-8489.
37. Dean R.M., Rivers R.L., Zeidel M.L., Roberts D.M. (1999) Purification and functional reconstitution of soybean Nodulin 26. An aquaporin with water and glycerol transport properties. J. Boichem., 38,347-353.
38. Denker B.M., Smith B.L., Kuhajada F.P., Agre P. (1988) Identification, purification and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules. J. Biol. Chem., 263,15634-15642.
39. Desikan R., Reynolds A., Hancock J.T., Neill S.J. (1998) Harpin and hydrogen peroxide both initiate programmed cell death but have differential effects on defence gene expression in Arabidopsis suspension cultures. J. Biochem., 330,115-120.
40. Dordas C., Chrispeels M.J., Brown P.H. (2000) Permeability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from squash roots. Plant Physiol., 124,1349-1361.
41. Engel A., Fijiyoshi Y., Agre P. (2000) The importance of aquaporin water channel protein structures. EMBO J., 19, 800-806.
42. Eisenbarth D.A., Weig A.R. (2005) Dynamics of aquaporins and water relations during hypocotyl elongation in Ricinus communis L. seedlings. J. Exp. Bot., 56, 18311842.
43. Fialkow L., Chan C.K., Rotin D., Grinstein S., Downey G.P. (1994) Activation of the mitogen-activated protein kinase signalling pathway in neutrophils. J. Biol. Chem., 269,31234-31242.
44. Fleurat-Lessard P., Frangne N., Maeshima M., Ratajczak R., Bonnemain J.-L., Martinoia E. (1997) Increased Expression of Vacuolar Aquaporin and H+-ATPase Related to Motor Cell Function in Mimosa pudica L. Plant Physiol., 114, 827-834.
45. Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.H. et al. (2003) Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature, 27,442-446.
46. Forman H.J., Fukuto J.M., Torres M. (2004) Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 287,246-256.
47. Garcia-Morales P., Minami Y., Luong E., Klausner R.D., Samelson L.E. (1990) Tyrosine phosphorylation in T cells is regulated by phosphatase activity: studies with phenylarsine oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,9255-9259.
48. Gaspar M., Bousser A., Sissogff I., Roche O., Hoarau J., Mahe A. (2003) Cloning and characterization of ZmPIPl-5b, an aquaporin transporting water and urea. Plant Sci., 165,21-31.
49. Gerbeau P., Gttflti J., Ripoche P., Maurel C. (1999) Aquaporin Nt-TIPa can account for the high permeability of tobacco cell vacuolar membrane to small neutral solutes. Plant J., 18, 577-587.
50. Gerbeau P., Amodeo G., Henzer Т., Santoni V., Ripoche P., Maurel C. (2002) The water permeability of Arabidopsis plasma membrane is regulated by divalent cations andpH. Plant J., 30,71-81.
51. Gestelen P.V., Asard H., Caubergs R.J. (1997) Solubilization and separation of a plant plasma membrane NADPH-b2-synthase from other NAD(P)H oxidoreductases. Plant Physiol., 115,543-550.
52. Giles N.M., Watts A.B., Giles G.I., Fry F.H., Littlechild J.A., Jacob C. (2003) Metal and redox modulation of cysteine protein function. Chem. and Biol., 10,677-693.
53. Glinka Z., Reinhold L. (1972) Induced changes in permeability of plant cell membranes to water. Plant Pysiol., 49,602-606.
54. Goldman R., Ferber E., Zor U. (1992) Reactive oxygen species are involved in the activation of cellular phospholipase A2. FEBS Lett., 309,190-192.
55. Goldman R., Zor U. (1994) Activation of macrophage Ptdlns-PLC by phorbol ester and vanadate: involvement of reactive oxygen species and tyrosine phosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 334-338.
56. Gonen Т., Sliz P., Kistler J., Cheng Y., Walz T. (2004) Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature, 429,193-197.
57. Guenther J.F., Chanmanivone N., Galetovic M.P., Wallace S., Cobb J.A., Roberts D.A. (2003) Phosphorylation of Soybean Nodulin 26 on Serine 262 Enhances Water Permeability and Is Regulated Developmentally and by Osmotic Signals. Plant Cell, 15,981-991.
58. Gupta R., Huang Y., Kieber J., Luan S. (1998) Identification of a dual-specificity protein phosphatase that inactivates a MAP kinase from Arabidopsis. Plant J., 16, 581589.
59. Gupta R., Ting J.T.L., Sokolov L.N., Johnson S.A., Luan S. (2002) A Tumor Suppressor Homolog, AtPTENl, Is Essential for Pollen Development in Arabidopsis. Plant Cell, 14,2495-2507.
60. Gupta R., Luan S. (2003) Redox regulation of protein tyrosine phosphatases and MAP kinases in higher plants. Plant Physiol., 132,1149-1152.
61. Guyton K.Z., Lui Y., Gorospe M., Xu Q., Holbrook NJ. (1996) Activation of mitogen-activated protein kinase by H202. J. Biol. Chem., 271,4138-4142.
62. Hancock J.T., Desikan R., Neill S.J. (2001) Role of reactive oxygen species in cell signaling pathways. Biochem. Soc. Trans., 29,345-350.
63. Hancock J., Desikan R., Harrison J., Bright J., Hooley R., Neill S. (2006) Doing the unexpected: proteins involved in hydrogen peroxide perception. J. Exp. Bot., 57,17111718.
64. Harmon A. C., Gribskov M., Harper J. F. (2000) CDPKs—a kinase for every calcium signal? Trends Plant Sci., 5,154-159.
65. Harries W.E., Akhavan D., Miercke L.J., Khademi S., Stroud R.M. (2004) The channel architecture of aquaporin 0 at a 2.2 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101,14045-14050.
66. Hazama A., Kozono D., Guggino W.B., Agre P., Yasui M. (2002) Ion permeation of AQP6 water channel protein. Single channel recordings after Hg2+ activation. J. Biol. Chem., 277,29224-29230.
67. Henderson L.M., Chappell J.B., Jones O.T.G. (1988) Internal pH changes associated with the activity of the NADPH oxidase of human neutrophils. Further evidence for the presence ofaH+ conducting channel. Biochem. J., 251, 563-567.
68. Henzler Т., Steudle E. (2000) Transport and metabolic degradation of hydrogen peroxide in Chara coralline: model calculations and measurements with the pressure probe suggest transport ofH202 across water channels. J. Exp. Bot., 51,2053-2066.
69. Henzler Т., Ye Q., Steudle E. (2004) Oxidative gating of water channels (aquaporins) in Chara by hydroxyl radicals. Plant Cell Environ., 27,1184-1195.
70. Hicke L. (1999) Getting down with ubiquitin: turning off cell-surface receptors, transporters and channels. Trends Cell Biol., 9,107-112.
71. Hogg P.J. (2003) Disulfide bonds as switches for protein function. Trends Biochem. Sci., 28,210-214.
72. Jang J.Y., Kim D.G., Kim Y.O., Kim J.S., Kang H. (2004) An expression analysis of a gene family encoding plasma membrane aquaporins in response to abiotic stresses in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol., 54,713-725.
73. Jap B.K., Li H. (1995) Structure of osmoregulated H20 channel, AQP-CHIP, in projection at 3.5 A resolution. J. Mol. Biol., 251,413-420.
74. Johanson K.D., Chrispeels M.J. (1992) Tonoplast-bound protein kinase phosphorylates tonoplast intrinsic protein. Plant Physiol., 100,1787-1795.
75. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M.J., Larsson C., Kjellbom P. (1998) Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell, 10,451-459.
76. Johansson I., Karlsson M., Johanson U., Larsson C., Kjellbom P. (2000) The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance. Biochim. Biophys. Acta, 1465, 324-342.
77. Johanson U., Gustavsson S. (2002) A new subfamily of major intrinsic proteins in plants. Mol. Biol. Evol., 19,456-461.
78. Jones M.A., Raymond M.J., Yang Z., Smirnoff N. (2007) NADPH oxidase-dependent reactive oxygen species formation required for root hair growth depends on ROP GTPace. J. Exp. Bot., 1-10.
79. Jung J.S., Preston G.M., Smith B.L., Guggino W.B., Agre P. (1994) Mocecular structure of the water channel through aquaporin CHIP. The hourglass model. J. Biol. Chem.,269,14648-14654.
80. Kammerloher W., Fischer U., Piechottka G.P., SchSffiier A.R. (1994) Water channels in the plasma membrane cloned by immuno-selection from a mammalian expression system. Plant J., 6,187-199.
81. Katsuhara M., Akiyama Y., Koshio K., Shibasaka M., Kasamo K. (2002) Functional analysis of water channels in barley roots. Plant Cell Physiol., 43, 885-893.
82. Kawasaki S., Borchert C., Deyholos M., Wang H., Brazille S., Kawai K., Galbraith D., Bohnert H.J. (2001) Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice. Plant Cell, 13, 889-905.
83. Keller Т., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A., Lamb C. (1998) A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs. Plant Cell, 10,255-266.
84. Kirch H.-H., Vera-Estrella R., Golldack D., Quigley F., Michalowski С. В., Barkla B. J., Bobnert H. J. (2000) Expression of water channel proteins in Mesembryanthemum crystallinum. Plant Physiol., 123, 111-124.
85. Klok E.J., Wilson I.W., Wilson D., Chapman S.C., Ewing R.M., Somerville S.C., Peacock W J., Dolferus R, Dennis E.S. (2002) Expression profile analysis of the low-oxygen response in Arabidopsis root cultures. Plant Cell, 14,2481-2494.
86. Knight M. R., Campbell A. K., Smith S. M., Trewavas A. J. (1991) Transgenic plant Aequorin reports the effects of touch and cold shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature, 352, 524-526.
87. Knight H., Trewavas A. J., Knight M. R. (1996) Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell, 8,489-503.
88. Kosower N.S., Kosower E.M., Zipser Y., Faltin Z., Shomrat R. (1981) Dynamic changes of red cell membrane thiol groups followed by bimane fluorescent labeling. Biochim. Biophys. Acts., 640,748-759.
89. Kovtun Y., Wan-Ling C.,Tena G., Sheen J. (2000) Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,2940-2945.
90. Y.-M., Mackintosh C., Casida J. E. (1993) Protein phosphatase 2A and its 3H.cantharidin/[3H]endothall thioanhydride binding site: Inhibitor specificity of cantharidin and ATP analogues. Biochem. Pharmacol., 46,1435-1443.
91. W., Li M., Zhang W., Welti R., Wang X. (2004) The plasma membrane-bound phospholipase D8 enhances freezing tolerance in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnol., 22,427-433.
92. Maathuis F.J., Filatov V., Herzyk P., et al. (2003) Transcriptome analysis of root transporters reveals participation of multiple gene families in the response to cation stress. Plant J., 35,675-692.
93. Macey R.I. (1984) Transport of water and urea in red blood cells. Am. J. Physiol., 246, C195-C203.
94. Marinelli R.A., Tietz P.S., Pham L.D., Rueckert L., Agre P., LaRusso N.F. (1999) Secretin induces the apical insertion of aquaporin-1 water channels in rat cholangiocytes. Am. J. Physiol., 39, G280-G286.
95. Marguet D., Lenne P.-F., Rigneault H., He H.-T. (2006) Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO J., 25,3446-3457.
96. Maurel C., Reizer J., Schroeder J.I., Chrispeels M.J., Saier M.H. (1994) Functional characterization of the Escherichia coli glycerol facilitator, Glpf, in Xenopus oocytes. J. Biol. Chem., 269, 11869-11872.
97. Maurel C., Kado R.T., Guern J., Chrispeels M.J. (1995) Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporin alpha-TIP. EMBO J., 13, 30283035.
98. Maurel C. (1997) Aquaporins and water permeability of plant membranes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48,399-429.
99. Maurel C., Chrispeels MJ. (2001) Aquaporins. A Molecular Entry into Plant Water Relations. Plant Physiol., 125, 135-138.
100. Maurel C., Javot H., Lauvergeat V., Gerbeau P., Tournaire C., Santoni V., Heyes J. (2002) Molecular physiology of aquaporins in plants. Int. Rev. Cytol., 215, 105-148.
101. Minorsky P. V. (1989) Temperature sensing in plants: a review and a hypothesis. Plant Cell Environ., 12,119-135.
102. Minorsky P. V., Spanswick R. M. (1989) Electrophysiological evidence for a role for calcium in temperature sensing by roots of cucumber seedlings. Plant Cell Environ., 12,137-143.
103. Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci., 7,405-410.
104. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., van Breusegem F. (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci., 9,490-498.
105. Monroy A. F., Dhindsa R. S. (1995) Low temperature signal transduction—induction of genes of alfalfa by calcium at 25°C. Plant Cell, 7,321-331.
106. Monroy A. F., Sarhan F., Dhindsa R. S. (1993) Cold induced changes in freezing tolerance, protein phosphorylation and gene expression: evidence for a role of calcium. Plant Physiol, 102,1227-1235.
107. Moran L.K., Gutteridge J.M.C., Quinlan G.J. (2001) Thiols in cellular redox signaling and control. Curr. Med. Chem., 8,763-772.
108. Mori I.C., Schroeder J.I. (2004) Reactive oxygen species activation of plant Ca2+ channels: a signaling mechanism in polar growth, hormone transduction, stress signaling, and hypothetical mechanotransduction. Plant Physiol., 135,702-708.
109. Morillon R., Lassales J.P. (1999) Osmotic water permeability of isolated vacuoles. Planta, 210,80-84.
110. Morillon R., Lienard D., Chrispeels M.J., Lassales J.-P. (2001) Rapid movements of plants organs require solute-water co-transporters or contractile proteins. Plant Physiol., 127, 720-723.
111. Moshelion M., Becker D., Biela A., Uehlein N., Hedrich R., Otto В., Levi H., Moran N., KaldenhofFR. (2002) Plasma membrane aquaporins in the motor cells of Samanea saman: diurnal and circadian regulation. Plant Cell, 14, 727-739.
112. Moshelion M., Moran N., Chaumont F. (2004) Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplasts plasma membrane. Plant Physiol., 135,2301-2317.
113. Murata K., Mitsuoka K., Hirai Т., Walz Т., Agre P., Heymann J.B., Engel A., Fijiyoshi Y. (2000) Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature, 407,599-605.
114. Nakhoul N.L., Davis B.A., Romero M.F., Boron W.F. (1998) Effect of expressing the water channel aquaporin-1 on the C02 permeability of Xenopus oocytes. Am. J. Physiol., 43, C543-C548.
115. Nemeth-Cahalan K.L., Hall J.E. (2000) pH and calcium regulate the water permeability of aquaporin 0. J. Biol. Chem., 275, 6777-6782.
116. Nemeth-Cahalan K.L., Kalman K., Hall J.E. (2004) Moleculer basis of pH and Ca2+ regulation of aquaporin water permeability. J. Gen. Physiol., 123, 573-80.
117. Niemietz C.M., Tyerman S.D. (2000) Channel-mediated permeation of ammonia gas through peribacteroid membrane of soybean nodules. FEBS Lett., 465,110-114.
118. Niemietz C.M., Tyerman S.D. (2002) New potent inhibitors of aquaporins: silver and gold compounds inhibit aquaporins of plant and human origin. FEBS Lett., 531(3), 443-447.
119. Orvar B.L., Sangwan V., Omann F., Dhindsa R.S. (2000) Early steps in cold sensing by plant cell: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity. Plant J., 23, 785794.
120. Palmgren M. (1990) An H+-ATPase assay: proton pumping and ATPase activity determined simultaneously in the same sample. Plant Physiol., 94, 882-886.
121. Pei Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Kltisener В., Allen G.J., Grill E., Schroeder J.I. (2000) Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic signalling in guard cells. Nature, 406,731-734.
122. Prasad G.V.R., Coury L.A., Finn F., Zeidel M.L. (1998) Reconstituted aquaporin 1 water channels transport CO2 across membranes. J. Biol. Chem., 273,33123-33126.
123. Preston G.M., Carroll T.P., Guggino W.B., Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science, 256, 385387.
124. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B., Agre P. (1993) Mercury-sensitive residue at cysteine 189 in the CHIP28 water channel. J. Biol. Chem., 268,17-20.
125. Ramahaleo Т., Morillon R., Alexandre J., Lassalles J.-P. (1999) Osmotic Water Permeability of Isolated Protoplasts. Modifications during Development. Plant Physiol., 119, 885-896.
126. Rivers R.L., Dean R.M., Chnady G„ Hall J.E., Roberts D.M., Zeidel M.L. (1997) Functional analysis of nodulin 26, an aquaporin in soybean root nodule symbiosomes. J. Biol. Chem., 272,16256-16261.
127. Robinson D.G., Sieber H., Kammerloher W., Schaeffner A.R. (1996) PIP1 aquaporins are concentrated in plasmalemmasomes of Arabidopsis mesophyll. Plant Physiol., Ill, 645-649.
128. Ruelland E., Cantrel C., Gawer M., Kader J.-C., Zachowski A. (2002) Activation of Phospholipases С and D Is an Early Response to a Cold Exposure in Arabidopsis Suspension Cells. Plant Physiol., 130,999-1007.
129. Sagi M., Fluhr R. (2001) Superoxide production by plant homologues of the gp91phox NADPH oxidase. Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus infection. Plant Physiol., 126, 1281-1290.
130. Sagi M., Fluhr R. (2006) Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases. Plant Physiol., 141,336-340.
131. Schaf&er A.R. (1998) Aquaporin function, structure, and expression: are there more surprises to surface in water relations? Planta, 204,131-139.
132. Schnitzer J.E., Oh P. (1996) Aquaporin-1 in plasma membrane and caveolae provides mercury-sensitive water channels across lung endothelium. Am. J. Physiol., 270, H416-H422.
133. Schtttz K., Tyerman S.D. (1997) Water channels in Chara corallina. J. Exp. Bot., 48, 1511-1518.
134. Seki M., Narusaka M., Ishida J., et al. (2002) Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray. Plant J., 31,279-292.
135. Shi L.B., Skach W., Verkman A.S. (1994) Functional independence of monomeric СШР28 water channels revealed by expression of wild type-mutant heterodimers. J. Biol. Chem., 269,10417-10422.
136. Stadelmann E.J., Lee-Stadelmann O.Y. (1989) Passive permeability. Methods Enzymol, 174,246-266.
137. Steudle E.(1994) Water transport across roots. Plant and Soil, 167,79-90.
138. Suga S., Murai M., Kuwagata Т., Maeshima M. (2003) Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol., 44,277-286.
139. Suh Y.-A., Arnold R.S., Lassegue В.,Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A.B., Griendling K.K., Lambeth J.D. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl. Nature, 401, 79-82.
140. Sui H., Han B.G., Lee J.K., Walian P., Jap B.K. (2001) Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel. Nature, 414, 872-878.
141. Sullivan S.G., Chiu D.T., Errasfa M., Wang J.M., Qi J.S., Stern A. (1994) Effects of H202 on protein tyrosine phosphatase activity in HER14 cells. Free Radic. Biol. Med., 16,399-403.
142. Suzuki N., Mittler R. (2006) Reactive oxygen species and temperature stresses: A delicate balance between signaling and destruction. Physiol. Plant., 126,45-51.
143. Tornroth-Horsefield S., Wang Y., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorshid E., Neutze R., Kjellbom (2006) Structural mechanism of plant aquaporin gating. Nature, 439,688-694.
144. Torres M.A., Onouchi H., Hamada S., Machida C., Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. (1998) Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox). Plant J., 14, 365-370.
145. Torres M.A., Dangl J.L., Jones J.D.G. (2002) Arabidopsis gp91(phox) homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,517-522.
146. Towbin H., Staehelin J., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4350-4354.
147. Tournaire-Roux C., Sutka M., Javot H., Gout E., Gerbeau P., Luu D.-T., Bligny R., Maurel C. (2003) Cytosolic pH regulates root water transport during anoxic stress through gating of aquaporins. Nature, 425,393-397.
148. Tyerman S.D., Niemietz C.M., Bramley H. (2002) Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ., 25,173-194.
149. Ueda A., Kathiresan A., Inada M., Narita Y., Nakamura Т., Shi W., Takabe Т., Bennett J. (2004) Osmotic stress in barley regulates expression of a different set of genes than salt stress does. J. Exp. Bot., 55,2213-2218.
150. Uehlein N., Lovisolo C., Siefritz F., Kaldenhoff R. (2003) The tobacco aquaporin NtAQPl is a membrane C02 pore with physiological functions. Nature, 425,734-737.
151. Vera-Estella R., Barkla B.J., Bohnert H.J., Pantoja O. (2004) Novel Regulation of Aquaporins during Osmotic Stress. Plant Physiol., 135,2318-2329.
152. Verkman A.S. (1995) Optical methods to measure membrane transport processes. J. Membr. Biol., 148,99-110.
153. Verkman A.S. (2000) Water Permeability Measurement in Living Cell and Complex Tissues. J. Membr. Biol., 173,73-87.
154. Verkman A.S., Mitra A.K. (2000) Structure and function of aquaporin water channels. Am. J. Physiol. Renal Physiol., 278, F13-F28.
155. Verkman A.S. (2005) More than just water channels: unexpected cellular roles of aquaporins. J. Cell Sci., 118,3225-3232.
156. Vigh L., Los D. A., Murata N. (1993) The primary signal in biological perception of temperature: Pd-catalysed hydrogenation of membrane lipids stimulated the expression of the desA gene in Synechocystis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,9090-9094.
157. Walz Т., Турке D., Smith B.L., Agre P., Engel A. (1995) Projection map of aquaporin-1 determined by electron crystallography. Nature Struct. Biol., 2,730-732.
158. Wan X., Steudle E., Hartung W. (2004) Gating of water channels (aquaporins) in cortical cells of young corn roots by mechanical stimuli (pressure pulses): effect of ABA and of HgCl2. J. Exp. Bot., 396,411-422.
159. Wang X., Lib W., Lia M., Weltid R. (2006) Profiling lipid changes in plant response to low temperatures. Physiol. Plantarum, 126,90-96.
160. Wayne R., Tazawa M. (1990) Nature of the water channels in the internodal cells of Nitellopsis. J. Membr. Biol., 116,31-39.
161. Weaver C.D., Crombie В., Stacey G., Roberts D.M. (1991) Calcium-dependent phosphorylation of symbiosome membrane proteins from nitrogen-fixing soybean nodules. Plant Physiol., 95,222-227.
162. Weaver C.D., Roberts D.M. (1992). Determination of the site of phosphorylation of nodulin 26 by the calcium-dependent protein kinase from soybean nodules. J. Biochem., 31,8954-8959.
163. Weig A.R., Jakob C. (2000) Functional identification of the glycerol permease activity of Arabidopsis thaliana NLM1 and NLM2 proteins by heterologous expression in Sachharomyces cerevisiae. FEBS Lett., 481,293-298.
164. Wintour EM. (1997) Water channels and urea transporters. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 24,1-9.
165. Wu Y., Kwon K.-S., Rhee S.G. (1998) Probing cellular protein targets of H202 with fluorescein-conjugated iodoacetamide and antibodies to fluorescein. FEBS Lett., 440, 111-115.
166. Xu Q., Fu H.H., Gupta R., Luan S. (1998) Molecular characterization of a tyrosine-specific protein phosphatase encoded by a stress-responsive gene in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 849-857.
167. Yang B.X., Fukuda N., van Hoek A., Matthay M.A., Ma Т.Н., Verkman A.S. (2000) Carbon dioxid permeability of aquaporin-1 measured in erythrocytes and lung of aquaporin-1 null mice and in reconstituted proteoliposomes. J. Biol. Chem., 275, 2686-2692.
168. Yasui M., Hazama A., Kwon Т.Н., Nielsen S., Guggino W.B., Agre P. (1999) Rapid gating and anion permeability of an intracellular aquaporin. Nature, 402,184-87.
169. Ye Q., Wiera В., Steudle E. (2004) A cohesion/tension mechanism explains the gating of water channels in Chara internodes by high concentration. J. Exp. Bot., 55, 449461.
170. Ye Q., Muhr J., Steudle E. (2005) A cohesion/tension model for the gating of aquaporins allows estimation of water channel pore volumes in Chara. Plant Cell Environ., 28,525-535.
171. Ye Q., Steudle E. (2006) Oxidative gating of water channels (aquaporins) in corn roots. Plant Cell Environ., 29,459-470.
172. Zelenina M., Bondar A.A., Zelenin S., Aperia A. (2003) Nickel and extracellular acidification inhibit the water permeability of human aquaporin-3 in lung epithelial cell. J. Biol. Chem., 278,30037-30043.
173. Zelenina M., Tritto S., Bondar A.A., Zelenin S., Aperia A. (2004) Copper inhibits the water and glycerol permeability of aquaporin-3. J. Biol. Chem., 279, 51939-51943.
174. Zeuthen Т., Klaerke D.A. (1999) Transport of water and glycerol in aquaporin 3 is gated by H+. J. Biol. Chem., 274,21631-21636.
175. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук Трофимовой Марине Сергеевне за поддержку, внимание и бесценную помощь, как в научной работе, так и в жизненных ситуациях.
-
Ампилогова, Янина Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.12
- Локализация АТФ-азной активности, дыхание и ультраструктура клеток корней пшеницы при модификации ионной проницаемости плазмалеммы
- Транспорт ионов кальция через плазматическую мембрану из клеток колеоптилей кукурузы и пшеницы
- Ионный гомеостаз растительной клетки и механизмы его регуляции
- Светоиндуцированные электрические потенциалы фотосинтезирующих растительных клеток
- Везикулярный транспорт PIP-аквапоринов в растительной клетке при осмотическом стрессе
