Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы прорастающих семян

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы прорастающих семян"

На правах рукописи

Щ4 --

Шижнева Ирина Александровна

УЧАСТИЕ АКВАПОРИНОВ В ПОСТУПЛЕНИИ ВОДЫ В ОСЕВЫЕ ОРГАНЫ ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН

03 00 12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

ООЗ 16

003161768

Работа выполнена в лаборатории роста и развития им акад М X Чайлахяна Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН, г Москва

Научный руководитель

доктор биологических наук, академик РАЕН

Обручева Наталья Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Трофимова Марина Сергеевна

доктор биологических наук профессор

Веселовский Владимир Александрович

Ведущая организация:

Кафедра физиологии растений РГАУ - МСХА им К А Тимирязева

Защита диссертации состоится « 13 » ноября 2007 г в «13» часов на заседании Диссертационного совета К 002 210 01 при Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35 Факс (495) 9778018, e-mail ifr@ipprasru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Автореферат разослан 9 01/7 _2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

МИ Азаркович

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Открытие аквапоринов - мембранных белков, формирующих водные каналы в растениях, позволило по-новому взглянуть на регуляцию поступления воды в растительные организмы В частности, актуальным стало изучение роли аквапоринов в поступлении воды в семена при прорастании, когда семена из воздушно-сухого состояния очень быстро переходят в состояние высокой оводненно-сти и активного метаболизма, приводящее к инициации роста в осевых органах зародыша Вода играет пусковую роль в прорастании семян (Обручева, Антипова, 1997, ОЬгоисЬеуа, 1999), то есть при последовательном достижении уровней оводненности, пороговых для каждого из основных процессов метаболизма, происходит активация метаболизма и начинается подготовка к инициации роста, которая заключается в накоплении осмотиков и размягчении клеточной оболочки В результате этих процессов в клетки поступает дополнительное количество воды, накапливаемой в формирующихся вакуолях, и благодаря давлению воды на оболочки, начинается их растяжение Тем самым происходит инициация растяжения клеток, проявляющаяся в проклевыва-нии кончика корня через семенную кожуру Поскольку вода играет ведущую роль в прорастании, изучение механизмов ее поступления в растущие осевые органы зародыша семян и участие аквапоринов в нем является актуальной проблемой физиологии растений Перспективность такого направления исследований следует, в том числе, из ряда данных по корреляции ростовых процессов у растений с экспрессией генов аквапоринов плазмалеммы и тонопласта (Рпске, СЬаишот, 2007)

Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в идентификации аквапоринов плазмалеммы и тонопласта, а также в оценке их участия в поступлении воды в осевые органы при набухании и прорастании двух типов семян, контрастных по водному статусу

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Получить препараты микросомальных, плазматических и вакуолярных мембран из осевых органов семян кормовых бобов и конского каштана, отличающихся по водному статусу

2 Охарактеризовать белковый состав выделенных фракций мембран при помощи денатурирующего электрофореза, провести электронную микроскопию этих фракций и определить активность плазмалеммной Н+-АТФазы

3 Идентифицировать аквапорины во фракциях выделенных мембран при помощи вестерн-блот анализа с антителами против консервативных последовательностей аквапоринов плазмалеммы и тонопласта

4 Исследовать состав и уровень аквапоринов в мембранных препаратах, выделенных из осевых органов семян кормовых бобов и конского капггана

5 Оценить степень участия аквапоринов в поглощении воды осевыми органами семян кормовых бобов и конского каштана.

Научная новизна. Изучение участия аквапоринов в поступлении воды в прорастающие семена впервые проведено на осевых органах зародышей семян, для которых характерна инициация роста и прохождение его начальных этапов только за счет растяжения клеток Таким образом, роль аквапоринов была изучена на модели, типичной для прорастания, поскольку растяжение клеток является обязательным процессом для инициации роста у семян всех типов Новизна данной работы заключается также в том, что она была проведена на семенах, имеющих разный водный статус Семена кормовых бобов относятся к обычному (ортодоксальному) типу, то есть имеют в покое низкую влажность (8-10% на сырой вес) и интенсивно набухают в присутствии воды, причем первая фаза набухания представляет собой физическое набухапие, тестируемое по влажности убитых семян Второй объект - семена конского каштана -относятся к рекальцитрантному типу, а именно его осевые органы сохраняют вакуоли в коре и влажность 62-64% (немного выше физического набухания) в течение 4 месяцев Семена обоих типов прорастают при влажности 74% Таким образом, впервые был изучен состав аквапоринов плазмалеммы и тонопласта при разной динамике возрастания влажности в осевых органах в контрастных по водному статусу типах прорастающих семян Особое внимание обращено на то, что в период набухания и инициации роста у обоих типов семян поступление воды через мембраны тонопласта и плазмалеммы происходит только за счет диффузии, а водные капалы принимают участие в нем только после инициации роста, когда происходит интенсивное растяжение клеток

Теоретическая и практическая значимость работы. Сопоставление динамики поступления воды в осевые органы семян двух контрастных типов и идентификация в них аквапоринов плазмалеммы (PIP, plasma membrane intrinsic proteins) и тонопласта (TIP, tonoplast intrinsic proteins) позволили по-новому подойти к пониманию основных закономерностей водного режима прорастающих семян Аквапорины плазмалеммы и тонопласта сохраняются в осевых органах покоящихся семян, как бобов, так и каштана, независимо от отсутствия (бобы) или сохранепия вакуолей (каштан) Однако они принимают участие в поступлении воды только в растущих осевых органах, когда поток воды в клетки усиливается Тем самым найдено объяснение, почему рост органов или целого растепия коррелирует с синтезом аквапоринов Облегчая поток воды в растущие клетки, аквапорины поддерживают тургор и способствуют растяжению кле-

клеток, то есть быстрому росту органов Полученные результаты, демонстрирующие особенности водного статуса двух контрастных типов семян, могут быть использованы при разработке методов предпосевной обработки семян Кроме того, такие данные следует учитывать при подборе семян для интродукции растений Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных могут быть включены в разделы роста и водного режима в курсе физиологии растений на биологических факультетах университетов

Апробация работы Основные результаты были представлены на IV международной научной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на VI съезде Общества физиологов растений России "Современная физиология растений от молекул до экосистем" (Сыктывкар, 2007), а также на 7 международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущиио, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ Структура и объем работы Диссертация состоит из обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на ИЧстранипах машинописного текста, включает 6 таблиц, ^¿рисунков, библиография содержит -^источника, в том числе 9 6 на иностранных языках

Объекты и методы исследования

В качестве объекта исследования были выбраны семена двух видов растений кормовых бобов (Vicia faba minor L ) сорта Стрелецкие и конского каштана (Aesculus hippocaslanum L )

Для прохождения влажной холодной стратификации свежесобранные семена конского каштана помещали в ящики в сырой песок и хранили в темноте при 4°С Семена кормовых бобов хранили при комнатной температуре Семена обоих видов проращивали при оптимальном количестве воды в темноте при 27°С Во всех экспериментах регистрировали время наклевывания 50% семян из выборки

Влажность осевых органов определяли весовым методом и рассчитывали в % на сырой вес Влажность, соответствующую насыщению физического набухания, оценивали по уровню оводнснности осевых органов после нагревания в течение недели в термостате при 80°С

Влияние сулемы на поглощение воды изучали на осевых органах из семян кормовых бобов (0,750 мМ) и непокоящихся семян конского каштана (0,5 мМ) при их набухании, наклевывании и дальнейшем росте Осевые органы регулярно взвешива-

ли Контролем служили пробы из осевых органов, помещенных на воду После обработки сулемой проростки переносили в раствор 10 мМ дитиотреитола (ДТТ)

Мембраны выделяли из осевых органов семян кормовых бобов, в ходе набухания (6, 12, 16, 18 ч), а также из проклюнувшихся и растущих осевых органов (длина 1см) Мембраны го осевых органов семян конского каштана выделяли по мере выхода семян из глубокого покоя в течение холодной стратификации, а также из осевых органов, изолированных в те же сроки и выращиваемых до проклевывания in vitro в темноте при оптимальной температуре (27°С) и водоснабжении

Навеску (15 г) осевых органов семян бобов или каштана гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ ДТТ, 5 мМ фенилметилсульфонилфторид и 0,6 %-ный поливинилпирролидон Микросомальные мембраны осаждали центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин Для получения препаратов плазмалеммы и внутриклеточных мембран фракцию микросом разделяли с использованием водной двухфазной полимерной системы (Larsson, 1994)

Содержание белка определяли с бицинхониновым реагентом («Bicinchonmic acid protein assay kit», Sigma) В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин

АТФ-гидролазнуга активность Н^-АТФазы в мембранных препаратах микро-сом, плазмалеммы и тонопласта измеряли согласно Briskm с соавт (1987) Количество неорганического фосфата определяли как описано в работе (Carter, Karl, 1982) Загрязнение выделенных фракций тонопласта и плазмалеммы оценивали путем измерения АТФ-гидролизуюшей активности в присутствии ингибитора Н^АТФазы Р-типа -ортованадата натрия

Электронно-микроскопические исследования образцов мембран проводили на электронном микроскопе JEM - 100CXII (JEOL) при ускоряющем напряжении 80 кВ

Для световой микроскопии готовили продольные срезы осевых органов конского каштана на микротоме с вибрирующим лезвием HM 650V (Carl Zeiss), толщина срезов составляла 60 мкм Для выявления вакуолей срезы прижизненно окрашивали нейтральным красным, а для окраски па белок - бромфеноловым синим (Барыкина с соавт, 2004) Срезы просматривали в универсальном микроскопе Ахю Imager Dl с обьективами х16 или х40

Полипептидный состав белков микросом, плазмалеммы и тонопласта определяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДДС-Na) по методу Laemmli (1970) В работе использовали гели с линейным градиентом концентрации акриламида 10-20% На дорожки наносили али-квоты с равным содержанием белка Гели после окрашивания Кумасси R-250 скани-

ровали и анализировали с использованием программного обеспечения Molecular Analyst Software (Bio-Rad) или Phorem 1 D (Nonlinear Dynamics)

Аквапорины идентифицировали иммунохимически (Towbin et al, 1979) при помощи антител, полученных против синтетических полипептидов, последовательности которых соответствовали (1)19 аминокислотным остаткам, консервативным для N-концевых областей аквапоринов PIPI- и PIP2- подсемейств (Ампилогова с соавт, 2006), (2) 42 аминокислотным остаткам из N-концевой области PIPI,1 (Santom et al, 2003), (3) С-концевой области PIP2,2 (Santom et al, 2003), (4) 13 аминокислотным остаткам из С-концевого домена TIP2 (Gerbeau et al, 1999) Антитела против PEP 1,1, PIP2.2 и TIP2 были любезно предоставлены проф С Maurel (Высшая агрономическая школа, Франция, Монпелье) Антисыворотка против PIP1/2 была любезно предоставлена докт биол наук М С Трофимовой, зав лабораторией мембран растительных клеток ИФР РАН

Для исследования аквапоринов тонопласта Т1РЗ,1 использовали антисыворотку против синтетического полипептида, аминокислотная последовательность которого характерна только для аквапоринов тонопласта, специфичных для мембран белковых тел созревающих и сухих зрелых семян Для выбора полипептида были использованы аминокислотные последовательности аквапоринов, представленные на сайте http //mbclserver rutgers edu/CPGN/AquaponnWeb/Aquaponn group html Синтетический полипептид (18 аминокислотных остатков) - Thr-Asn-Asn-Met-Arg-Pro-Ser-Gly-Phe-His-Val-Ser-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Gly получен в Институте биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН Перед иммунизацией полипептид конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА) или коллоидным золотом (размер частиц 15 им) Конъюгирование с коллоидным золотом, а также выделение антисыворотки проведено доктором биологических наук JI А Дыкманом (Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН)

Для иммунологической идентификации аквапоринов, мы модифицировали условия солюбилизации и денатурации мембранных белков, а также состав буферов, используемых для приготовления гелей при проведении электрофореза в денатурирующих условиях

Так как аквапорины являются интегральными белками мембраны, они обладают высокой гидрофобностью и подвержены агрегации, которая наблюдается даже в буферах, содержащих ДДС-Na (Veenholf et al, 2002) Перед проведением электрофореза белки мембран солюбилизировали в буфере для образцов, который содержал 62,5 мМ Трис-HCl (pH 6,8), 2% ДДС-Na, 10%-ный глицерин, 100 мМ ДТТ, 4 М мочевину и 0,01%-ный бромфеноловый синий Белковый препарат денатурировали при комнатной температуре в течение 1 ч Для предотвращения агрегации белков в ходе

ДДС-Na электрофореза в концентрирующий и разделяющий гели была добавлена мочевина до конечной концентрации 4 М При иммунохимическом анализе аквапоринов подобранные условия позволили обнаруживать мономеры, димеры и мультимеры аквапоринов, что повысило качество и воспроизводимость результатов

Данные обработаны статистически с помощью программы Excel и представлены в виде среднего и его стандартной ошибки

Результаты

Поскольку физиологические процессы, подготавливающие начало прорастания, происходят именно в осевых органах, было исследовано возрастание влажности в них при набухании и прорастании Для начала рассмотрим данные, полученные на семенах кормовых бобов

На рис 1 показана кривая набухания осевых органов семян бобов, снятая с двухчасовым интервалом

ВС 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Пр 1-СМ Набухание, ч

Рис 1 Кривая набухания осевых органов из семян кормовых бобов вс - воздушно-сухие семена, пр - наклюнувшиеся семена, 1-см — осевые органы, выросшие до размера 1 см Стрелками обозначены сроки взятия проб Пунктирная линия показывает уровень насыщения физического набухания

По форме она соответствует типичным кривым набухания семян. Первый этап поступления волы (до 12 ч) пред став;! лет собой быстрое, так называемое "физическое" набухание за счет матричных сил, в результате которого влажность, быстро достигает 66%-иого уровня. В течение второго этапа наблюдается медленное, постепенное увеличение овсднснности по 73-74 %, благодаря формированию физиологического механизма поглощения вода. В это время накапливаются осмотически активные вещества, и происходит увеличение осмотического компартмента - вакуоли, что завершается наклепыванием семян (инициацией роста) при влажности осевых органов 7374%. На третьем этапе влажность растущих осевых органов продолжает увеличиваться го ходу прорастания вследствие дальнейшего накопления осмотически-активвш веществ и увеличения вакуоли. В растущих (1 -см) осевых органах влажность достигает 89%. На рис. 1 показаны сроки на кривой набухания, в которые были набраны большие навески (от 15 г) осевых органов ятш выделения мембран.

Чтобы оценить чистоту и гомогенность препаратов мембран, полученных разделением микросом н двухфазной полимерной системе, был проведен электронно-микроскопический анализ полученных фракций.

На рис. 2 показаны электронные микрофотографии препаратов фракций, полученных из проклюнувшихся осевых органов бобов.

Рис.2. Электронные микрофотографии мембранных фракций, полученных из проклюнувшихся осевых органов бобов. А - плазмалелта, Б — тонопласт.

На микрофотографиях видно, что фракция тгокшластных мембран (рис. 2Б) содержи!' собственно везикулы тонопласта, часть из них с включениями белка, а также большое количество "бывших белковых тел, в которых белок частично гидролизован, Фракция плазма леммы (рис, 2А) значительно чище и представлена везикулами округлой формы.

В качестве второго критерия, позволяющего судигь о разделении препаратов макросом на фракции плазмайеммы и тонопласта, использовали определение активности Н+-АТФазы. Установлено, что полученная верхняя фракция содержала в достаточной степени очищенную плаз мал™ му. Активность N а3 V Од-ингиблру с мой Н+-АТФазы почти во всех пробах фракции плазмалеммы была выше в несколько раз, чем во фракции тонопласта, что, наряду с электронной микроскопией, позволило считать разделение достаточно успешным.

Сравнение поли пептидно го состава белков плазмалеммы и тонопласта методом электрофореза к денатурирующих условиях показало, что по мере набухания семян бобов спектр полипептидов плазмалеммы менялся мало, но заметно отличался при наклевывании и начале роста. В тонопласте при набухании и даже при наклевывай и и существенных изменений не было, тогда как в растущих осевых органах уменьшалось общее число полипептидов и возрастала доля (шзкомолекулярных (10-15 кД) полипептидов (данные не представлены)

Для идентификации PIP использовали поликловальные антитела против синтетического пептида, консервативного у преде га виге лей PIP1- и PIP2- подсемейств (Амп и логова с соапт., 2006).

чаЕухание, ч

6 1:6 1Й ПР: 1 СМ

85*

Рис. 3. Вестерн-Олот анализ мембранных белков фракции плазмалеммы с штш-РЦ'1/2 антителами. ГГр - проклевы-вание; 1см - осевые органы кормовых бобов длиной 1 см. Полосы специфического взаимодействия отмечены К Мол. массы белкой указаны в кД.

Иммунологический анализ фракции плазмалеммы (рис 3) показал, что анти-PIP1/2 антитела специфически взаимодействуют с белками, имеющими мол массу 85, 64, 59, 44, 35 и 28 кД Полипептид 20 кД является, по-видимому, результатом протео-литической деградации первого трансмембранного домена (Barone et al, 1997) Можно предположить, что белки 28 и 35 кД соответствуют мономерам PIP1/2, тогда как 59- и 64- кД белки являются их димерами, а 85-кД - тримером Общее содержание ак-вапоринов плазмалеммы (сумма всех окрашенных полос) практически не менялось вплоть до начала роста после прорастания

Таким образом, в плазмалемме осевых органов кормовых бобов обнаружены ак-вапорины PIPI и PIP2, которые в препаратах выделенных мембран присутствовали в виде мономеров, димеров и тримеров В период до наклевывания резкого изменения содержания аквапорипов Р1Р1/2 не выявлено

При анализе тонопластной фракции использована антисыворотка на пептид из С-петли аквапоринов Т1РЗ,1, характерных для мембран белковых тел семян (Kirch et al, 2000) При вестерн-анализе обнаружено специфическое взаимодействие антител с полипептидами, мол массы которых соответствовали 49, 47, 26, 22 и 21 кД (рис 4А) Последние два относятся, как принято считать, к продуктам деградации Полипептид с мол массой 26 кД соответствует мономерной форме аквапорина Т1РЗ,1, а полипептиды 47 и 49 кД - его гомо- или гетеродимсрам Аквапорин ТГРЗД является маркером тонопласта белковых тел, образующихся из вакуолей при созревании семян На рис 4А видно, что в течение набухания содержание аквапоринов TIP3.1 не менялось, но затем, при инициации роста снижалось Известно, что в осевых органах кормовых бобов до проклсвывания корешка, происходит постепенное превращение белковых тел в небольшие вакуоли (Обручева с соавт, 1993), которые затем сливаются К моменту проклевывания площадь, занимаемая вакуолями в клетке, возрастала с 40 до 60% Поскольку содержание тонопластных аквапоринов TIP3.1 снижалось, синтеза этого аквапорина, по-видимому, не происходило Вероятно, в растягивающихся клетках синтезируются аквапорины других подсемейств, например, обнаруженные в кончиках растущих корней аквапорины подсемейства TIP1 (Ludevid et al, 1992)

В отсутствие антиТ1Р1 специфических антител, нам представлялось логичным проверить, присутствуют ли в тонопласте осевых органов бобов аквапорины TIP2, которые, подобно TIP1, характерны для вегетативно растущих органов В микросо-мальной и тонопластной фракциях из осевых органов бобов при помощи анти-Т1Р2 антител были обнаружены полипептиды с мол массами 52 и 49 кД, которые, вероятно, являются димерами аквапорина TIP2, и полипептиды с мол массами 28-33 кД -мономеры этого аквапорина (рис 4Б) Полипептиды с мол массами 23, 22, 21 кД могут быть результатом протсолитической деградации мономеров TIP2 Заметно, что

содержание аквагюринов Т1Р2 в юно масти ой фракции также несколько уменьшается к моменту проклеаывашш и начала роста (рис. 4Б), тогда как в микросомах изменения содержания Т1Р2 не наблюдалось.

' ©ЗЕОТЕ&стшя фрамжы

'Набухание: 12ч

Тшагшаетная фращкя

Рис. 4. Идентификация Т1РЗ;ЦА) и Т1Г2(Б) при помощи вестерн-бяот анализа белков микросомальчой и тоноплаепший фракции из осевых органов семян кормовых бобов; ир - проклевьшание, 1 см - осевые органы, длиной 1 см. Полосы специфического взаимодействия отмечены К. Молекулярные массы указаны в кД.

Таким образом, имму нохимически было показано присутствий акпатюринов PIPI п РТР2 в плач мал сим с tí атпшгарияОв ТТРЗ;1 и TIP2 в тонопласте осевых органов кормовых бобов, содержание которых дифференциально изменяется в период набухания, инициации роста и собственно роста растяжением.

Рассмотрим теперь донные но осевым органам конского каштана. Для прорастания рекальцитрантных семян конского каштана, так же как н для ортодоксальных семян кормовых бобов, необходимо повышение оводненности, но в гораздо меньшем диапазоне влажности 62 - 74% (рис. 5). У семян каштана уровень влажности 62 - 64% немного превышает уровень насыщения физического набухания. Дальнейшее поступление коды в осевые органы осуществляется вследствие гтакопления осмо-тически-актиииых веществ (Обручева, Антипода, 1999).

сз о О)

ш

о о.

л о

-О

н

о о

X

X га с СО

90 -I 80 70 6050 -40 -30 20 10 Н

-- ф « -4-»---

0 —I—I—I—I—I—I-1—I—1—I—I—I I I I—I—I—I—I—I

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Длительность холодной стратификации, нед

Рис 5 Кривая набухания осевых органов семян конского каштана Стрелками указаны сроки взятия проб 16-18 нед - непокоящиеся семена, инициация роста

Поступление воды в осевые органы находится в зависимости от вакуолизации их клеток, которая в случае конского каштана изучена недостаточно Для того чтобы выяснить, имеются ли в них вакуоли, было использовано прижизненное окрашивание нейтральным красным продольных срезов через осевые органы семян Как следует из рис 6, перед проклевыванием вакуоли интенсивно окрашены в красный цвет Такое окрашивание вакуолей очень четко видно в клетках коры как меристемы корня, так и гипокотиля Клетки эпидермиса и корневого чехлика не окрашены, тогда как в центральном цилиндре окраска очень слабая Эти данные указывают на наличие вакуолей в осевых органах каштана, что соответствует их высокой оводненности

Мы также использовали краситель бромфеноловый синий, который окрашивает белки Клетки коры окрашивались брофеноловым синим слабее, чем клетки центрального цилиндра, вероятно, из-за наличия вакуолей, поскольку пристенный слой цитоплазмы в вакуолизированных клетках тоньше В клетках были хорошо видны многочисленные неокрашенные крахмальные зерна, особенно в гшюхотилс, который является местом отложения запасного крахмала Белковых тел при использованном увеличении не обнаружено, что соответствует низкому содержанию общего белка в осевых органах каштана

Рис. 6, Продольный срез через корешок зародыша семени конского каштана. Окрашивание нейтральным красным. Коровые клетки меристемы корня - мщ корневой чехлик - кч центральный цилиндр - цц.

Следующим этапом работы стало изучение аквашринов плазмадвммы и тгоо-пласта в препаратах мембран, выделенных их семян каштана. При помощи антисыворотки к PIPI были идентифицирован],! поли пептиды с мол. массами 56- и 28 кД во фракциях микросом и плаз малом мы каштана (рис. 7). Подипеитид с мол. массой 56 кД, который Преобладал па б лотах, является дни ер ом 28 кД-поли пептида. На данном и последующих рисунках полипегттиды с мод. массами менее 23 кД, скорее всего, являются продуктами протсолиза (Barone et ai., 1997). У осевых органов йз семян, находящихся в покое (0 свежесобрапиые), в состоянии выхода из песо (8-13 нед.) и после выхода из покоя (16-18 нед. етратификотии) содержание аквапоринои PIPI не менялось. и было высоким (рис. 7).

При сравнении распределения аквапорипов из осевых органов семян, подвергнутых стратификации (рис. 7), а также из проклюнувшихся в оптимальных условиях оссных органон в-вдно, что их состав практически был одинаков. В .иикросо.иальной и плазмагтеммпой фракциях из проклюнувшихся осевых органов (рис. 7) содержание № пап ори нов 28 и 56 кД немного снижалось по мере выхода из покоя Сем я о, из которых эти осевые органы были извлечены (к 13 нед. стратификации). Г.ели осевые орга-

вы были извлечены из непокоящихся семя г г (16-18 пед.) и проросли в оптимальных условиях, в них при Инициации роста содержание акваиоршюв PIP I насколько возрастало.

Осевые органы из интактных семян Стратификация, нед.

Проклюнувшиеся in viiro осевые органы Стратификации, нед.

МщфОшмапьнай Плазма лемм ная Фракия фракция

20*

Микросом. Плаз ма лемм пая фракция фракция

Рис. 7. Идентификация акеапоринов плазмапеммы PIPJ в препаратах фракций микросом и пяазмаяеммы ш осевых органов конского каштана. Представлены данные для осевых органов из интактных семян, подвергнутых стратификации, а также для осевых органов, извлеченных из семян в те же сроки стратификации и проклюнувшихся in vitro в Оптимальных условиях. О - свежеопавшне семена; 8-13 нед. ~ выход семян из покоя; J6-/8 нед. - непокоящиеся семена. Мол. массы белков указаны вкД.

При помощи анти-Р1Р2 анти сыворотки в микросомгшьнои и плазмалеммной фракциях из осевых органов каштана были обнаружены полипешшш с мол. массами 57 и 29 кД (рис. 8). Акванорины с мол. массой 29 кД относятся к мономерам PIP2, а с мол. массой 57кД - к их ли мерам. Как в осевых органах из целых семян, подвергнутых стратификации, так и в извлеченных из них и проклюнувшихся осевых органах (рис. 8) аквапорины плазмалеммы PÍP2 сохраняются практически на одном уровне.

Осевые органы из инташыхсемян Проклюнувшиеся in vitro осезые органы

Рис. 8. Идентификация аквапорчнов алазмаяеммы P1F2 в препаратах фракций макросом и мазмалеммы из осевых органов конского каштана. Представлены данные для осевых органон из интактных семян, подвергнутых стратификации, а также для осевых органон, извлеченных из семян в те же сроки стратификации и проклюнувшихся m vitro в оптимальных условиях. О - свежеопавшие семена ; 8-J3 нед. — выход семян из покоя: !6-1S нед. — непокоящиеся семена, Мол. массы белков указаны вкД.

В тотюпласте хзшташ при использовании антисьпюргтси против Т1РЗ;1 были обнаружены полинептиды со следующими мол. массами: 52, 48, 34. 27 и 25 кД (рис. 9). Полипептнды с мол. массами 27 и 25 ЕсД являются мономерами аквапоринов TIP3; 1, а полипептиды с мол. массами 52 и 48 кД - их димерамя. Аквапорин TTP3J, который рассматривают обычно как маркер тонопласта белковых тел, присутствует на всем протяжении периода покоя и перехода к прорастанию. Содержание аквапо-ринов Т]РЗ; 1 в проклюнувшихся осевых органах каштана было исскомьш меньше (рис. 9), чем в осевых органах из целых семян в тс же сроки стратификации. Это особенно заметно на 8-ой и 13-ой нед стратификации. Такая закономерность обнаруживается в микросомальной фракции, и сохраняется в то но пласт ной фракции. Наибольшее количество аквапоринов TIP3 ; Í присутствует в осевых органах из си еж гопавших семяп и na 16-18 нед. стратификации, т. е, у вышедших из покоя семян.

Стратификация, нед. G 8 Ü з 13 16-18

Стратификация, нед

О 8 131Ë-1S О S 13 16-13

Микросом. Плазма лемм ная фракция фракция

Микросома льная фракция

Плазмалеммнзя фракция

Осевые-органы из иитактиыхсемян Проклюнувшиеся т 1'Иго осевые органы Стратификация, нед. Стратификация, нед

^••фосом. Тонопластнзя Микросомальнэя Тонопластн©}

фракция' франция фракция фракция

Рис. 9. Идентификации Т/Р 3;1 в препаратах фракций микросом и тонопласта из осевых органон »окского кяштпио при помощи антисыворотки пришив Т]РЗ;1 -пептида, конъюгированного с коллоидным золотом. Представлены данные для осевых органов из интактных семян, подвергнутых стратификации, а также для осевых органов, извлеченных из семян в те же сроки стратификации и проклюнувшихся иг 1'йго в оптимальных условиях, 0 - свежеопавшие семена; 8-13 нед. - выход семян из покоя; 16-18 нед. — непокоящиеся семена. Мол, массы белков указаны а кД.

Далее мм исследовали, присутствуют ия в осевых органах семян каштана аква-воривы тонопласта, Относящиеся к Т1Р2. Для этой цели использовали антисыворотку против аквапорина КС-ТГРа (Л'и-ОПапа шЬасшп) (ОегЬеап е! аЗ., 1999). В макросом аль-ной и тонопластлой фракциях из осевых органов конского каштана при помощи этой анти сыворотки были обнаружены полипептиды с мол. массами 101, 70,57, 48, 35 и 28 кД (рис. 10). Полипептиды, имеющие мол. массу 101 и 70 кД, могут быть чримерами аквапорина Т1Р2, полппептиды с массами 57 и 48 хД, вероятно, представляют собой димерьг, а 35 и 28 кД-полипептида - мономеры атемторипои Т1Р2 топопласта.

Осевые органы из интактных семян

Проклюнувшиеся /л vim осевые органы Стратификация, нед о S 13 16-18 о в 13 16-13

Стратификация, нед.

ОЙ 0 8 13 (6-18

щ

^

Микросом фракция

Тоноппастная фракция

Микросомальная фракция

Тоноппастная фракция

Рис. 10. Идентификация Т1Р2 в препаратах фракций макросом и тонапласта из осевых органов конского каштана. Представлены данные для осевых органов из ш-тактных семян., подвергнутых стратификации, а также для осевых органов, извлеченных из семян в те же сроки стратификации и проклюнувгиихся in vitro в оптимальных условиях. О - свежеопавшие семена; 8-13 нед. - выход семян из покоя; 16-18 - непокоящиеся семена, Мол. массы белков указаны в кД.

Таким образом, tí осевых органах ссмяи конского каштан а обнаружены акввпо-рипы плаз мал ем мы, относящиеся к семействам PIPI и PIP2, а также аквапорины rorro пласта TÍP3;J и TÍP2,

Участие акваиоршшв в поступление поды и осевые органь! семян кормо-

Чтобы оценить участие акватторинон в поступлении воды был использован общераспространенный к последние голы метод ингибироватшя поглощения воды соединениями ртути с последующим снятием этого эффекта восстановителем (см. Метода). Принцип метола заключается во взаимодействии ионов ртути с SH-группами цистеина 189, находящеюся в сужении норы водного канала (Preston ct al,, 1993). В результате этого взаимодействия меняется конформация аквапорина и нора закрывается; восстановление SH-групп тем или иным восстановителем приводит к открытию водного канала. Обратимость функционирования водного канала является тестом на

вых бобов и конского каштана

участие аквапорипов плазмалеммы и топопласта в поступлении воды (Magglo, Му, 1995) Тест был проверен в различных системах по измерению осмотической водной проницаемости в ооцитах (Батек й а1, 1996), гидравлической проводимости на везикулах мембран (МегшсГг, Туеппап, 1997) и на корнях различных растений (Ма^о, 1о1у, 1995, Вагго\УсЬ1ои§Ь е1 а1, 2000) Тест считается специфичным при соблюдении минимальной в растворе сулемы экспозиции и последующего отмывания корней (1ауо1, Маиге1, 2002)

При проведении теста на участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы обоих видов семяп было показано, что в проростках бобов (длиной 1 см) и конского каштана (длиной 1-2 и 3-5 см) сулема достоверно ингибировала поглощение воды через 30 мии (рис 11А, 12А), а последующая обработка восстановителем ДТТ приводила к снятию ингибирования. Следовательно, в осевых органах, растущих за счет растяжения клеток, поступление воды происходит при участии водных каналов Одпако в набухающих и наклюнувшихся семенах обоих видов такого эффекта не обнаружено (рис 11Б, 12Б) В случае бобов сулема слабо ингибировала поглощение воды, а ДТТ не снимал, а усиливал ингибирование (рис 11 Б) В осевых органах конского каштана наблюдалось замедленное действие сулемы, но обратимости эффекта не установлено (рис 12Б)

30 60 Время, мин Проростки длиной 1 см

30 60 90 Время, мин

Инициация роста

Рис 11 Действие сулемы (0,75 мМ) на поглощение воды проростками кормовых бобов Стрелкой обозначено время переноса из раствора Н&С1г (после ополаскивания) в 10 мМ ДТТ Количество поглощенной воды представлено (А) для 7 осевых органов и (Б) для 10 осевых органов

9 5 I О

А

Ат

Сулема

Вода £0

40 30 20

50

10 О

Б

Вода

Сулема

ДТТ

0 30 60 90 Время, мин Проростки длиной 2-5 см

0 50 70 100 130 Время, мин Инициация роста

Рис 12 Действие сулемы (0,5 мМ) на поглощение воды осевыми органами проростков конского каштана Стрелкой показан перенос из Н§С12 (после ополаскивания) в 10 мМ ДТТ Количество поглощенной воды представлено (А) для1 проростка, и (Б) для 5 осевых органов

Таким образом, показано участие аквапоринов плазмалеммы и тонопласта в поглощении воды только после инициации роста, то есть интенсивно растягивающимися клетками На предыдущих этапах, несмотря на присутствие аквапоринов, поступление воды, происходит, скорее всего, за счет ее диффузии через мембраны, без участия аквапоринов

В данной работе проведен анализ аквапоринов в осевых органах двух типов семян в период покоя (конский каштан), набухания (кормовые бобы), инициации роста (оба вида семян) и роста осевых органов после прорастания (кормовые бобы) Оба вида семян с таких позиций не были исследованы Отличительной особенностью работы является изучение состава и активности аквапоринов именно в осевых органах семян, в которых происходит подготовка, инициация и дальнейший рост проростка

Осевые органы семян кормовых бобов и конского каштана — перспективная модель для изучения процессов, происходящих при прорастании, поскольку в них рост начинается, и долгое время происходит только путем растяжения клеток, тогда как у других видов деления клеток начинаются или одновременно или немного позже растяжения

ОБСУЖДЕНИЕ

Изученные виды семян были выбраны также потому, что они отличаются по водному статусу кормовые бобы имеют низкую влажность в воздушно-сухом состоянии и набухают вплоть до прорастания (ортодоксальный тип семян), а конский каштан сохраняет высокую влажность осевых органов после опадения, и только после выхода из покоя влажность увеличивается до уровня, необходимого для прорастания (рекальцитраптный тип) Подчеркнем, что, если семена ортодоксального типа (горох, арабидопсис) были изучены с позиций роли аквапоринов в поступлении воды (Весе-лова, Веселовский, 2005, Willigen et al, 2006), то рекальцитраптные семена пока внимания не привлекли, несмотря на их способность поддерживать высокий уровень оводненности в осевых органах (Обручева, Антонова, 2004) и сохранять метаболическую активность после опадения (Farrant, Walters, 1998, Гумилевская с соавт, 2003)

В осевых органах обоих видов семян с помощью специфических иммунохими-ческих реакций были идентифицированы аквапорины плазмалеммы PIPI и PIP2 и то-нопласта TIP3.1 и TIP2 Их мол массы соответствуют аквапоринам из других растительных объектов Полученные в работе данные позволяют проследить, как меняется состав обнаруженных аквапоринов по мере увеличения оводненности осевых органов семян при прорастании

Набухание семян бобов (рис 1) в течепие 6 - 12 ч происходит в результате интенсивного поглощения воды за счет физического набухания В осевых органах этих семян обнаружены аквапорины PIPI и PIP2 и TIP3.1 и TIP2, содержание и соотношение которых не менялось по мере набухания Однако тест на участие аквапоринов в поглощении воды (сулема+ДТТ) дал отрицательный результат, что совпадает с данными на целых семенах арабидопсиса (Willigen et al, 2006) и гороха (Веселова, Веселовский, 2006) По мнепию Веселовой и Веселовского в сухих семенах водные каналы открыты, по в начале набухания закрываются во избежание слишком быстрого набухания, приводящего к гипоксии Поскольку в наших опытах сулема не ингибирова-ла поглощения воды во время физического набухания, то можно заключить, что аквапорины не принимают в нем участия Интенсивное набухание происходит за счет физических процессов, завершающихся диффузией воды через мембраны в клетки, однако в этот период тем не менее происходит экспрессия генов плазмалеммных аквапоринов (Willigen et al, 2006) Наиболее интересно обнаруженное в работе присутствие аквапорина Т1РЗ,1 в топопласте осевых органов бобов (рис 4А) Этот аквапорин считается маркером тонопласта белковых тел, и найден в белковых телах семядолей многих семян (Melroy, Herman, 1991, Monyasu et al, 2003) В целых семенах арабидопсиса гены, кодирующие этот белок, интенсивно экспрессируются при набухании сухих семяп (Willigen et al, 2006) В осевых органах ортодоксальных семян этот аквапорин обнаружен нами впервые Его присутствие связано с образованием в гипокоти-

ле белковых тел из вакуолей во время созревания семян При набухании происходит их реставрация до вакуолей, увеличивающихся в объеме после достижения влажности, при которой начинается гидролиз запасных белков (Обручева с соавт , 1993) Таким образом, аквапорин Т1РЗД характерен для белковых тел не только в запасающих, но и в осевых органах семян

Следующий этап кривой набухания - фаза подготовки клеток к инициации роста Аквапорины плазмалеммы PIPI и PIP2 присутствуют в обоих видах семян и содержание их почти не меняется, как по сравнению с периодом физического набухания (бобы), так и на протяжении почти 4-месячного периода стратификации (каштан) Поступление воды на этом этапе происходит медленно, так как осмотически активные вещества в осевых органах накапливаются постепенно (Обручева, Антипова, 1999), и, по-видимому, диффузии воды через мембраны достаточно для поддержания водного тока внутрь клеток Действительно, обработка осевых органов обоих видов семян в наших опытах сулемой со снятием эффекта ингибирования ДТТ, и аналогичные опыты с целыми семенами арабидопсиса (Willigen et al, 2006) показали, что аквапорины не участвуют в поступлении воды и на этом этапе

В тонопласте у обоих видов семян присутствуют TIP2 и TIP3.1 Их содержание поддерживается в течение этого периода неизменным в осевых органах каштана Однако в осевых органах бобов уровень Т1РЗД снижается, так как завершается деградация белковых тел и превращение их в вакуоли - процесс, предшествующий и обязательный для инициации растяжения клеток Автофагия белковых тел вместе с участками инвагинаций цитоплазмы, охватывает и деградацию Т1РЗ,1 аквапорина белковых тел (Melroy, Herman, 1991) Вероятно, его функция была связана с удалением воды из вакуоли при созревании семян и образовании белковых тел При набухании поступающая вода обеспечивает гидратацию запасного белка и активацию протеаз, а по завершении, как запасания, так и мобилизации белка функция прекращается и он Т1РЗД исчезает в осевых органах бобов

В осевых органах каштана этот аквапорин Т1РЗД сохраняется и обнаруживается во все сроки стратификации, что, вероятно, связано с отсутствием белковых тел в осевых органах, где главными запасными веществами являются крахмал и сахароза (Обручева с соавт, 2006) При прижизненном окрашивании вакуолей (рис 6) установлено их наличие во всех клетках коры гипокотиля и корня О сохранности вакуолей в осевых органах семян каштана свидетельствуют также высокое содержание воды в осевых органах, низкое содержание белка в них и прямые электронномикроско-пические наблюдения (Мусатенко с соавт, 1997) В таком случае, аквапорин Т1РЗД следует называть не маркером тонопласта белковых тел, а маркером вакуолей в со-

зревающих семенах, которые у ортодоксальных семян превращаются в белковые тела, а у каштана (рекальцитрантный тип) сохраняются во время прорастания

При инициации роста, то есть при проклевывании осевых органов, аквапори-ны изучены и у бобов, и у каштана Содержание PIPI и PIP2 оставалось постоянным в обоих видах семян (рис 3, 7, 8) В тонопласте содержание Т1РЗД продолжало уменьшаться в бобах, a TIP2 сохранялся на прежнем уровне У вышедших из покоя семян каштана содержании Т1РЗ,1 и TIP2 несколько возрастало (рис 9, 10) Инициация роста связана с увеличением вакуолей в растягивающихся клетках, в оболочках вакуолей каштана продолжают накапливаться аквапорины, связанные с вакуолизацией Если TIP3.1 характерен для тонопласта вакуолей из созревающих семян, то TIP2 считается типичным аквапорином для вакуолей всех вегетативных органов растений (Daniels et al, 1996, Karlsson et al, 2000) и отсутствующим в меристематических тканях В па-ших объектах TIP2 присутствовал все время в набухающих осевых органах у обоих семян и даже возрастал (у каштана) при инициации роста, что связано с увеличением размеров вакуоли и подготовкой клеток к растяжению В тесте на участие аквапори-нов в поступлении воды (сулема+ДТТ) не получено четкого положительного ответа с осевыми органами наклюнувшихся семян обоих видов В опытах Willigen с соавт (2006) с целыми семенами арабидопсиса также отмечен очень слабый эффект сулемы Вероятно, что в поглощении воды при наклевывании аквапорины не принимают участия

На последнем этапе кривой набухаттия - поступлении воды в растущий проросток - аквапорины были изучены в осевых органах бобов длиной 1 см, рост которых происходил только путем растяжения клеток На этом этапе аквапорины активно участвуют в поступлении воды, как показали опыты по ингибировашпо водного транспорта сулемой и снятию этого эффекта ДТТ (рис IIA) Аналогичный эффект получен на осевых органах проростков каштана (рис 12А), а также на двухдневных проростках арабидопсиса (Willigen et al, 2006) В осевых органах бобов уровень обнаруженных плазмалеммных аквапоринов несколько уменьшился (рис 3) В тонопласте бобов TIP3.1 не выявлен (рис 4А), а уровень аквапорина TIP2 снизился (рис 4Б) Из литературы известно, что у арабидопсиса резко возрастает экспрессия генов, кодирующих различные изоформы как PIPI и PIP2, так и TIP1 и ПР2 (Willigen et al, 2006) По-видимому, после прорастания меняется состав аквапоринов плазмалеммы и тонопласта В наших объектах также возможно изменение состава аквапоринов в связи с интенсивным растяжением клеток и участием аквапоринов не только в поступлении воды в растягивающиеся клетки, но и в транспорте воды по тканям и сосудам проростка Наиболее вероятным кандидатом для этих целей можно считать аквапорин топопласта TIP1, экспрессия генов которого характерна для растягивающихся и диф-

ференцирующихся клеток корня и гипокотиля (Ludevid et al, 1992, Gao et al, 1999, Maeshima et al, 1994), а также аквапорин плазмалеммы PIP2.2 (Javot et al, 2003) В любом случае аквапорины принимают участие в поступлении воды в растущий проросток

Содержание аквапоринов в белке плазмалеммы в осевых органах изученных семенах, а также тонопласта (TIP2) не меняется в период, включающий инициацию роста Поскольку объем клетки при этом возрастает, то увеличивается площадь поверхности плазмалеммы и тонопласта, следовательно, в пересчете на клетку при растяжении возрастает и количество белка в мембранах и количество аквапоринов в них

Если сравнить данные по ортодоксальному и рекальцитрантному типу семян, то разница между ними заключается в судьбе тонопластного аквапорина Т1РЗ,1, который у бобов исчезает в осевых органах ко времени прорастания вместе с белковым телом, завершив свою функцию в мембране белкового тела В семенах каштана этот аквапорин не исчезает, а содержание его даже возрастает к наклевыванию, что связано с высокой оводненностью тканей и сохранением вакуолей со времени созревания и продолжением их функционирования при прорастании Готовность к быстрому прорастанию и отсутствие состояния покоя в осевых органах в период стратификации семян каштана (Обручева с соавт , 2003) коррелирует с сохранением водных каналов в мембранах

Выводы

1 В мембранах осевых органов ортодоксальных семян кормовых бобов и рекаль-цитрантных семян конского каштана обнаружены аквапорины плазмалеммы и тоно-пласта, которые в препаратах выделенных мембрап представлены в виде мономеров, димеров и мультимеров

2 В осевых органах семян кормовых бобов и конского каштана в период до на-клевывания не выявлено заметных изменений количества аквапоринов плазмалеммы PIPI и PIP2

3 Содержание аквапоринов топопласта TIP3.1 - маркеров мембран вакуолей созревающих семян, поддерживается на одном уровне в осевых органах кормовых бобов при набухании, значительно уменьшается при инициации роста, а у растущих проростков TIP 3,1 исчезает

4 В осевых органах семян кормовых бобов аквапорины тонопласта TIP2 сохраняются на протяжении периодов покоя, набухания и инициации роста

5 В осевых органах семян конского каштана содержание аквапоринов тонопласта TIP 3,1 и TIP2 не меняется в течение периода покоя и возрастает при выходе из него, что связано с высокой оводнснностью осевых органов и сохранением в них вакуолей в течение периода покоя

6 При помощи ингибиторного анализа показано, что после инициации растяжения клеток в растущих проростках поглощение воды происходит при участии аквапоринов, тогда как на более ранних этапах аквапорины, несмотря на их присутствие, не участвуют в поступлении воды через мембраны

7 Отличие рекальцитрантных семян от ортодоксальных проявляется в изменении состава аквапоринов тонопласта в рекальцитрантпых семенах сохраняются имевшиеся в зрелых семенах аквапорины вакуолей Т1РЗ,1, тогда как в ортодоксальных семенах эти аквапорины при прорастании исчезают

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1 Обручева Н.В., Новикова Г.В , Шижнева И.А. (2005) Аквапорины и поступление воды в осевые органы при инициации прорастания семян Vicia faba minor Материалы 4 Международной Научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 26-28 октября) с 167

2 Шижнева И.А., Новикова Г В., Обручева Н.В. (2006) Аквапорины плазма-леммы и тонопласта в ходе вакуолизации клеток осевых органов при прорастании семян Vicia faba minor Материалы 1 (IX) Международной конференции Молодых Ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая)-СПб Издательство ТЭТУ, с 220

3 Шижнева И.А , Новикова Г.В., Обручева H В. (2007) Аквапорины тонопласта и плазмалеммы из осевых органов семян бобов в процессе прорастания Доклады Академии Наук, 413, (1) 116-119

4 Шижнева И.А., Новикова Г.В., Обручева Н.В (2007) Аквапорины тонопласта и плазмалеммы в осевых органах прорастающих семян Материалы докладов VI съезда общества физиологов растений России «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 18-24 июня), т 2, с 435

5 Шижнева И.А., Новикова Г.В., Обручева Н.В, Азаркович М.И. (2007) Содержание аквапоринов в тонопласте из осевых органов семян конского каштана при прорастании Материалы 7 Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 18-22 июня) т 2, с 353-356

6 Шижнева И А , Новикова Г В., Обручева H В. (2007) Изучение аквапоринов в прорастающих семенах Материалы 5 Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, Беларусь, 28-30 ноября)

Подписано в печать 08 10 2007 г Исполнено 09 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 849 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шижнева, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Прорастание семян

1.2. Роль растяжения клеток в прорастании семян

1.3. Вода как пусковой фактор прорастания

1.4. Аквапорины растений

1.5. Строение и функционирование аквапоринов

1.6. Регуляция активности аквапоринов

1.7. Функции аквапоринов

1.8. Аквапорины в семенах

1.9. Аквапорины и рост клеток 32 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Проращивание семян, снятие кривых набухания и проклевывания

2.2. Стратификация и проращивание семян конского каштана 36 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Определение влажности

3.2. Ингибирование поглощения воды растворами сулемы (

§С12) и его снятие дитиотреитолом (ДТТ)

3.3. Выделение мембран

3.4. Определение количества белка

3.5. Определение активности ванадат-чувствительной Н+-АТФазы

3.6. Измерение количества неорганического фосфата

3.7. Электронно-микроскопическое исследование образцов выделенных мембран

3.8. Световая микроскопия прижизненных препаратов

3.9. Электрофорез мембранных белков в денатурирующих условиях

ЗЛО. Вестерн-блот анализ

3.11. Описание антисывороток, применявшихся для определения аквапоринов

3.11.1. Антисыворотки к аквапоринам плазмалеммы PIP

3.11.2. Антисыворотка к аквапорину тонопласта TIP

3.11.3. Получение антисыворотки против TIP 3;

3.12. Подбор режима солюбилизации и денатурации белка для вестерн-блот анализа

3.12.1. Экстракция белка смесью хлороформ-метанол

3.12.2. Использование мочевины 52 3.13. Анализ окрашенных гелей и блотов

РЕЗУЛЬТАТЫ 56 4. Аквапорины в осевых органах прорастающих семян кормовых бобов и их участие в поступлении воды

4.1. Характеристика прорастания семян

4.2. Повышение оводненности осевых органов при набухании

4.3. Тестирование участия аквапоринов в поглощении воды осевыми органами прорастающих семян

4.4. Характеристика выделенных фракций плазмалеммы и тонопласта

4.4.1. Электронно-микроскопический анализ фракций, выделенных из осевых органов семян бобов

4.4.2. Характеристика выделенных фракций по активности маркерного фермента

4.4.3 Анализ спектров мембранных белков

4.5. Идентификация аквапоринов плазмалеммы PIP в мембранных фракциях из осевых органов семян бобов

4.6. Идентификация аквапоринов тонопласта TIP в мембранных фракциях из осевых органов семян бобов

5. Аквапорины в осевых органах прорастающих семян конского каштана и их участие в поступлении воды

5.1. Характеристика прорастания и водного статуса осевых органов семян каштана

5.2. Тестирование участия аквапоринов в поглощении воды осевыми органами прорастающих семян конского каштана

5.3. Характеристика выделенных мембранных фракций

5.4. Идентификация аквапоринов плазмалеммы PIP в мембранных фракциях из осевых органов семян конского каштана

5.5. Идентификация аквапоринов тонопласта TIP в мембранных фракциях из осевых органов семян конского каштана

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы прорастающих семян"

Открытие аквапоринов - мембранных белков, формирующих водные каналы в растениях, позволило по-новому взглянуть на регуляцию поступления воды в растительные организмы. В частности, актуальным стало изучение роли аквапоринов в поступлении воды в семена при прорастании, когда семена из воздушно-сухого состояния очень быстро переходят в состояние высокой оводненности и активного метаболизма, кульминацией чего является инициация роста в осевых органах зародыша. Вода играет пусковую роль в прорастании семян, то есть при последовательном достижении уровней оводненности, пороговых для каждого из основных процессов метаболизма, происходит активация метаболизма и начинается подготовка к инициации роста, которая заключается в накоплении осмотиков и размягчении клеточной оболочки. В результате этих процессов в клетки поступает дополнительное количество воды, накапливаемой в формирующихся вакуолях, и благодаря давлению воды на оболочки, начинается их растяжение. Тем самым происходит инициация растяжения клеток, то есть начало прорастания. Поскольку вода играет ведущую роль в прорастании, изучение механизмов ее поступления в растущие осевые органы зародыша семян и участие аквапоринов в нем является актуальной проблемой физиологии растений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Прорастание семян

Семена растений относят к двум типам - ортодоксальные семена и рекальцит-рантные. Ортодоксальные семена охватывают большинство видов семян, в том числе сельскохозяйственных растений. Их характерная особенность заключается в том, что при созревании они теряют воду и высыхают до влажности 8-10%, не теряя при этом жизнеспособности, затем при наличии воды они прорастают. Рекаль-цитрантные (в переводе «непослушные») преимущественно распространены в тропических и субтропических районах с высокой влажностью. Они отличаются тем, что при созревании высыхают незначительно и сохраняют свою высокую влажность. Если рекальцитрантные семена теряют воду, они погибают. Таким образом, указанные типы семян отличаются по устойчивости к высыханию и своему водному статусу.

Под прорастанием, для всех типов семян, принято понимать переход из состояния покоя (вынужденного или разной степени глубины) к росту, который приводит к формированию проростка. Поэтому, прорастание семян представляет собой первый этап онтогенеза растений. Успешное прорастание семян необходимо для последующего развития растений и, тем самым, является исходным процессом для получения следующего поколения.

Первый этап прорастания - ттаклевывание семени - тестируется по появлению кончика корня на поверхности семени и представляет собой инициацию роста осевых органов зародыша. Осевые органы в семенах двудольных состоят из корешка, гипокотиля и почечки. Инициация роста может происходить в корешке, благодаря чему он «пробивает» кожуру, - если имеет место эпигеальное прорастание (Васильев и др., 1978). Рост может также начинаться в гипокотиле, если происходит гипогеальное прорастание; в этом случае растущий гипокотиль выталкивает кончик корешка через семенную кожуру.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шижнева, Ирина Александровна

выводы

1. В мембранах осевых органов ортодоксальных семян кормовых бобов и ре-кальцитрантных семян конского каштана обнаружены аквапорины плазмалеммы и тонопласта, которые в препаратах выделенных мембран представлены в виде мономеров, димеров и мультимеров.

2. В осевых органах семян кормовых бобов и конского каштана в период до наклевывания не выявлено заметных изменений количества аквапоринов плазма-леммы PIPI и PIP2.

3. Содержание аквапоринов тонопласта Т1РЗ;1 - маркеров мембран вакуолей созревающих семян, поддерживается на одном уровне в осевых органах кормовых бобов при набухании, значительно уменьшается при инициации роста, а у растущих проростков TIP 3;1 исчезает.

4. В осевых органах семян кормовых бобов аквапорины тонопласта TIP2 сохраняются на протяжении периодов покоя, набухания и инициации роста.

5. В осевых органах семян конского каштана содержание аквапоринов тонопласта TIP 3;1 и TIP2 не меняется в течение периода покоя и возрастает при выходе из него, что связано с высокой оводненностью осевых органов и сохранением в них вакуолей в течение периода покоя.

6. При помощи ингибиторного анализа показано, что после инициации растяжения клеток в растущих проростках поглощение воды происходит при участии аквапоринов, тогда как на более ранних этапах аквапорины, несмотря на их присутствие, не участвуют в поступлении воды через мембраны.

7. Отличие рекальцитрантных семян от ортодоксальных проявляется в изменении состава аквапоринов тонопласта: в рекальцитрантных семенах сохраняются имевшиеся в зрелых семенах аквапорины вакуолей Т1РЗ;1, тогда как в ортодоксальных семенах эти аквапорины при прорастании исчезают.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шижнева, Ирина Александровна, Москва

1. Ампилогова Я.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С. (2006) Редокс-модуляция осмотической водной проницаемости плазмалеммы, изолированной из корней и стеблей проростков гороха. Физиология растений, 53, 703-710.

2. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятое А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. (2004) Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М.: Наука, 312 с.

3. Божко К.Н., Жесткова И.М., Трофимова М.С., В.П. Холодова, Кузнецов Вл. В. (2004) Изменение содержания аквапоринов в клеточных мембранах Mesem-bryanthemum crystallinum при переходе с С3-типа фотосинтеза на САМ. Физиология растений. 51, 887 895.

4. Васильев А.Е., Воронин Н.С., Еленевский А.Г., Серебрякова Т.И. (1978) Ботаника: анатомия и морфология растений. М.: Просвещение, 478с.

5. Веселова Т.В., Веселовский В.А. (2006) Возможность участия аквапоринов в поглощении воды семенами гороха разного качества. Физиология растений, 53, 106-112.

6. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Усманов П.Д., Усманова О.В., Козарь

7. В.И. (2003) Гипоксия и повреждения при набухании стареющих семян. Физиология растений, 50,930-937.

8. Гумилевская Н.А.,Азаркович М.И., Комарова М.Е., Обручева Н.В. (2001) Белки осевых органов покоящихся и прорастающих семян конского каштана. I. Общая характеристика белков. Физиололгия растений, 48,5-17.

9. Данович К.Н. (1982) Структура и развитие семян. В: кн.: Физиология семян, под ред. A.A. Прокофьева. М.: Наука, с 5-47.

10. Дженн Р.К., Амен Р.Д. (1982) Что такое прорастание? В кн.: Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. Пер. с англ. М.: Колос, с 19-44.

11. Каравайко И.Н., Земляченко Я.В., Селиванкина С.Ю. Кулаева О.Н. (1995) Выделение из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающего белка, участвующегов активации транс-зеатином синтеза РНК in vitro. Физиология растений, 42, 547554.

12. Ковалев А.Г., Обручева Н.В. (1977) Клеточный анализ S- кривой роста корня. Особенности деления и растяжения клеток в корнях конского каштана. Онтогенез, 8,397-405.

13. Миронов A.A., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. (1994) Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. Санкт-Петербург: Наука, 400 с.

14. Мусатенко Л.И., Генералова В.М., Мартын Г.Г. (1997)К вопросу о физиологии семян Aesculus hyppocastanum L. Укр. бот. ж. 54: 86-91.

15. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова JI.M. (1999) Биология семян. Санкт-Петербург: СПбГУ, 133 с.

16. Обручева Н.В., Антипова О.В. (1994) Запуск роста осевых органов и его подготовка при прорастании семян, находящихся в вынужденном покое. 2. Инициация «кислого» роста в осевых органах семян кормовых бобов. Физиология растений, 41,443-447.

17. Обручева Н.В., Антипова О.В. (1997) Физиология инициации прорастания семян. Физиология растений, 44, 287-302.

18. Обручева Н.В., Антипова О.В. (1999) Общность физиологических механизмов подготовки к прорастанию у семян с различным типом покоя. Физиология растений, 46, 426 431.

19. Обручева Н.В., Антипова О.В. (2004) Роль поступления воды в переходе ре-кальцитрантных семян от покоя к прорастанию. Физиология растений, 51,942-951.

20. Обручева Н.В., Антипова О.В., Азаркович М.И., Гумилевская H.A. (2004) Анализ способности к росту зародышевых осей в период покоя семян и выхода из него .Докл. Акад. наук, 396,424-426.

21. Обручева Н.В., Зембднер Г., Дате В. (1985) Эндогенная абсцизовая кислота в прорастающих семенах гороха. Докл. АН СССР, 280, 254-256.

22. Обручева Н.В., Ковадло JI.C. (1985) Два этапа усиления дыхания прорастающих семян гороха по мере увеличения оводненности. Физиология растений, 32, 753-761.

23. Обручева Н.В., Ковадло JI.C., Прокофьев A.A. (1988) Уровень оводненности как пусковой фактор мобилизации крахмала и белка при прорастании семян гороха. Физиология растений, 35,322-328.

24. Обручева Н.В., Литягина C.B., Рихтер А. (2006) Динамика углеводов в осевых органах семян конского каштана при переходе от покоя к прорастанию. Физиология растений, 53, 869-879.

25. Остерман JI.A. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, с 50.

26. Пирс Э. (1962) Гистохимия. М.: Иностранная литература, с. 706.

27. Соболев A.M. (1985) Запасание белка в семенах растений М.: Наука, 112 с.

28. Сытник K.M., Мартин Г.И., Мусатенко Л.И. (1977) Цитологический анализ роста корня. Докл. Акад. наук Укр. ССР, сер. биол., 9, 851-854.

29. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Андреев И.М., Свинов М.М., Бобылев Ю.С., Сорокин Е.М. (2001) Осмотическая водная проницаемость вакуолярных и плазматических мембран, изолированных из корней кукурузы. Физиология растений, 48,341-348.

30. Хайдекер У. (1982) Стресс и прорастание семян: агрономическая точка зрения. В кн.: Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. Пер. с англ., М.: Колос, с 273-319.

31. Шапигузов А.Ю. (2004) Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции. Физиология растений, 51, 142-152.

32. Шарова Е.И. (2004) Клеточная стенка растений. Санкт-Петербург: СПГУ, 153с.

33. Alexandersson E., Saalbach G., Larsson C., Kjellbom P. (2004) Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol., 45, 1543-1556.

34. Barone L.M., Shih C., Wasserman B.P. (1997) Mercury-induced confomational changes and identification of conserved surface loops in plasma membrane aquaporins from higher plants. J. Biol. Chem., 272,30672-30677.

35. Barrowchlough D.E., Peterson C. A., Steudle E., (2000) Radial hydraulic conductivity along developing onion roots. J. Exp. Bot., 51, 547-557.

36. Bewley J.D., Black M. (1985) Seeds: physiology of development and germination., New York: Plenum Press, 367 p.

37. Bewley J.D., Black M. (1994) Seeds: physiology of development and germination., New York: Plenum Press, 445 p.

38. Boursiac Y., Chen S., Luu D.-T., Sorieul M., van der Dries N., Maurel C. (2005) Early effects of salinity on water transport in Arabidopsis roots molecular and cellular features of aquaporin expression. Plant Physiol. 139, 790-805.

39. Briskin D.P., Leonard R.T., Hordges T.K. (1987) Isolation of the plasma membrane: membrane markers and general principles. Meth. Enzymol., 148, 542-558.

40. Bruni F., Leopold A.C. (1991) Hydration, protons and onset of physiological activities in maize seeds. Physiol. Plant., 81, 359-364.

41. Carter S.G., Karl D.W. (1982) Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J. Biochem. Biophys. Meth., 7, 7-13.

42. Carvajal M., Cooke D. T., Clarkson D.T. (1996) Responsess of wheat plant to nutrient deprivation may involve the regulation of water-channel function. Planta, 199, 372-381.

43. Chaumont F., Barrieu F., Herman E.M., Chrispeels M.J. (1998) Characterization of a maize tonoplast aquaporin expressed in zones of cell division and elongation. Plant Physiol., 117, 1143-1152.

44. Chaumont F., Barrieu F., Jung R., Chrispeels M.J. (2000) Plasma membrane in-trinistic proteins from maize cluster in two sequence subgroups with differential aq-uaporin activity. Plant Physiol., 122, 1025-1034.

45. Chaumont F., Barrieu F., Wojcik E., Chrispeels M.J., Jung R. (2001) Aq-uaporins constitute a large and highly divergent family in maize. Plant Physiol., 125, 1206-1215.

46. Cheng A., Van Hoek A., Yeager M., Verkman A., Mitra A. (1997) Three-Dimensional organization of a human water channel. Nature, 387,627-630.

47. Daniels M.J., Mirkov E., Chrispeels M.J. (1994) The plasma membrane of Arabi-dopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is a homolog of the tono-plast water channel protein TIP. Plant Physiol., 106, 1325-1333.

48. Daniels M.J., Chaumont F., Mirkov E.T., Chrispeels M.J. (1996) Characterization of a new vacuolar membrane aquaporin sensitive to mercury at a unique site. Plant Cell, 8,587-599.

49. Denker B., Smith B., Kuhada F., Agre P. (1988) Identification, purification and partial characterization of novel Mr 28.000 integral membrane protein from erithrocytes and renal tubules. J. Biol. Chem., 263,15634-15642

50. Dommes Y., Van de Walle C. (1983) Newly synthesized mRNA is translated during the initial imbibition phase in germinating maize embrio. Plant Physiol., 73,484-487.

51. Farrant J.M., Pammenter N. W., Berjak P., Walters C. (1997) Subcellular organization and metabolic activity during the development of seeds that attain different levels of desiccation tolerance. Seed Sci. Res., 7, 135-144.

52. Farrant J.M., Walters C. (1998) Ultrastructural and biophysical changes in developing embryos of Aesculus hyppocastanum in relation to the acquisition of tolerance to drying. Physiol. Plant., 104, 513-524.

53. Fricke W., Chaumont F. (2006) Solute and water relations of growing plant cells. In: J.P. Verbelen, K. Vissenberg. The expanding cell. Berlin: Springer-Verlag, Plant cell monogr., p. 5-31.

54. Fujiyoshi Y., Mitsuoka K., de Groot B.L., Philippsen A., Grubmuller H., Agre P., Engel A. (2002) Structure and function of water channels. Curr. Opin. Struct. Biol., 12, 509-515.

55. Gao Y.P., Young L. Bonham-Smith P., Gusta L.V. (1999) Characterization and expression of plasma amd tonoplast membrane aquaporins in primed seed of Brassica napus during germination under stress conditions Plant Mol. Biol, 40, 635-644.

56. Gastaldo P., Caviglia M.A., Carli S., Profumo P. (1996) Somatic embryogenesis and esculin formation in calli and embryoids from bark explants of Aesculus hippocasta-num L. Plant Sci., 119,157-162.

57. Gerbeau P., Guclu J., Ripoche P., Maurel C. (1999) Aquaporin Nt-TIPa can account for the high permeability of tobacco cell vacuolar membrane to small neutral solutes. Plant J., 18, 577-587.

58. Haber A.H. (1968) Ionizing radiations as research tools. Annu. Rev. Plant Physiol. 19,463-489.

59. Harvengt P., Vlerick A., Fuks B., Wattiez R., Ruysschaert J.-M., Homble F.2000) Lentil seed aquaporins form a hetero-oligomer which is phosphorylated by a Mg dependent and Ca -regulated kinase. Biochem. J., 352,183-190.

60. Herman E.M., Larkins B.A. (1999) Protein storage bodies and vacuoles. Plant Cell, 11, 601-613.

61. Hofte H., Chrispeels M.J. (1992) Protein sorting to the vacuolar membrane. The Plant Cell, 4, 995-1004.

62. Jauh G.Y., Philips T.E., Rogers J.C. (1999) Tonoplast intrinistic protein isoforms as markers for vacuolar functions. Plant Cell, 11,1867-1882.

63. Javot H., Lauvergeat V., Santoni V., Martin-Laurent F.,Gii£lii J., Vinh J., Heyes J., Franck K.I., Schaffner A.R., Bouchez D., Maurel C. (2003) Role of single aquaporin isoform in root water uptake. Plant Cell, 15, 509-522.

64. Javot H., Maurel C. (2002) The role of aquaporins in root water uptake. Ann. Bot., 90,301-313.

65. Johansson I., Larsson C., Ek B., Kjellbom P. (1996) The major integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putative aquaporins and are phosphorylated in response to Ca and apoplastic water potential. Plant Cell, 8,1181-1191.

66. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M.J., Larsson C., Kjellbom P. (1998) Water transport activity of the plasma membrane aquaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell, 10, 451-460.

67. Johnson K.D., Herman E.M., Chrispeels M.J. (1989) An abundant, highly conserved tonoplast protein in seeds. Plant Physiol., 91,1006-1013.

68. Kaldenhoff R., Kolling A., Richter G. (1996) Regulation of the Arabidopsis thaliana aquaporin gene athH2 (PIPlb). J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 36, 351-354.

69. Karlsson M., Johansson I., Bush M., McCann M., Maurel C., Larsson C., Kjellbom P. (2000) An abundant TIP expressed in mature highly vacuolated cells. Plant J., 21, 83-90.

70. Mader M., Chrispeels M.J. (1984) Synthesis of an integral protein of the protein-body membrane in Phaseolus vulgaris cotyledons. Planta, 160, 330-340.

71. Maeshima M. (1990) Development of vacuolar membranes during elongation of cells in mung bean hypocotyls. Plant Cell Physiol., 31, 311-317.

72. Maeshima M., Hara-Nishimura I., Takeuchi Y., Nishimura M. (1994) Accumulation of vacuolar ^-pyrophosphatase and H+-ATPase during reformation of the central vacuole in germinating pumpkin seeds. Plant Physiol., 106,61-69.

73. Maggio A., Joly R.J. (1995) Effect of mercuric chloride on the hydraulic conductivity of tomato root systems: evidence for a channel-mediated water pathway. Plant Physiol., 109,331-335.

74. Marty F. (1999) Plant vacuoles. Plant Cell, 11, 587-599.

75. Matsuda H., Li Y., Murakami T., Yamahara J., Yoshikawa M. (1999) Effectc of escins la, lb, lib from horse chestnuts on gastric emptying in mice. European Journal of Pharmacology., 368, 237-243.

76. Maurel C. (1997) Aquaporins and water permeability of plant membranes. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48,399-429.

77. Maurel C. (2007) Plant aquaporins: novel function and regulation properties. FEBS Lett., 581,2227-2236.

78. Maurel C., Chrispeels M.J. (2001) Aquaporins. A molecular entry into plant water relations. Plant Physiol. 125, 135-138.

79. Maurel C., Reizer J., Schroeder J.I., Chrispeels M.J. (1993) The vacuolar membrane protein y-TIP creates water specific channels in Xenopus oocytes. EMBO J. 12: 2241-2247.

80. Maurel C., Kado R.T., Guern J., Chrispeels M.J. (1995) Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporin a-TIP. EMBO J. 14, 30283035.

81. Maurel C., Javot H., Lauvergeat V., Gerbeau P., Tournaire C., Santoni V., Heyes J. (2002) Molecular physiology of aquaporins in plants. Int. Rev. Cytol., 215: 1 OS-MS.

82. Mayer A.M., Poljakoff-Mayber A. (1989) The germination of seeds. Oxford: Per-gamon Press, 270 p.

83. Melroy D.L., Herman E.M. (1991) TIP, an integral membrane protein of the protein-storage vacuoles of the soybean cotyledon undergoes developmentally regulated membrane accumulation and removal. Planta, 184, 113-122.

84. Morillon R., Chrispeels M. J. (2001) The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmotic water permeability of leaf cells. Proc. Natl Acad Sci. USA, 98, 14138-14143.

85. Obroucheva N.V. (1999) Seed germination: a guide to the early stages. Leiden: Backhuys Publ., 156 p.

86. Obroucheva, N.V., Antipova O.V., Gorbova E. N., Kotova L.M. (1995) Relationship between initiation of cell elongation and cell division in radicles of germinating seeds. Plant Soil., 173, 311-316.

87. Obrucheva N.V., Lityagina S.V. (2007) Dormancy release and germination in recalcitrant Aesculus hippocastanum seeds. Dendrobiology, 57, 27-33.

88. Oliviusson P., Hakman I. (1995) A tonoplast intrinsic protein (TIP) is present in seeds, roots and somatic embryos of Norway spruce (Picea abies). Physiol. Plant., 95, 288-295.

89. Phillips A., Huttly A. (1994) Cloning of two gibberellin-regulated cDNAs from Arabidopsis thaliana by substractive hybridization: expression of the tonoplast water channel, gamma-TIP, is increased by GA3. Plant Mol. Biol., 24, 603-615.

90. Preston G., Agre P. (1991) Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,11110-11114.

91. Preston G.M., Carrol T. P., Guggino W.B., Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science, 256,385-387.

92. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B., Agre P. (1993) The mercury-sensitive residue at cysteine 189 in CHIP28 water channel. J. Biol Chem., 268, 17-20.

93. Quigley F., Rosenberg J.M., Shachar-Hill Y., Bohnert H.J. (2001) From genome to function: the Arabidopsis aquaporins. Genome Biol., 3, 1-17.

94. Robinson D.G., Sieber H., Kammerloher W., Schaffner A.R. (1996) PIP1 aquaporins are concentrated in plasmalemmasomes of Arabidopsis thaliana mesophyll. Plant Physiol, 11, 645-649.

95. Rogan P.G., Simon, E.W. (1975) Root growth and the onset of mitosis in germinating Vicia faba. New Phytol., 74, 273-275.

96. Saito C., Ueda T., Abe H., Wada Y., Kuroiwa T., Hisada A., Furuya M., Na-kano A. (2002) A complex and mobile structure forms a distinct subregion within thecontinuous vacuolar membrane in young cotyledons of Arabidopsis. Plant J., 29, 245255.

97. Sakurai J., Ishikawa F., Yamaguchi T., Uemura M., Maeshima M. (2005) Identification of 33 rice aquaporin genes and analysisof their expression and function. Plant Cell Physiol., 46, 1568-1577.

98. Santoni V., Vinh J., Pelieger D., Sommerer N., Maurel C. (2003) A proteomic study reveals novel insights into the diversity of aquaporin form expressed in the plasma membrane of roots. Biochem. J., 373, 289-296.

99. Santoni V., Verdoucq L., Sommerer N., Vinh J., Pfliger D., Maurel C. (2006) Methylation of aquaporins in plant plasma membrane. Biochem. J., 400: 189-197.

100. Scheuring S., Ringler P., Borgnia M., Stahlberg H., Muller D., Agre P., Engel A. (1999) High resolution AFM topographs of the Escherichia coli water channel aquaporins Z. EMBO J., 18,4981-4987.

101. Siefritz F., Biela A., Eckert M., Otto B., Uehlein N., Kaldenhoff R. (2001) The tobacco plasma membrane aquaporin Nt AQP1. Exp. Bot., 52, 1953-1957.

102. Stuart D.A., Durnani D.J., Jones R.L. (1977) Cell elongation and cell division in elongating lettuce hypocotyl sections. Planta, 135, 249-255.

103. Suga S., Komatsu S., Maeshima M. (2002) Aquaporin isoforms responsive to salt and water stresses and phytohormones in radish seedlings. Plant Cell Physiol43, 12291237.

104. Suga S., Murai M., Kuwagata T., Maeshima M. (2003) Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol., 44, 277-286.

105. Tornroth-Horsefield S., Wang Y., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorsid E., Neutze R., Kjellbom P. (2006) Structural mechanism of plant aquaporin gating. Nature, 439, 688-694.

106. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,428-432.

107. Tyerman S.D., Bohnert H.J., Maurel G, Steudle E., Smith J.A. (1999) Plant aq-uaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J. Exp. Bot., 50, 1055-1071.

108. Van der Wilden W., Herman E.M., Chrispeels M.J. (1980) Protein bodies of mung bean cotyledons as autophagic organelles. Proc. Natl. Acad. Set, USA, 77, 428432.

109. Veenholf L.M., Heuberger E.H.L.M., Poolman B. (2002) Quaternary structure and function of transport proteins. Trends Biochem. Sci., 27,242-249.

110. Vera-Estrella R., Barkia B.J., Bohnert H.J.,Pantoja O. (2004) Novel regulation of aquaporins during osmotic stress. Plant Physiol., 135, 2318-2329.

111. Verkman A. (2000) Water permeability measurement in living cell and complex tissues. J. Membr. Biol. 173,73-87.

112. Wan X., Steudle E., Hartung W. (2004) Gating of water channels (aquaporins) in cortical cells of young corn roots by mechanical stimuli (pressure pulses): effects of ABA and of HgCl2. J. Exp Bot., 55,411-422

113. Wang M., Heimovaara-Dijkstra S., Van Duijn B. (1995) Modulation of germination of embryos isolated from dormant and nondormant barley grains by manipulation of endogenous abscisic acid. Planta. 195,586-592.

114. Willigen V. G, Postaire O., Tournair-Roux C., Boursiac Y., Maurel C. (2006) Expression and inhibition of aquaporins in germinating Arabidopsis seeds. Plant Cell Physiol. 47,1241-1250.

115. Yamada S., Katsuhara M., Kelly W., Michalowski G, Bohnert H. (1995) A family of transcripts encoding the water channel proteins: tissue-specific expression in the common ice plant. Plant Cell, 7, 1129-1142.

116. Yamamoto Y.T., Taylor C.G., Acedo G.H., Cheng C-L., Conkling M.A. (1991)

117. Characterization of c/'v-acting sequences regulating root-specific gene expression in tobacco. Plant Cell, 3,371-382.

118. Zhang W.H., Tyerman S.D. (1999) Inhibition of water channels by HgCl2 in intact wheat root cell. Plant Physiol, 120, 849-858.1. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

119. Шижнева И.А., Новикова Г.В., Обручева Н.В. (2007) Аквапорины тонопласта и плазмалеммы из осевых органов семян бобов в процессе прорастания. Доклады Академии Наук, 413, (1): 116-119.

120. Шижнева И.А., Новикова Г.В., Обручева Н.В. (2007) Изучение аквапоринов в прорастающих семенах. Материалы 5 Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, Беларусь, 28-30 ноября).

121. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук Обручевой Наталье Владимировне за внимание, всестороннюю поддержку и бесценную помощь в научной работе.

122. Автор выражает искреннюю благодарность доктору биологических наук Новиковой Галине Викторовне за помощь в работе над диссертацией, советы и дружескую поддержку.