Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прорастание семян кормовых бобов и динамика полиаминов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Прорастание семян кормовых бобов и динамика полиаминов"

российская академия наук

ордена трудового красного знамени институт физиологии растении им. к. а. тимирязева

Р Г б О Д На правах рукописи

. 3 V.; 1:\"Л

котова Людмила Михаиловна

ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН КОРМОВЫХ БОБОВ II ДИНАМИКА ПОЛНАМШГОВ

Специальность 03.00.12 — физиология растении

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических паук, старший научный сотрудник Н. В. ОБРУЧЕВА

Официальные оппонейты:

доктор биологических наук, старшин научный сотрудник Н. И. ШЕВЯКОВА,

доктор биологических наук, профессор В. Б. ИВАНОВ

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет.

Защита состоится «./....»...кУт.Ог^г......1994 года в ....... часов

иа заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан .....>>.^.''.^4.^^.1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, канд. биол. наук

Л. И. СЕРГЕЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ' Актуальность проблемы. Прорастание семян представляет собой первый этап жизни каждого нового поколения растений, обеспечивая воспроизведение вида. Понимание физиологических механизмов, лежащих в основе прорастания семян, представляет собой не только важную научную проблему, но имеет и большое практическое значение. Изучение физиологии прорастания семян актуально для практики растениеводства, так как получение полноценных и дружных всходов закладывает основу нормального роста и развития хозяйственно-ценных видов растений.

С теоретической точки зрения физиология прорастания семян представляет интерес прежде всего потому, что при прорастании осуществляется быстрый переход зрелого жизнеспособного семени из состояния вынужденного покоя, характеризующегося крайне вяло протекающим основным метаболизмом, к состоянию активной жизнедеятельности, завершающемуся интенсивным ростом проростка. Наряду с активацией метаболизма в семенах при прорастании возрастает содержание полиаминов (Änguillesi et al.,1978; Villanaeva et al.,1978; Lin,1984; Torrigiani et al.,198Q;Savithramma,Swamy,1989;Walker et al.,1989). Из литературных данных следует, что накопление полиаминов и усиление активности ферментов. их биосинтеза могут быть связаны с быстрым ростом тканей и высокой активностью клеточных делений (Palavan, Galston,1982; Shen,Galston,1985;Palavan-Unsal,1987;Federico,Angelini, 1988). Однако, как правило, такие исследования ведутся на модельных системах 1л vitro: в суспензионной культуре клеток, в культуре протопластов, каллусов и эксплантов. Изучение роли полиаминов в ростовых процессах, идущих в прорастающем семени, в отличие от модельных систем in vitro,-тлеет ряд преимуществ.

При прорастании семени и развитии проростка последовательно включается ряд физиологических процессов: выход из вынужденного покоя и активация метаболизма во время физико-химического набухания семян; подготовка к началу растяжения клеток и рост еа счет растяжения клеток, приводящий к наклевыванш семян; рост осевых органов за счет и растяжения, и делений ¡меток (Bei? 1 еу,Black, 1978,1085;Обручева, 1991). При прорастании семян изучение роли полиачшов в инициации роста осевых органов затруднено тем, что деление и растяжение клети? у многих видов семян начинается одновременно. Однако, у ряда видов прорастание начинается только за счет растяжения клеток (Обручева,1982,1991). К их числу относятся семена кормовых бобов

Vicia faba minor L., y которых при прорастании растяжение и деление клеток раздвинуты во времени. Преимущества данного объекта позволяют изучить закономерности превращений полиаминов при инициации растяжения и деления клеток в прорастающих семенах, что представляет собой актуальную проблему не только для физиологии семян, но и для физиологии роста растений в целом.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучить динамику содержания полиаминов в прорастающих семенах Vlcla faba minor L. в связи с инициацией и протеканием в них ростовых процессов. , Перед нами стояли следующие задачи:

- исследовать влияние экзогенных полиаминов (путресцина, кадаверина, спермидина и спермина) на подготовку роста осевых органов семян к прорастанию, на собственно наклевывание семян' и на рост осевых органов после проклевывания;

-изучить динамику содержания полиаминов в процессе прорастания семян в семядолях и осевых органах эародьша и в процессе роста проростков;

- выяснить особенности образования полиаминов из аминокислот-предшественников;

- сравнить динамику накопления путресцина, спермидина и спермина в различных органах проростка, отличающихся по началу и характеру роста клеток;

- выяснить зависимость между накоплением полиаминов и процессами растяжения и делений клеток в осевых органах прорастающих семян путем ингибирования роста за счет прекращения митотической активности с помощью »-облучения и за счет подавления растяжения клеток путем инкубирования семян в осмотике.

Научная новизна работы. В процессе прорастания семян кормовых бобов Vlcla faba minor L. была изучена зависимость между содержанием ПА и особенностями роста осевых органов. Обнаружено, что в осевых органах на начальных этапах прорастания полиамины синтезируются слабо и, в основном, из аргинина , образующегося при гидролизе запасных белков, затем начинается интенсивное накопление полиаминов за счет начала работы срнитинового цикла, поддерживаемого транспортом азотсодержащих соединений из семядолей'. Впервые была проанализирована динамика каждого из полиаминов в связи с особенностями роста каждого из осевых органов, т.е. с позиций соотношения в них процессов растяжения и деления клеток. Удалось показать,' что полиамины не участвуют в подготовке растяжения клеток в осевых органах

перед началом прорастания. Рост органов в длину коррелирует с накоплением в них путресцина. Установлено, что растяжение клеток во всех органах связано именно с накоплением путресцина, тогда как начало делений в них - с накоплением спермидина. При избирательном подавлении растяжения клеток инкубированием в осмотике, а деления клеток - г-облучением, было продемонстрировано прекращение синтеза путресцина и спермидина. Выдвинуто представление о том, что начало растяжения в осевых органах вызывает синтез путресцина, а начало делений - образование спермидина.

Практическое и теоретическое значение. Разработана модельная система, позволяющая тестировать влияние соединений на темп накле-вывания семян: для математической обработки и сравнения кривых вполне достаточно вести регулярные наблюдения за проклевыванием, пока не проклюнется 50% семян, и в конце опыта учитывать всхожесть. Тем самым облегчается постановка опытов по скринингу действия -различных веществ на проклевывание семян.

Полученные результаты по накоплению полиаминов на начальных этапах прорастания позволили разграничить начальный биосинтез полиаминов в осевых органах за счет аргинина запасных белков и последующее образование полиаминов за счет притекающего из семядолей аспа-рагина при активном участии орнитинового цикла. При сопоставлении накопления полиаминов и особенностей роста клеток каждого из осевых органов, а также их роста при подавлении растяжения осмотиком, а делений - г-облучением, было показано, что путресцин образуется в начавших растягиваться клетках, а спермидин - при делении клеток, что позволяет с новых повиций оценить участие полиаминов в ростовых процессах.

Апробация работы. Материалы дисдертации были представлены на 14-ой Международной конференции по регуляторам роста растений (Амстердам, Голландия, 1993) и доложены на трех Всесоюзных конференциях молодых ученых ( Рига, 1987; Петрозаводск, 1988; Ташкент, 1990), Всесоюзной конференции по физиологии семян, Душанбе, 1990, а также ца семинарах лаб. физиологии запасающих органов и на расширенном ¡заседании лаб. роста и развития ИФР РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа (/6/< страницы, 3.91 рисунков,' таблиц) состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, включающей результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, спис-

ка литературы ¿¿^^наименований, из них ^¿зарубежных авторов).

Используемые сокращения: ПА - полиамины Агм - агматин Apr -'аргинин

Пут - путресцин Кад - кадаверин Орн орнитин

Спд - спермидин Спм - спермин Цит - цитруллин

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. •

Семена кормовых бобов Vlcla faba minor L. сорта Аушра проращи-. вали в кюветах, накрытых стеклом, на "гармошках" из фильтровальной бумаги, смоченной'дистиллированной водой, при 27°С в темноте.

Разграничение корня и гипокотля. Для разграничения корня и гипокотиля, визуально трудно различимых на начальных этапах прорастания, использовали методику, основанную на различных сорбционных свойствах поверхности корня и гилокотиля (Обручева и др.,1984). .

Обнаружение мттов. Начало пролиферации клеток устанавливали по наличию митотических фигур на постоянных давленых препаратах после окраски ацетожелеаогематоксилином в модификации. Соловьевой (1982).

Облучение хинн. Для предотвращения делений в осевых' органах воздушно-сухие семена облучали т-лучами на установке "ГУРХ -100000" в Институте физической химии РАН в дозах 25, 50, 100, 150, 200 кидорентгек.

Видорхишшис сеияи s растворах осшжика. Для ингибирования роста растяжением использовано инкубирование в растворах осмотика полизтиленгликоля (ПЭГ) (м.в. 6000).

Изучение действия ПА па. ход иаллашнааип ceisnu. Семена проращивали в растворах: Пут, Спд, Спм и Кад в концентрациях от Ю~10 до 10-3М и в воде (контроль). Число наклюнувшихся семян регистрировали каждые 2 часа. Опыты проводили в трехкратной повторности по 100 семян в каждой. Для математической обработки кривых прорастания

к сх

использовали уравнение Гомпертца'(y-aeDe ). Анализ кривых прорастания показал, что для сравнения различных воздействий на каклевыва-ние семян достаточно следить за динамикой наклевывания 507. семян и отмечать X их всхожести. .

Обработка ссияи исяодои гим&Ятщри - подсуаиьасил - регидрвввг кии. Метод гидратации - подсушивания - регидратации позволяет кос-. if-mio - по ускорению регидратации - установить начало накопления ' осмотически активных Еепеств (Обручева,Антипова,1985). Метод заключается в набухании семян в течение определенного промежутка времени

до достижения осевыми органами заданного уровня влажности, после чего их подсушивают до контролируемого уровня влажности; аатем семена вновь намачивают и точно фиксируют промежуток времени, необходимый осевым органам для того, чтобы вновь достигнуть уровня влажности, имевшегося перед подсушиванием (период регидратации). Ускорение регидратации свидетельствует о том, что осевые органы еще при первоначальном набухании накопили столько осмотически-активных веществ (сахара, аминокислоты, К+), что поступление воды усиливается.

Вовдувно1сухие семена помещали в'растворы'Пут, Спд, Спм, Над в концентрациях от 10~7М до КГ3!^ и затем отбирали семена через 16, 22 и 24 ч, что соответствовало влажности осевых органов 65, 68 и 72Х. Затем семена подсушивали, пока влажность их осевых органов не сниэится до заданного уровня. При повторном намачивании следили sa временем регидратации осевых органов до той влажности, которую они имели перед началом высушивания. При подсушивании семян и их регидратации диапазон влажности осевых органов выдерживали с разбросом 1.5Х.

i'jz&pssisa гю£хис£зтр cpsgy cceswj ops&nzxu секст. Были использованы семена, наклюнувшиеся в воде или в растворах ПА. После отделения от семядолей осевые органы инкубировали 25 мин в нескольких сменах 10"^ Сайг и 15 мин в 10-3Ы КС1 (Обручева,Антипо-ва,1994), Для "измерения сдвига рН в 10 мл Ю"3« КС1 (рН 6.2) помечали 100 зародьшевых осей. Прямое действие ПА на подкисление раствора изучали, добавляя ПА в инкубационную среду, когда осевые органы переставали сами подкислять раствор.

/йшжшеякгэс! сзалаш. Содержание свободных аминокислот и амидов в спиртовых экстрактах- из осевых органса зародышей прорастающих сешш определяла на аминокислотной анализаторе AAA-339 (Чехословакия).

полгглггаз. Разделение свободных ПА проводили по методу Эядо (Endo,1983) с помсщь» колоночной жидкостной хроматографии на фосфоцеллюлозе Р11 Fibrous form, England. Рабочий объем колоша - О.бхЗси. Навеска сырого растительного матери-ада 200-1000 кг фиксировали в жидком авоте, растирали в 0.4 Ы НСЮд (100 ыг:1 ил1 п экстрагировали на льду в течение часа. Пробы центрифугировали 20 иин при 5 OOOg при 4°С. Супернатант сливали в пластиковые пурыръкя, доводили 2М КОН до рН 4-6 и давали отстояться а течение 10-15 ман при 2-4°С. Затем пробу в 2 ил переносили на колонку. ПА элюировали градиентом возрастающей концентрации NaCl в

боратном буфере. Подобранные концентрации N301 и объем элюента для оптимального разделения ПА показаны в табл.1. Объем фракций - 2 мл, скорость элюции - 40 мл/час. Содержание ПА в фракциях элюата определяли по оптической плотности растворов после реакции с 2,4,6-три-нитробензолсульфонатом в диметилсульфоксиде при длине волны 420 нм. Калибровочные кривые имели прямолинейные участки в. диапазоне концентраций 2-25 нмоль/мл для Пут, Спд и Спм в соответствующем буфере.

Таблица 1

Разделение полиаминов методом жидкостной хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке

Буферы V элюата Элюируемые соединения

1. 0.03 М Ыа-фосфатный рН 6.2 2. 0.06 М N8-фосфатный рН 6.2 3. 0.1 М боратный рН 8.5 0.1 М N301 8 мл 6 мл 10 мл многие первичные амины пептиды, аминокислоты

4. 0.2 М боратный рН 8.5 0.25 М N301 24 мл путресцин

5. 0.2 М боратный рН 8.5 0.50 М ЫаС1 20 мл спермидин

б. 0.2 М боратный рН 8.5 0.75 М N301 14 мл спермин

7. 0.2 М боратный рН 8.5 . 1.5 М ЫаС! 6-8 мл промывание колонки

Типичная картина разделения ПА в навеы материале приведена на рис.1; примененный метод позволил обнаружить и измерить три полиамина: Пут, Спд и Спм. Точность составляла 0.1 нмоль/мл. Анализы проводили в трехкратной биологической повторности, данные представлены в виде среднего арифметического и его ошибки.

РадюивоаолтгЗ повод. Для идентификации пика путресцина к су-пернатанту добавляли Нэ-путресцин (АтеггЬат, Англия) с удельной активностью 28 Ки/ммоль; разделяли обычным способом и определяли локализацию пика Пут по цветной реакции и параллельно - с толуольним сиинтклляторои на сцкнтилляционном счетчике (ЛКБ, Швеция) (рис.2). Чтс£<ы выя;нить, синтезируется ли Кад в проростках кормовых бобов, осевые органы инкубировали 24ч с предшественником Кад -

оптическая плотность

0.4

о.з

0.2

0.1

0.0

Спд

Спы

оптическая плотность имп/мин

5000-г

N фракции

Рис.1. Разделение полиаминов на фосфоцеллюловной колонке. Осевые органы семян бобов при проклевывалии (18 ч).

оптическая плотность 0.5

имп/мин 10000-

10 15 20 25 30

N фракции

Рис.3. Разделение полиаминов иэ экстрактов осевых органов бобов (А) и гороха (Б), инку-Рис.2, Локализация Пут в эпзате зк- бированных в растворе кечено-стракта из осевых органов бобов (Збч). го лизина.

ЬЛ1-14С/-лиэином (Чехословакия) с активностью 4 МБк. Осевые органы инкубировали в течение суток в растворе 14С-ли8ина (50 мкл на 10 мл дистиллированной воды). После стандартного разделения ПА определяли положение пика по цветной реакции и с толуольным сцинтиллятором (рис.ЗА). Параллельно инкубировали в тех же условиях осевые органы проростков гороха Plsum sativum L., в которых кадаверин заведомо синтезируется (Smith,1S8G). Иа рис.ЗБ следует, что проростки кормовых бобов, в отличие от гороха, не синтезируют Кад.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика роста проростков кормовш Собог.

Бобы обладают гипогеальным типом прорастания, т.е. не выносят семядоли на поверхность почвы. Наклевываиие семян, происходит за счет растяжения клеток гипокотиля, проталкивавшего нерастущий пока корешок черев семенную кожуру (18ч от начала набухания).

18 ч 28 ч Эб ч

Проклевывание Рост ги- Начало де-кореска за покотидя лений в счет растяяе- и корня корне; рост нкя клеток еа счет гипокотиля гипокотиля растяле- за счет

ния кле- растяжения; ток. нет притока из семядолей.

Ркс.4. Рост осевых органов аародша прорастаюаих семян бобов. Корень (о), эпккотияь Ш, гклскотиль (а)

46 ч

Рост корня и зпи-кот иля. за счет и деления, и растяжения клеток; начался приток ве-аеств кз семядолей.

72 ч Интенсивный рост корня и эпикотиля; ги-покоткль закончил рост; приток из семядолей продолжается.

- и -

Рост гипокотиля осуществляется только эа счет растяжения клеток, делений клеток в нем не происходит, поэтому он обладает ограниченным ростом, заканчивающимся после двух суток. Вторым начинает растягиваться корень (уже после прорыва семенной кожуры). Много позднее (через 18ч после проклевывания) в корневой меристеме начинается деление клеток, и с этого момента корень быстро растет в длину как за счет растяжения имевшихся клеток, так и за счет растяжения образовавшихся в результате деления клеток. Последним начинает растягиваться зпикотиль. Деления клеток в 'нем начинаются еще позже - через сутки после проклевывания. До 36ч все осевые органы растут только за счет растяжения меток. Приток запасных веществ из семядолей в осевые органы начинается после 36ч.

Дейстгио падааминси на прорастание семян.

Все испытанные ПА (Пут, Спд, Спм и Кад) в широком диапазоне концентраций от Ю-10 до 10-3М не влияют на физиологические механизмы, подготавливающие начало растяжения клеток. Во-первых, ПА не ускоряют накопление осмотически-активных веществ, о чем мы судили по отсутствию какого-либо ускорения регидратации семян, набухавших в растворах ПА. Во-вторых, ПА не влияют на подкисление клеточных оболочек, способствующее повышению их пластичности, необходимому для начала растяжения клеток. Отсутствие действия ПА на подготовку растяжения приводит и к отсутствию его влияния на собственно накле-вываниё семян,, происходящее эа счет растяжения. Так, экзогенные ПА не влияют на теш наклевывания семян ( выборочные кривые на рис.б) и на сам ход растяжения клеток осевых органов, т.е. на начальный рост проростков.

путресцин

спермидин

¥оо 1 1 .....1 ' 1 ' Г 1 I Г

во в-У

во |/ |/

.40 "У 1

20 - § 1

0 ФУ 0й! 1 1 .,1. 1.....-Л ! 1.1 .

время,ч

20 40 £0 О 20 40 60 ВО 100

Рис.5. Наклевыьание. семян, бобов в,„растворах путресцина в свермидина: (?), 10~7М (V), 10 9М .(о), контроль-вода (о).

Поскольку экзогенные ПА не влияли на прорастание семян, мы предположили, что в самих семенах содержатся ПА в достаточном количестве. Поэтому следующей задачей было изучение содержания эндогенных ПА в прорастающих семенах бобов.

Эвдогомнь® пшшаюши и аминокислоты-предшоствешиво! в семядолях н осевых органах прорастающих семян бобов.

Содержание ПА в осевых органах составляет мкмоли на г сухого веса, а в массивных семядолях бобов их на порядок меньше. В связи с тем, что исследование посвящено динамике и роли ПА в растущих органах, наиболее информативны данные по содержанию ПА в расчете на каждый орган по мере его роста.

В семядолях бобов много Спд, . Пут в два раза меньше, а Спм - в четыре раза. Содержание ПА существенно не меняется в них в течение трех суток прорастания (рис.6). Поскольку уровень Спм и в семядолях, и в осевых органах очень низок и практически не меняется при прорастании, основное внимание будет уделено Пут и Спд. нмоль/орган семядоли

Ркс.б. Количество путресцина (о), спермидина (а) и спермина (о) в отдельных органах прорастающих семян бобов.

В воздушно-сухих семенах бобов во всех органах преобладает Спд. что, по-мшимому, обусловлено интенсивно протекавзими делениями клеток еее ро время Формирования семени. В гипокотиле, растущем Оер делений, уровень Спд не меняется. В корне и эпикотиле Спд уве-

личивается по мере роста, причем больше Спд накапливается в эпико-тиле, поскольку в нем идет формирование листовых зачатков. Интенсивный рост корня, зпикотиля и медленный рост гипокотиля коррелируют с темпом накопления Пут в них. Поскольку гипокотиль растет только sa счет растяжения и в нем происходит синтез Пут, можно думать, что Пут связан с растяжением клеток. Это подтверждается тем, что еще более интенсивное накопление Пут происходит в корне и апикоти-ле, которые растут в длину главным образом за счет растяжения имевшихся и вновь' образовавшихся клеток.

В осевых органах, в отличие от семядолей, очевидно сильное возрастание количества Пут по мере их роста. В корне Пут возрастает в 100 раз по сравнению с исходным уровнем, в эпикотиле - в 50 раз, в гипокотиле - в 30 раз. Такое интенсивное накопление Пут прямо указывает на синтез ПА в растущих осевых органах; его нельзя отнести аа счет высвобождения из связанного состояния, так как количество связанных ПА в проростках составляет всего 1-4Х от свободных (Torrigiani et al.,1088).

Пут образуется в растениях из аминокислот орнитинового цикла: из Apr (через Агм) и непосредственно из Орн и Цит с помощью соответствующих декарбоксилаз путем отщепления СОг- У Vicia faba Apr высвобождается в больших количествах при протеолизе запасных белков при прорастании семян (Boulter,Davis,1968;Millerd et al.,1971). Кроме того, Apr может накапливаться■и за счет биосинтеза при участии орнитинового цикла, который также действует в прорастающих семенах кормовых бобов (Kolloffel,Van Dljke,1975). Орн может образоваться или. из глутамата, или под действием аргиназы из Apr (Thompson,1980).

Диамин Пут далее дает начало Спд. Наращивание цепочки ПА происходит за счет присоединения шинопропиловой группы от метионина с помощью шинопропидтрансфераэы; Спд таким же образом может превращаться в Спм (Suresh.Adiga,1977;Sindhu,Cohen,1984;Katoh.Hasegasa, 1989). Так как растения семейства бобовых содержат ограниченные количества метионина (Lea,Norris,1976), они могут использовать альтернативный механизм синтеза Спд с использованием относительно доступного аспартата как донора ачинопропиловых групп (Adlga, Prasad, 1085).

В прорастающих семенах кормовых бобов мы изучили динамику всех свободных аминокислот' в связи с динамикой ПА и показали, чтр аминокислоты, входящие в орнитиновый цикл (Орн и Цит) обнаруживаются в

осевых органах только после Збч (рис.7). Следовательно, биосинтез ПА идет по-разному - до 36ч и после, кмоль/орган

корень эпикотиль гипокотиль

До 36 ч, пока еще нет притока веществ иа семядолей, ПА могут синтезироваться только ва счет собственного Apr, уровень которого вначале невелик. Из рис.7 видно, что количество Apr,во всех осевых органах резко увеличивается, по-видимому, за счет высвобсвдения Apr из вал ¿юных белков самих осевых органов; дальнейшее снижение уровня Apr ыокно объяснить его использованием на синтез ПА.

После 36 часов в осевых органах начинает функционировать орни-тиновый цикл. Синтез ПА идет гораздо более интенсивно, что, по-видимому, связано с начавпиыся притоком веществ в осевые органы из семядолей. В осевых органах ш наблвдали заметное возрастание количества аспарагина после Збч сначала в гипокоткле, затем в корне а эпикотиле, что свидетельствует о начале поступления азотсодержащих соединений из семядолей в осевые органы (глутаыина в прорастающих . семенах бобов «ало). Аспарагин, притекший в осевые органа, кокет превращаться в них через глутауат в орнитин и тем саьш активно ис~ . пользоваться на синтез ПА.

Таким образом, в осевых органах происходит интенсивное накопление ПА. которое маяно объяснить только синтезов ПА de novo; притока ПА иа семядолей в осевые органы не происходит, так как в семя-

долях не наблюдается снижения уровня ПА (рис.б). Для, интенсивного синтеза ПА в осевых органах при прорастании семени и росте проростка всегда есть аминокислоты - предшественники. На этапе до 36 часов ПА синтезируются за счет свободного Apr и в большей степени за счет ■ Apr, образующегося при мобилизации собственных запасных белков; после начала притока, из семядолей амиды (в основном, аспарагин) превращаются в осевых органах в аминокислоты, вовлекаются в орнити-новый цикл, давая предшественников ПА, из которых в самих осевых органах, идет интенсивный синтез ПА.

Зависийостй кеяду ростом клеток растяттем и кекоплепкем путрссцга!а, а ташк» «еяду делением плотен и иакоплениэм спермкдгага.

Для выяснения зависимости между ростом и содержанием ПА мы сравнили динамику обоих показателей в гипокотиле, корне и апикотилег после проклевывания семян кормовых бобов (рис.4 и рис.б). Из них. видно, что с ростом органов в длину коррелирует только содержание Пут, тогда как количество Спд и Спм с ростом не коррелирует.

Для удобства рассмотрения динамика роста осевых органов и количество Пут на орган показаны на рис,8.

длина, им Пут,нмоль/орган _ -

корень • эпикотидь гипокотиль

Рис.в. Рост (сплошные линии) и уровень путресцина (пунктир) под воздействием г-облучения и осмотика. Семена, облученные у-луча!,«I в дозе 100 кр (о), помещенные в Ж ПЭГ (п), контроль (о).

В гипокотиле, растущем только за счет растяжения клеток, происходит интенсивное накопление'Пут, которое продолжается, но гораздо медленнее, после остановки роста гипокотиля. В случае корня и эпикоти-ля положительная корреляция между возрастанием количества Пут и ростом органа в длину еще более заметна. По-видимому, накопление Пут связано именно с растяжением клеток, так как увеличение размеров органов обусловлено в первую очередь ростом клеток в длину; чем длиннее орган, тем больше в нем растягивающихся и завершивших растяжение клеток. Пут локализован, в основном, в базальных частях корня и гипокотиля проростков сои (Lin,1984). О зависимости между длиной корней и отношением Пут/Спд судили по одинаковому виду сиг-моидных кривых у проростков гороха, томата и проса (Shen.Galston, 1985). У этиолированных проростков гороха и чечевицы, характеризующихся более интенсивным растяжением, по сравнению с растениями, растущими на свету, уровень Пут на г сыр.в. в 4-6 раз выше (Fedorico,Ange1ini,1988).

Чтобы проверить, действительно ли существует прямая зависимость между содержанием Пут и растяжением клеток, рассмотрим результаты опытов с подавлением растяжения клеток при инкубировании семян в осмотике. Помещение семян в 30% полизтиленгликоль в момент проклевывания привело к остановке роста органов в длину и прекращению накопления Пут, Отчетливо видна эта закономерность на рис.8. В обсуждаемом варианте не происходит ни делений, ни растяжения клеток.

Третья серия опытов была поставлена с облученными семенами, у которых деления клеток в осевых органах не происходило из-sa повреждения ДНК. На рис.10 показано содержание отдельных ПА и их суммы в 5 мм корнях семян, облученных ï-лучами в разных дозах. Для дальнейших опытов мы выбрали дозу 100 кр, при которой облучение уже предотвращает деления клеток, но еще не нарушает синтез полиаыи-нов. Кроме того, мы сравнили осевые органы из облученных и необлу-ченных семян по содержанию ПА на г сырого веса и убедились, что ■• между ними нет существенной разницы.

Осевые органы таких семян, облученных v-лучами в дозе 100 кр росли только за счет растяжения имевшихся в зародыше клеток, причем само растяжение происходило медленнее, чем в контроле. Накопление Пут в гипокотилях, корнях и эпикотшшх из облученных семян происходило также гораздо слабее, чем в контроле.

нмоль/орган

дова облучения, кр

На рис.10 представлены корреляции между длиной корней (1) и эпикотилей (2) из облученных и необлученных семян и содержанием в них Пут. Даже при отсутствии делений и замедлении, растяжения клеток связь между логарифмом длины и логарифмом количества Пут на орган остается линейной, и постоянной величиной. • - .•

Рис.9. Путресцин (®), спермидян (v), спермин (?) и сумма полиаминов (о) в 5 мм корнях проросших семян бобов, облученных в воздушно-сухом состоянии г-лучами в разных дозах, ln Fut ln Put

О 1 ■ 2 3 4 ln 1 0.3 1.2 ' 1.6 ln } 2.0

Рис.10. Корреляции между длиной (в виде натурального логарифма) органов контрольных семян (О) и облученных г-лучам в дезе 100 кр (о) и количеством путресцина в них (таске в виде натурального логарифма). 1 - корень; 2 - эпикотиль.

На рис.8 все три серии экспериментов (необработанные, выдержанные в осмотике и облученные семена) наглядно демонстрируют, что существует прямая зависимость между растяжением клеток и синтезом Пут, причем воздействие именно на растяжение влияет на ход синтеза Пут. Мы предполагаем, что связь процесса растяжения клеток с синтезом Пут обусловлена происходящим при растяжении усилением в клетках многих метаболических процессов, в том числе синтева белков, РНК.и многих ферментов (Обручева,1965;Хавкин,1978). По мнению О.Хэби и ' Л.Перссона (Heby,Persson,1990) ПА поддерживают структуру матричной, рибосомальной и транспортной РНК. Кроме того. Пут .может прочно связываться с рибосомами, в опытах 1л vitro он способствует реассоциа-ции рибосомальных субъединиц (Qalston.Saivhney.lS90).

При. завершении растяжения, например, в гипокотилях контрольных растений, синтез Пут замедляется, что позволяет думать, что Пут отчасти выполнил свою физиологическую роль в растягивающихся клетках. При. завершении растяжения в гипокотиле, корне и эпикотиле облученных семян также наблюдается замедление накопления Пут. Модно думать, что по окончании роста часть ПА разрушается путем их окисления (Smith,1980;Angellni et al,1988;Torrigianl et al,1989). Извест-,' но, что по окончании роста клеток часть ПА выходит черев плазмалем-му в апопласт. Так, в молодых клетках гипокотиля вигны большая часть ПА локализована в протопласте, а в зрелых - связана с клеточными оболочками- (Goldberg,Perdrizet,1984). В оболочках выроспих .клеток Пут окисляется диаминоксидазаш, образующаяся Н2О2 используется пероксидазами для окисления предшественников лигнина, что приводит к.лигнификации клеточных оболочек (Torrlgieni et al.,1988¡Angelina .1993),

На рис.11 представлены аналогичные графики для Спд. Здесь, очевидна другая закономерность: нет возрастания количества Спд, коррелирующего с увеличением длины органа у контрольных растений. У гипокотиля его содержание не меняется. Поскольку физиологическая роль г Спд заключается, вероятно, в поддер-хании стабильности двухцепочеч-ной ^НК (Heby,Persson,109O), его уровень следует соотносить, в первого очередь, с делением клеток. Очевидно, что такая динамика Спд в гипокотиле свявана с тем, что рост его происходит без участия деления клеток. У эпикотиля Спд еамвтно превышает исходный уровень, особенно после 48 ч, по-видимому, в связи с началом развития зачатков первых листьев в апексе. Одна:-», такой подпой корреляции кеиду

- 19 -

длина, мм Спд,нмоль/орган

корень эпикотиль гипокотиль

время, ч

Рио,11. Рост (сплошные линии) и уровень спермидина (пунктир) под Елдайствием у-оОлучения и осмотика. Семена, облученные г-лучами в доее 100 кр (о), помещенные в ЭОХ ПЭГ (а), контроль (О)..

накоплением Спд и ростом, которую мы наблюдали для Пут на рис.8, вдесь нет. В корнях контрольных проростков содержание Спд увеличивается с началом делений примерно в 2 рава, что связано, вероятно, с функционированием только одной (апикальной) меристемы. При задержке растяяения клеток оснотиком в корне и в эпикотиле еще не начинаются деления клеток. Для них характерно поддержание Спд и Спм. на исходной уровне. При повреждении ДНК облучением Сод такхе не увеличивается.

Из приведенного материала следует, что во всех случаях, когда делений нет, уровень Спд не меняется (у-облучение, все органы; инкубирование в 0050ТКК8, корень, эпикотиль; контрольные семена, гипокотиль), тогда как его колггчество возрастает в тех органах, в которых деление происходит (контрольные семена, корень и эпикотиль). Известно, что на ранних стадиях прорастания семян пшеницы,. сои и подсолнечника динамика Спд коррелирует с началом делений (Anqullle-з1 et al.,1980;(fefnamik.Fryinan.1990). Кроме того, Спд и Спм в основном обнаруживаются в апикальных венах корня и стебля (Lln,1384;

Shen,Galston,1985; Federlco,Angelini,1988; Scocclantl et al.,1990). Наивысший уровень Спд' и Спм был в почках сосны до побегообразования (Konigshofer.1990).

Общий вывод из проведенных экспериментов заключается в том, что Пут связан с растяжением клеток, а Спд - с делением клеток. Такой вывод можно в общих чертах сделать и из совокупности работ, приведенных в литературном обзоре . Однако, сама констатация зависимости еще не объясняет, что является причиной и что является следствием. Например, образование ли Пут необходимо для начала растяжения клеток, или же синтев Пут является следствием начавшегося растяжения. Опыты с ингибированием синтеза ПА могли бы ответить на вопрос, необходимы ли ПА для роста, в частности, для деления клеток. Применение таких ингибиторов не дало четкого положительного ответа на этот вопрос, так как результаты оказались противоречивыми. Во многих случаях ингибирование ферментов биосинтеза ПА не приводило к эффективному ингибированию роста (Phillips et al.,1987, 1988;Fellx,Harr,1989;Wengoll et al.,1989;Birecka et al.,1991), a иногда даже вызывало стимулирование роста (Berlln,Forche,1981; Fallon.Phillips,1988;Fobert,Webb,1988;Burtln et al. ,1989;Kaur-Sawh-,'ney et al. ,1989).

.Наши опыты с осмотиком и облучением позволили подойти к поставленному вопросу с другой стороны: воздействовать на ростовые процессы и проследить за динамикой ПА. Оказалось, что синтез Пут .является следствием начавшегося растяжения клеток, а.синтев Спд -следствием начавшихся делений (при наличии в клетках осевых органов определенного уровня ПА, достигнутого при формировании семян). Это заключение находится в соответствии с результатами опытов по применению экзогенных ПА. Негативные результаты воздействия ПА объясняются тем, что па пшигзэннэ концентрации ПА (достигаемое добавлением ПА или их синтезом) запускает или ускоряет ростовой процесс, а сам ростовой процесс вызывает усиление синтеза соответствующих эндоген-- них ПА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Рассмотрим в заключение, как в целом происходит прорастание семян кормовых бобов, с учетом полученных в диссертации результатов.

Прорастанию кормовых бобов предшествует их набухание, приводящее ^повышению оводненности как-семядолей, так и осевых органов. ■ По мере поступления в них воды последовательно достигаются порого-

вые уровни влажности, позволяющие начаться ключевым процессам метаболизма. Уже при 20-257. влажности возобновляется работа дыхательных систем и основной метаболизм, включающий и превращения аминокислот; при достижении влажности 40-457. начинается синтез белков и РНК; при 60-55Х начинается мобилизация запасных отложений. Активация аминокислотного метаболизма позволяет начаться биосинтезу ПА при достаточно низкой влажности; Следовательно, превращения и образование ПА не лимитируются ходом набухания семян. Ход активации метаболизма и в семядолях, и в осевых органах одинаков, однако в семядолях он происходит гораздо медленнее; все процессы, в том числе мобилизация запасных белков, в осевых органах начинается гораздо раньше. , . '

Ко времени достижения 60Х влажности активированы уже все- основные метаболические системы, и в осевых органах, в отличие от семядолей, начинают работать.физиологические механизмы, подготавливающие начало растяжения клеток: накопление осмотически-активных веществ, обеспечивающее дальнейшее поступление воды, и активация плазмалеммных АТФ-аз, приводящая к выделению протонов в оболочки клеток, их подкислению и увеличению пластичности. Они инициируются, в результате повышения влажности осевых органов до 65* и 68% соответственно. Пут, Спд и Спм не оказывают влияния на эти процессы.

Проклевывание корешка, т.е. начало прорастания, достигается за счет растяжения клеток гипокотиля при его влажности 722; растяжение клеток корня начинается немного позднее; много позже (через 18-20ч после проклевывания) начинаются деления клеток в корневой меристе-' ме. Первый период жизнедеятельности осевых органов у проросших семян кормовых бобов длится от момента наклевывания (18ч) до начала притока веществ из семядолей (36ч) и начала делений (3б-38ч); в те-. чение этого периода все осевые органы растут только за счет растяжения составляющих их клеток. Пут, , Спд и Спм не влияют на начало растяжения клеток при проклевывании корешка и на сам ход растяжения, т.е. на рост проростка.

К моменту проклевывания осевые органы содержат относительно мало Пут и достаточные количества Спд и Спм, что, по-видимому, было обусловлено интенсивно протекавшими делениями клеток еще во время формирования зародыша (при очень незначительном увеличении объема клеток). Начавшееся в осевых органах растяжение клеток вызывает образование дополнительных количеств Пут, но не влияет на содержание Спд и Спм. Синтез Пут происходит иэ аргинина, отчасти имеющегося в

- гг -

осевых органах, а в основном возникшего при протеоливе запасных белков в самих осевых 'органах. Усиление метаболизма, происходящее при растяжении клеток, полностью базируется в этот период на использовании запасных отложений в клетках осевых органов. В осевых органах при растяжении клеток происходят активно превращения аминокислот и интенсивный синтез белков, образуются de novo многие ферменты, усиливается синтез РНК, образуются новые рибосомы; в целом усиливаются все стороны метаболизма, возрастает масса цитоплазмы, клеточных мембран и растет вакуоль, происходит образование и встраивание новых компонентов клеточных ободочек.

В связи с полифункциональностью ПА, разностороннее участие Пут в поддержании активно протекающего метаболизма необходимо для растягивающейся клетки. Можно предположить участие Пут в поддержании структуры матричных, транспортных и рибосомальных РНК, а также в функционировании рибосом. В цепи реакций Пут -> Спд -> Спм перехода от -Пут к Спд не происходит. Синтез Пут осуществляется с помощью АДК, локализованной в цитоплазме.

Во второй период роста осевых органов, т.е. после начала притока из семядолей продуктов мобилизации основных запасов семени, на .фоне активно поступающих в осевые органы сахарозы и аспарагина, усиливаются разнообразные синтетические процессы, в том числе в процессы синтеза полиаминов. В осевых органах начинает интенсивно функционировать орнитиновый цикл; синтез Пут в растягивавшихся ■клетках происходит теперь не только из аргинина, но и иэ орнитина. Начавшиеся деления клеток вызывают образование Спд и Спы из Пут ь меристемах. По-видимому, в меристемах функционирует другая декар-боксилаза - ОДК, активность которой сосредоточена в основной в ядре и ДНК-содержащих органеллах.

Во второй период роста, благодаря деятельности апикальных меристем корня и эпикотиля, переходят к растяжении клетки, образовавшиеся в них уже после прорастания, поддерживая тем сашм рост орга-- нов с высокой скоростью. Вместе с тем, клетки, растягивавшиеся в течение первого периода, функционируют уже как врелые клетки. В них часть ПА окисляется аминооксидазачи. В клеточных оболочках Пут, вышедший из цитоплазмы, окисляется диаминоксидазама, образуя перекись водорода, которая сразу же используется пероксидаваш для окисления и полимеризации предшественников лигнина. Таким образом ПА участвуют в-одревеснении клеточных оболочек у завершивших рост клетс;,.

Так можно .представить себе участке ПА в прорастания семян,

инициации и протекании роста проростков на начальных дтапах.

ВЫВОДЫ

1. Экзогенные полиамины в диапазоне концентраций 10-1О-10_3М не действуют.на подготовку клеток осевых органов к растяжению в семенах кормовых бобов, т.е. на накопление осмотически-активных ве-.ществ и подкисление клеточных оболочек, не ускоряют начало растяжения, т.е. наклевывание семян, а также не влияют на рост осевых органов после проклевывания.

2. Воздушно-сухие и наклюнувшиеся семена кормовых бобов содержат значительные количества эндогенных полиаминов, уровень которых составляет мкмоль/г сук.в. в осевых органах и выражается в 10 раз меньшими величинами в семядолях. Эндогенные полиачины представлены, путресцином, спермвдином и спермином, тогда как кадаверин, широко распространенный у бобовых, отсутствует.

3. В ходе прорастания семян количество полиаминов на орган возрастает в осевых органах в 10 раз', тогда как в семядолях не снижается. В корке, в эпикотиле и в гипокотиле количество путресцина возрастает наиболее интенсивно, количество спериидина растет медленнее, тогда как уровень спершша низок и почти не меняется.

4. Возрастание1 количества путресцина и спермядина в осевых органах прорастающих семян обусловлено их биосинтезом, а не притоком их из семядолей. Образование полиаминов происходит за счет имеющегося ерпотина (свободного и образующегося при гидролизе йапасяых белков) в период, предиествущяй началу притока метаболитов из се-шдолей в осевые орга:гы.

5. После начала притока из семядолей продуктов мобилизации запасных веществ, в осэвья органах начинает функционировать оркитино-енй цикл, что обеспечивает более гттеисивкнй синтез полиатюв 'из ориитина и 'гргшшиа, образующихся главным образом в результате превращений притекающего в осевые органы аспарагина.

6. Подавление растяжения•в осевьк органах (до начала делений в них) с помощью осиотпка полиэииеягликоля привело к прекращению синтеза путресцина и сохранения исходного уровня спермядина и спермина. . •

7. При облучении сеети, предотвращающем деления и замедляющем растяжение клеток, синтез путресшша ингибируется в соответствии с кнгибированием роста, а синтеза спериидива и спермина не происхо-

дит.• ....

8. На основании иеучения динамики полиаминов в осевых органах прорастающих семян при различных способах воздействия на рост, показано, что синтез путресцина происходит в результате растяжения клеток и замедляется при завершении растяжения. Возрастание спермидина в осевых органах обусловлено делением клеток.

• Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Лебедева (Котова) Д.М. Действие полиаминов на начальные этапы роста при прорастании семян бобов// Изучение, рациональное исполь-вование и охрана природных ресурсов: Тез.докл.-Рига, 1987, с.94-95.

Котова Л.М. Динамика содержания эндогенных полиаминов на начальных этапах прорастания семян кормовых бобов// III Всес.конф. мол.уч. по физиологии растительной клетки: Тез.докл.-Петрозаводск, 1988, с. 93.

Котова Л.М., Обручева Н.В. Свободные полиамины и их предшественники в осевых органах прорастающих семян// Физиология семян: Формирование, прорастание, прикладные аспекты, под ред. Х.Х. Каримо-,'ва. Душанбе: Дониш, 1S90,"'C.187-191.

Котова Л.М.- Свободные полиамины в проростках кормовых бобов// Роль ботанических садов в рациональном использовании и воспроизводстве растительных ресурсов: Tes.докл.-Ташкент: фан, 1990, .с.135-136.

Obroucheva N.Y.., Kotova L.M. Poly aulne formation related to call division and elongation in germinating seeds of ■ Vicia teba minor// Abstracts 14th International Conference on Plant Growth Substances, Amsterdam, 1993.

Обручева H.B., Антипова O.B., Котова Л.М. О запуске деления и растяжения клеток при прорастании семян кормовых бобов// Физиол. и биох. культ, раст., 1993, т.25, N 3.C.243-248.

Котова Л.М.