Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующее излучение в малых дозах и другие слабые воздействия), определяемое методом замедленной люминесценции

Веселова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующее излучение в малых дозах и другие слабые воздействия), определяемое методом замедленной люминесценции
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующее излучение в малых дозах и другие слабые воздействия), определяемое методом замедленной люминесценции"

На правах рукописи

ВЕСЕЛОВА Татьяна Владимировна

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТОЯНИЯ СЕМЯН ПРИ ИХ ХРАНЕНИИ, ПРОРАЩИВАНИИ И ПОД ДЕЙСТВИЕМ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ (ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ И ДРУГИХ СЛАБЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ), ОПРЕДЕЛЯЕМОЕ МЕТОДОМ ЗАМЕДЛЕННОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

03 00.01-03 - радиобиология 03 00 02-03 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0031БВ125

Москва, 2008 г.

003166125

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного университета им М В Ломоносова

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, профессор

Бурлакова Елена Борисовна

доктор биологических наук, профессор

Пелевина Ирина Ивановна

доктор биологических наук, акад РАЕН

Обручева Наталья Владимировна

Ведущая организация - ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и

агроэкологии, Обнинск

Защита состоится «¿7»(^шхаЛ часов на заседании

диссертационного совета Д.501 00.65 при Московском Государственном Университете им. М В Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд 557

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова Отзывы просим присылать по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им М В Ломоносова, биологический факультет Факс (495) 939-11-16

Автореферат разослан 4^.200$ г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Существует проблема разнонаправленного действия больших и малых доз ионизирующей радиации Если причины повреждающего действия больших доз достаточно хорошо изучены, то вопрос о стимулирующем действии малых доз до сих пор остается открытым, несмотря на многочисленные исследования в этой области [Бреславец, 1946, Кузин, 1995, Преображенская, 1971, ДМ Гродзинский, Гудков, 1973, Ижик, 1976, Савин, 1981, ДМ Гродзинский, 1989, Райнхарт, 1998, Miller, Miller, 1987, Sheppard, Regitmg, 1987, Mokobia et al, 2006] Интерес к проблеме вызван перспективой использования явления радиационной стимуляции растений в сельском хозяйстве с целью увеличения продуктивности растений и получения более высокого урожая

Большинство работ по радиостимуляции растений выполнено путем облучения элитных семян, результат наблюдают по урожаю Однако урожай в первую очередь зависит от всхожести семян Ее уменьшение даже на 10-20% приводит к двух-трехкратному снижению урожая [Реймерс, 1987]

При хранении семена старятся, качество и всхожесть семян снижаются, поэтому в партии семян, хранившейся несколько лет, присутствуют сильные семена, слабые (живые, но не прорастающие) и мертвые

Известны приемы предпосевной обработки семян, с помощью которых можно увеличить всхожесть семян, утраченную при хранении Кроме ионизирующей радиации в малых дозах, озвучивание [Данько и др 2000], кратковременная тепловая [Priestley, 1986, Реймерс, 1987] и ударно-волновую обработка [Игнатьев, 1976], экспонирование в электрическом и магнитных полях [Аносова и др, 1992, Бондаренко и др, 1998], лазерное облучение [Инюшин, 1978, Числова, 1988], предпосевное замачивание в растворах биологически активных веществ и др могут увеличить всхожесть семян и урожай на 15-25% [Бреславец, 1946, Преображенская, 1971, Ижик, 1976, Кузин, 1995, Савин, 1981, Гудков, 1985, Д М Гродзинский, 1989]

Возникает естественный вопрос, каким образом воздушно-сухие семена, которые годами старели, накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной предпосевной обработки приобретают способность прорастать Для того чтобы ответить на этот вопрос, надо, прежде всего, иметь представление, какие изменения в стареющих семенах приводят к снижению всхожести - появлению не прорастающих, но еще живых семян Всхожесть может быть увеличена только за счет этих семян

Старение и гибель семян обусловлены нарушением целостности клеточных мембран и повреждением ДНК [обзоры, Priestley, 1986, Bewley, Black, 1994, Smith, Berjak, 1995] Предполагают, что это вызвано продуктами свободнорадикалыюго перекисного окисления мембранных липидов Процесс старения семян уподабливают окислительному стрессу [Stewart, Bewley, 1980, Barber, 1984, Thompson et al, 1987, Senaratna, et al, 1988, Hendry, 19975, Simontacchi, Puntarulo, 1994] В последние годы обратили внимание на то, что старение семян, как и животных и человека, сопряжено с процессом неферментативного гликозилирования белков и нуклеиновых кислот (реакция Амадори-Майларда) [Серами и др, 1987, Растинг, 1993, Sun, Leopold, 1995]

Существует гипотезы, объясняющие стимуляцию жизнедеятельности растительного организма, слабыми воздействиями Одна из них предполагает, чго уровень метаболизма возрастает из-за ослабления контроля со стороны регуляторных механизмов, которые в норме ограничивают функциональную активность клетки [Александров, 1985], то есть имеет место проявление правила Арндта-Шульца Согласно другой распространенной гипотезе, стимуляция роста и развития растения трактуются как следствие гиперфункции репарационных процессов в ответ на первоначальное повреждение и появление малых количеств клеточных токсинов [Бреславец, 1946, Тимофеев-Ресовский, 1956, ДМ Гродзинский, Гудков, 1973, Савин, 1981, ДМ Гродзинский, 1989, Кузин, 1995]

У организмов в состоянии метаболического покоя (воздушно-сухие семена, пыльца, споры и др ) считают, что облучение в малых дозах и другие физические воздействия оставляют в клетках скрытые (потенциальные) повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние [Кузин, 1995] Естественно, что предполагаемые механизмы стимуляции могут включаться у семян только во время их прорастания Но еще до набухания в облученном семени развиваются пострадиационные физико-химические процессы Так, после больших доз облучения состояние семян в процессе хранения ухудшается, они теряют всхожесть («эффект хранения») Эффект стимуляции растений из семян, облученных в малых дозах, при затягивании сроков высева пропадает

Для стимуляции всхожести воздействию обычно подвергают неоднородные партии хранящихся семян, состоящие из сильных, слабых и мертвых Поскольку увеличить всхожесть партии семян можно лишь за счет живых семян, не прорастающих при данных условиях, то для исследования механизма стимулирующего действия у-радиации и других факторов необходимо иметь воздушно-сухие семена однородные по качеству Но задача деления партии

состаренных семян на фракции разного качества до проращивания до сих пор практически не была решена

Цель и задачи исследования

Целью работы было выяснить механизм изменения всхожести семян при их хранении и под действие внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий)

В задачи работы входило

1) разработка люминесцентного метода анализа качественного состава партий воздушно-сухих семян и прогнозирования их всхожести без проращивания,

2) установление взаимосвязи между люминесцентными характеристиками индивидуальных сухих семян и качеством вырастающих из них проростков,

3) исследование влияния ионизирующей радиации и других факторов, в дозах обычно используемых для стимуляции всхожести, на качественный состав партии сухих семян,

4) выяснение причины, препятствующей прорастанию ослабленных семян и роли окислительного стресса в образовании проростков с морфологическими дефектами,

5) исследование динамики всхожести семян в период после действия на семена ионизирующего излучения и тепловой обработки

На защиту выносятся следующие положения:

1 Изменение всхожести семян под влиянием ионизирующего излучения, тепловой обработки, и других физических факторов (озвучивание, механические воздействия, лазерное облучение, электрические и магнитные поля) является неспецифическим ответом, который определяется, в основном, процессами, происходящими в сухих семенах до проращивания.

2 Кратковременная стимуляция всхожести семян под влиянием физических факторов разной природы обусловлена ускорением процесса естественного старения (накопления повреждений)

Научная новизна работы Впервые показано, что при помощи регистрации фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) у воздушно-сухих семян до проращивания можно прогнозировать изменение всхожести после предпосевной обработки факторами различной природы в малых дозах (тепловое, ионизирующее излучение, акустическое воздействие, электрическое поле коронного разряда, комбинированное магнитное поле, лазерное излучение)

Измерение уровня ФКТ индивидуальных сухих семян (злаковых, бобовых,

огурцов, сосны) и анализ распределения семян по уровню ФКТ впервые позволило разделять партии воздушно-сухих семян пониженной всхожести на три дискретных фракции, отличающихся по качеству

Повышение всхожести партии можно прогнозировать по распределению сухих семян по ФКТ, если воздействие вызывает увеличение доли семян во фракции I (всхожих) за счет их перехода из фракции II (живых, но невсхожих)

Причиной стимуляции всхожести семян бобовых низкого качества после у-облучения и других воздействий в малых дозах является модификация клеточных мембран, которая сопровождается замедлением поступления воды в клетки при набухании

Впервые показано, что, регистрируя фосфоресценцию эндогенных порфиринов у набухающих семян, можно оценивать уровень дефицита кислорода под семенной оболочкой

Нарушение процесса деления у ненормальных проростков является следствием пост-гипоксического окислительного стресса после проклевывания семян При доступе воздуха к зародышу после гипоксии образование активных форм кислорода, в основном, Н2О2, наблюдали хемилюминесцентным методом в присутствии люминола Отсутствие гипоксии у семян, из которых вырастают нормальные проростки, обусловлено их более медленным набуханием, при котором потребление кислорода при дыхании зародыша компенсируется его диффузией через оболочку семени

Анализ уровня ядерной ДНК при подготовке клеток зародышевой оси к делению (переход 2С->4С) показал, что у семян фракции II торможение репликации ДНК совпадает во времени с возрастанием количества Н2О2

Практическое значение работы Разработан экспрессный метод, основанный на явлении фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ), для определения такого важного показателя качества семян как влажность (А с № 1047431, 1981) Метод позволяет оценить разницу во влажности образцов в 0,10,2% у семян и биопрепаратов (муки, крупы, конидий и др ) при содержании в них воды от 4 до 20% от сырого веса

Регистрация ФКТ индивидуальных воздушно-сухих семян позволяет характеризовать гетерогенность партии семян по влажности Метод может быть рекомендован для выделения из партии ослабленных и мертвых семян

С помощью метода ФКТ можно наблюдать последействие факторов разной природы на воздушно-сухие семена до их проращивания и контролировать жизнеспособность семян (А с № 1131488, 1982)

Разработан метод выделения из партии элитных семян огурцов семян,

имеющих высокую потенциальную продуктивность (максимальный урожай) (А с № 1570681, 1988)

Разработан метод контроля гипоксии у прорастающих семян, основанный на регистрации фосфоресценции эндогенных порфиринов Показано, что набухание семян в присутствии антиоксидантов (например, пропилгаллата) уменьшает повреждение зародыша при пост-гипоксическом окислительном стрессе и увеличивает всхожесть семян

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Межфакультетской научно-практической конференции "МГУ - сельскому хозяйству", 1982 (Москва), отчете по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме исследования в области биологической физики, 1984 (Пущино), Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии, 1984 (Кишинев), Всесоюзном научном совещании "Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности", 1985 (Минск), Всесоюзном симпозиуме "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", 1986 (Ташкент), Всесоюзном симпозиуме "Физиология семян", 1988 (Душанбе), Всесоюзной конференции "Измерительная и вычислительная техника в управлении производственными процессами в АПК", 1988 (Ленинград), Симпозиуме Интернациональной ассоциации по тестированию семян "Технологический прогресс и исследования семян", 1994 (Вагенинген, Голландия), III съезде общества физиологов России "Физико-химические проблемы физиологии растений", 1996 (Пенза), II Международном научно-практическом симпозиуме по селекции и семеноводству, 1997 (Аранжелович, Югославия), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики", 1999 (Москва), II Съезде Биофизиков России, Москва, МГУ, 1999, IV съезде общества физиологов растений России "Физиология растений — наука III тысячелетия", 1999 (Москва), Международной научно-практической конференции «Семя», 1999 (Москва), Школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 2000 (Пущино-на-Оке), Международной конференции "Растения под стрессом окружающей среды", 2001 (Москва), V конференции "Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс у растений", 2001 (Ницца, Франция), VII международном рабочем совещании по семенам, 2002 (Саламанка, Испания), Международной конференции "Семена древесных", 2002 (Ханья, Греция), Международном рабочем совещании "Новые достижения в улучшении качества семян", 2003 (Лодзь, Польша)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, в том числе 2 монографии, 17 статей в российских журналах из списка ВАК, 6

работ в рецензируемых журналах, 4 авторских свидетельства, 6 статей в сборниках и 10 тезисов международных конференций

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 276 стр машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (глава II), изложения полученных результатов (глава III), их обсуждения (глава IV), выводов, списка литературы и приложения Текст иллюстрирован 20 таблицами и 77 рисунками Список литературы включает 159 отечественных и 271 зарубежных работ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности выбранной темы в связи с имеющимися на сегодняшний день исследованиями по стимуляции жизнедеятельности растений после действия ионизирующего излучения в малых дозах и действия других факторов Сформулированы цели и задачи исследования В обзоре литературы (глава I), состоящем из четырех разделов, представлен обзор данных о радиостимуляции, предполагаемых механизмах повышения всхожести семян под влиянием различных факторов, возможных механизмах потери всхожести семенами при старении Обсуждается взаимосвязь между состоянием мембран семян и их всхожестью Дан обзор методов, которые можно использовать для индивидуальной оценки качества семян

II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II.1. Объекты Большая часть исследования проведена на семенах гороха ('Немчиновский-85 и др) и сои ('Букурия' и др) Кроме того, в работе использовали семена пшеницы, ржи, ячменя ('Рядовой'), огурцов ('Московский тепличный'), перца, подсолнечника, кукурузы, фасоли и сосны

112. Всхожесть семян определяли стандартным способом (правила ISTA -Международной ассоциации оценки качества семян, 1996) Под всхожестью партии понимают процент семян, из которых вырастают нормальные проростки Не прорастающие семена и семена, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, считаются невсхожими

II.3. Выход электролитов из семян измеряли после 1,5 ч экспонирования индивидуального семени в 2 мл дистиллированной воды Электропроводность среды определяли бесконтактным методом при помощи Oscillotitrator ОК-302 II.3. Действующие факторы:

II.3.1. Семена гороха подвергали воздействию у-излучения в

Объединенном институте ядерных исследований (Дубна) на установке ROKUS-M при мощности дозы 0,913 Гр/мин на расстоянии 75 см от источника Дозу подбирали, варьируя время облучения (1 Гр - 65,78 с) Для облучения семян в дозе 190 мГр использовали источник у-квантов 60Со (Е37) Р0=0 362 Р/час/м (мощность дозы облучения - 5,7 мГр/час, расстояние 80 см, время облучения -1/3 часа) Были выбраны 3 уровня доз сверхмалая доза 190 мГр (использована для выявления ранних цитогенетических эффектов [Корогодина и др, 2004]), стимулирующие дозы для наблюдения радиационного гормезиса 3-10 Гр, и летальная доза 100 Гр

11.3.2. Тепловую обработку семян проводили двумя способами 1 Прогревание при 40°С и 85% относительной влажности воздуха (так называемое «ускоренное старение») 2 Прогревание при 40°С герметично упакованных семян, влажность которых предварительно была увеличена до фиксированного значения («контролируемое повреждение»)

11.3.3. Лазерное облучение элитных семян огурцов проводили на вращающемся зеркальном диске в сухом затемненном помещении при температуре 20-25°С Использовали гелий-неоновый лазер ЛГ-75 (Я.^632,5 плотностью мощности 0,3 мВт/см2) дозами 100-150 импульсов (1 импульс 50 мкДж/см2) (Облученные семена были предоставлены Р С Бахтияровым)

П.3.4. Звуковую обработку выборки семян ячменя (от 100 до 500 шт) проводили в чашке Петри в течение 5 минут с помощью источника акустических волн (Звуковой генератор) мощностью 65 дБел с регулируемой частотой (с точностью 1 Гц) (Озвученные семена были предоставлены В В Егоровым)

II.3.5. Семена овса, подвергнутые светоимпульсному облучению (0,5 с, 50 МВт), и семена пшеницы после обработки электрическим полем коронного разряда (0,5 с, 2кВт/см2) с целью повышения их всхожести были получены из Всесоюзного НИИ экспериментальной физики (г Саров)

11.4. Влажность семян определяли весовым способом по правилам ISTA [1996] Сухие семена размалывали, быстро формировали из муки семян три навески по ~5 г и помещали в сушильный шкаф с 105°С на 3-5 часов до достижения постоянного веса В дальнейшем закрытые бюксы с семенами охлаждали при комнатной температуре После остывания семена взвешивали и рассчитывали влажность, как изменение веса после подсушивания, отнесенное к исходному весу

11.5. Поглощение кислорода индивидуальными семенами или выделенными зародышевыми осями определяли полярографически при 20°С электродом типа Кларка Электрод Е5047, фирмы Radiometer A/S Denmark Диаметр платинового

электрода 20 мкм Зародышевые оси инкубировали в камере с водой объемом 60 мкл После того, как при дыхании зародыша или зародышевых соей концентрация кислорода в воде снижалась до нуля, камеру вновь заполняли водой и регистрировали дыхание Процедуру повторяли 3-4 раза

II.6. Анализ содержания ядерной ДНК проводили стандартным методом [Redfearn et al, 1995] в нашей модификации Для анализа 2-мм отрезки апикальной части зародышевой оси растирали в буфере для выделения (0,2 М маннит, 10 мМ Мес-буфер, 10 мМ NaCI, 10 мМ спермин-тетрагидрохлорид, 2,5 мМ Na2-3flTA, 0,05 об/об Тритон Х-100, рН 5,8) В суспензию добавляли 10 мкл 5 мг/мл этидиум бромида - специфического флуоресцентного (ФЛ) красителя ДНК, уровень ФЛ которого пропорционален количеству ДНК в клетке (2С, 4С, 8С) ФЛ регистрировали на микрофлуорометрическом анализаторе 10 мкл суспензии помещали на предметное стекло люминесцентного микроскопа (ЛЮМАМ 13) с видеокамерой (QX3, Intel, США) Сигнал анализировали с помощью компьютерной программы, разработанной С В Гальчуком и В Б Туровецким Интенсивность ФЛ измеряли у 600-800 ядер (25-80 ядер на каждом стекле) для каждой экспериментальной точки

П.7. Определение состояния ДНК. Пятнадцать пятимиллиметровых кончиков зародышевых осей размалывали в жидком азоте с лизирующим раствором (50 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,5), 25 мМ ЭДТА, 1% СДС) Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре После добавления NaCI до 1 М концентрации смесь была депротеинизирована встряхиванием с хлороформ/спиртовым раствором (10/1 об/об) После центрифугирования в течение 10 минут при 5000 g, ДНК была выделена из жидкой фазы добавлением тройного объема этанола (96%) и растворена в 50 мМ Трис-HCf-буфере (рН 7,5), содержащем 25 мМ ЭДТА Образцы ДНК были обработаны рибонуклеазой А, не содержащей ДНКазы (50 мкМ/мл) в течение 20 мин при 37°С и затем ДНК снова осаждена добавлением тройного объема этанола (96%) Одинаковые объемы изолированной и очищенной ДНК были электрофоретически разделены в течение 2 часов в 1,2% агарозном геле при напряжении 2,3 В/см в 0,09 М Трис-боратном буфере (рН 8,3), содержащем 0,5 мкМ/мл этидиум бромида (эту работу проводили совместно с лабораторией чл-корр Б Ф Ванюшина, НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского, МГУ)

II 8. Хемилюминесценцию эмбриональных осей семян гороха измеряли в присутствии 510"5М хемилюминесцентного индикатора люминола Свечение регистрировали на хемилюминометре с одноэлектронным счетом фотонов Сигнал от фотоумножителя (ФЭУ-85), чувствительного в видимой области

спектра, поступал на усилитель, а затем на самописец Образцы во время измерения находились в термостатируемой камере Растворы каталазы (2000 U/мг, Сигма, США) и антиоксидантов (пропилгаллат [10"4М] и Р-меркаптоэтиламина [10"3М] использовали в качестве ингибиторов активных форм кислорода

II.9. Термохемилюминесценцию регистрировали на этом же хемилюминометре, сигнал с которого поступал на компьютер

11.10 фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом Объект освещали импульсами видимого света (6 мс свет, 24 мс темнота) от галогенной лампы КГМ-150 Послесвечение регистрировали в интервале 3-18 мс после прекращения освещения в видимой части спектра Сигнал с фотоумножителя поступал сначала на усилитель (рН-340), а затем на самописец Кинетику затухания свечения регистрировали в миллисекундной временной области на осциллографе с памятью С8-13

11.11. Содержание глюкозы в семенах гороха оценивали двумя независимыми методами глюкометром (Gluco care, Венгрия) и по уровню термохемилюминесценции при 150°С (метод разработан нами)

11.12. Интенсивность синтеза белка определяли по включению меченого [35SjMCTHoimiia в белки осевых органов семян гороха в течение 3-х часов набухания согласно рекомендации [Гумилевская и др , 1996]

Повторность опытов 3-5-кратная Статистическую обработку результатов при оценке средних значений по выборке проводили с помощью программ статистической обработки данных определяли средние значения, среднее квадратичное отклонение и дисперсию, использовали корреляционный анализ

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Качество семян при хранении ухудшается Из состарившихся семян наряду с нормальными проростками вырастают проростки с морфологическими дефектами (ненормальные), а часть живых семян, как и мертвые, не наклевываются вовсе [Isoly, 1957] В период прорастания семена особенно чувствительны к внешним факторам, и потому их всхожесть в большой степени зависит от условий набухания, в частности от скорости поступления воды в семена и температуры [Priestley, 1986, Vertucci, 1989] Старые семена больше подвержены повреждениям по сравнению с молодыми [Vertucci, Farant, 1995, Obroucheva, 1999] Быстрое поступление воды в клетки сухого зародыша может механически разрушить клетки [Larsson, 1968, Hoekstra et al, 2001]

При набухании у семян возникает кратковременная гипоксия, которую

семена обычно благополучно переживают [Джеймс, 1956] Причиной гипоксия у крупных семян бобовых может быть высокая скорость поглощения кислорода зародышем и медленная диффузия газа внутрь семени через семенную оболочку, поскольку семенная кожура препятствует поступлению к зародышу достаточного количества атмосферного кислорода, особенно в избыточном количестве воды [Crawford, 1977, Duke, Kakefuda, 1981, Rolletschek et al, 2002]

Вода поступает в клетки семян путем диффузии через липидный бислой и по специальным каналам, образуемым белками аквапоринами [Maurel et al, 1995,

1997, Schuurmans et al, 2003] Они формируются на поздних стадиях созревания и регулируют поступление воды в клетки семян при набухании [Johansson et al,

1998, Chrispeels et al, 1999] Скорость водного транспорта через каналы, образуемые аквапоринами, зависит от их количества и состояния (открыты или закрыты) В фосфорилированном состоянии каналы «открыты» и закрываются при дефосфорилировании, которая осуществляет фосфатаза Инактивация фосфатазы не дает каналам закрываться [Maurel et al, 1995, Johansson et al, 1998] Препараты ртути (парахлормеркурий бензоат и HgCl2) являются специфическими ингибиторами аквапоринов Они связываются с цистеином-187 белка аквапорина, стерически закрывают канал, и тормозят поступление воды в клетки Состояние каналов восстанавливается при отмывании семян восстановителем тиоловых групп дитиотрейэтолом [Maurel, 1997, Javot, Maurel, 2002] На участие аквапоринов в набухании семян указывает малая зависимость этого процесса от температуры (энергия активации прохождения воды через аквапорины меньше 5 ккал/М, а диффузии через липидный бислой -12-14 ккал/М) [Maurel, 1997]

Изучение взаимодействия этих факторов, определяющих в совокупности состояние семян при их хранении и при разных воздействиях, требует разработки специального метода, который мог бы давать интегральную оценку состояния семени на всех этапах хранения и при прорастании в режиме реального времени

III.1. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СЕМЯН

Популяция хранящихся семян содержит семена, из которых вырастают нормальные проростки (они определяют всхожесть партии), проростки с морфологическими дефектами (ненормальные проростки, которые по ГОСТу не считаются всхожими), и мертвые

Во время хранения семена стареют, и качественный состав партии меняется (рис 1) Вначале уменьшение числа всхожих семян обусловлено увеличением числа ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими

дефектами. Очевидно, что повысить всхожесть партии семян можно только за счет воздействия на ослабленные семена. Для изучения механизма «улучшения» такие семена необходимо отобрать из партии еще до проращивания. К началу нашей работы не существовало методов, которые позволили ли бы это делать.

О качестве семян обычно судят по качеству вырастающих из них проростков, а жизнеспособность определяют окрашиванием набухших

семян витальными красителями и по выходу электролитов в дистиллированную воду.

Каждую из процедур можно проводить только один раз, поэтому для выяснения изменений качества семян при хранении используют

популяционно-статистический подход. Мы разработали метод нсповреждакнцего контроля качества индиви-дуальных сухих семян.

III.1.1. Качество воздушно-сухих семян. Воздушно-сухие семена после освещения видимым светом обладают длительным послесвечением, которое затухает в течение многих минут [Веселова и др., 1985а, б]. Кинетика затухания свечения многокомпонентная. При регистрации свечения с помощью фосфороскопа в миллисекунд! юй области, оно, в основном, представлено двумя компонентами со временами жизни 1-3 и 12-20 мс.

Известно, что длительное свечение различных органических веществ, характеризуется свойствами, включающими линейную зависимость от интенсивности возбуждающего света, снижение при повышении температуры, в присутствии кислорода и повышении влажности, активируемое в присутствии ионов тяжелых металлов. Оно является фосфоресценцией с триплетного уровня при комнатной температуре [Parker el al., 1980, а, Ь]. Полученные нами характеристики свечения воздушно-сухих семян оказались сходными с таковыми для фосфоресценции органических соединений при комнатной температуре. 11а

О 2 4 6 8 10 12 17 Врем хранения, годы

Рис. 1. Схематическое представление изменения доли всхожих (светлые части столбиков), ослабленных (заштрихованные) и мертвых (черные) семян во время хранения [Bewley, Black, 1994].

основании этого мы пришли к выводу, что свечение семян также является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). Измеренный нами спектр свечения ФКТ воздушно-сухих семян широкий, неструктурированный (рис. 2, кривая 1) и, скорее всего, представляет собой сумму спектров свечения различных веществ: продуктов распада хлорофилла - порфиринов, целлюлозы, и

флавинов, которых много в

!,0

Л,6

ол

Л*

I •■

У/Л 1ал

ш зю т

Длина Волны, им

Рис. 2. Спектр ФКТ воздушно-сухих семян (1) и спектры излучения (2) и возбуждения (3) свечения набухающих семян гороха.

семенах. Оказалось, что характер спектра свечения меняется в зависимости от состояния семян. В отличие от широкого неструктурированного спектра ФКТ сухих семян, спектр свечения набухающих семян имеет четыре четко выраженных максимума, характерных для спектра фосфоресценции порфирина не содержащего металла. То есть свечение набухающих семян

обусловлено присутствием в них порфирина.

12 16 20

« I

а ч с

Влажность семян, % сыр. веса

Рис. 3. Уровень ФКТ семян фасоли (кружки), пшеницы (треугольники), гороха (ромбы) (1) и амплитуды Т2 сигнала ЯМР (2) при разном содержании воды в семенах.

Фосфоресценцию биополимеров наблюдают при криогенных температурах. При температуре выше 170 К фосфоресценция быстро снижается. Тушителем фосфоресценции является кислород [Гиллет, 1988]. Фосфоресценцию сухих семян при комнатной температуре можно наблюдать, потому что в них практически отсутствует кислород. При увлажнении семян диффузия кислорода в семя возрастает и фосфоресценция снижается. На

рис. 3 кривой 1 показано, как с увеличением содержания влаги в семенах снижается ФКТ (коэффициент корреляции -0,96- -0,98). Увлажнение семян до 1820% приводит к полному исчезновению ФКТ. При влажности семян 18-20%, судя по резкому в возрастанию амплитуды Т2 сигнала ЯМР, в семенах появляется свободная вода (рис. 3, кривая 2).

На основании зависимости ФКТ биопрепаратов и семян от влажности нами был предложен чувствительный метод оценки влажности этих объектов [Авт. свид. № 1047431, 1981]. Фосфоресцентным методом можно определить разницу в содержании воды до 0,1-0,2% при общей влажности от 4 до 20%. Другие инструментальные методы имеют близкую чувствительность, но при влажности объектов выше 30-40%.

При хранении (старении) сухих семян разных видов параллельно со снижением всхожести возрастает уровень их ФКТ (рис. 4). Коэффициент корреляции между всхожестью и уровнем ФКТ составляет -0,94 - -0,98. Поэтому, было предложено по уровню фосфоресценции семян судить о всхожести партии [Авт. свид. № 1131488, 1982].

характерно для биополимеров

100

Известно, что обезвоживание жизнедеятельных организмов при их старении [Воюцкий, 1960; Серами и др., 1987; Растит-, 1993].

Рис. 4. Соотношение между

всхожестью семян сои (1), ржи (2) =

и пшеницы (3) и их уровнем ФКТ. р Числами около верхней линии ' указана влажность семян сои \

соответствующей всхожести. 5

В процессе старения семян и их гибели содержание них воды также снижается (числа около прямой 1 на рис. 4). Вода в воздушно-сухих семенах является, в основном, связанной [Аксенов, 2006]. А в процессе гибели содержание воды уменьшается на 1,5-2%, (пятая

часть связанной воды). Известно, что такая потеря воды отражает необратимые перестройки макромолекул, сопровождающиеся уменьшением их

и ©

40 60 80 Всхожесть, %

ФКТ, отн. ед.

120

Рис 5 Распределение семян гороха в партиях с разной всхожестью по уровню ФКТ Римскими цифрами обозначены номера фракций

водоудерживающей способности [Библь, 1963, Levitt, 1972, Голдовский, 1986]

Распределение сухих семян по уровню ФКТ (фракции). Методом ФКТ можно проводить

измерения без нарушения целостности семян, что дает возможность периодически контролировать их влажность в процессе хранения Вследствие высокой чувствительности ФКТ метода можно регистрировать сигнал от отдельных семян и анализировать состав популяции На рисунке 5 показаны распределения по уровню ФКТ семян из партий разной всхожести Распределение семян гороха в партии с 98-%-ной всхожестью выглядит близким к нормальному В партии со всхожестью 72% распределение имеет два максимума, а у семян с 50%-ной всхожестью - три Тесная взаимосвязь между уровнем свечения и влажностью семян, позволила считать, что их распределение в партии по уровню ФКТ отражает распределение семян по влажности Эта закономерность легла в основу анализа гетерогенности партии семян по влажности

Средняя влажность семян в партии 72%-ной всхожести - 9,52% Однако определение влажности семян фракции I, отобранных из этой партии, как и влажность семян партии 98%-ной всхожести составляла 9,84% Влажность семян фракции II (уровень ФКТ 50-60 отн ед ) - 8,90%, а фракции III, отобранной из партии 50%-ной всхожести (уровень 80-110 отн ед) - 8,2% Это означает, что в партиях семян пониженной всхожести семена могут значительно отличаться по содержанию воды, и гетерогенность семян по влажности увеличивается

Усреднение влажности партии семян 50%-ной всхожести по всем обнаруженным фракциям с учетом их долевого вклада дает значение средней влажности при обычном (весовом) определении у нефракционированной партии -9,2%

Вид распределений по уровню ФКТ свидетельствовал о наличии в

популяции семян трех фракций (субпопуляций, групп) I, II и III, как, например, показано на рис 5 для партии семян с 50%-ной всхожестью В каждой группе семена распределены нормально, семян с промежуточным уровнем ФК Г мало

При проращивании из семян фракции I вырастали нормальные проростки Из семян фракции II преимущественно выросли проростки с морфологическими дефектами, которые считаются ненормальными Семена фракции Ш не прорастали, т к, по-видимому, были мертвыми

Таким образом, ранжируя воздушно-сухие семена по уровню ФКТ, можно выбрать семена, из которых вырастут проростки определенного качества Отобрав ослабленные семена фракции И, можно было выяснить причину, по которой из этих семян вырастают проростки с морфологическими дефектами, и уменьшается всхожесть партии семян Определив эту причину, можно понять, каким образом стимулирующие воздействия ее устраняют

III. 1.2. Набухание семян бобовых. ФКТ воздушно-сухих семян уменьшалось до фона, когда в набухающем семени появлялась свободная вода Однако, при дальнейшем увлажнении (при содержании воды в семени более 50%) у некоторых семян свечение возникало вновь, и могло в 5-10 раз превышать свечение семян в воздушно-сухом состоянии (рис 6, кривая 3) Такие семена не прорастали (подвергались лизису)

О том, что есть два вида свечения свидетельствуют спектры Спектр ФКТ сухих семян широкий В спектре излучения набухших семян (рис 2, кривая 2) присутствовали четыре характерных максимума На этом основании и, учитывая спектр возбуждения свечения (рис 2, кривая 3), был сделан вывод, что свечение набухших семян является фосфоресценцией не содержащих металла порфиринов

Рис 6 Фосфоресценция проклюнувшихся (1 и 2) и не проклюнувшегося (3) семян гороха во время набухания Стрелкой показан момент прокле-вывания Слева от пунктирной линии показано затухание ФКТ сухих семян при их увлажнении

Длительность набухания, часы

Когда зародышевый корешок у набухающего семени прорывал семенную оболочку (проклевывание семени), то свечение снижалось (кривые 1 и 2) Если уровень свечение был низкий, то вырастал нормальный проросток При среднем уровне свечения семя проклевывалось, свечение падало, но из такого семени чаще всего вырастал проросток с морфологическими дефектами

Известно, что наблюдать фосфоресценцию порфиринов можно лишь при очень низком содержании кислорода в среде (меньше 20 мкМ) [Теренин, 1967] Это означает, что у набухающих семян светятся только те структуры, где содержание кислорода меньше 20 мкМ Свечение набухших семян исчезало после нарушения целостности семенной оболочки У "потухших" на воздухе семян свечение частично восстанавливалось в атмосфере азота или при помещении семян в раствор ИагЯОз (с целью удаления из воды кислорода), что доказывает дефицит кислорода под оболочкой семени [Веселова и др, 1985в, УеэеЬуа й а1, 1988] Как нами было показано, оболочка плохо проницаема для кислорода, а кислород активно поглощается зародышем набухающего семени в процессе дыхания [Веселова и др, 2003] При содержании воды в семенах гороха 45-50% завершается митохондриогенез [ОЬгоисЬеуа, 1999] Как показано на рис 7, снижение концентрации кислорода в герметичной камере при митохондриальном дыхании зародышевых осей семян гороха приводит к пропорциональному возрастанию фосфоресценции порфиринов Блокирование митохондриального дыхания цианидом замедляло поглощение кислорода и нарастание фосфоресценции порфиринов [Веселова и др , 1985в]

Рис. 7 Соотношение между концентраций кислорода в камере и уровнем фосфоресценции порфиринов зародышевых осей семян гороха

Таким образом, уровень фосфоресценции эндогенных порфиринов у набухших семян может служить маркером степени недостатка

кислорода под оболочкой.

16 12 8 4 0

Концентрация кислорода, мкМ

MI 1.3 Термохемшиоминесцентный метод наблюдения амино-карбонильной реакции в порошках семян. Известно, что при хранении в семенах повреждения белков и нуклеиновых кислот вызывают продукты автоокисления мембранных липидов и процесс неферментативного гликозилирования восстанавливающими сахарами (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995, Sun, Leopold, 1995] Исследование роли этих процессов в снижении качества семян затрудняет определение их продуктов, имеющих сходные спектральные характеристики и присутствие в семенах флуоресцирующих соединений полифенолыюй природы [Feeney, Whitaker, 1982, Ory, St Angelo, 1982, Baker, Bradford, 1994] Известно, что хемилюминесценция возникает при автоокислении липидов [Тарусов, Журавлев, 1965] и гликозилировании белков [Castilho et al, 1994] Обычно ее регистрируют при повышенной температуре Так, например, термохемилюминесценцию листьев гороха и водорослей в красной области спектра (>650 нм), обусловленную термическим распадом перекисей липидов, наблюдали ранее [Венедиктов и др 1989, Stallaert et al, 1995]

Для определения продуктов перекисного окисления липидов и неферментативного гликозилирования белков в сухих семенах мы регистрировали температурные зависимости хемилюминесценции порошков семян (в сине-зеленой части спектра, максимум при 450 нм) В модельных опытах наблюдали TXJI в порошках аминокислот и белков с разными восстанавливающими сахарами, линоленовой кислотой (18 3) и глютаровым диальдегидом Температуру объектов от комнатной до 190-200°С повышали со скоростью 10°/мин

Термограмма порошка семян представляет экспоненциально нарастающую кривую, начиная от 110°С (рис 8, кр 1)

Рис 8 Термограмма хемилюминесценции порошка семян огурцов без добавок (1) и с добавлением 0,5%-ного раствора глютарового диальдегида (2) и 2,5% порошка глюкозы (3)

400

90 130

Температура, град. С

170

семян с глюкозой свидетельствует о том, что при температуре выше 130°С свечение обусловлено участием в хемилюминесцент-ной

реакции глюкозы (максимум при 150°С, кривая 3) В области температур от 50 до 110°С в ТХЛ, по-видимому, участвуют продукты

перекисного окисления

липидов, как показывает термограмма порошка семян при добавлении глютарового диальдегида (кривая 2) Рис 9 ТХЛ не окисленной (1, 3) и окисленной Свечение порошка из мертвых (2, 4) линоленовой кислоты, иммобилизован- семян при этих температурах в ной на кварцевом песке (I, 2) и порошке

триптофана (3, 4) несколько раз превышало фон

После обработки порошка хлороформ-метанольной смесью свечение пропадало Иммобилизованная на кварцевом песке линоленовая кислота (18 3), имела низкий уровень ТХЛ (рис 9, кривые 1, 2) В присутствии порошка триптофана ТХЛ окисленной кислоты многократно возрастала (кривая 4) Те для возникновения ТХЛ в этой химической системе необходимо наличие аминогруппы 0,5%-ный раствор глютарового диальдегида активировал хемилюминесценцию различных аминокислот и коллагена (данные не приведены) ТХЛ при 90°С использовали как свидетельство присутствия в семенах продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот

В модельных опытах наблюдали ТХЛ в смеси глюкозы с различными аминокислотами и растительными белками Эти вещества в отдельности не обладали ТХЛ Термограммы смеси аминокислот и белков с глюкозой в координатах Аррениуса имели такой же наклон (энергию активации), что и термограмма порошка семян Это позволило предположить, что свечение семян при высокой температуре обусловлено реакцией гликозилирования

Пропорционально увеличению количества экзогенной глюкозы в порошке семян (от 0,2 до 5 мг/г) возрастал уровень ТХЛ при 150°С (рис 10) На основании этой зависимости можно показать, что количество эндогенной глюкозы в

250 200

о 150 а 100

а.

! •

А3

• 4 I

I •

•* л?

i А

9_ООО о!

40 60 80 1 100 120

Температура, град С

порошке семян гороха не превышает 0,1 мг/г семян. Подобное же значение (0,080,11 мг/г) содержания глюкозы в семенах гороха и сои приводятся в литературе [Locher, Bucheli, 1998].

600

Рис. 10. Зависимость стимуляции уровня ТХЛ при 150°С от количества глюкозы, добавленной к порошку семян гороха (черные ромбы).

На основании этих результатов уровень ТХЛ порошка сухих семян при 150°С мы использовали как показатель содержания в них глюкозы.

0,01 0,1 1 10 100 Количество экзогенной глюкозы, мг/г

III.2. ДИНАМИКА КАЧЕСТВА СЕМЯН ПРИ РАЗНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

Поскольку нами был разработан метод оценки индивидуального качества семян, представляло интерес проверить, можно ли анализируя распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ прогнозировать их качество в зависимости от дозы воздействия. Действующими факторами были выбраны у-облучение и влаго-тепловая обработка семян (40°С и 85% относительная влажность воздуха). Проникающая радиация, как и тепловая обработка, ускоряют старение семян [Roberts, 1972].

Ш.2.1. Изменение ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их всхожести под влиянием влиянием у-облучения. С увеличением дозы у-облучения всхожесть семян гороха и средний уровень ФКТ воздушно-сухих семян до проращивания изменялись сложным образом.

При малых дозах 190 мГр и 3 Гр всхожесть уменьшалась до 58 и 45%, соответственно (рис. 11, кривая 1), а уровень ФКТ возрастал (кривая 2). Всхожесть семян, облученных в дозах 7 и 10 Гр, была близка к исходной. Уровень ФКТ соответствовал свечению необлученных семян.

100

л 60

0 II 111111 | || ||Щ1 | I I I 111|1 I I I I 11ц1 0

0,01 0,1 1 10 100

Доза облучения, Гр

Рис. 11. Всхожесть семян гороха (1) и средний уровень ФКТ (2) через неделю после у-облучения.

После больших доз облучения всхожесть падала и при 100 Гр составляла 4%. ФКТ возрастало и превышало исходный

уровень почти втрое у семян, облученных в дозе 100 Гр.

120

Изменение среднего

уровня ФКТ определялось изменением фракционного состава партии (рис. 12). До облучения семян гороха их распределение по уровню ФКТ было унимодальным с максимумом при 40 отн. ед. (фракция I) и небольшим плечом при 60 отн. ед. (кривая К).

Увеличение среднего уровня ФКТ после облучения в дозах 190 мГр и 3 Гр вызвано тем, что в распределении семян по уровню ФКТ количество семян

фракции I уменьшилось и увеличилось число семян во фракции II (ФКТ 60 отн. ед., кривые 190 мГр и 3 Гр). Увеличение количества живых, но невсхожих семян (фракции II) означало, что в эту фракцию перешли

семена из фракции I. После облучения в дозах

ФКТ, отн. ед.

Рис. 12. Распределение по уровню ФКТ сухих семян гороха через неделю после облучения в разных дозах. Римскими цифрами I и II обозначены номера фракций.

7 и 10 Гр распределения семян по уровню ФКТ мало отличались от контрольного Часть семян из фракции II (невсхожих) перешла во фракцию I (всхожих) Мы назвали такие семена «улучшенными», поскольку они имели такую же всхожесть, как и необлученные семена фракции I Поэтому и всхожесть семян, облученных в дозе 7 и 10 Гр стала близка исходной

Таким образом, как и средний уровень ФКТ, анализ распределения сухих семян по уровню ФКТ позволяет прогнозировать изменения всхожести в зависимости от дозы у-облучения.

111.2.2. Изменение всхожести семян гороха после теплового воздействия и ФКТ воздушно-сухих семян. С увеличением продолжительности тепловой обработки (40°С, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть семян изменялась сложным образом (рис 13, кривая 1) После индукционной фазы всхожесть снижалась, затем возрастала выше исходного уровня, и, наконец, необратимо падала Эти изменения не связаны с изменением числа живых семян (число мертвых семян не меняется (кривая 2) Еще до проращивания изменения всхожести можно было предвидеть, регистрируя до проращивания средний уровень ФКТ сухих семян (кривая 3) Изменения последнего в зависимости от времени воздействия являлось зеркальным отражением кривой всхожести

Рис 13 Всхожесть семян гороха (1), доля мертвых (2) и средний уровень ФКТ (3) сухих семян через неделю после тепловой обработки

Изменение среднего уровня ФКТ было обусловлено варьированием фрак-циионного состава сухих семян У исходных семян (всхожесть 82%) распределение по уровню ФКТ близко к нормальному с небольшим плечом справа (рис 14, кривая 0) Оно практически не менялось в течение первых четырех суток тепловой обработки После 5-7 суток обработки появлялся новый максимум II (кривая 5) Это предполагало уменьшение всхожести Распределение

0 4 8 12 16

Время тепловой обработки, дни

вновь становилось унимодальным после 8-9 суток теплового воздействия Доля семян во фракции I увеличивалась (кривая 9) за счет семян перешедших из фракции II (невсхожих) Это привело к возрастанию всхожести После 12-14 дней тепловой обработки в распределении были представлены уже три максимума (кривая 14) Третий максимум свидетельствует о появлении мертвых семян К 16-м суткам теплового воздействия в ФКТ-распределении оставался, в основном, максимум III, те большинство семян погибло Иными словами, изменение всхожести семян под влиянием теплового воздействия можно предсказать, анализируя фракционный состав партии воздушно-сухих семян ФКТ-методом

При исследовании выхода электролитов в дистиллированную воду из отдельных семян, подвергнутых тепловой обработке, тоже было показано наличие фракций в партии семян гороха [Веселова и др, 1999а] Из хороших семян фракции I выход электролитов был

минимальным, При переходе семян во фракцию II выход электролитов возрастал вдвое После перехода семян из фракции II (невсхожих) во фракцию I («улучшенных») выход электролитов становился таким же, как и у необлученных семян

Когда при отмирании Рис 14 Распределение воздушно-сухих семян

гороха через неделю после 0 дней, 5 дней (1), 9, 14 семена переходили во и 16 дней тепловой обработки (40°С, 80%) по фракцию III, выход уровню ФКТ I, II и III - номера фракций электролитов был в 3-5

раз выше, чем у

необлученных семян, свидетельствуя о нарушении целостности клеточных мембран

Переходы семян из одной фракции в другую, зарегистрированные по ФКТ, и выходу электролитов, имели скачкообразный характер Например, после 4-х суток тепловой обработки большая часть семян находилась во фракции I, но уже

ФКТ, отн ед

через сутки их значительная часть оказывалась во фракции II Если после 7 суток экспонирования при повышенной температуре доля семян во фракции II была велика, то после 8-х суток большая часть семян вновь оказывалась во фракции I

Т.о. снижение и возрастание всхожести семян как при нарастании дозы у-облучения, так и в случае теплового воздействия, обусловлены изменением фракционного состава воздушно-сухих семян (числа семян во фракциях I и II).

111.2.3. Примеры изменения ФКТ распределений воздушно-сухих семян, подвергнутых действию разных факторов На рис 15 показаны распределения семян до (кривые 1) и после (кривые 2) стимулирующего воздействия Стимулирующие всхожесть дозы были подобраны экспериментально (см методический раздел) По характеру распределения можно еще до проращивания оценить результат воздействия

Фосфоресценция при комнатной температуре, отн ед

Рис 15 Распределения семян по уровню ФКТ до (1) и после (2) а) свето-импульсной обработки семян овса (0,5с, 50 МВт), б) обработки электрическим полем коронного разряда семян пшеницы (0,5с, 2кВт/см2), в) озвучивания семян ячменя (200 гц, 5 мин, 65 дБ), импульсного облучения гелий-неоновым лазером семян огурцов (632,5 нм, 0,3 мВт/см2, 100 имп по 50 мкДж/см2)

Через 3 дня после светоимпульсной обработки семян овса вид распределения по уровню ФКТ изменялся (рис 14, а) Доля семян во фракции II уменьшилась, и возросло число семян во фракции I До обработки всхожесть партии составляла 69%, а после нее возросла до 83% за счет уменьшения числа ненормальных проростков

Через три дня после воздействия на семена пшеницы электрического поля коронного разряда происходило аналогичное изменение распределения семян по уровню ФКТ Уменьшалась доля семян фракции И и увеличивалась доля семян во фракции I (рис 14, б) Всхожесть возросла от 47 до 88%

Озвучивание семян ячменя с частотой 200 Гц увеличивало всхожесть семян от 67 до 85% При этом доля семян с низким уровнем ФКТ возрастала, и уменьшалось число семян с более высоким уровнем ФКТ (рис 14, в)

После импульсного облучения семян огурцов гелий-неоновым лазером необходима была двухдневная "отлежка", после которой можно было наблюдать переход некоторой части семян с высоким уровнем ФКТ во фракцию с более низким свечением (рис 14, г) Всхожесть семян огурцов возрастала от 82 до 91%

Таким образом, предпосевная обработка сухих семян различными по природе факторами в стимулирующих их всхожесть дозах всегда сопровождается неспецифическим увеличением доли семян во фракции I.

Ш.2.4. Стимулирующий эффект зависит от качества семян и уровня воздействия В опытах использовали семена гороха различной всхожести (98, 82, 80, 72, 56, 54, 50 и 48%) С увеличением длительности теплового воздействия (40°С, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть сначала снижалась, а затем возрастала (стимуляция) Причем эти изменения были сильнее выражены у семян с низкой всхожестью У семян с 56%-ной всхожестью она сначала снижалась до 18-20%, и затем возрастала до 64% У семян высокого качества (всхожесть 98%) термическое воздействие таких изменений всхожести не вызывало

Анализ фракционного состава партии семян по ФКТ показал, что стимуляция была выше в партии, в которой было больше семян фракции II

У семян гороха 16%-ной влажности при 40°С эффект хорошо воспроизводился Если такой же тепловой обработке подвергали семена с влажностью 20%, что увеличивает их термочувствительность, то стимулирующий эффект отсутствовал, а наблюдали только однонаправленное снижение всхожести Когда вместо увеличения влажности семян, использовали прогрев при

45°С (увеличивали силу воздействия), то стимулирующий эффект тоже пропадал Эти наблюдения подтверждают выводы других авторов о роли состояния объекта и мощности действующего фактора для проявления стимулирующих эффектов при воздействиях, имеющих разную природу [Преображенская, 1971, Александров, 1985, Кузин 1995]

На основании вышеприведенных данных мы пришли к выводу, что разнообразные факторы вызывают у воздушно-сухих семян однотипные изменения фракционного состава партии С увеличением дозы воздействия возрастает доля семян фракции II и всхожесть снижается В области доз, стимулирующих всхожесть, число семян фракции II уменьшается, и они переходят во фракцию I Дальнейшее возрастание дозы воздействия приводит к появлению семян фракции III - мертвых Эта закономерность подсказывает, что для исследования механизмов стимуляции всхожести семян, необходимо, знать как минимум фракционный состав партии, или лучше использовать отдельные фракции

П12.5. Свойства разных фракций на примере семян гороха. Для

исследования из партии необлученных отобрали семена фракции I (уровень ФКТ 20-30 отн ед) Из партии, облученных в дозе 3 Гр отобрали семена фракции II (50-60 отн ед ). Кроме того были использовали «улучшенные» семена (20-30 отн ед ) из партий семян, облученных в дозе 10 Гр Эти семена, судя по уровню ФКТ, «возвратились» из фракции II во фракцию I Из таких семян тоже вырастали нормальные проростки Семена фракции III имели уровень ФКТ 80-100 отн ед

Прежде всего, мы хотели найти отличия у семян, из которых вырастают нормальные и ненормальные проростки, а также выяснить, на каком этапе прорастания семян фракции II у проростков возникают морфологические дефекты

Семена разных фракций при одной и той же относительной влажности воздуха содержат разное количество воды Как следует из измерения ФКТ, сухие семена фракций II и III менее гидратированы Определение влажности стандартным весовым методом показало, что семена гороха из фракции I (исходных и «улучшенных») содержали 9,81 и 9,84 % воды, соответственно, а из фракции II - 8,9 %, а фракции III - 8,2 % Это может быть обусловлено как разной водоудерживающей способностью биополимеров семян, так и разной проницаемостью мембран клеток для воды

Сухие семена из разных фракций не только удерживали разное количество воды, но и с разной скоростью поглощали ее при набухании (рис 16) Семена

второй фракции вдвое быстрее поглощали воду при набухании, чем семена фракции I и «улучшенные» Семена третьей фракции поглощают воду активнее, чем семена фракции II Семенная оболочка является главным барьером на пути воды в семя Как мы показали ранее, семенная оболочка одинаково тормозила поступление воды в семена фракций I и II, т е не оболочка была причиной более быстрого поступления воды в семена фракции II по сравнению с семенами

фракции I

Рис 16 Кинетика набухания семян разных фракций (1-Ш) на влажной фильтровальной бумаге и семян фракций I, II и «улучшенных» в

присутствии ПХМБ

Семена гороха разных фракций

отличались не только по влажности и скорости поступления воды в них при набухании, но и по выходу электролитов в это время Скорость

выхода электролитов из семян фракции II вдвое, а из фракции III в 3-5 раз выше, чем из семян фракции I и «улучшенных» семян [Веселова и др , 1999]

100 О

12 24 36

Длительность набухания, часы

Ш.2.6. Взаимосвязь между скоростью набухания и возникновением дефицита кислорода у семян гороха Появление в семенах при набухании свободной воды активирует поглощение кислорода При влажности 30-35% скорость поглощения кислорода выходит на стационарный уровень Когда при влажности семян гороха 45% заканчивается митохондриогенез [ОЬгоисЬеуа, 1999], скорость поглощения кислорода вновь резко возрастает Сродство дыхания к кислороду увеличивается

На рис 17 показаны зависимости скорости поглощения кислорода семенами от его концентрации в среде После 20 ч набухания семена фракции I имели

влажность 43%, а II фракции - 50%, те у семян фракции II уже включилось цитохромное дыхание (рис 17) Регистрация поглощения кислорода семенами в оболочке и без нее показала, что оболочка семян фракции I тормозила поглощение кислорода в 2,1 раза (в оболочке 15 мкМ, а без оболочки - 32 мкМ 02/(мин семя), а семенами фракции II в 2,6 раза (29 и е 76 мкМ 02/(мин семя), соответственно) Очевидно, более высокая скорость поглощения зародышем кислорода в процессе дыхания и медленная диффузия последнего через оболочку были причиной дефицита кислорода у зародыша семян фракции II

Рис 17

Зависимости скорости поглощения кислорода набухавшими 20 ч семенами гороха I, II и III фракций в оболочке и без нее (I', II') от концентрации кислорода в камере

Семена из партии 72%-ной всхожести при набухании из-за разной скорости поглощения воды, после 20ч пребывания на влажной фильтровальной бумаге разделились на две группы (рис 18, а) в соответствии с фракциями I и И, выбранными по ФКТ Из семян фракции I (максимум в распределении по влажности на 44% (кривая 1) вырастали нормальные проростки Максимум в распределении семян фракции II приходился на влажность 50% Некоторые семена этой фракции не прорастали (кривая 3), а из других вырастали ненормальные проростки (кривая 2)

Измерение фосфоресценции порфиринов у семян набухавших в течение 20 ч показало, что семена фракции I или имели низкий уровень фосфоресценции порфиринов, или не светились вовсе (рис 18-6, кривая 1) Семена фракции II с уровнем фосфоресценции порфиринов 20-40 отн ед (соответствует концентрации кислорода под оболочкой 10-12 мкМ, рис 6), обычно проклевывались, но из них вырастали ненормальные проростки (кривая 2)

0 50 100 150 200 250 300 Концентрация кислорода, мкМ

Рис 18 Распределение семян по влажности (а) и по фосфоресценции порфиринов (б) в партии семян с 72%-ной всхожестью после 20 ч набухания 1 - семена фракции I, из которых выросли нормальные проростки, 2 - семена фракции II, из которых выросли ненормальные проростки, 3 — ненаклю-нувшиеся семена

фракции II

100

Си

и ей

н о н и я V

0 ь

0 20 40 60 80 100 120 140

Фосфоресценция порфиринов, отн.ед.

Семена с высоким уровнем свечения - 40 и более отн ед (концентрация кислорода менее 10 мкМ) не проклевывались Поскольку зародышевой корешок не мог проткнуть семенную оболочку, то они задохнулись во время набухания (кривая 3)

У мертвых семян фосфоресценция

порфиринов не возникала, тк они не дышали (рис 17, прямая III) Поэтому можно было отличить задохнувшиеся семена от исходно мертвых

Если у семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов (значительный дефицит кислорода) удаляли оболочку, то некоторые из них прорастали, но проростки имели морфологические нарушения, т е были ненормальными

Оставалось неясным, почему даже после восстановления нормальной обеспеченности зародышей кислородом из семян фракции II вырастали проростки с морфологическими дефектами

Ill 2.7. Синтез общих белков и ДНК на раиних стадиях набухания семян гороха Для прорастания семян и нормального роста необходимы синтез белков и ДНК Нарушение синтеза ДНК препятствует делению клеток зародышевых осей Торможение синтеза белка нарушает процесс растяжения клеток [Гумилевская и др, 1996, Obroucheva, 1999] Вероятно, нарушение этих процессов могло быть причиной появления проростков с морфологическими дефектами из семян фракции II Как мы показали ранее, судя по включению меченого [358]метионина в белки осевых органов в течение 3-х часов набухания семян гороха (после предварительного 19-часового набухания без метки), незначительные различия в скорости этого процесса у семян первой и второй фракций определяются только разной скоростью набухания [Veselova et al, 2004]

Также был изучен процесс репликации ДНК на стадии подготовки клеток зародышевых осей к делению После созревания семян большинство ядер в мерисгематических клетках содержат 2С набор ДНК (фазы G] или Go клеточного цикла) [Обручева, 1982, Bino et al, 1993, Redfeam et al, 1995, Gornik et al, 1997] В сухих семенах гороха III и III фракций около 90% ядер содержали 2С набор ДНК (табл 1) С увеличением времени набухания увеличивалась число ядер в фазе G2, содержащих 4С набор ДНК Динамику этого процесса отражает отношение 4С/2С

У мертвых семян фракции III удвоение ДНК не происходило и количество ядер с 2С набором ДНК не изменялось У семян гороха фракций I и II в течение 48 часов набухания количество ядер с 2С набором ДНК уменьшалось и увеличивалось число ядер с 4С набором ДНК Причем у семян фракции II, которые набухали быстрее и имели большую влажность, отношение росло сильнее Рост отношения 4С/2С означал, что повреждения ДНК либо были незначительны, либо репарированы на ранних стадиях гидратации Известно, что процесс удвоения ДНК может начинаться только после ликвидации ее нарушений [Osborne, 1983, Smith, Berjak, 1995]

Однако после проклевывания на 44-48 ч набухания отношения 4С/2С у семян фракции II прекращало увеличиваться, в то время как у семян фракции I оно продолжало расти Задержка репликации ДНК происходила накануне или после проклевывания Она могла быть вызвана продуктами брожения, образующимися под семенной оболочкой [А1-Аш et al, 1985] Дефицит кислорода под семенной оболочкой у семян фракции II возникал после 12-14 ч набухания и продолжался до момента проклевывания (40-46 ч набухания) Тем не менее, в это время удвоение ДНК происходило, т е не гипоксия в данном случае являлась

причиной прекращения репликации ДНК

Таблица 1 Соотношение ядер в состояниях 2С и 4С у зародышевых осей семян гороха разных фракций во время набухания (%)

Время набухания, ч Фракция I Фракция II Фракция III

2С 4С 4С/2С 2С 4С 4С/2С 2С 4С 4С/2С

0 88,0 12,0 0,14 88,0 12,0 0,14 91 9,0 0,10

6 84,7 15,3 0,18 82,6 17,4 0,21 90 9,0 0,10

24 75,4 23,6 0,30 71,4 28,8 0,40 90 10,0 0,11

48 56,4 39,5 0,70 54,0 46,0 0,85 90 10,0 0,11

72 30,7 63,0 2.02 53,5 46,5 0,87 89 11,0 0,12

II1.2.8 Пост-гипоксический окислительный стресс. Мы обратили внимание на то, что торможение удвоения ДНК у семян второй фракции происходило после их проклевывания, т е после перехода от гипоксии к аэробным условиям Поэтому было предположено, что причиной повреждения зародышевых осей может быть пост-гипоксический окислительный стресс Этому явлению в последние годы уделяют большое внимание в биологии и медицине Интенсивно обсуждают цитоксическое действие активных форм кислорода в пост-гипоксический период, их роль в повреждении ДНК, белков и липидов [Crawford et al, 1994, Pfister-Sieber, Brandie, 1994, Puntando, 1994, Khan, Wilson, 1995, Wojtaszek, 1997, Inze et al, 1998, Bailly et al, 1998]

В параллельных экспери-ментах мы показали, что при поступлении воздуха

к зародышевым осям семян гороха после 12-14-часовой гипоксии тушится

фосфоресенция порфири-нов и одновременно увеличивается спонтанная хеми-люминесценция (рис 19)

Рис 19 Кинетика фосфоресценции порфири-нов и хемилюминесценции зародышевых осей в период естественной

аэрации сразу после 14-часовой гипоксии

Время аэрации после гипоксии, мин

Интенсивность спонтанной хемилюминесценции растений отражает количество активных форм кислорода, генерируемых клетками корней молодых проростков [УаПареиап е1 а1, 1974, Тарусов, Веселовский, 1978,] Поэтому рост хемилюминесценции при контакте зародышевых осей с воздухом после гипоксии свидетельствует о резком возрастании в них генерации активных форм кислорода.

Таблица 2 Хемилюминесценция эмбриональных осей семян гороха (фракция I без гипоксии и фракция II после 14-часовой гипоксии) и влияние ингибиторов активных форм кислорода

Хемилюминесценция, отн.ед./концентрация Н202 Тушение хемилюминесценции, %

р-МЭА КАТ ПГ

Без гипоксии 32 ±5 (1 мкМ) 73 ±4 78±6 82 + 6

После гипоксии 2450 ±98 (-80 мкМ) 97±3 95 + 4 97 ±4

(5-МЭА - [3-меркаптоэтиламин [10"3М], ПГ - пропилгаллат [10"4М],

КАТ - каталаза [200и/мл каталазы]

Допуск воздуха к зародышевым осям после гипоксии увеличивал уровень хемилюминесценции почти на два порядка (Табл 2) Хемшпоминесценцию тушили каталаза и антиоксиданты пропилгаллат и p-меркаптоэтиламин По-видимому, основной формой активного кислорода на поверхности клеток является перекись водорода Стационарная концентрация Н202 на поверхности семян без гипоксии около 1 мкМ то в пост-гипоксический период стационарная концентрация перекиси может достигать ~80 мкмолей В таких количествах Н2Ог полностью тормозит деление как растительных, так и животных клеток, нарушая ДНК [Crawford et al, 1994]

Чтобы выяснить, происходит ли повреждение ДНК в пост-гипоксический период, исследовали состояние ДНК в клетках зародышевых осей На рисунке 20 показаны электрофореграммы ДНК из семян гороха фракций I и II

Профиль ДНК, выделенной из зародышевых осей семян фракции I выглядит компактным (гель 1) Гели 2 и 4 - ДНК выделена из зародышевых осей семян гороха второй фракции после 14 часовой гипоксии Но гель 4 - после 15 минутной аэрации зародышевых осей, а гель 2 - после 6 ч экспонирования осей на воздухе (деградация ДНК) Т е деградация ДНК происходит не во время

гипоксии, а развивается в пост-гипоксический период. Если семена в этот период инкубировали в присутствии пропилгаллата, то деградация ДНК была У 3 Р / значительно меньше (гель 3).

Рис. 20. Электрофореграмма ДНК, изолированной из зародышевых осей набухших семян гороха. Пояснения в тексте.

Эти данные указывают на то, что именно активные формы кислорода в пост-гипоксический период являются причиной прекращения удвоения ДНК и последующей ее деградации. И значит, причиной образования ненормальных проростков из семян фракции II, и снижения всхожести вссй партии семян, является пост-гипоксический окислительный стресс во время прорастания семян.

У семян фракции II, в отличие от семян фракции I, дефицит кислорода возникает из-за их более быстрого набухания и активации дыхания.

Ш.2.9. Почему возрастает скорость поглощения воды семенами после перехода из фракции I во фракцию II. Методом ФКТ были отобраны семена разного качества: необлученные семена фракции 1 (уровень ФКТ 40 ±5 отн.ед.), семена фракции II из партии, облученной в дозе 3 Гр (60 ± 5 отн.ед.), и «улучшенные» семена фракции I (40 ±5 отн.ед.), облученные в дозе 10 Гр. Набухание семян фракции II слабо зависело от температуры (Qi0 = 1,2; энергия активации 3 ккал/моль). Для семян фракций I и «улучшенных» - Q10 = 2 (Еа = 12 ккал/моль). Следовательно, при набухании семян фракции II вода в клетки поступает, по-видимому, через водные каналы, тогда как при набухании семян фракции I и «улучшенных» она диффундирует преимущественно через липидный бислой.

С целью проверить это предположение был проведен ингибиторный анализ. Обычно для исследования состояния аквапоринов широко используются ооциты лягушки Xenopus [Daniels et al., 1994; Maurel et al., 1993]. Мембраны этих клеток отличаются очень низкой собственной проницаемостью для воды. Мы

воспользовались стандартными приемами исследования состояния аквапоринов для работы на целых семенах

Влияние парахлормеркурий бензоата на набухание семян ПХМБ в концентрации 5 мкМ практически не влиял на скорость гидратации семян фракции I (необлученных и «улучшенных») (В такой концентрации ПХМБ не влиял на дыхание, для подавления дыхания используют концентрации на 2 порядка больше ) Однако семена фракции II, в присутствии ингибитора набухали в 1,8-2 раза слабее, чем без ингибитора (рис 16, кривая +ПХМБ) Если после 4-х часового пребывания в растворе ПХМБ эти семена переносили в 1 мМ раствор дитиотреиэтола (восстановитель БН-групп), то еще через 2 ч скорость поглощения воды семенами полностью восстанавливалась Это означало, что замедление поступления воды в семена фракции II в присутствии ПХМБ действительно было вызвано закрыванием водных каналов, которые исходно были открыты Поскольку ПХМБ не влиял на скорость набухания необлученных и «улучшенных» семян, то это могло свидетельствовать о том, что у этих семян во время набухания водные каналы были «закрыты»

Однако на основании этих результатов нельзя решить, были ли водные каналы в мембранах «закрыты» у сухого семени до набухания, или же закрывание происходило во время гидратации мембран

Влияние МаГ (ингибитора фосфатазы) на набухание семян Если предположить, что водные каналы у сухих семян были «закрыты», то при набухании у семян фракции I состояние каналов не изменяется, а у более слабых семян фракции II в это время каналы «открываются» Если же сухие семена хранились с «открытыми» водными каналами, то в начале набухания у семян фракции I водные каналы в мембранах «закрываются», а у семян фракции II они не «закрываются», по-видимому, из-за повреждения механизма «закрывания»

Известно, что «закрывание» водных каналов у семян обычно является следствием дефосфорилирования аквапоринов, осуществляемого быстро активируемой во время набухания фосфатазой Если ее инактивировать ЫаР, то водные каналы в мембранах не «закроются» и скорость поглощения воды семенами фракции I увеличится Если же каналы у семян фракции I были «закрыты» до набухания, то ингибирование фосфатазы не изменит скорость их набухания

В концентрации 100 мкМ ЫаР не влиял на скорость набухания семян гороха фракции II за 22 часа прибавка веса составляла, как и в отсутствии 1МаР, 85 ± 7 % В то же время у семян фракции I скорость набухания увеличивалась прибавка веса возрастала от 63 + 5 % (без ИаР) до 85 ±6 % Скорость набухания семян

фракции I в присутствии NaF становилась одинаковой с таковой у семян фракции II

Поскольку фторид натрия препятствует «закрыванию» водных каналов, то это свидетельствует о том, что у сухих семян фракций I и II водные каналы «открыты» У семян фракции I во время набухания аквапорины дефосфорилируются и каналы закрываются У семян фракции II водные каналы остаются «открытыми»

Набухание семян в присутствии NaF увеличивало количество быстро набухающих семян с последующим развитием у них гипоксического состояния Число семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов возрастало Если в контроле таких семян было 20%, то в присутствии NaF их количество возрастало

втрое (рис 21) Всхожесть партии семян падала от 80 до 40%

Важно, что набухание «улучшенных» семян не ускорялось в присутствии NaF, как в случае семян фракции I Вероятно, у этих сухих семян водные каналы «закрылись» еще до набухания Поскольку в воздушно-сухом состоянии закрывание водных каналов путем ферментативного дефосфорилирования аквапоринов исключено, то, вероятно, имеет место неферментативный механизм Так снижение качества сухих семян при хранении вызывают продукты автоокисления липидов (свободные радикалы, перекиси и альдегиды) и процесс неферментативного гликозилирования белков (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995, Sun, Leopold, 1995] Эти процессы ускоряются под влиянием внешних воздействий [Roberts, Ellis, 1982] и вероятно могут вызвать «закрывание» каналов и появление «улучшенных» семян

О 12 24 36 48 60 Последовательность семян

Рис 21 Фосфоресценция порфиринов у семян гороха из партии 80%-ной всхожести, набухавших в воде (1) и 100 мкМ растворе №Р (2) в течение 22 ч Семена расположены в порядке нарастания уровня фосфоресценции порфиринов

1112.10. Изменения всхожести семян при хранении Мы

предположили, что у семян, всхожесть которых упала сразу после воздействия (увеличение числа семян во фракции II), при дальнейшем хранении она может возрасти (появятся «улучшенные» семена) Это предположение подтверждают нижеприведенные наблюдения

Мы обнаружили, что при хранении семян гороха сорта Немчиновский-85 в производственных условиях их всхожесть изменяется немонотонно (рис 22, кривая 1) После 4-х лет хранения всхожесть семян уменьшилась с 93 до 73% Однако еще через год всхожесть оказалась равной исходной В последующие годы она опять уменьшалась и после 8 лет хранения семена практически все были невсхожими

Чтобы проверить, не связано ли изменение всхожести с качеством семян разных лет урожая, мы проверили, как изменяется всхожесть семян одного года урожая при хранении после теплового воздействия (40°С, 85% относительная влажность воздуха)

Рис 22 Всхожесть семян гороха (1) и содержание глюкозы в них (2)

2 4 6 Время хранения, годы

Изменение всхожести семян гороха при хранении после теплового воздействия тоже было не монотонным (табл 3) Всхожесть контрольных семян (0 суток тепловой обработки) в течение 7 месяцев практически не изменилась Если всхожесть семян определяли через неделю после 5-7 суточной тепловой обработки, то она падала до 22-24% Однако после 7 месяцев хранения всхожесть у тех же семян возрастала (до 40-44%) по сравнению с определенной через неделю после обработки То есть хранение семян, у которых всхожесть была понижена тепловой обработкой, приводит к увеличению их всхожести

Таблица 3 Всхожесть семян гороха через неделю и через 7 месяцев после разной продолжительности теплового воздействия (40°С, 85% относительная влажность

воздуха)

Время проращивания после обработки Время тепловой обработки, сутки

0 4 5 7 8 9 15

Всхожесть, %

Через неделю 58 52 24 22 44 68 40

Через 7 месяцев 56 52 40 44 8 0

У семян, всхожесть которых через неделю после 9 суток тепловой обработки возрастала по сравнению с исходной на 10%, после 7 месяцев хранения она, напротив, упала до 8% Хранение семян после тепловой обработки в стимулирующей дозе, приводит не только к исчезновению эффекта стимуляции, но и к более быстрой гибели, по сравнению с контрольными семенами

Изменение всхожести семян гороха при хранении после у-облучения.

Всхожесть семян, облученных в дозе 190 мГр, сначала постепенно уменьшалась в течение первых 2-х месяцев хранения, но к 5-ому месяцу восстановилась до

После облучения семян в дозе Гр она снижалась быстрее, но затем тоже восстанавливалась и через пять месяцев хранения всхожесть семян была даже выше исходной (кривая 3)

Рис 23 Всхожесть семян гороха (число нормальных проростков) в разные сроки после облучения в дозах 0 Гр (1), 190 мГр (2), 3 Гр (3) и 10 Гр (4)

уровня необлученных семян (рис 23, кривая 2)

Время после облучения, месяцы

Спустя два месяца после облучения в дозе 10 Гр всхожесть семян, которая через неделю после облучения мало отличалась от всхожести необлученных семян, снижалась быстрее (кривая 4), чем всхожесть необлученных семян и после 5 месяцев хранения была вдвое ниже всхожести контрольных семян

То есть при хранении семян можно наблюдать разнонаправленные изменения их всхожести в зависимости от дозы облучения У семян, всхожесть которых была снижена ионизирующим облучением в малой дозе, происходит ее восстановление и даже некоторая стимуляция по сравнению с изменением всхожести необлученных семян У семян, всхожесть которых после облучения в несколько больших дозах или мало отличалась от исходной или бьиа несколько повышенной, при хранении, наблюдали только однонаправленное снижение всхожести по сравнению с контролем

Однако, анализ распределений сухих семян по уровню ФКТ показал, что и при дозе облучения 10 Гр есть фаза, когда через двое суток после облучения

уменьшилась почти вдвое доля семян во фракции I и выросла доля семян фракции II (рис 24, кривая 2) Такое измерение распределения сухих семян обычно характерно для снижения всхожести Спустя 4-6 суток после облучения вновь распределение стало унимодальным (кривая 3), возросло число семян во фракции I за счет уменьшения их во фракции II Уровень ФКТ регистрировали у одних и тех же семян, помещенных в индивидуальные номерованные ячейки Можно было наблюдать, как у некоторых семян фракции I при регистрации ФКТ через двое суток после облучения, уровень свечения вырос приблизительно вдвое, а спустя

0 20 40 60 80 100 ФКТ, отн. ед.

Рис 24 Распределение семян гороха по уровню ФКТ во времени после облучения в дозе 0 и 10 Гр Семена через 2 (2) и 4 сут (3) и через 2 мес (4) после облучения

четверо суток после облучения снизился практически до исходного

Иными словами, как в случае естественного старения и тепловой обработки, так и при хранении облученных семян, наблюдаются начальное снижение всхожести, ее последующее возрастание до исходно уровня или даже выше его (стимуляция), и окончательное падение при появлении мертвых семян

III.2.11 Возможный механизм стимуляции всхожести семян под действием внешних факторов Мы показали выше, что снижение всхожести обусловлено появлением семян фракции II, для которых характерно быстрое набухание, гипоксия под оболочкой и пост-гипоксический окислительный стресс Более быстрое поглощение воды семенами фракции II объяснили тем, что аквапориновые каналы при набухании этих семян, в отличие от семян фракции I, остаются открытыми

В литературе принято, что возрастание проницаемости клеточных мембран для воды и электролитов при снижении качества семян вызвано изменением фазового состояния липидного бислоя мембран вследствие перекисного окисления фосфолипидов [Harrington, 1973, Senaratna et al, 1988, Smith, Berjak, 1995] Если у семян фракции II увеличение скорости набухания обусловлено не только состоянием водных каналов, но и изменением липидной фазы мембран, то при закрывании каналов препаратами ртути скорость набухания семян фракции II должна была бы быть выше, чем у семян фракции I Однако у семян фракции I, «улучшенных» семян и семян фракции II с блокированными ртутью каналами скорости набухания одинаковы Поэтому маловероятно, что за переходы семян из фракции I во фракцию II и последующее «превращение» семян в «улучшенные» ответственно изменение липидной фазы мембран

Мы не смогли термохемилюминесцентным (TXJI) методом зарегистрировать у семян фракций I, II и «улучшенных» продукты перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот Свечение в области температур 60-90°С наблюдали только у семян фракции III, то есть продукты перекисного окисления присутствуют только в порошке из мертвых семян Именно у последних резко возрастает проницаемость мембран для воды и ионов

Нам кажется, что многочисленные факты обнаружения продуктов перекисного окисления липидов в стареющих популяциях семян являются результатом использования выборки сухих семян, которая содержит семена разною качества, включая, мертвые Например, опыты [Senaratna et al, 1988] выполнены на семенах сои 13%-ной всхожести В наших экспериментах сопоставляли содержание перекисных продуктов у семян разных фракций, в

которые были объединены семена одинаковые по качеству

Переход воздушно-сухих семян из фракции I во фракцию II при тепловом воздействии и у-облучении, отражающий уменьшение влажности происходят достаточно быстро - в течение суток-двух При исходной влажности семян гороха 9,9% (вся вода связанная), она уменьшается примерно на 0,6-0,8% Допустить, что содержание воды в семенах уменьшается за счет ее испарения в окружающую среду маловероятно, поскольку для установления равновесной влажности необходимы большие сроки (неделя и более) Например, семена были увлажнены до 11%, затем их поместили в эксикатор с относительной влажностью воздуха 43% Равновесная влажность устанавливалась у мертвых семян через 3 сут, у семян фракции II - за 8 сут, а семян фракции I -за 20 сут В то же время после у- облучения в дозе 10 Гр переход семян из фракции I во фракцию II (со снижением содержания воды) происходил за двое суток А при дозе 3 Гр для перехода было необходимо 4 сут при относительной влажности воздуха 60% То есть уменьшение содержания воды в семенах после облучения происходило гораздо быстрее, чем ее потеря испарением Поэтому можно предположить, что снижение содержания воды в семенах происходит при гидролизе олигосахаридов, который происходит в семенах при хранении [Bernal-Lugo, Leopold, 1992, Locher, Bucheli, 1998, Zalewski, Lahuta, 1998] При гидролизе полисахаридов происходит внутриклеточное перераспределение воды некоторая доля связанной воды включается в структуру продуктов (в виде атома Н или группы ОН) Сопоставление суммарного молекулярного веса продуктов гидролиза олигосахарида, например, сахарозы, и ее исходного молекулярного веса подтверждает это предположение (180 + 180 =342 + 18)

Используя данные работы [Locher, Bucheli, 1998] о деградации олигосахаридов в семенах сои при хранении, мы рассчитали, насколько может измениться влажность семян за счет неферментативного гидролиза олигосахаридов Расчеты показали, что при гидролизе 50,07 мг/г олигосахаридов (вербаскозы, стахиозы, раффинозы и сахарозы) влажность семян должна снизиться на 0,4-0,5% Эта величина такого же порядка, что и снижение влажности семян гороха при переходе из фракции I во фракцию II. Поэтому можно предположить, что переход воздушно-сухих семян во фракцию II и уменьшение их влажности вызваны гидролизом олигосахаридов, при котором возрастает количество глюкозы Мы измерили содержание глюкозы в семенах фракций I, II и «улучшенных» Измерение проводили в порошке сухих семян термохемилюминесцентным методом по уровню свечения при 145-150°С, и глюкометром в супернатанте гомогената порошка в дистиллированной воде

Таблица 4 Содержание глюкозы в семенах гороха разных фракций

Способ определения Фракция I Фракция II «Улучшенные» Мертвые

Глюкометр, мг/г семени 0,11 ±0,02 0,25 ±0,03 0,09 ±0,03 1,2 ±0,3

TXJI, отн ед 15 ±2 40±5 25+5

Действительно, оба метода показали, что семена фракции II содержат в 2-3 раза больше глюкозы, чем семена фракции I (табл 4)

Кроме того, оказалось, что содержание глюкозы у семян гороха после 4 лет хранения, когда всхожесть снижалась из-за увеличения доли второй фракции, тоже возрастало вдвое по сравнению с исходными семенами (рис 22, кривая 2) Когда всхожесть семян после 8 лет хранения приближалась к нулевой, содержание глюкозы возрастало в десятки раз Этот факт согласуется с данными других авторов, исследовавших гидролиз олигосахаридов при старении семян [Bernal-Lugo, Leopold, 1992, Sun, Leopold, 1995, Horbowicz, 1997, Locher, Bucheli, 1998, Zahwski, Lahuta, 1998, Murthy et al, 2003]

Появление семян фракции II в партиях, облученных в дозах 190 мГр и 3 Гр, тоже сопровождалось увеличением содержания глюкозы у облученных семян по сравнению с необлученными (табл 5) После летальной дозы облучения 100 Гр количество глюкозы в семенах возрастало в 5 раз

Таблица 5 Содержание глюкозы в воздушно-сухих семенах гороха через неделю после у-облучения

Доза, Гр 0 0,19 3 7 10

TXJI, отн ед 17 ±2 28 ±4 51 ±7 27+5 11+3

Возникшие в семенах при неферментативном гидролизе восстанавлияющие сахара активно вступают в реакции с белками и аминокислотами - амино-карбонильную реакцию или реакцию гликозилирования В последние годы роль амино-карбонильной реакции (Амадори-Майларда) в старении не только семян [Wettlaufer, Leopold, 1991, Sun, Leopold, 1995, Murthy, Sun, 2000, Murthy et al, 2003], но и животных и человека активно обсуждается [Серами и др, 1987, Растинг, 1993] Отмечают, что малое содержание восстанавливающих Сахаров в сухих семенах является защитой от неферментативной амино-карбонильной

реакции, которая активно протекает в области влажностей от 6 до 15%

Переход семян из фракции II в разряд «улучшенных», сопровождающийся возрастанием влажности семян, совершается также быстро - в течение одних-трех суток (время последействия - «отлежка») В качестве возможного объяснения увеличения содержания воды в сухом семени можно предположить реакцию гликозилирования (амино-карбонильную реакцию), в которой при взаимодействии гидроксила глюкозы с концевой аминогруппой белка образуется глюкозиламин и отщепляется молекула воды Образовавшийся гликопротеин становится более гидрофильным [Wettlaufer, Leopold, 1991] Снижение содержания глюкозы коррелирует с возрастанием всхожести семян после пяти лет хранения (рис 21, кривая 2), а также стимуляцией всхожести семян после у-облучения в дозах 7 и 10 Гр (табл 5)

Мы предполагаем, что именно эта неферментативная реакция ответственна за «закрывание» водных каналов в сухих семенах и стимуляцию их всхожести К выводу о стимулирующей роли продуктов гликозилирования белков (Амадори продукты) могли бы прийти и Wettlaufer и Leopold [1991], которые привели данные о параллельном увеличении продуктов Амадори и всхожести семян сои, однако этот факт они не обсуждают Уменьшение содержания свободной глюкозы при «улучшении» качества семян подтверждает наше предположение (табл 4, 5) о том, что в «закрывании» водных каналов может участвовать реакция гликозилирования В литературе также отмечают, что гликозилирование является одной из реакций, влияющей на активность аквапоринов [обзор, Шапигузов, 2004]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нам удалось разработать метод оценки качества индивидуальных семян, основанный на регистрации ФКТ, который позволил оценивать гетерогенность семян в партии по содержанию воды в них

Оказалось, что изменение качества семян при постепенном накоплении повреждений изменяется не плавно, а скачком Нам удалось показать, что снижение всхожести (переход семян в разряд невсхожих), или ее стимуляцию (переход семян в разряд всхожих) под влиянием внешних воздействий можно обнаружить на сухих семенах без проращивания, регистрируя их фосфоресценцию при комнатной температуре (ФКТ)

В сухих семенах, перешедших за время хранения, а также под влиянием внешних воздействий (у-облучение, или тепловая обработка) во фракцию II (невсхожих), увеличивается вдвое содержание продукта гидролиза олигосахаридов - глюкозы Влажность таких семян снижается на 0,8-1%, что связано с использованием воды в процессе гидролиза Одновременно у этих семян происходит инактивация фосфатазы, что свидетельствует о нарушении регуляторной функции водных каналов У семян фракции II на ранних стадиях набухания аквапорины клеточных мембран не закрываются, и скорость поступления воды в семена при набухании возрастает Активное поглощение кислорода при митохондриальном дыхании и слабая диффузия кислорода через оболочку семян приводит к развитию гипоксии При проклевывании зародышевого корешка (его контакте с воздухом) возникает пост-гипоксический окислительный стресс, сопровождающийся накоплением перекиси водорода, которая повреждает ДНК Это приводит к образованию проростков с морфологическими дефектами и снижению всхожести

По-видимому, в сухих семенах, перешедших в разряд «улучшенных», в том числе под влиянием стимулирующего воздействия, происходит неферментативное гликозилирование белков-аквапоринов (амино-карбонильная реакция) и водные каналы закрываются Семена с закрытыми каналами набухают медленно, так что из них вырастают нормальные проростки, а всхожесть всей партии семян увеличивается

«Улучшенные» семена не могут сохранять свое качество при хранении Стимуляция всхожести, «ювенилизация» семян, не является восстановлением качества семян, а представляет собой временный эффект, во время которого однонаправленный процесс старения продолжается В дальнейшем «улучшенные» семена быстрее теряют всхожесть по сравнению с контрольными По-видимому, наблюдаемая нами временная стимуляция всхожести семян после действия вышеуказанных факторов происходит не вследствие репарации (восстановления) возникших при хранении нарушений, а является дальнейшим накоплением повреждений в сухих семенах

В практическом плане это означает необходимость оперативного использования семян, подвергнутых стимулирующей предпосевной обработке

ВЫВОДЫ:

1 Обнаружено явление послесвечения воздушно-сухих семян, которое по

механизму является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ) На его основе разработан метод оценки качества индивидуальных семян, позволивший показать, что гетерогенность в партии при длительном хранении увеличивается за счет появления дискретных фракций семян разного качества сильных, ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, и мертвых

2 С помощью ингибиторного анализа впервые показано, что у сухих семян

гороха фракции I (сильные семена) водные каналы - аквапорины открыты и закрываются в начале набухания семени (при дефосфорилировании аквапоринов), и скорость поступления воды в семена замедляется У семян фракции II (ослабленные семена) водные каналы остаются открытыми из-за инактивации фосфатазы в сухих семенах

3 Впервые обнаружено свечение набухающих семян, являющееся

фосфоресценцией эндогенных порфиринов, которая тушится кислородом На этой основе разработан метод оценки уровня дефицита кислорода под семенной оболочкой у семян бобовых

4 Показано, что основной причиной образования из ослабленных семян

проростков с морфологическими дефектами является повреждение ДНК активными формами кислорода (перекисью водорода) в пост-гипоксический период

5 Необратимое закрывание водных каналов у сухих семян вследствие

гликозилирования белков-аквапоринов приводит к снижению скорости поглощения воды при их набухании и возрастанию всхожести

6 Установлено, что предпосевная обработка у-излучением, и действием других

физических факторов в стимулирующих дозах приводит к перераспределению фракционного состава партии семян с возрастанием доли сильных семян («улучшенных»)

7 Установлено, что регистрируя фосфоресценцию при комнатной температуре

воздушно-сухих семян, можно предсказать характер влияния у-радиации, тепловой обработки и других факторов на всхожесть семян

Список публикаций по теме диссертации

Монографии

1 Веселовский ВА, Веселова Т.В. Люминесценция растений (А Б Рубин, ред ), М Наука, 1990 -200 с

2 Веселова Т.В., Веселовский В А , Чернавский Д С Стресс у растений М , Издательство Московского Университета, 1993 - 145 с

Статьи в реферируемых журналах

1 Веселова Т.В, Веселовский В А Влияние УФ и рентгеновского облучения на сверхслабую хемилюминесценцию проростков гороха // Радиобиология. -1971 -Т 11 с 627-630

2 Бочваров ПЗ, Веселова Т.В., Алехина НД, Веселовский В А Использование метода замедленной люминесценции для оценки изменений, происходящих в семенах сои после ускоренного старения // Сельскохозяйственная биология -1984-№6 - С 66-68

3 Веселова Т.В., Веселовский В А, Красновский А Ф (мл), Лихштельд К Замедленная люминесценция семян //Биофизика - 1985а Т 30, №4, с 711-712

4 Веселова Т.В., Веселовский ВА, Козарь ВИ, Бочваров ПЗ Оценка изменения жизнеспособности семян сои при хранении методом замедленной люминесценции // Сельскохозяйственная биология - 19856 - № 6 - С 76-79

5 Веселова Т.В., Веселовский В А, Козарь В И О замедленной люминесценции набухающих семян сои // Сельскохозяйственная биология.-1985b -№ Ю - С 57-61

6 Veselova Т. V., Veselovsky VA, Rubin А В, Bochvarov Р Z Delayed luminescence of air-dry soybean seeds as a measure of their viability // Physiology Plantarum - 1985 - Vol 65 - P 493-497.

7 Kapmatuoea ЕР, Веселова T.B., Веселовский В А, Надыкта ВД, Терешкина СД Замедленная люминесценция семян подсолнечника при длительном хранении в условиях регулируемой газовой среды и на воздухе // Научные доклады высшей школы Биологические науки - 1988 -№5 - С 31-35

8 Veselova Т. V., Veselovsky VA , Kozar VI, Rubin А В Delayed luminescence of soybean seeds dunng swelling and accelerated ageing // Seed Science and Technology - 1988 - Vol 16 -P 105-113

9 Угольников OB, Веселова T.B., Сафьяннжова ТЮ Влияние ускоренного старения на дыхание и всхожесть семян ржи //Онтогенез - 1992 Т 23 -№3 -С 326-330

10 Шумаев А С, Орлова И А, Веселова Т. В, Куликов Б H, Бучинский В И Фотоиндуцированная замедленная люминесценция конидий Pyricularia oryzae Cav и пути ее практического использования // Научные доклады высшей школы Биологические науки - 1992 - №1 С 33-37

II. Веселова Т.В., Веселовский В А, Карташова ЕР, Терешкина СД Количественное определение потери жизнеспособности семян сосны при разных способах хранения // Физиология растений - 1995 -Т 42 -№4 - С 616-621

12 Веселова Т.В., Веселовский В А, Леонова ЕА Что означает изменение гетерогенности популяции семян при ускоренном старении9 // Физиология растений. - 1999а - Т 46 - № 3 - С 477-483

13 Веселова Т.В., Веселовский В А, Колупаев А Г, Леонова Е А , Чернавский ДС Математическая модель процесса ускоренного старения семян // Биофизика -19996 Т 44-Вып 3 -С 510-517

14 Веселова Т. В., Веселовский В А, Чернавский ДС Трехфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды // Российский химический журнал. Журнал Российского химического общества им. Д И Менделеева. - 1999в - Т 43 -№5 - С 49-54

15 Аксенов С И, Швалева А Л, Грунина Т Ю, Веселова Т.В., Веселовский В А Особенности семян различных по засухоустойчивости сортов озимой пшеницы (Triticum aestivum L ) в ходе созревания // Сельскохозяйственная биология. -2001 - № 1 - С 60-64

16 Veselova T.V Assessment of individual seed vigor and seed lot heterogeneity by room temperature phosphorescence // Seed Science and Technology - 2002 - V 30 -P 187-196

17 Чернавский ДС, Колупаев АГ, Веселова Т.В, Веселовский В А Исследование перемешивающего слоя методом точечных отображений // Биофизика. - 2003 -Т 48 -Вып 2 - С 361-367

18 Veselova T.V., Veselovsky VA Investigation of atypical germination changes dunng accelerated ageing of pea seeds // Seed Science and Technology - 2003 - V 31,-P 517-530

19 Веселовский В A, Веселова T.B., Чернавский Д С Бимодальное изменение всхожести семян при тепловом воздействии // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003 - Т 43 -№3 -С 355-357

20 Веселова Т.В., Веселовский В А , Усманов ПД, Усманова О В, Козарь В И Гипоксия и повреждения при набухании стареющих семян // Физиология растений - 20036 - Т 50 - № 6 - С 930-937

21 Veselova T.V., Veselovsky VA, Turovetsky VB, Galchuk S V, Vanyushin В F,

Aleksandrushhna N1, Rubin А В Post-hypoxic oxidative stress during imbibition of low-vigor pea seeds (as a possible cause for appearance of abnormal seedlings) // Seed Science and Technology - 2004 - V 32 - P 283-296

22 Веселова T.B., Веселовский В А Возможность участия акваиоринов в поглощении воды семенами гороха разного качества // Физиология растений -2006 -Т 53 -№ 1 С 106-112

23 Веселовский В А, Веселова Т.В, Корогодина В Л, Флорко Б В, Мокрое Ю В Бимодальное изменение всхожести семян гороха под влиянием у-излучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология - 2006 - Т 46 - № 6 С 691-696

24 Веселовский В А, Веселова Т.В. Нарушение функции аквапоринов клеточных мембран как причина изменение всхожести семян гороха при действии у-излучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007 - Т 47 - № 1 - С 28-33

Авторские свидетельства

1. Веселовский В А, Веселова Т.В, Шеберлайн В, Маренков ВС, Рубин А Б Способ определения влажности семян растений и устройство для его осуществления Авторское свид № 1047431 с приоритетом от 13 июля 1981 г

2 Веселовский В А , Веселова Т.В., Бочваров П 3, Маренков В С, Рубин А Б Способ определения жизнеспособных семян растений Авт свид № 1131488 с приоритетом от 31 декабря 1982 г

3 Веселова Т.В, Веселовский В А , Юрина А В, Рубин А Б, Орлова С Ф Способ отбора высокопродуктивных форм огурцов Авт свид № 1570681 с приоритетом от 16 июня 1988г

4 Аксенов СИ, Веселова Т.В., Веселовский ВА, Грунина ТЮ Способ оценки засухоустойчивости зерновых культур Патент № 1630705 с приоритетом изобретения от 29 марта 1989 г Зарегистрирован 24 июня 1993 г

Статьи в сборниках

1 Веселовский В А, Веселова Т.В. Старение семян и кислород // Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов / Киев Наукова думка, 1986- С 182-183

2 Веселова Т.В., Веселовский В А, Козарь В И Люминесцентный метод определения влажности и жизнеспособности семян // Физиология семян Формирование, прорастание, прикладные аспекты Душанбе - 1990 - С 276-280

3. Веселова Т.В., Веселовский В А , ЧернавскийДС Стресс у растений //Изд-во Московского Государственного Университета, 1993 - 144 с

4 Veselova T.V, Veselovsky VA, Schoberlem W Determination of viability and longevity of seeds by luminescence method // Yield and Quality m Herbage Seed Production / Proceedings of Third International Herbage Seed Conference, Eds Schoberlem W, Forster К Germany, Halle (Saale Martin-Luther-Umv HalleWittenberg,- 1995 - P 398-402

5 Veselova T. V., Veselovsky VA, Kartachova E R Changes in heterogeneity of pine seeds during ageing in low-oxygen atmosphere // Tree Seeds / Greese Crete, Chania University of Athens, - 2002 С 202-207

6 Veselova T.V, Veselovsky VA, Leonova EA Assessment of potential vigour and productivity of air-dried cucumber seeds by the application of luminescence method // Seleckcya i Semenarstvo (Yugoslavia) - 1998 - V 5 - № 1-2 - P 85-90

Тезисы международных конференций

1. Veselova T.V., Veselovsky VA, Kartachova ER Luminescent analysis of changes of seed viability after storage at low oxygen conditions // ISTA/ISHS Symposium "Technological advances in variety and seed research" / Wagemngen The Netherland - 1994 -P 15-16

2. Veselova T. V., Veselovsky VA , Leonova E A Determination of viability and longevity of seeds by luminescence method // Annual Symposium "Physical-chemical basis of plant physiology" / Penza - 1996 -P 112

3. Колупаев А Г, Леонова E A , ЧернавскийДС, Веселова Т.В, Веселовский В А Моделирование процесса парадоксального изменения всхожести семян при ускоренном старении // Международная школа "Проблемы теоретической биофизики"/Москва- 1998 - С 138

4. Леонова E А, Веселовский В А, Веселова Т.В. Трехфазное ("парадоксальное") изменение всхожести партии семян при старении // IV Съезд Физиологов Растений России / Международная конференция "Физиология растений - наука III тысячелетия" Москва - 1999 -Т II-С 620

5. Veselova T.V, Veselovsky VA Room temperature phosphorescence of air-dry seeds as indicator of seed quality during storage // XVIII International Conference on "Maize and Sorghum Genetics and Breeding at the end of the 20th Century / Belgrade Yugoslavia -2000 -P 15

6. Acsyonov SI, Grunina TYu, Shvaleva AL, Veselova T.V, Veselovsky VA State of water and membranes in wheat seeds during ripenmg, storage and germination //Ibid -2000 -P 60

7. Veselova T.V., Veselovsky VA Seed ageing and oxidative stress during imbibition // International Symposium "Plant under Environmental Stress"/ Moscow -2001 -P 309-310

8. Veselova T.V., Veselovsky VA, Rubin AB Post hypoxic oxidative stress during imbibition of low vigour pea seeds // Fifth conference on "Oxygen, free radicals and oxidative stress ion plants" - Nice, France -2001 -P-151

9. Veselova T.V., Veselovsky VA, Kozar VI Room temperature phosphorescence as a marker of seed quality // New Development in Seed Quality Improvement / Book of abstracts of International Workshop on Applied Seed Biology Lodz, Poland -2003 -P 57-58

10. Veselova T. V., Veselovsky VA, Kozar VI Hypoxia in germinating legume seeds // New Development in Seed Quality Improvement /Book of abstracts of International Workshop on Applied Seed Biology Lodz, Poland - 2003 - P 95-96

Подписано к печати 29.02/7;? Тираж 100 Заказ 2.9

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Веселова, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Закономерности ответа биологических систем на внешние воздействия. Радиостимуляция.

1.1.1. Двухфазная реакция.

1.1.2. Трехфазная дозовая кривая.

1.1.3. Радиостимуляция растений.

1.1.4. Фазные изменения всхожести после различных обработок воздушно-сухих семян.

1.1.5. Объяснение природы радиостимуляции.

1.1.6. Свободные радикалы в семенах.

1.2. Старение семян.

1.2.1. Формализация проблемы старения.

1.2.2. Факторы, определяющие скорость старения семян при хранении.

1.2.3. Физиолого-биохимические нарушения в стареющих семенах.

Хромосомные аберрации и повреждения ДНК.33.

Изменения РНК и синтеза белков.

Изменение ферментов и запасных веществ.

Изменение дыхания и синтеза АТФ.

Изменение мембран при старении семян.

Изменение мембранных белков при старении.

Свободные радикалы и перекисное окисление мембранных липидов у семян при старении.

1.3. Набухание семян.

1.3.1. Гидратация семени.

1.3.2. Повреждение семян при набухании.

1.3.3. Окислительный стресс при набухании семян.

1.4. Люминесцентные методы анализа качества семян.

II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

11.1. Объекты.

П.2. Действующие факторы.

П.2.1. Тепловая обработка.

П.2.2. у-облучение.

П.2.3. Лазерное облучение.

П.2.4. Звуковая обработка.

II.2.5. Светоимпульсное облучение и обработка электрическим полем коронного разряда.

11.3. Определение всхожести семян.

11.4. Определение жизнеспособности семян.

II. 5. Определение влажности семян.

11.6. Измерение скорости гидратации семян.

11.7. Измерение выхода электролитов.

11.8. ЯМР определение свободной воды в семенах.

П.9. Электрохимическое измерение скорости поглощения кислорода.

II. 10. Интенсивность общего синтеза белка.

II. 11. Анализ содержания ядерной ДНК.

11.12. Определение состояния ДНК.

11.13. Хемилюминесцентный контроль активных форм кислорода.

11.14. Термохемилюминесценцию регистрировали.

11.15. Регистрация фосфоресценции при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян.

II. 16. Измерение спектров послесвечения воздушно-сухих и набухших семян.

II.17. Повторность опытов.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

III. 1. Разработка методов оценки качества индивидуальных 89 семян.

III. 1.1. Люминесценция воздушно-сухих семян.

111.1.1.1. Исследование свойств замедленной люминесценции воздушно-сухих семян.

III. 1.1.2. ФКТ как метод определения влажности сухих семян и биопрепаратов.

III. 1.1.3. ФКТ сухих семян как метод оценки всхожести 110 III. 1.1.4. О причине возрастания ФКТ семян при старении.

III. 1.1.5.Распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ как характеристика гетерогенности партии 115 III. 1.2. Оценка состояния набухающих семян бобовых . 121 III. 1.2.1. Возникновение свечения у набухающих семян

111.1.2.2. Спектральные характеристики свечения набухающих семян.

III. 1.2.3 Появление свободной воды и поглощения кислорода набухающими семенами.

III. 1.2.4. Свечение набухающих семян как показатель уровня гипоксии.

111.1.3. Разработка термохемилюминесцентно (TXJI) метода обнаружения продуктов перекисного окисления липидов и содержания глюкозы в сухих семенах

III. 1.3.1. TXJI регистрация продуктов перекисного окисления продуктов ненасыщенных жирных кислот в порошке семян.

III. 1.3.2. Определение содержания свободной глюкозы в сухих семенах.

111.2. Изменение всхожести семян и ФКТ после различных воздействий.

111.2.1. Всхожесть семян гороха после теплового воздействия.

111.2.2. Условия наблюдения парадоксального изменения всхожести семян.

Ш.2.3. Анализ кривых жизнеспособности и всхожести в пробит координатах.

111.2.4. Всхожесть семян гороха после теплового воздействия и ФКТ.

111.2.5. Изменение гетерогенности семян гороха по физиологическим показателям и ФКТ при старении

111.2.6. ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их всхожесть под влиянием ионизирующего облучения

111.2.7. Примеры изменения ФКТ-распределений воздушно-сухих семян, подвергнутых действию разных факторов.

111.2.8. Переход семян из фракции во фракцию скачком

111.3. Свойства семян разных фракций на примере гороха

111.3.1. Поглощение воды семенами разных фракций

111.3.2. Взаимосвязь между скоростью набухания и возникновением дефицита кислорода у семян гороха

111.3.3. Первичные повреждения при гидратации семян и гипоксия.

111.3.4. Синтез общих белков.

111.3.5. Процесс репликации ДНК на стадии подготовки клеток зародышевых осей к первому делению.

111.3.6. Пост-гипоксический окислительный стресс.

111.4. Механизм изменения скорости поглощения воды при переходе из одной фракции в другую. Аквапорины.

III.4.1. Проницаемость клеточных мембран семян для воды зависит от открытости водных каналов.

111.4.2. Влияния парахлормеркурий бензоата на набухание семян.

111.4.3. Влияние NaF (ингибитора фосфатазы) на набухание семян.

III.5. Последействие в сухих семенах. Механизм стимуляции всхожести.

111.5.1. Изменение всхожести семян при хранении.

111.5.2. Изменение всхожести семян при хранении после у-облучения.

111.5.3. Возможный механизм стимуляции всхожести под действием внешних факторов.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующее излучение в малых дозах и другие слабые воздействия), определяемое методом замедленной люминесценции"

Актуальность исследования. Существует проблема разнонаправленного действия больших и малых доз ионизирующей радиации. Если причины повреждающего действия больших доз достаточно хорошо изучены, то вопрос о стимулирующем действии малых доз до сих пор остается открытым, несмотря на многочисленные исследования в этой области. Интерес к проблеме вызван перспективой использования явления радиационной стимуляции растений в сельском хозяйстве с целью увеличения продуктивности растений и получения более высокого урожая.

Большинство работ по радиостимуляции растений выполнено путем облучения элитных семян, результат наблюдают по урожаю. Однако урожай в первую очередь зависит от всхожести семян, ее уменьшение даже на 10-20% приводит к двух-трех-кратному снижению урожая.

Известны приемы предпосевной обработки семян, с помощью которых можно увеличить всхожесть семян, утраченную при хранении. Ионизирующая радиация в малых дозах, озвучивание, кратковременная тепловая и ударно-волновая обработки, экспонирование в электрическом и магнитных полях, лазерное облучение, предпосевное замачивание в растворах биологически активных веществ и др. могут увеличить всхожесть семян, скорость роста растений и урожай на 15-25%.

Возникает естественный вопрос, каким образом воздушно-сухие семена, которые годами старели, накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной предпосевной обработки приобретают способность прорастать. Для того чтобы ответить на этот вопрос, надо, прежде всего, иметь представление, какие изменения в стареющих семенах приводят к снижению всхожести - появлению не прорастающих, но живых семян. Всхожесть может быть увеличена только за счет этих семян.

Старение и гибель семян обусловлены нарушением целостности клеточных мембран и повреждением ДНК. Предполагают, что это вызвано продуктами свободнорадикального перекисного окисления мембранных липидов. Процесс старения семян уподабливают окислительному стрессу. В последние годы обратили внимание на то, что старение семян, как и животных и человека, сопряжено с процессом неферментативного гликозилирования белков и нуклеиновых кислот (реакция Амадори-Майларда).

Существует гипотезы, объясняющие стимуляцию жизнедеятельности растительного организма, слабыми воздействиями. Одна из них предполагает, что уровень метаболизма возрастает из-за ослабления контроля со стороны регуляторных механизмов, которые в норме ограничивают функциональную активность клетки, то есть имеет место проявления правила Арндта-Шульца. Согласно другой распространенной гипотезе стимуляция роста и развития растения трактуется как следствие гиперфункции репарационных процессов в ответ на первоначальное повреждение и появление малых количеств клеточных токсинов.

У организмов в состоянии метаболического покоя (воздушно-сухие семена, пыльца, споры и др.) считают, что облучение в малых дозах и другие физические воздействия оставляют в клетках скрытые потенциальные) повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние. Естественно, что предполагаемые механизмы стимуляции могут включаться у семян только во время их прорастания. Но еще до набухания в облученном семени развиваются пострадиационные физико-химические процессы. Так, после больших доз облучения состояние семян в процессе хранения ухудшается, они теряют всхожесть («эффект хранения»). Эффект стимуляции растений из семян, облученных в малых дозах, при затягивании сроков высева пропадает.

Для стимуляции всхожести воздействию обычно подвергают неоднородные партии хранящихся семян, состоящие из фракций сильных, слабых и мертвых. Поскольку увеличить всхожести партии семян можно лишь за счет живых семян, которые не прорастают при данных условиях, то для исследования механизма стимулирующего действия у-радиации и других факторов необходимо иметь воздушно-сухие семена однородные по качеству. Но задача деления партии таких семян на фракции разного качества до проращивания до сих пор практически не была решена.

Цель и задачи исследования

Целью работы было выявить, каким образом сухие семена, которые годами накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной обработки приобретают способность прорастать.

В задачи работы входило:

1) разработка люминесцентного метода анализа качественного состава партий воздушно-сухих семян и прогнозирования их всхожести без проращивания;

2) установление взаимосвязи между люминесцентными характеристиками индивидуальных сухих семян и качеством вырастающих из них проростков;

3) исследование влияния ионизирующей радиации и других факторов, обычно используемых для стимуляции всхожести, на качественный состав партии сухих семян;

4) выяснение причины, препятствующей прорастанию ослабленных семян и роли окислительного стресса в образовании проростков с морфологическими дефектами;

5) исследование динамики всхожести семян в период после действия на семена ионизирующего излучения и тепловой обработки.

В результате нашей работы разработан люминесцентный метод регистрация фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) для фракционирования воздушно-сухих семян по их качеству. С его помощью в распределении партии семян по уровню ФКТ можно выделить три дискретные фракции. Из сильных семян фракции I высокого качества вырастают нормальные проростки, из слабых семян фракции II - проростки с морфологическими дефектами, семена фракции III - мертвые. При стимулирующем всхожесть воздействии число семян во фракции I растет за счет сокращения количества их во фракции II.

Уменьшение всхожести семян бобовых (горох, соя) при старении обусловлено увеличением проницаемости клеточных мембран для воды вследствие нарушения функции аквапориновых каналов. Открытые при хранении клеточные водные каналы у семян фракции II не закрываются во время набухания из-за прекращения дефосфорилирования аквапоринов. Быстрое набухание семени создает дефицит кислорода у зародыша и последующий пост-гипоксический окислительный стресс (повреждение мембран и деградация ДНК).

Стимуляция всхожести семян низкого качества факторами разной природы вызвана замедлением их набухания после необратимого закрывания водных каналов, вызванного, по-видимому, неферментативным гликозилированием белков.

Гликозилирование белков является первой стадией известного процесса старения - необратимой реакции Амадори-Майларда не только семян, но и человека и животных. Отсюда следует, что стимуляция всхожести семян происходит не из-за восстановления возникших ранее повреждений, а является дальнейшим их развитием. Именно поэтому «улучшенные» семена теряют всхожесть и жизнеспособность значительно быстрее, чем не стимулированные любыми факторами.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Веселова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Обнаружено явление послесвечения воздушно-сухих семян, которое по механизму свечение является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). На его основе разработан метод оценки качества индивидуальных семян, позволивший показать, что гетерогенность семян в партии при длительном хранении увеличивается за счет появления новых дискретных фракций: ослабленных семян, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, а затем и мертвых.

2. С помощью ингибиторного анализа впервые показано, что у сухих семян гороха фракции I (сильные семена) водные каналы - аквапорины открыты и закрываются в начале набухания семени (при дефосфорилировании аквапоринов), и скорость поступления воды в семена замедляется. У семян фракции II (ослабленные семена) водные каналы остаются открытыми из-за инактивации фосфатазы в сухих семенах.

3. Впервые обнаружено свечение набухающих семян, являющееся фосфоресценцией эндогенных порфиринов, которая тушится кислородом. На этой основе разработан метод оценки уровня дефицита кислорода под семенной оболочкой у семян бобовых.

4. Показано, что основной причиной образования из ослабленных семян проростков с морфологическими дефектами является повреждение ДНК активными формами кислорода (в основном, перекисью водорода) в пост-гипоксический период.

5. Установлено, что предпосевная обработка у-излучением, тепловым и действии других физических факторов в стимулирующих дозах приводит к перераспределению фракционного состава партии семян с возрастанием доли сильных семян («улучшенных»). Снижение проницаемости клеточных мембран для воды у этих семян происходит за счет необратимого закрывания водных каналов у сухих семян вследствие гликозилирования белков-аквапоринов.

6. Установлено, что регистрируя фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих семян, можно предсказать характер действия у-радиации, тепловой обработки и других факторов на всхожесть семян.

7. Наблюдаемая нами временная стимуляция всхожести семян после действия вышеуказанных факторов происходит не вследствие репарации восстановления возникших при хранении нарушений, а является дальнейшим накоплением повреждений в сухих семенах

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Веселова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Аверьянов А А. (1985). Генерация супероксидного радикала интактны-ми корнями гороха. Физиология растений, 32. 268-273.

2. Аверьянов A.A. (1991). Активные формы кислорода и иммунитет растений. Успехи современной биологии, 111, вып. 5. 722-737.

3. Авраменко E.H., Есельсон М.П. (1979). Спектральный анализ в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность. 183 с.

4. Акифьев Ф.П., Потапенко А.И., Рудаковская Е.Г. (1997). Ионизирующие излучения и 5-бром-2'-дезоксиуридин как инструменты анализа фундаментального механизма старения животных. Радиационная биология. Радиоэкология. 37, вып. 4. 613-620.

5. Аксенов С.И. (1980). Состояние воды в биологических объектах. В кн.: «Связанная вода в дисперсных системах». М.: Изд-во МГУ, 5. 48-76.

6. Аксенов С.И. (1985). Роль воды в процессах функционирования биологических структур и в их регулировании. Биофизика, 30, вып. 2. 220223.

7. Аксенов С.И. (1990). Вода и ее роль в регуляции биологических процессов. М.: Наука. 113 с.

8. Аксенов С.И. (2006). Вода и ее роль в регуляции биологических процессов.

9. Аксенов С.И., Булычев A.A., Грунина Т.Ю., Туровецкий В.Б. (1996). О механизмах воздействия низкочастотного магнитного поля на начальные стадии прорастания семян пшеницы. Биофизика, 41. 919-925.

10. Александров В.Я. (1985). Реактивность клеток и белки. JI-д: Наука. 1985.

11. Алешин Е.П., Цой K.M., Красникова Г.С., Тур Н.С. (1974). Оценка со-леустойчивости сортов риса с помощью регистрации хемилюминесценции, индуцированной Н2О2. Материалы I Всесоюз. симп. по моле-куляр. и прикл. биофизике растений. Краснодар. 178.

12. Андреев В.К., Фомичев М.М., Бородин И.Ф. и др. (1986). Способ определения жизнеспособности семян зерновых культур. A.c. № 1607712.

13. Архипов М.В., Савин В.Н. (1984). Способ определения жизнеспособности семян. A.C. № 1230486

14. Атрощенко Е.Э. (1997). Действие ударно-волновой обработки семян на морфофизиологические особенности и продуктивность растений. Ав-тореф. канд. дисс. М.

15. Батыгин Н.Ф. (1963). К вопросу о понимании процессов радиостимуляции. В сб. «Предпосевное облучение семян сельскохозяйственных культур». АН СССР. 36 с.

16. Батыгин Н.Ф., Савин В.Н. (1966). Использование ионизирующих излучений в растениеводстве. Ленинград: Колос. 123 с.

17. Березина Н.М. (1964). Предпосевное обучение семян сельскохозяйственных растений. М., Атомиздат.

18. Березина Н.М., Каушанский Д.А. (1975). Предпосевное облучение семян сельскохозяйственных растений. М.: Атомиздат. 235 с

19. Бреславец Л.П. (1946). Растение и лучи Рентгена. М., Изд-во АН СССР.

20. Бовей Ф. (1959). Действие ионизирующих излучений^на природные и синтетические полимеры. М.: Изд-во Иностранной литературы. 295 с.

21. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Г.П., Конрадов A.A., Антоновский В.Л., Бурдакова Е.Б. (1989). Влияние органических пероксидов на рост культивируемых клеток высших растений. Биофизика, 34. 327-329.

22. Бочваров П.З., Веселова Т.В., Алехина Н.Д., Веселовский В.А. (1984). Использование метода замедленной люминесценции для оценки изменений, происходящих в семенах сои после ускоренного старения. Сельскохозяйственная биология. № 6. 66-68.

23. Бурлакова Е.Б. (1994). Эффект свехмалых доз. Вестник Российской

24. Академии Наук, 64, № 5. 425-431.

25. Бурлакова Е.Б. (1999). Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности. Российский химический журнал, 43, №5.3-11.

26. Бурштейн Э.А. (1977). Собственная люминесценция белка (природа и применение). Итоги науки и техники. Биофизика. М.: ВИНИТИ. 7. 83105.

27. Бемфорд К., Дженкинс А, (1962). Стабилизированные радикалы в биологических процессах. В кн.: «Образование и стабилизация свободных радикалов». Басс А., Бройл Г. (ред.). М.: Изд-во ИЛ. 503-542.

28. Ванярхо В.Г. (1990). Способ определения жизнеспособности семян. Патент РФ 2076554.

29. Васильев И.М. (1962). Действие ионизирующих излучений на растение. М. АН СССР.

30. Венедиктов П.С., Маторин Д.Н., Кафаров P.C. (1989). Хемилюминес-ценция хлорофилла при фотоиндуцированном окислении липидов в мембранах тилакоидов. Биофизика, 34, вып. 2. 241-245.

31. Веселова Т.В., Веселовский В.А. (1971). Влияние УФ и рентгеновского облучения на сверхслабую хемилюминесценцию проростков гороха. Радиобиология, 11. 627-630.

32. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Колупаев А.Г., Леонова Е.А., Чернав-ский Д.С. (1999). Математическая модель процесса ускоренного старения семян. Биофизика. 44, Вып. 3. 510-517.

33. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Красновский А.Ф.(мл.), Лихштельд К. (1985а). Замедленная люминесценция семян. Биофизика. 30. № 4. 711-712.

34. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И., Бочваров П.З. (19856). Оценка изменения жизнеспособности семян сои при хранении методом замедленной люминесценции. Сельскохозяйственная биология. № 6. 76-79.

35. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Козарь В.И. (1985в). О замедленной люминесценции набухающих семян сои. Сельскохозяйственная биология. № 10. 57-61.

36. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. (1993). Стресс у растений. М., Издательство Московского Университета, 145 с.

37. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Леонова Е.А. (1999а). Что означает изменение гетерогенности популяции семян при ускоренном старении? Физиология растений. 46, 3. 477-483.

38. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Усманов П.Д., Усманова О.В., Козарь В.И. (2003). Гипоксия и повреждения при набухании стареющих семян. Физиология растений. 50. № 6. 930-937.

39. Веселовский В.А. (1982). О роли биоантиоксидантов в устойчивости растений к неблагоприятным условиям существования. В кн.: «Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии». М.: Наука. 150-162.

40. Веселовский В.А., Веселова Т.В. (1990). Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М. Наука. 200 с

41. Веселовский В.А., Веселова Т.В., Чернавский Д.С. (1999). Трехфазная (парадоксальная) дозовая зависимость реакции растительной клетки на факторы внешней среды. Российский химический журнал, 43. № 5.

42. Веселовский В.А., Веселова Т.В. (2007). Нарушение функции аквапоринов клеточных мембран как причина изменение всхожести семян гороха при действии у-излучения в малых дозах. Радиационная биология. Радиоэкология, 47, № 1. 28-33.

43. Виленчик М.М. (1985). Молекулярные и клеточные системы поддержания надежности организма и их изменение при старении. В кн.: «Надежность биологических систем». Киев. Наукова думка. 161-167.

44. Виленчик М.М. (1987). Молекулярно-клеточные механизмы защиты и гомеостаз клетки. В кн.: «Надежность и гомеостаз биологических систем». Киев. Наукова думка. 67-71.

45. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972). Перекисное окисление липи-дов в биологических мембранах. М.: Наука. 252 с.

46. Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф. (1959). Исследование слабых свечений в биологических системах. Биофизика, 4. 601-605.

47. Владов Ю.Р. (1985). Люминесцентный автоматический контроль зерна. Тез докл. Всес. Научн. Совещ.: «Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности». Минск. 71-73.

48. Воюцкий С.С. (1960). Растворы высокомолекулярных соединений. М. Гос. научн.-тех. изд-во химической литературы.132 с.

49. Габуда С.П. (1982). Связанная вода. Факторы и гипотезы. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение. 157 с.

50. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. (1986). Биология продолжительности жизни. М.: Наука. 169 с.

51. Гиллет Дж. (1988). Фотофизика и фотохимия полимеров. Введение в изучение фотопроцессов в макромолекулах. (Пер. с англ. 1985) М.: Мир. 435 с.

52. Голдовский А.М. (1986). Анабиоз и его практическое значение. Л-д: Наука. 187 с.

53. Горчакова Н.О., Горчаков С.А., Павлов Л.В. (1992). Устройство для предварительного определения всхожести семян. Патент РФ 2060638.

54. Гродзинский Д.М. (1983). Надежность растительных систем. Киев: Наукова думка. 368 с.

55. Гродзинский Д.М. (1986). Старение у растений. В сб.: «Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов». Киев. Наукова думка. 12-20.

56. Гродзинский Д.М. (1989). Радиобиология растений. Киев: Наукова думка. 384 с.

57. Гродзинский Д.М., Гудков И.Н. (1973). Защита растений от лучевого поражения. Москва: Атомиздат. 229 с.

58. Гудков И.Н. (1985). Клеточные механизмы пострадиационного восстановления растений. Киев: Наукова думка. 223 с.

59. Гумилевская H.A. (1987). Синтез белков и нуклеиновых кислот в прорастающих семенах. Дис. докт. биол. наук.

60. Гумилевская H.A., Чумикина JI.B., Арабова Л.И., Зимин М.В., Шатилов В.Р. (1996). Действие повышенных температур на синтез белка в осях набухающих зародышей гороха. Физиология растений, 43 (2). 247-255.

61. Данько С.Ф., Данильчук E.H., Юрьев Д.Н., Егоров В.В. (2000). Проращивание ячменя после воздействия звуком разной частоты. Пиво и напитки, № 3, С. 22-23.

62. Джеймс В. (1956). Дыхание растений. М. Изд-во Иностранной литературы. 1956. С. 209-214.

63. Дикий Б.Ф., Иващенко Б.П., Коган Ф.И. (1961). Применение люминесцентного анализа в пищевой промышленности. М. 56 с.

64. Дубров А.П. (1968). Генетические и физиологические эффекты действия ультрафиолетовой радиации на высшие растения. М., Наука.

65. Зайцев C.B., Ефанов A.M., Сазанов JI.A. (1999). Общие закономерности и возможные механизмы действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах. Российский химический журнал, 43. № 5.

66. Зелинский Г.В. (1989). Периодические колебания всхожести, силы роста и активности протеиназ семян сои при различных режимах их длительного хранения. Физиол. и биохимия культ, растений, 21. 469-474.

67. Ижик Н.К. (1976). Полевая всхожесть семян. Киев: Изд-во «Урожай». 200 с.

68. Инюшин В.М. (1978). Элементарная теория биологического поля. Издание Казахского госуниверситета. Алма-Ата.

69. Каримов Х.Х., Донцова C.B. (1999). Растворимые белки в семенах хлопчатника как связь с их жизнеспособностью. Физиол. растений, 46, №3.484-491.

70. Карпов Б.А., Лаврик И.П. (1986). Способ определения жизнеспособности семян борщевника. A.c. № 1395167.

71. Кияшко Ю.Г. (1985). Интенсивность и кинетика сверхслабого свечения семян сои в процессе старения. Тез. докл. всесоюз. сов. «Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности». Минск. 68-70.

72. Козловский В.А., Л.А. Гаврилов (1983). Многостадийность гибели какоснова старения (гипотеза случайных последовательных переходов). В кн.: «Проблемы биологии старения». М. Наука. 19-23.

73. Кольтовер В.К. (1986). Генетическая детерминированность молекулярных конструкций клетки и стохастическая реализация программы старения. В сб.: «Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов». Киев. Наукова думка. 38-52.

74. Конев C.B. (1965). Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Минск: Наука и техника.

75. Конев C.B., Катибников М.А. (1961). Длительное послесвечение белков и аминокислот при комнатной температуре. Биофизика, 6. 638-642.

76. Корецкая Т.Ф., Веселовский В.А., Погосян С.И., Жолкевич В.Н. (1968). О соотношении между интенсивностью дыхания и сверхслабым свечением корней. Докл. АН СССР, 180. 1005-1007.

77. Кришнамурти К.В., Аверьянов А.А., Потапов Н.Г., Веселовский В.А. (1973). Возрастные изменения сверхслабого свечения зон корня люпина в изолированной культуре. Физиология растений, 20. 688-692.

78. Крищенко В.П., Ушакова Т.Ф., Верещак М.В., Фомина Л.Г., Хомич Н.П. (1990). Способ определения жизнеспособности семян. Патент РФ. 2025928.

79. Кудряшов Ю.Б. (2004). Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: ФИЗМАТЛИТ. 448 с.

80. Кузин A.M. (1970). Структурно-метаболическая гипотеза в радиобиологии. Москва: Наука. 222 с.

81. Кузин A.M. (1977). Стимулирующее действие ионизирующего излучения на биологические процессы. М.: Атомиздат. 208 с.

82. Кузин A.M. (1986). Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. Москва: Наука. 284 с.

83. Кузин A.M. (1995). Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М.: наука. 158 с.

84. Ларионов Ю.С., Ларионова Л.М. (1981). Способ определения жизнеспособности семян зерновых культур, преимущественно пшеницы. А.с. № 1015836.

85. Литке C.B., Лялин Г.Н. (1985). Замедленная флуоресценция адсорбированных флавинов. Оптика и спектроскопия, 59, № 3. 670-673.

86. Литке C.B., Михалевкин А.Б., Лялин Г.Н. (1984). Фотоника адсорбированных флавинов. Химическая физика, 3, № 9. 1268-1273.

87. Лэмб М. (1980). Биология старения. М.: Мир. 206 с.

88. Майер A.M. (1982). Метаболическая регуляция прорастания. В кн.: «Физиология и биохимия покоя и прорастания семян». Перевод с англ. под ред. Николаевой М.Г., Обручевой Н.В. 397-424.

89. МамедовТ.Г. (1982). Биохемилюминесценция клеток и тканей. Баку: Элм. 191 с.

90. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. «Мир».1. Москва. 1980. Т. 2. 607с.

91. Мэгайр Д.Д. (1982). Качество семян и их прорастание. В кн.: «Физиология и биохимия покоя и прорастания семян». Перевод с англ. под ред. Николаевой М.Г., Обручевой Н.В. 254-271.

92. Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Позднова JI.M. (1999). Биология семян. С-П. 231 с.

93. Обручева Н.В. (1982). Прорастание семян. В сб.: «Физиология семян». М.: Наука. 223-274.

94. Обручева Н.В. (1990). Физиология прорастания семян. В сб.: «Физиология семян. Формирование, прорастание, прикладные аспекты». Каримов Х.Х. (ред.). Душанбе: Дониш. 107-119.

95. Обручева Н.В., Антипова О.В. (1997). Физиология начала прорастания семян. Физиология растений, 44. № 2. 287-302.

96. Обручева Н.В., Антипова О.В. (1999). Общие физиологические механизмы подготовки семян с разными типами покоя к проклевыванию. Физиология растений, 46. № 3. 426-431.

97. Обручева Н.В., Антипова О.В., Котова JI.M. (1993). О запуске деления и растяжения клеток при прорастании семян кормовых бобов. Физиология и биохимия культурных растений, 25. № 3. 243-248.

98. Обручева Н.В., Ковадло JI.C. (1985). Два этапа усиления дыхания прорастающих семян гороха по мере увеличения их оводненности. Физиология растений, 32, вып. 4. 753-761.

99. Окада Ш. (1974). Радиационная биохимия клетки. М.: Изд-во «МИР». 407 с.

100. Патрикеев В.В., Чудный A.B. (1971). Способ определения жизнеспособности семян и пыльцы растений. A.c. № 381313.

101. Преображенская Е.И. (1971). Радиоустойчивость семян растений. М., Атомиздат. 232 с. (С. 11-19 таблицы)

102. Погосян С.И., Аверьянов A.A., Мерзляк М.Н., Веселовский В.А., (1978). Внеклеточная хемилюминесценция корней растений. ДАН СССР, 239 (4), 974-976.

103. Погосян С.И., Корецкая Т.Ф., Веселовский В.А. (1974). Субстраты и ингибиторы сверхслабого свечения растительных тканей. В кн.: «Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве». М. Изд-во МГУ. 99-103.

104. Рабинович Е. (1953). Фотосинтез. М.: Изд-во Иностранной лит-ры. Том II. 651 с.

105. Райнхарт Э. (1998). Гормезис и оценка сверхмалых доз для биологически активных веществ. Биологическая медицина. № 2. 4-8.

106. Ракитин Ю.В. (1953). Проблемы стимуляции растений в связи с задачами сельского хозяйства. Успехи совр. биол. 36 (3), 289-296.

107. Рапли Дж., Янг П., Толлин Г. (1984). Исследование термических и других параметров взаимодействия воды с белками. В кн.: «Вода в полимерах». М., Мир. 114-136.

108. Растинг P.JI. (1993). Почему мы стареем? В мире науки. № 2-3 февраль-март. 76-86.

109. Реймерс Ф.Э. (1987). Растение во младенчестве. Наука. Сиб. Отд. 183.

110. Роберте Е.Г. (1978,а). Влияние условий хранения семян на их жизнеспособность. В кн.: «Жизнеспособность семян». Роберте Е.Г. (ред.). М. Колос. 20-62.

111. Роберте Е.Г. (1978,6). Цитологические, генетические и метаболические изменения, связанные с потерей жизнеспособности. В кн.: «Жизнеспособность семян». Роберте Е.Г. (ред.). М.: Колос. 244-293.

112. Романовский Ю.Ь., Степанова Н.В., Чернавский Д.С. (1984). Математическая биофизика. М.: Наука. 304 с.

113. Рухля А.Н., Шадыро Щ.И., Петряев Е.П., Петренко Л.И. (1981). Способ определения посевной годности семян. A.c. № 982556.

114. Савин В.Н. (1981). Действие ионизирующего излучения на целостный растительный организм. М.: ЭНЕРГОИЗДАТ. 120 с.

115. Сапежинский И.И. (1972). Исследование радиационных превращений в растворах белков методом хемилюминесценции. В кн.: «Молекулярная радиобиология: Современные проблемы радиобиологии». М.: Атом-издат. 95-129.

116. Сафьянникова Т.Ю., Орлова H.H., Солдатова О.П. (1987). Анализ потенциала хранения семян инбредных линий из сорно-полевой ржи и сорта Вятка-2 с помощью метода ускоренного старения. Биологические науки № 11. 106-111.

117. Серами Э., Влассара Э. Браунли М. (1987). Глюкоза и старение. В мире науки. № 7 июль. 42-47

118. Соболев A.M., Станкевич Ю.Г. (1988). Способ определения жизнеспособности семян пшеницы. A.c. № 1625368.

119. Солдатова О.П., Орлова H.H. (1979). Мутационный процесс при хранении семян в различных условиях. Биологические науки, № 6.

120. Солдатова О.П., Орлова H.H. (1984). Развитие мутационного процесса в семенах при хранении. Доклады ВАСХНИИЛ, №11. 18-20.

121. Степаненко Б.Н. (1977). Химия и биохимия углеводов (моносахариды). М. Высшая школа. 224 с.

122. Стрелер Б. (1964). Время, клетки и старение. М.: Мир. 213 с.

123. Сэхляну В. (1965). Химия, физика и математика жизни. Бухарест: Научное издательство. С.426-427.

124. Тарусов Б.Н., Веселовский В.А. (1978). Сверхслабые свечения растений и их прикладное значение. М.: Издание МГУ. 151с.

125. Тарусов Б.Н., Журавлев А.И. (1965). Биохемилюминесценция липи-дов. В кн.: «Биолюминесценция». М.: Наука. 125-132.

126. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. (1967). Сверхслабое свечение биологических систем. М.: Изд-во МГУ. 70 с.

127. Теренин Т.Н. (1967). Фотоника молекул красителей. JI-д: Наука. 308с.

128. Тимофеев-Ресовский Н.В. (1956). Биофизическая интерпретация явлений радиостимуляции растений. Биофизика. 1, вып. 7. 616-627.

129. Тимофеев-Ресовский Н.В. (1962). О радиоактивных загрязнениях биосферы и о мерах борьбы с этими загрязнениями. Сб. работ лаборатории биофизики (Тр. ин-та биологии УФ АН СССР, Свердловск), 4. Вып. 22. 7-16.

130. Тимофеев-Ресовский Н.В, Порядкова H.A. (1956). О радиостимуляции растений. Ботанический журнал. 41. № 11. 1620-1623.

131. Тимофеев-Ресовский Н.В., Савич A.B., Шальнов М.И. (1981). Введение в молекулярную радиобиологию (физико-химические основы). М.: медицина. 320 с. (с. 110 распад олигисахаридов)

132. Трубицин А.Г. (1974). Способ выделение здоровых семян сои. Патент RU 1205330. A.c. № 513660.

133. Тюрин Ю.С., Шаин С.С. (1974). Применение люминесцентного анализа в селекции яровой вики. Материалы I Всесоюз. симп. по молеку-ляр. и прикл. биофизике растений. Краснодар. 188-189.

134. Угольников О.В., Веселова Т.В., Сафьянникова Т.Ю. (1992). Влияние ускоренного старения на дыхание и всхожесть семян ржи. Онтогенез, 23. №3.326-329.

135. Усманов П.Д. (1999). Старение семян Arabidopsis thaliana и его обращение. Физиология растений, 46. № 3. 492-494.

136. Фаррар Т., Беккер Э. (1973). Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. М.: Мир. 150 с.

137. Филенко О.Ф. (1988). Водная токсикология. М.: Изд-во Московского университета. 154 с.

138. Фирсова М.К., Попова Е.П. (1981). Оценка качества зерна и семян. М.: Колос. 223 с.

139. Фрадкин Г.Е., Айзенберг O.A. (1986). Возможная роль нарушениямеханизмов, регулирующих репликацию и репарацию ДНК в процессах старения. В сб.: «Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов». Киев. Наукова думка. 123-133.

140. Фролькис В.В. (1970). Регулирование, приспособление и старение. JI-д. Наука. 432 с.

141. Фролькис В.В. (1986). Общие закономерности старения животных организмов. В сб.: «Надежность и элементарные события процессов старения биологических объектов». Киев: Наукова Думка. 5-12.

142. Хайдекер У. (1982). Стресс и прорастание семян: агрономическая точка зрения. В кн.: «Физиология и биохимия покоя и прорастания семян». Перевод с англ. под ред. Николаевой М.Г., Обручевой Н.В. 273319.

143. Хургин Ю.И. (1976). Гидратация глобулярных белков. Журн. Всесо-юз. хим. об-ea им. Д.И.Менделеева. 21. 684-690.

144. Черницкий Е.А. (1972). Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. Минск: Наука и техника. 278 с.

145. Числова Н.М. (1988). Влияние предпосевного фотоактивирования семян на продуктивность лука, огурца и люпина. Автореферат канд. дисс. Москва, (Всесоюзный сельскохозяйственный институт заочного образования, Балашиха).

146. Шапигузов Ф.Ю. (2004). Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции. Физиология растений, 51, № 1. 142-152.

147. Шестранд Ф. (1959). Ультраструктура клеток, наблюдаемая в электронном микроскопе. В кн.: Вопросы электронной микроскопии тканей. М.: Издат-во ИЛ. 9-66.

148. Шижнева И.А. (2007). Участие аквапоринов в поступлении воды в осевые органы прорастающих семян. Автореф. канд дисс. М., ИФР им. К.А.Тимирязева РАН. 26 с.

149. Шиманов В.Г., Шамсутдинов З.Г., Шегай В.Ю., Ионис Ю.И. (1975).

150. Способ определения всхожести семян. А.с. № 546314.

151. Цеденбал Зориг (1982). Исследование темнового фенментативного и светозависимого перекисного окисления мембранных липидов растений и его влияние на некоторые фотосинтетические функции. Авто-реф. канд. дисс., М.: МГУ, биофак. 23 с.

152. Цой К.М., Апрод А.И., Алешин Е.П., Баллод З.И. (1970). Способ определения жизнеспособности семян растений. А.с. № 372975.

153. Эйдус JI.X. (2001). Мембранный механизм биологического действия малых доз. М. 82 с.

154. Эмануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. (1961). Торможение процессов окисления жиров. М.: Пищепромиздат.

155. Эренберг, (1963) Свободные радикалы в ферментативных и радиобиологических процессах. В кн.: «Свободные радикалы в биологии». М.: ИЛ. 388-403.

156. Aaron J.J., Andino M., Winefordner J.D. (1984). The effect of ionexchange filter papers and of heavy atoms on room-temperature phosphorescence of several indoles. Analitica ChimicaActa, 160. 171-184.

157. Abdul-Baki A.A. (1980). Biochemical aspects of seed vigor. Hortscience, 15, 765-771.

158. Abdul-Baki A.A., Anderson J.D. (1972). Physiological and biochemical deterioration of seeds. In: «Seed Biology». Kozlovski T.T. (éd.). N.Y.: Academic Press. 2. 283-315.

159. Abeles F.B. (1986). Plant chemiluminescence. Annu. Rev. Plant Physiol., mi. 49-72.

160. Abeles F.B. (1987). Plant chemiluminescence: an overview. Physiol. Plant, 71. 127-130.

161. Al-Ani A., Bruzau F., Raymond P., Saint-Ges V., Leblanc J.M., Pradet A., (1985). Germination, respiration and adenylate energy charge of seeds at various oxygen partial pressures. Plant Physiol., 79, 885-890.

162. Albert F.G., Bennett L.W., Anderson A.J. (1986). Peroxidase associated with the root surface of Phaseolus vulgaris. Canad. J. Bot., 64. 573-578.

163. Alexander L.T. (1950). Radioactive materials as plant stimulants. Agronom. J., 42, 252-261.

164. Alsadon A.A., Yule L.J., Powell A.A. (1995). Influence of seed ageing on the germination, vigour and emergence in module trays of tomato and cucumber seeds. Seed Sci. and Tecnol., 23, № 3. 665-672.

165. Anderson J.D. (1973). Metabolic changes associated with senescence. Seed Sci. and Tecnol, 1. 401-416.

166. Andrews F., Bjorksten J., Trenk F.B. (1965). The reaction of an autoxi-dized lipid with proteins. J. Am. Oil Chem. Soc. 42. 779-781.

167. Appelqvist L.-A. (1975). Biochemical and structural aspects of storage and membrane lipids in developing oil seeds. In: «Recent advances in the chemistry and biochemistry of plant lipids». Galliard T., Mercer E.I. (eds.). 247286.

168. Baker E.H., Bradford K.J. (1994). The fluorescence assay for Maillard product accumulation does not correlate with seed viability. Seed Sci. Res., 4. 103-106.

169. Barber R.F. (1984). Senescence-related changes in the molecular organization of membrane lipid bilayer. Ph.D. Thesis, Univ. Of Waterloo. Waterloo, Ontario, Canada.

170. Barber R.F., Thompson J.E. (1980). Senescence-dependent increase in the permeability of liposomes prepared from bean cotyledon membranes. J. of ExperimentalBot, 31,Nol24. 1305-1313.

171. Barrowchlough D.E., Peterson C A., Steudle E. (2000). Radial hydraulic conductivity along developing onion roots. J. Exp. Bot., 51, 547-557.

172. Barton L.V. (1961). Seed preservation and longevity. London: Leonard Hill. №t. no Smith, Berjak, 1995).

173. Bateh R.P., Winefordner J.D. (1982). An evaluation of cellulose as a substrate for room-temperature phosphorescence. Talanta, 29. 713-717.

174. Baynes J.W. (1991). Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes, 40. 405-412.

175. Bernal-Lugo I., Leopold A.C. (1992). Changes in soluble carbohydrates during seed storage. Plant Physiol., 98. 1207-1210.

176. Bewley J.D., Black M. (1994). Seeds. Physiology of Development and

177. Germination (2nd edition). New York: Plenum Press.

178. Bino R.J., Lantery S., Verhoeven H.A., Kraak H.L. (1993). Flow cytometric determination of nuclear replication stage in seed tissues. Annals of Botany, 72. 181-187.

179. Blok M.C., Vender Neut-kok E.C.M., van Deenen L.L.M. de Gier J. (1975). The effect of chain length and lipid phase transitions on the selective permeability properties of liposomes. Biochim Biophys. Acta, 406. 187-191.

180. Botha F.C., Potgieter G.P., Botha A.-M. (1992). Respiratory metabolism and gene expression during seed germination. Plant Growth Regulation, 11. 211-224.

181. Boveris A., Cadenas E., Chance B. (1980). Low level chemiluminescence of the lipoxygenase reaction. Photobiochem. Photobiophys., 1. 175-182.

182. Boveris A., Puntarulo S.A., Roy A.H., Sanchez R.A. (1984). Spontaneous chemiluminescence of soybean embryonic axes during imbibition. Plant Physiol, 76. 447-451.

183. Boveris A., Varsavsky A.I., Da Silva S.G., Sanchez R.A. (1983). Chemiluminescence of soybean seeds: spectral analysis, temperature dependence and effect of inhibitors. Photochem. Photobiol., 38. 99-104.

184. Bray C.M., Dasgupta J. (1976). Ribonucleic acid synthesis and loss of viability in pea seeds. Planta, 132, No 1. 103-108.

185. Brocklehust P.A., Fraser R.S.S. (1980). Ribosomal RNA integrity and rate of seed germination. Planta, 148. № 5. 417-421.

186. Buchvarov P., Grantcheff T. (1984). Influence of accelerated and natural ageing on free radical levels in soybean seeds. Physiol.Plant., 60. 53-56.

187. Buitink J., Leprince O. Hemminga M.A., Hoekstra F.A. (2000). Molecularmobility in the cytoplasm: a new approach to describe and predict lifespan of dry germplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97. 2385-2390.

188. Buitink J., Mireille M.A.E., Hemminga M.A., Hoekstra FA. (1998). Influence of water content and temperature on molecular mobility and intracellular glasses in seed and pollen. Plant Physiology, 118. 531-541.

189. Buitink J., Walters-Vertucci C., Hoekstra F.A., Leprince O. (1996). Calo-rimetric properties of dehydrating pollen: analysis of a desiccation-tolerant and an -intolerant species. Plant Physiology, 111. 235-242.

190. Calabrese E.J., Baldwin L.A. (1999). Radiation hormesis: its historical foundation as a biological hypothesis. Human and Experimental Toxicology, 18. http://www.belleonline.com/newsletters/volume8/vol8-2/n2v82.html.

191. Calabrese E.J., Baldwin L.A. (2000). Tales of two hypotheses: the rise and fall of chemical and radiation hormesis. Human and Experimental Toxicology, 19. 85-97.

192. Caraceni P., Gasbarrini A., Vanthiel D.H., Borle A.B. (1994). Oxygen free radical formation by rat hepatocytes during postanoxic reoxygenation — scavenging effect of albumin. Am. J. Physiol. 266 (3 part 1). G451-G458.

193. Carvajal M., Cooke D.T., Clarkson D.T. (1998). The lipid bilayer and aq-uaporins: parallel pathways for water movement into plant cells. Plant Growth Regulation, 25. 89-95.

194. Chao C., Ma Y.-S., Stadtman E.R. (1997). Modification of protein surface hidrophobicity and methionin oxidation by oxidative systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94. 2969-2974.

195. Chaumont F., Barrieu F., Wojcik E., Chrispeels M.J., Jung R. (2001) Aq-uaporins constitute a large and highly divergent family in maize. Plant1. Physiol., 125, 1206-1215.

196. Ching T.M. (1973). Adenosine threephosphate content and seed vigor. Plant Physiol., 51. 400-402.

197. Chrispeels M.J., Crawford N.M., Schroeder J.I. (1999). Proteins for transport of water and mineral nutrients across the membranes of plant cells. The Plant Cell, 11 (April). 661-675.

198. Colli L., Facchini U. (1954). Light emission by germinating plants. Nuovo cim., 12. 150-153.

199. Colli L., Facchini U., Guidotti G., Duonani R., Lonati M., Orsenido, Sommariva O. (1955). Further measurements on the bioluminescence of the seedlings. Experienta, 11. 479-481.

200. Come D., Corbineau F. (1989). Some aspects of metabolic regulation of seed germination and dormancy. In: «Recent advances in the development and germination of seeds». Taylorson R.B. (ed.). N.Y.: Plenum Press. 165179.

201. Coolbear P., McGill C.R., Sakunnarak N. (1991). Susceptibility of pea seeds to acetone toxicity: interactions with moisture content and ageing treatments. Seed Sci., Technol, 19. № 3. 519-526.

202. Crawford R.M.M. (1977). Tolerance of anoxia and ethanol metabolism in germinating seeds. New PhytoL, 79. 511-517.

203. Crawford R.M.M., Walton J.C., Wollenweber-Ratzer B. (1994). Similarities between post-ischemic injury to animal tissues and post-anoxic injury in plants. Proceed. Royal Society of Edinburg, 102B. 325-332.

204. Crow D., Hoekstra F.A., Crow L.M. (1992). Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology, 54. 579-599.

205. Daniels M.J., Chaumont F., Mirkov T.E., Chreespeels M.J. (1996). Characterization of a new vacuolar membrane aquaporins sensitive to mercury at a unique site. Plant Cell, 8. 587-599.

206. Daniels M.J., Mirkov T.E., Chreespeels MJ. (1994). The plasma membrane of Arabidopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is a homolog of the tonoplast water channel protein TIP. Plant Physiol., 106. 1325-1333.

207. Debye P., Edwards I.O. (1952). A note on the phosphorescence of proteins. Science, 116. 143-144.

208. Dell-Aquila A., Taranto G. (1986). Cell division and DNA-synthesis during osmopriming treatment and following germination in aged wheat embryos. Seed Sci. Technol. 14. 333-341.

209. Delouche J.C., Baskin C.C. (1973). Accelerated aging techniques for predicting the relative storability of see lots. Seed Sci. Technol., 1. 427-452.

210. Dickie J.B., Ellis R.H., Kraak H.L., Ryders K., Tompsett P.B. (1990). Temperature and seed storage longevity. Annals of Botany, 65. 197-204.

211. Dourado A.M., Roberts E.H. (1984). Phenotypic mutations induced during storage in barley and pea seeds. Annals of Botany, 54, № 6. 781-790.

212. Duke S.H., Kakefiida G. (1981). Role of the testa in preventing cellular rupture during imbibition of legume seeds. Plant Physiol, 61. 449-456.

213. Duke S.H., Kakefuda G. (1983). Differential leakage of intracellular substances from imbibing soybean seeds. Plant Physiol., 72. 919-924.

214. Dure L.S., III. (1977). Stored messenger ribonucleic acid and seed germination. In: The Physiology and Biochemistry of Seed Dormancy and Germination. North Holland, Amsterdam. 335-345 (u,ht. no Smith, Berjak, 1995).

215. Elder R.H., Osborne D.J. (1993). Function of DNA synthesis and DNA repair in the survival of embryos during early germination and in dormancy. Seed Sci. Research, 3. 43-53.

216. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.H. (1986). Logarithmic relationship between moisture content and longevity in sesame seeds. Annals of Botany, 57,499-503.

217. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.H. (1989). A comparison of the low-moisture-content limit to the logarithmic relation between seed moisture andlongevity in twelve species. Annals of Botany, 63, 601-611.

218. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.H. (1990) Moisture content and the longevity of seeds of Phaseolis vulgaris. Annals of Botany, 66, 341-348.

219. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.H. (1991) Correspondence. Seed moisture content, storage and vigor. Seed Sci. Res., 1, 275-279.

220. Ellis R.H., Hong T.D., Roberts E.H. (1995). Survival and vigour of lettuce (Lactuca sativa L.) and sunflower (Helianthus annuus L.) seeds stored at low and very-low moisture contents. Annals of Botany, 16, 521-534.

221. Ellis R.H., Osei-Bonsu K., Roberts E.H. (1982). The influence of genotype, temperature and moisture on seed longevity in chickpea, cowpea and soya bean. Annals of Botany, 50. 69-82.

222. Ellis R.H., Roberts E.H. (1981). The quantification of ageing and survival in orthodox seeds. Seed Sci. Technol., 9, 373-409.

223. Elstner E.F., Heupel A. (1976). Formation of hydrogen peroxide by isolated cell walls from horseradish {Armoracia lapathifolia Gilib.). Planta, 130. 175-180.

224. Engel A., Walz T., Agre P. (1994). The aquaporin family of membrane water channels. Current Opinion in Structural Biology, 4. 545-553.

225. Feeney R.E., Whitaker J.R. (1982). The Maillard reaction and its prevention. In: «Food Protein Deterioration: Mechanisms and Functionality». J.P. Cherry (ed.). Washington: American Chemical Society. 201-229.

226. Finney D.G. (1971). Probit Analysis. L.: Cambridge Univ. Press. P. 26.

227. Franks F., Hatley R.H.M., Mathias S. (1991). Materials science and the production of shelf-stable biological. Bio. Pharm., 4. 38-42.

228. Fujimaki M., Namiki M., Kato H. Eds. (1986). Amino-Carbonyl Reactions in Food and Biological Systems. Elsevier. New York. (ijht. no Koster, Leopold, 1988).

229. Gao Y.P., Young L., Bonham-Smith P., Gusta L.V. (1999). Characterization and expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in primed seed of Brassica napus during germination under stress conditions. Plant MolBiol., 40. 635-644.

230. Giese A.C., Leighton P.A. (1937). Phosphorescence of cells and cell products. Science, 85. 428-430.

231. Ghasempour H.R., Gaff D.F., Williams R.P.W., Gianello R.D. (1998). Content of sugar in leaves of drying desiccation tolerant flowering plants, particularly grasses. Plant Growth Reg., 24. 185-191.

232. Golovina E.A., Tikhonov A.N. (1994). The structural differences between the embryos of viable and nonviable wheat seeds as studied with the EPR spectroscopy of lipid-soluble spin labels. Biochim. Biophys. Acta, 1190. 385-392.

233. Golovina E.A., Tikhonov A.N., Hoekstra F.A. (1997a). An electron paramagnetic resonance spin-probe study on membrane-permeability changes with seed ageing. Plant Physiol., 114. 383-389.

234. Goodwin R.H. (1953). Fluorescent substances in plants. Annu.Rev.Plant Physiol., 4. 283-304.

235. Goodwin R.H., Koski V.M., Owens O.V.H. (1951). The distribution and properties of a porphyrin from the epidermis of vicia shoots. Amer. J. of Bot., 38. 629-635.

236. Gornik K., de Castro R.D., Liu Y., Bino R.J., Groot S.P.C. (1997). Inhibition of cell division during cabbage (Brassica oleracea L.) seed germination. Seed Sci. research, 7. 333-340.252.

237. Harman G.E., Mattick L.R. (1976). Association of lipid oxidation with seed ageing and death. Nature, 260. № 5549. 323-324.

238. Harrington J.F. (1972). Seed storage and longevity. In: «Seed Biology». Kozlowski T.T. (ed.). Vol. 3. N.Y.: Academic Press. 145-245.

239. Harrington J.F. (1973). Biochemical basis of seed longevity. Seed Sci. Technol., 1, pp. 453-461.

240. Harrison B.J. (1966). Seed deterioration in relation to storage conditions and its influence upon germination, chromosomal damage, and plant performance. J. Natl. Inst. Agric. Bot., (G.B.) 10. 644-663.

241. Hastings G.W., Gibson O.H. (1967). The role of oxygen in the photoex-cited luminescence of bacterial luciferase. J. Biol.Chem., 242. 720-726.

242. Hay F.R., Mead A., Manger K., Wilson F. (2002). One-step analysis of seed storage data and longevity of Arabidopsis thaliana seeds. In: «VII International Workshop on Seed Biology». Salamanka, Spain. Abst. 47.

243. Hendry G.A.F. (1997). Free radicals in seeds moving the debate forward. 35

244. In: «Basic and Applied Aspects of Seed Biology». Ellis R.H., Black M., Murdoch A.J., Hong T.D. (eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Printed in Great Britain. 657-663.

245. Hendry G.A.F., Khan M. (1998). Seed mortality and free radicals. Abs. Book "Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants ". Euroconference, Granada, Spain December 17-19, 1998. 40.

246. Heydecker J.F. (1972). Vigour. In: «Viability of Seeds». Roberts E.H. (ed.) London. Chapman and Hall. 209-252.

247. Hill H.J., Taylor A.G., Huang X.L. (1988). Seed viability determinations in cabbage utilizing sinapin leakage and electrical conductivity measurements. J. Exp. Bot., 39. № 207. 1439-1447.

248. Hiramoto K., Kato Т., Kikugawa K. (1993). Generation of DNA-breaking activity in the Maillard reaction of glucose amino acid mixtures in the soil system. Mutat. Res., 285, № 2. 191-198.

249. Hoekstra F.A., Crow L.M., Crow J.H., Van Roekel Т., Vermeer E. (1992). Do phospholipids and sucrose determine membrane phase transitions in dehydrating pollen species? Plant Cell Environ., 15. 601-606.

250. Hoekstra F.A., Golovina E.A., Buitink J. (2001). Mechanisms of plant desiccation tolerance. TRENDS in Plant Science, 6 (9). 431-438.

251. Hofte H., Chrispeels M.J. (1992). Protein sorting to the vacuolar membrane. The Plant Cell, 4, 995-1004.

252. Horbowicz M. (1997). Changes of carbohydrate contents during natural and accelerated ageing of some vegetable seeds. In: «Basic and Applied Aspects of Seed Biology». Ellis R.H., Black M., Murdoch A.J., Hong T.D. (eds.) 803-808.

253. Inoue K., Takeuchi Y., Nishimura M., Hara-Nishimura I. (1995). Characterization of two integral membrane proteins located in the protein bodies of pumpkin seeds. Plant Molecular Biology, 28. 1089-1101.

254. Inze D., Vraniva E., Willekens H., Van Breusegem F., Van Montagu M., Van Camp W. (1998). Oxidative stress and signaling in plants. In Abstr. Books Eurokonference: "Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants ". Granada, Spain, 49.

255. Isely D. 1957. Vigor tests. Proc. Assoc. Offic. Seed Anal., 47, 176-182.

256. Ishida A., Ookubo К., Ono K. (1987). Formation of hydrogen peroxide by NAD(P)H oxidation with isolated cell wall-associated peroxidase from cultured liverwort cells Marschantia polymorpha L. Plant and Cell Physiol., 28. 723-726.

257. ISTA (International Seed Testing Association). International rules for seed testing: rules 1996, SeedSci. Technol., 24, Supplement (1996) 29-34

258. Jalink H., Van der Schoor R., Frandas A., Van Pijlen J.G. (1998). Chlorophyll fluorescence of the testa of Brassica oleracea seeds as an indicator of seed maturity and seed quality. Seed Sci. Res., 8. 437-443.

259. Javot H., Maurel C. (2002). The role of aquaporins in root water uptake. Annals of Botany, 90. 301-313.

260. Johansson I., Karlsson M., Shukla V.K., Chrispeels M.J., Larsson C., Kjellbom P. (1998). Water transport activity of the plasma membrane aq-uaporin PM28A is regulated by phosphorylation. Plant Cell, 10. 451-459.

261. Johnson K.D., Chrispeels M.J. (1992). Tonoplast-bound protein kinase phosphorylates tonoplast intrinsic protein. Plant Physiology, 100. 17871795.

262. Johnson K.D., Herman E.M., Chrispeels M.J. (1989). An abundant, highly conserved tonoplast protein in seeds. Plant Physiology, 91. 1006-1013.

263. Kaloyereas S .A. (1958) Rancidity as a factor in the loss of viability of pine and other seeds. J. Amer. Oil Chemists' Society, 35. 176-179.

264. Kalpana R., Madhava Rao K.V.M. (1995). On the ageing mechanism in pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.) seeds. Seed Sci. Technol., 23. 1-9.

265. Kauffman J.M. (2003). Radiation hormesis: Demonstrated, deconstructed, denied, dismissed, and some implications for public policy. J. Sci. Exploration. 17. N. 3. 389-407.

266. Khan A.U., Wilson T. (1995). Reactive oxygen species as cellular messengers. Chemistry and Biology, 2 (7). 437-445.

267. Kinoshita S., Masui H., Yoshida S., Murata I. (1999). Radiation hormesis: Stimulatory effects of low level ionizing radiation on plant. Technology report of the Osaka Univ. 49. 19-28.

268. Klein S., Barenholz H., Budnik A. (1971). The initiation of growth in isolated lima bean axes. Physiological and fine structural effects of actinomy-cin D, cycloheximide and chloramphenicol. Plant Cell Physiol, 12. 41-60 (Hht. no Smith, Berjak, 1995).

269. Koostra P.T., Harrington J.F. (1969). Biochemical effects of age on membrane lipids of Cucumis sativus L. seeds. Proc. International Seed Testing Ass. 34. 329-340.

270. Lanteri S., Quagliotti L., Belleti P., Scordino A., Triglia A., Musumeci F. (1997). Delayed luminescence of unaged and controlled deteriorated pepper seeds (Capsicum annuum L.). Capsicum and Eggplant Newsletter, 16.106109.

271. Larson L.A. (1968). The effect soaking pea seeds with or without seed coats has on seedling growth. Plant Physiol., 43. 255-259.

272. Leblova S. (1978). Pyruvate conversions in higher plants during natural anaerobiosis. In: «Plant Life in Anaerobic Environments». Hook D.D., Crawford R.M.M. (eds.). Ann Arbor Science, Ann Arbor, Michigan. 155168.

273. Lee G.L., Thompson J.E. (1980). Lipid composition and molecular organization in plasma membrane-enriched fractions from senescing cotyledons. Physiol. Plant., 49. 215-221.

274. Legesse, N. and Powell, A.A. (1992). Comparison of water uptake and imbibition damage in eleven cowpea cultivars. Seed Sci. Technol., 20. 173180.

275. Leopold A.C. 1983. Volumetric components of seed imbibition. Plant

276. Physiol, 736 №3, pp. 677-680.

277. Leopold A.C., Vertucci C.W. (1989). Moisture as a regulator of physiological reaction in seeds. In: «Seed Moisture». CSSA Special Publication # 14. Crop Science Society of America. Madison, WI. 51-67.

278. Likhatchev B.S., Zelensky G.V., Kiashko Yu.G., Shevchenko Z.N. (1984). Modeling of seed ageing. Seed Sci. and Technol., 12. 385-393.

279. Lindner W.A., Hoffman Ch., Grisebach H. (1988). Rapid elicitor-induced chemiluminescence in soybean cell suspension cultures. Phytochemistry, 27. 2501-2503.

280. Livesley M.A., Bray C.M. (1991). The effect of ageing upon a-amilase production and protein synthesis by wheat aleurone layers. Annals of Botany, 68. 69-73.

281. Locher R., Bucheli P. (1998). Comparison of soluble sugar degradation in soybean seed under simulated tropical storage conditions. Crop Science, 38, September-October, 1229-1235.

282. Ludevid D., Hofte H., Himelblau E., Christpeels M.J. (1992). The expression pattern of the tonoplast intrinsic protein y-TIP in Arabidopsis thaliana is correlated with cell enlargement. Plant Physiology, 100. 1633-1639.

283. Luckey T.D. (1980). Hormesis with ionizing radiation.

284. Lunn G., Madsen E. (1981). ATP levels of germinating seeds in relation to vigor. Physiologia Plantarum, 53. 164-169.

285. Mccarthy A.D., Cortizo A.M., Segura G.G., Bruzzone L., Etcheverry S.B. (1998). Non-enzymatic glycosylation of alkaline phosphatase alters its biological properties. Mol. Cell Biochem. APR, 181 (1-2). 63-69.

286. MacLeod A.M. (1952). Enzyme activity in relation to barley non-viability. Transsactions and Proceedings of the Botany Society of Edinburgh, 36. 1833 (uht. no Smith, Berjak, 1995).

287. Mader M., Chrispeels M.J. (1984). Synthesis of an integral protein of the protein-body membrane in Phaseolus vulgaris cotyledons. Planta, 160, 330

288. Maeshima M., Hara-Nishimura I., Takeuchi Y., Nishimura M. (1994). Accumulation of vacuolar H+-pyrophosphatase and H^-ATPase during reformation of the central vacuole in germination pumpkin seeds. Plant Physiology, 106. 61-69.

289. Maguire J.D. (1977). Seed quality and germination. In: «The Physiology and Biochemistry of Seed Dormancy and Germination». Khan A.A. (ed.). Amsterdam: North Holland Publication Corp. 219-235.

290. Marcus A. (1969). Seed germination and the capacity for protein synthesis. Symposium of the Society for Experimental Biology, 23. 143-190 (цит. no Smith, Berjak, 1995).

291. Matile P., Hortensteiner S., Thomas H. (1999). Chlorophyll degradation. Annu.Rev. Physiol. Plant Mol. Biol., 50. 67-95.

292. Maurel C. (1997). Aquaporins and water permeability of plant membranes. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48, 399-429.

293. Maurel C., Chrispeels M., Lurin C., Tacnet F., Geelen D., Ripoche P., Guern J. (1997). Function and regulation of seed aquaporins. Journal of Experimental Botany, 48, Special issue, 421-430.

294. Maurel C., Reizer J., Schroeder J.I., Chrispeels M.J. (1993). The vacuolar membrane protein y-TIP creates water specific channels in Xenopus oocytes. EMBOJ. 12, 2241-2247.

295. Maurel C., Kado R.T., Guen J., Chrispeels J. 1995. Phosphorylation regulates the water channel activity of the seed-specific aquaporins a-TIP. The EMBO Journal, 14, 3028-3035.

296. Mazor L., Negbi M., Perl M. (1984). The lack of correlation between ATP accumulation in seeds at the early stage of germination and seed quality. Journal of Experimental Botany, 35. N 157. 1128-1135.

297. Mccarthy A.D., Cotizo A.M., Segura G.G., Bruzzone L., Etcheverry S.B. (1998). Non-enzymatic glycosylation of alkaline phosphatase alters its biological properties. Mol. CellBiochem. 181 (1-2). 63-69.

298. McKersie B.D., Lopock J.R., Kruuv J., Thompson J.E. (1978). The effects of cotyledon senescence on the composition and physical properties of membrane lipid. Biochi. Biophys. Acta, 508. 197-212.

299. McKersie B.D., Thompson J.E. (1977). Lipid crystallization in senescent membranes from cotyledons. Plant Physiol., 59. 803-807.

300. Mead A., Gray D. (2002). Prediction of seed longevity: a modified model and improved fitting process. In: «VII International Workshop on Seed Biology». Salamanka, Spain. Abst. 46.

301. Mccarthy A.D., Cortizo A.M., Segura G.G., Bruzzone L., Etcheverry S.B. (1998). Non-enzymatic glycosylation of alkaline phosphatase alter its biological properties. Mol. Cell Biochem. 181 (1-2). 63-69.

302. Melroy D.L., Herman E.M. (1991). TIP, an integral membrane protein of the protein-storage vacuoles of the soybean cotyledon undergoes develop-mentally regulated membrane accumulation and removal. Planta, 184. 113122.

303. Miller M.W., Miller W.M. (1987). Radiation hormesis in plants. Health Phys., 52(5). 607-616.

304. Mokobia C.E., Okpakorese E.M., Analogbei C., Agbonwanegbe J. (2006). Effect of gamma irradiation on the grain yield of Nigerian Zea mays and

305. Arachis hypogaea. J. Radiol. Prot. 26(4). 423-427.

306. Monnier V.M. (1989). Toward a Maillard reaction theory of aging. In: The Maillard Reaction in Aging, Diabetes and Nutrition. Baynes J.W., Monnier V.M. (eds). Academoc New York, NY: Alan R. Liss, Inc. 1-22.

307. Mukhtar N.D., Laidman D.L. (1982). Mineral ion transport in the embryos of germinating wheat (Triticum aestivum). J. Exp. Bot. 33, 643-655.

308. Murata M., Roos E.E., Tsuchiya T. (1981). Chromosome damage induced by artificial seed ageing in barley I. Germinability and frequency of aberrant anaphases at first mitosis. Canadian J. Genetics and Cytology, 23. 267-280.

309. Murthy U.M.N., Sun W.Q. (2000). Protein modification by Amadori and Maillard reactions during seed storage: role of sugar hydrolysis and lipid peroxidation. J. Exp. Bot., 51, No 348. 1221-1228.

310. Musumeci F., Triglia A., Grasso F., Scordino A., Sitko D. (1994). Relation between delayed luminescence and functional state in soya seeds. II Nuovo cimento, 16(1). 65-73.

311. Namiki M., Oka M., Otsuka T., Fujimoto K., Namiki K. (1993). Weak chemiluminescence at an early stage of the Maillard reaction. J. Agr. Food Chem., 41 (10), 1704-1709.

312. Navashin M.S. (1933). Ageing of seeds is a cause of chromosome mutations. Planta, 10. 233-243.

313. Nichaus W.J. Js. (1978). A proposed role of superoxide anion as a biological nucleophile in the deesterification of phospholipid. Bioorg. Chem., 1. 7784.

314. Nichols C. (1941). Spontaneous chromosome aberration. In: Allium. Genetics, 26. 89-100.

315. Obroucheva N.V. (1999). Seed Germination: a Guide to the Early Stages, Buckhuys Publishers, Leiden, 1999. 145 pp.

316. Oliviusson P., Hakman I. (1995). A tonoplast intrinsic protein (TIP) is present in seeds, roots and somatic embryos of Norway spruce (Picea abies). Physiol Plant., 95, 288-295.

317. Ory R.L., St.Angelo A J. (1982). Effect of lipid oxidation on protein of oil seeds. «In: Food Protein Deterioration: Mechanisms and Functionality». Cherry J.P. (ed.). Washington: American Chemical Society. 55-65.

318. Osawa Z., Kuroda H. (1982). Luminescence emission of high-density polyethylene./ ofPolymer Set: Polymer Letters Edition, 20. 577-581.

319. Osborne DJ. (1980). Senescence in seeds. In: «Senescence in Plants». Thimann K.V. (éd.). CRC Press, Boca Raton, FL. 13-37.

320. Osborne D.J. (1982). Deoxyribonucleic acid and repair in seed germination: the importance in viability and survival. In: «The Physiology and Biochemistry of Seed Dormancy and Germination». Khan A. (ed.): Amsterdam. Elsevier Biomedical Press. 435-463.

321. Osborne D.J. (1983). Biochemical control systems operating in the early hours of germination, Canadian Journal of Botany, 61. 3568-3577.

322. Papkovsky D.B., Ponomarev G.V., Trettnak W., O'Leary P. (1995). Phosphorescent complexes of porphyrin ketones: optical properties and application to oxygen sensing. Anal. Chem., 67. 4112-4117.

323. Papp S., Vanderkool J.M. (1989). Tryptophan phosphorescence at room temperature as a tool to study protein structure and dynamics. Photochem. Photobiol, 49 № 6. 775-784.

324. Parrish D.L., Leopold A.C. (1977). On the mechanism of aging in soybean seeds. J. Exp. Bot, 61. 365-368.

325. Patterson C.O., Myers J. (1973). Photosynthetic production of hydrogen peroxide of Anacystis nidulans. Plant Physiol. 51. 104-109.

326. Perl M., Luria I., Gelmond H. (1978). Biochemical changes in wheat embryos aged under different storage conditions. J. Exp. Bot., 28. 227-236.

327. Perry D.A. 1973. Interacting effects of seed vigour and environment on seedling establishment. In: «Seed Ecology». Heydecker W. (ed.). London. Butterworth. 311-335.

328. Petruzelli L., Taranto G. (1984). Phospholipid changes in wheat embryos aged under different storage conditions. J. Exp. Bot., 35. 517-534.

329. Pfister-Sieber M., Brandie R. (1994) Aspects of plant behavior under anoxia and post-anoxia, Proceed. Royal Society of Edinburgh 102B. 313-324.

330. Pillay D.T.N., Gowda S. (1981). Age-related changes in transfer RNA synthesis in germinating soybean (Glycine max cultivar Harcor) cotyledons. Gerontology, 27. 194-204.

331. Piatt-Aloia K.A., Thompson W.W. (1985). Freez-fracture evidence of gelphase lipid in membranes of senescing cowpea cotyledons. Planta, 163. 360-369.

332. Ponquett R.T., Smith M.T., Ross G. (1992). Lipid autoxidation and seed ageing: putative relationships between seed longevity and lipid stability. SeedSci. Research, 2. 51-54.

333. Powell A.A., Matthews S. (1977). Deteriorative changes in pea seeds (Pisum sativum L.) stored in humid or dry conditions. J. Exp. Bot., 28, № 112. 787-794.

334. Powell A.A., Matthews S. (1978). The damaging effect of water on drypea embryos during imbibition. J. Exp. Bot., 29, № 112. 1215-1229.

335. Powell A.A., Matthews S. (1979). The influence of test conditions on the imbibition and vigour of pea seeds. J. Exp. Bot., 30, 193-197.

336. Powell A.A., Matthews S. (1981). Association of phospholipid changes with early stage of seed ageing. Ann. Bot., 47. 709-712.

337. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B., Agre P. (1993). The mercury-sensitive residue at cystein 189 in the CHIP28 water channel. J. Biol. Chem., 268. 17-20.

338. Prichard Ph.M., Corner M.J. (1968). Studies on the mechanisms of horseradish peroxidase catalyzed luminescent peroxidation of luminol. Biochem. AndBiophys. Res. Commun., 31. 131-138.

339. Priestley D.A. (1986). Seed Ageing: Implication for Seed Storage and Persistence in the Soil, Comstock Publishing Associates, Ithaca, New York, London. 304.

340. Priestley D.A., Leopold A.C. (1979). Absence of lipid oxidation during accelerated aging of soybean seeds. Plant Physiology, 63. 726-729.

341. Priestley D.A., Verner B.G., Leopold A.C. McBride M.B. (1985). Organic free radical levels in seeds and pollen. The effects of hydration and ageing. Physiol. Plant., 64. 88-94.

342. Pukacka S. (1983). Phospholipid changes and loss of viability in norway maple (Acer platanoides L.) seeds. Z .Pflanzenphysiol., 112. 199-205.

343. Puntarulo S. (1994). Effect of oxidative stress during imbibition of soybean embryonic axes. Proceedings of the Royal Society of Edinburg, 102B. 279-286.

344. Puntarulo S., Galleano M., Sanchez R.A., Boveris A. (1991). Superoxide anion and hydrogen peroxide metabolism in soybean embryonic axes during germination. Biochemica et Biophysica Acta, 1074, 277-283.

345. Ramamoorthy K.D., Kalavathy C.P., Thiagrajan, Jajakumar G. (1989). Evaluation of maize inbreds and their hybrids for vigour, viability and storability by accelerated ageing. Seeds and Farms., 15. 31-32.

346. Raymond P., Al-Ani A., Pradet A. (1983). Low contribution of non respiratory pathways in ATP regeneration during early germination of lettuce seeds. Physiol Veg., 21 (4), 677-687.

347. Raymond P., Al-Ani A., Pradet A. (1985). ATP production by respiration and fermentation and energy charge during aerobiosis and Anaerobiosis in twelve fatty and starchy germinating seeds. Plant Physiol, 79. 879-884.

348. Redfearn M., Clarke N.A., Osborne D.J., Halmer P., Thomas T.H. (1995). DNA integrity and synthesis in relation to seed vigour in sugar beet. In: «Basic and Applied Aspects of Seed Biology». Ellis R.H., Black M., Murdoch A J., Hong T.D. (eds.) 413-421.

349. Rich G.T., Sha'afi R.I., Barton T.C., Solomon A.K. (1968). Permeability studies on red cell membranes of dog, cat and beef. J. Gen. Phys., 50. 23912405.

350. Roberts E.H. (1972). Cytological, genetical and metabolic changes associated with loss of viability. In: «Viability of Seeds». Roberts E.H. (ed). Chap-mam and Hall, London. 253-306.

351. Roberts E.H. (1988). Seed aging: the genome and its expression. In: «Senescence and Aging in Plants». N.Y.: Academic Press. 465-498.

352. Roberts E.H., Abdalla F.H. (1968). The influence of pre- and post-storage hydration treatment on chromosomal aberrations, seeds abnormalities, and viability of lettuce seeds. Annals of Botany, 32. 97-117.

353. Roberts E.H., Ellis R.H. (1982). Physiological, ultrastructural and metabolic aspects of seed viability. In: «The Physiology and Biochemistry of Seed Dormancy and Germination». Khan A.A. (ed.) Amsterdam: Elsevier Biomedical Press. 465-485.

354. Roberts E.H., Ellis R.H. (1989). Water and seed survival. Ann. of Botany, 63. 39-52.

355. Roberts E.H., Osborne D.J. (1973). Protein synthesis and the viability inrye embryos. The lability of transferase enzymes during senescence. Biochemical Journal, 135. 405-410.

356. Rolletschek H., Borisjuk L., Koschorreck M., Wobus U., Weber H. (2002). Legume embryos develop in a hypoxic environment. J. Experim. Bot., 53 (371). 1099-1107.

357. Saeki R., Miyazawa Т., Usa M., Inaba H. (1990). Relationship between low-level chemiluminescence and germinability of soybean seeds. Agr. Biol. Chem., 54(6). 1603-1605.

358. Salama A.M., Pearce R.S. (1995). Ageing of cucumber and onion seeds: phospholipase D, lipoxygenase activity and changes in phospholipid content. J. Exp. Bot., 44. № 265. 1253-1265.

359. Sanchez L.M., Doke N., Kawakita K. (1993). Elicitor-induced chemiluminescence in cell suspension cultures of tomato, sweet pepper and tobacco plants and its inhibition by suppressors from Phytophthora spp. Plant Sci., 88 (2). 141-148.

360. Sanchez R.A., Miguel L.C. (1983). Ageing of Datura ferox seeds embryos during diy storage and its reversal during imbibition. Z.Pflanzenphysiol., 110.319-329.

361. Schoettle A.W., Leopold A.C. (1984). Solute leakage from artificially aged soybean seeds after imbibition. Crop Science, 24. 835-838.

362. Schuurmans J.A., van Dongen J.T., Rutjens B.P. et al. (2003). Member of the aquaporin family in the developing pea seed coat include representatives of the PIP, TIP and NIP subfamilies. Plant Mol. Biol. 53. № 5. 633-645.

363. Scott G.E. (1981). Improvement for accelerated aging response of see in maize population. Crop Science, 21, 41-43.

364. Scott H., Wettlaufer S.H., Leopold A.C. (1991). Relevance of Amadori and Maillard products to seed deterioration. Plant Physiol., 97. 165-169.

365. Senaratna T., Gusse J.F., McKersie B.D. (1988). Ageing-induced changes in cellular membranes of imbibed seed axes. Physiol. Plant., 73. 85-91.

366. Senaratna T., McKersie B.D., Stinson R.H. (1985). Simulation of dehydration to membranes from soybean axes by free radicals. Plant Physiol., 77. 472-474.

367. Shah N.K., Ludescher D. (1993). Influence of hidratation on the internal dynamics of hen egg white lysozyme in the dry state. Photochem. and Photobiol., 58 (2). 169-174.

368. Sheppard S.C., Regitnig P.J. (1987). Factors controlling the hormesis response in irradiated seed. Health Phys., 52(5). 599-605.

369. Simon E.W. (1974). Phospholipids and plant membrane permeability. New Phytol, 73. 377-420.

370. Simon E.W., Harum. R.M.R. (1972). Leakage during seed imbibition. J. Exp. Bot., 23, № 77. 1076-1085.

371. Simontacchi M., Puntarulo S. (1994). Effects of ageing on oxygen radical generation by soyabean seeds. In: «Oxygen Environment Stress in Plants». Waiting R., Allen J. A. (eds.) Proceedings of the Royal Society ofEdinburgh, 102B. 295-302.

372. Sivritere H.O., Dourado A.M. (1994). The effect of humidification treatments on viability and the accumulation of chromosomal aberration in pea seeds. Seed Sci. Technol. 22. № 2. 337-348.

373. Smirnov A.L., Golovina E.A., Yakimchenko O.E., Aksyonov S.I., Lebe-dev Y.S. (1992). In vivo seed investigation by ESR spin probe technique. J.Plant Physiol, 140. 447-452.

374. Smith M.T., Berjak P. (1995). Deteriorative changes associated with the loss of viability of stored desiccation-tolerant and desiccation-sensitive seeds. In: «Seed Development and Germination». Kigel J., Galibi G. (eds.).

375. Marcel Dekker, Inc., New York. 701-746.

376. Stewart R.R.C., Bewley J.D. (1980). Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiol., 65. 245-248.

377. Street H.E. (1977). Plant Tissue and Cell Culture. Oxford etc. Bot. Monogr., 11. 614 p.

378. Strehler B.L., Arnold W.A. (1951). Light production by green plants. G. Gen. Physiol., 34. 809-820.

379. Sun W.Q., Irving T.C., Leopold A.C. (1994). The role of sugar, verification and membrane phase transition in seed desiccation tolerance. Physiol. Plant., 90. 621-628.

380. Sun W.Q., Leopold A.C. (1993). The glassy state and accelerated aging of soybeans. Physiol. Plant., 89. 767-774.

381. Sun W.Q., Leopold A.C. (1994). Glassy state and seed storage stability: a viability equation analysis. Annals of Bot., 74. 601-604.

382. Sun W.Q., Leopold A.C. (1995). The Maillard reaction and oxidative stress during ageing of soybean seeds. Physiol. Plant., 94. 94-104.

383. Sung J.M. (1996). Lipid peroxidation-scavenging in soybean seeds during ageing. Physiol. Plant., 97. 85-89.

384. Tilden, R.L., West, S.H. (1985). Reversal of the effect of ageing in soybean seeds. Plant Physiol., 77. 584-586.

385. Thompson J.E., Legge R.L., Barber R.F. (1987). The role of free radicals in senescence and wounding. New Phytol., 105. 317-344.

386. Tully R.E., Musgrave M.E., Leopold A.C. (1981). The seed coat as a control of imbibitional chilling injury. Crop Sci., 21. 312-317.

387. Vartapetian B.B., Agapova L.P., Averianov A.A., Veselovsky V.A. (1974). New approach to study of oxygen transport in plants using chemiluminescent method. Nature, 249, no. 5454. 269-270.

388. Vazquez E.F., Montiel, Vazquez-Ramos J.M. (1991). DNA ligase activity in deteriorated maize embryonic axes during germination: a model relating defects in DNA metabolism in seeds to loss of germinability. Seed Sci. Res., 1. 269-273.

389. Vertucci C.W. (1989). The kinetics of seed imbibition: controlling factors and relevance to seedling vigor. In: «Seed Moisture». Crop Science Society of America, Special Publication no. 14 Madison, WI. 93-115.

390. Vertucci C.W., Farrant J.M. (1995). Acquisition and loss of desiccation tolerance. In: «Seed Development and Germination». Kigel J., Galili G. (eds.). New York, Basel, Hong Kong: Marcel Dekker, Inc. 238-271.

391. Vertucci C.W., Leopold A.C. (1984). Bound water in soybean seed and its relation to respiration and imbibitional damage. Plant Physiol, IS. 114-117.

392. Vertucci C.W., Leopold A.C. (1986). Physiological activities associatedwith hydration level in seeds. In: «Membranes, Metabolism and Dry Organisms». Leopold A.C. (ed.). Comstock Publ. Ass. Ithaca, London. 35-49.

393. Vertucci C.W., Roos E.E. (1990). Theoretical basis of protocols for seed storage. Plant Physiol., 94. 1019-1023.

394. Vertucci, C.W., Ross, E.E. and Crane, J. (1994). Theoretical basis of protocols for seed storage III. Optimum moisture contents for pea seeds stored at different temperatures. Annals of Botany, 74, 531-540.

395. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Rubin A.B., Bochvarov P.Z. (1985). Delayed luminescence of air-dry soybean seeds as a measure of their viability. Physiol. Plant., 65. 493-497.

396. Veselova T.V., Veselovsky V.A., Kozar V.I., Rubin A.B. (1988). Delayed luminescence of soybean seeds during swelling and accelerated ageing. Seed Sci. Technol. 16. 105-113.

397. Villiers T.A. (1973). Ageing and longevity of seeds in field conditions. In: «Seed Ecology». Hey decker W. (ed.), London: Butterworth. 265-288.

398. Walters C., Engels J. (1998). The effect of storing seeds under extremely dry conditions. Seed Sci. Res., 8. 3-8.

399. Walton D.C., Soofi G.S. (1969). Germination of Phaseolus vulgaris. III. The role of nucleic acid and protein synthesis in the initiation of axes elongation. Plant Cell Physiol, 10. 307-315 (miT. no Smith, Berjak, 1995).

400. Weissenbock G., Schnabl H., Scharf H., Sachs G. (1987). On the properties of fluorescent compounds in guard and epidermal cells of Allium cepa L. Planta, 171. 88-95.

401. Wendell Q.S., Leopold A.C. (1995). The Maillard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Physiol Plantarum, 94.94-104.

402. Wettlaufer S.H., Leopold A.C. (1991). Relevance of Amadori and Maillard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Plant Physiol., 97. 165-169.

403. Williams R.J., Leopold A.C. (1989). The glassy state in corn embryos. Plant Physiol., 89. 977-981.

404. Widell S., Sundqvist Ch. (1987). Fluorescence properties of plasma membranes from oats and cauliflower in relation to blue light physiology. Physiol. Plant., 70. 27-34.

405. Willigen V. C., Postaire O., Tournair-Roux C., Boursiac Y., Maurel C. (2006). Expression and inhibition of aquaporins in germinating Arabidopsis seeds. Plant Cell Physiol., 47, 1241-1250.

406. Wilson D.O., McDonald M.B., (1986). The lipid peroxidation model of seed ageing. Seed Sci. Technol., 14. 269-300.

407. Wojtaszek P. (1997). Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem J., 322. 681-692.

408. Wolkers W.F. (2001) Isolation and characterization of D-7LEA protein from pollen that stabilizes glasses in vitro. Biochim. Biophys. Acta, 1544. 196-206.

409. Wondrak G., Pier T., Tress R. (1995). Light from Maillard reactions: photon counting, emission spectrum, photography and visual perception. J. Biolumines,. Chemilumines., 10, № 5, 277-284.

410. Wong J.K., Salin M. (1981). Quenching of peroxidized luminol chemilu-minescence by reduced pyridine nucleotides. Photochem. and Photobiol., 33. 737-740.

411. Woodstock L.W., Tao K.L.J. (1981). Preventing of imbibition injury in low vigour soybean embryonic axes by osmotic control of water uptake. Physiol. Plant., 51. 133-139.

412. Woodstock L.W., Taylorson R.B. (1981). Soaking injury and its reversal with polyethylene glycol in relation to respiratory metabolism in high andlow vigor soybean seeds. Physiol. Plant., 53. 263-268.

413. Yamada S., Katsuhara M., Kelly W.B., Michalowski C.B., Bohnet HJ. (1995). A family of transcripts encoding water channel proteins: tissue-specific expression in the common ice plant. Plant Cell, 7. 1129-1142.

414. Zalewski K. (1999). Changes in the composition of glycerophospholipids in faba bean seeds during storage. Plant Breeding and Seed Science. 43. No 2. 21-27.

415. Zalewski K., Lahuta L.B. (1998). The metabolism of ageing seeds, changes in the raffinose family oligosaccharides during storage of field bean (Vicia faba var. minor Harz) seeds. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 67. No 2. 193-196.

416. Zeng X.-Y., Chen R.-Z., Fu J.-R., Zhang X.-W. (1998). The effect of water content during storage on physiological activity of cucumber seeds. Seed Sci. Research, 8. 65-68.

Информация о работе

Веселова, Татьяна Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.01

Диссертация

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующее излучение в малых дозах и другие слабые воздействия), определяемое методом замедленной люминесценции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы