Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающих семенах различных сортов ярового ячменя

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающих семенах различных сортов ярового ячменя"

4852904

КОВАЛЁВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ГЛУТАТИОНА В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ

Специальность 06.01.05. - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

|1 5 СЕН 2011

Краснодар - 2011

4852904

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Азово-Черноморская Государственная Агроинженерная академия» в 2005-2010 гг.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Казакова Алия Сабировна

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Федулов Юрий Петрович; кандидат биологических наук Зеленский Алексей Григорьевич

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится 22.09 2011 г. в 11 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 220.038.03 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, зал заседаний диссертационного совета. Телефон (факс) (8-861) 221-57-93

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом на сайте http://www.kubsau.ru

Автореферат разослан « »_2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, д.б.н., профессор

Л.В.Цаценко

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Прорастание семян сопровождается активацией генома и физиолого-биохимических процессов [Обручева и др., 1999]. С активизацией метаболических процессов в клетках прорастающих семян наблюдается образование активных форм кислорода (АФК), защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы (АОС) в составе низко- и высокомолекулярных соединений [Кения, Лукаш, 1993]. Имеющийся в настоящее время научный материал свидетельствует о важной роли низкомолекулярных компонентов АОС - аскорбиновой кислоты (АК) и глутатиона (СБН) - в защите клеток от избыточного накопления и повреждающего действия АФК [Мерзляк, 1999; Полесская, 2007].

Исследования АК и вБН проводятся в основном на вегетирующих растениях, а изучение их функционирования в прорастающих семенах носит фрагментарный характер [Вопза£ег е! а1., 2010; Спивак, Шалыго, 2010]. Такие исследования проводят на семенах, которые прорастали определенное время, поэтому в одну пробу попадают семена, находящ иеся на разных фазах прорастания, а также могут попасть и мертвые. Исследование содержания компонентов АОС в период прорастания индивидуального семени ярового ячменя представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии, что поможет разработать надежные критерии оценки селекционных образцов на устойчивость к различным стрессам, которым подвергается семя в период прорастания. В АЧГАА предложена усовершенствованная шкала микрофенологических фаз прорастания семян ячменя [Казакова, Козяева, 2009], которая может служить методической базой для изучения работы АОС в индивидуальном семени ячменя. Для однозначного понимания роли низкомолекулярных антиоксидантов (НАО) аскорбиновой кислоты и глутатиона необходимо изучить их содержание в определённые фазы прорастания индивидуального семени в условиях нормального водообеспечения и оценить работу аскорбат-глутатионового цикла.

Цель исследований - Выявить особенности изменения содержания низкомолекулярных антиоксидантов аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающем семени различных сортов семян ярового ячменя за разные годы репродукции в условиях оптимального увлажнения. Задачи исследований:

1. провести анализ современного состояния проблемы участия НАО в устойчивости к окислительному стрессу сухих и прорастающих семян, проростков и вегетирующих растений зерновых культур;

2. определить энергию прорастания и всхожесть семян разных сортов ярового ячменя при проращивании в условиях оптимального и недостаточного увлажнения;

3. определить содержание АК, GSH и значения общей редуцирующей активности (OPA) в сухом и прорастающем семени ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения;

4. установить влияние гидротермических условий года репродукции семян на содержание НАО в сухом и прорастающем семени по микрофенологическим фазам прорастания семян;

5. выявить корреляционные связи содержания АК и GSH в сухом и прорастающем семени;

6. изучить содержание и интенсивность накопления компонентов системы аскорбиновой кислоты в сухом и прорастающем семени ярового ячменя;

7. изучить содержание и интенсивность накопления восстановленного глутатиона в сухом и прорастающем семени ярового ячменя;

8. провести анализ функционирования аскобат-глутатионового цикла на основании данных по содержанию аскорбиновой кислоты и глутатиона в семени по микрофенологическим фазам прорастания.

Научная новизна: Впервые изучена динамика содержания низкомолекулярных антиоксидантов АК и GSH в прорастающем семени ярового ячменя районированных сортов селекции двух ведущих центров юга России - Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко и ВНИИЗК им. И.Г.

Калиненко (г. Зерноград Ростовской области) в условиях оптимального увлажнения. Выявлены общие закономерности и сортовая специфика содержания НАО по микрофенологическим фазам прорастания семян (МФФ ПС). Установлены закономерности изменения количества компонентов системы аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона и интенсивности этого процесса в прорастающем семени в условиях оптимального увлажнения у устойчивых и неустойчивых к почвенной засухе сортов ярового ячменя. Показано влияние генотипа и условий весенне-летнего периода года формирования семян на содержание АК и ОБН в сухом семени. Установлено изменение молярного соотношения АК и ОБН по фазам прорастания семени. Показано, что содержание АК и СБН в сухом и прорастающем семени имеют отрицательную корреляцию. Сорта, отличающиеся по устойчивости к дефициту влаги в период прорастания семян, имеют отличия в содержании ОБН и компонентов системы АК.

Структура работы. Диссертация изложена на 159 страницах компьютерной версии и состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературных источников из 136 наименований, в том числе 55 -иностранных авторов, и 14 приложений. Диссертация включает 13 таблиц и 25 рисунков.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты исследований были доложены на научно-практических конференциях АЧГАА (г. Зерноград) в 2008, 2009 и 2010 гг.; на 3-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону) в 2009г.; на Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (г.Москва) в 2010г.

Методика и условия проведения опытов Объектом исследования явились семена восьми сортов ярового ячменя: Стимул, Мамлюк, Виконт, Рубикон (краснодарской селекции), а также Зерноградец 770, Зерноградский 584 и Приазовский 9 (зерноградской

селекции). Семена были выращены в учебно-опытном фермерском хозяйстве АЧГАА в 2004 (семена-04), 2006 (семена-06) и 2007 (семена-07) годов.

Методика исследований. Семена проращивали в растильнях на фильтровальной бумаге, их энергию прорастания и всхожесть определяли согласно ГОСТ 12038-84. Засуху моделировали с помощью 0,2М раствора сахарозы с осмотическим давлением 5,3атм. Характеристику гидротермического режима весенне-летнего периода вегетации растений ячменя давали с использованием гидротермического коэффициента Селянинова [Сапожникова, 1958], на основании чего 2004г. характеризуется как оптимальный, 2006г. — умеренно засушливый, а 2007г. -острозасушливый. Содержание АК и GSH определяли в сухих семенах («СС»), и семенах, достигших определенной микрофенологической фазы прорастания: «точка, Т» (наклюнувшиеся семена), «к-2» (короткие корешки), «к-3» (длинные корешки) и «проросток, П» [Казакова, Хозяева, 2009]. Для анализа вычленяли из них зародыш и определяли в нем содержание НАО.

Определение АК, GSH и OPA проводили по методу Петта в модификации Прокошева [Третьяков, 2003]. Количественное определение аскорбиновой (АК), дегидроаскорбиновой (ДАК) и дикетогулоновой (ДКГК) кислот в растительных тканях проводили по методу Соколовского и др. [Чупахина, 2000]. Определение восстановленного глутатиона проводили по модифицированной нами методике определения восстановленной формы глутатиона в вегетативных органах растений [Гришко, Сыщиков, 2002] с реактивом Эллмана.

3. Результаты исследований 3.1 Особенности функционирования аскорбат-глутатионового цикла

в прорастающих семенах ярового ячменя разных сортов 3.1.1 Содержание аскорбиновой кислоты, глутатиона и значения общей редуцирующей активности. Изменение содержания АК, GSH и

значений OPA в тканях зародыша семени ярового ячменя по МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения имеют общие закономерности для всех сортов. Оно сначала увеличивается и достигает максимума в фазе «к-3» или в фазе «П»; либо, достигнув максимума в фазе «к-3», снижается к фазе «П» (рисунок 1). Выявлены сортовые различия по содержанию НАО по МФФ ПС. Сорта, накапливающие много АК в тканях зародыша по МФФ ПС, не всегда имеют высокое содержание GSH. По содержанию АК в «СС» выделился сорт Стимул, а по содержанию GSH - Зерноградский 584.

ДЗзсвзШ.,

Аскорбиновая кислота

[Г-Н

проросток

проросток

Общая редуцирующая активность

сухое

ш Мамлюк

точка к-2

□ Стимул

□ Рубикон ■ Приазовский 9

в Зерноградец 770 а Максим

к-3 проросток

В Виконт

Н Зерноградский 584

Рисунок 1 - Содержание АК, GSH и значения OPA в сухом и прорастающем семени ярового ячменя (среднее за три года)

3.1.2. Влияние гидротермических условий года репродукции семян на содержание НАО в прорастающих семенах ярового ячменя. Характер накопления АК и GSH и значений OPA в семени по МФФ ПС не зависит от условий года репродукции семян, а содержание НАО меняется по-разному: содержание АК снижается в ряду семена-04>семена-06 >семена-07, а вот содержание GSH снижается в ряду семена-06>семена-07 >семена-04 (рисунок 2).

Аскорбиновая кислота

2004 - 2QQ6 -2007

проросток

; 1во 140

I 120 \ 100

Рисунок 2 - Влияние года репродукции семян на содержани АК, ОБН по МФФ ПС (среднее по 8-ми сортам)

Закономерности изменения значений OPA, которая даёт возможность судить о суммарной работе НАО, сходны с таковыми АК и GSH.

Влшние условий года репродукции семян на варьирование количества НАО в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя. Коэффициент вариации содержания АК в «СС» имеет очень близкие значения в семенах оптимального и засушливого годов и снижается в два раза в семенах острозасушливого года (таблица 1).

Факторный анализ содержания АК и GSH в сухих семенах. Впервые показано, что существенная роль в накоплении АК на материнском растении

принадлежит генотипическим особенностям данного сорта (35%), а также гидрометеорологическим условиям года репродукции семян (34,8%) (рисунок 3). Меньшее влияние оказывает взаимодействие этих факторов между собой (27,8%). Различия по содержанию (ЖН в сухих «СС» за разные годы репродукции между сортами достоверны, за исключением семян сорта Мамлюк, полученных в 2004 и 2006 годах.

Таблица 1 - Значения коэффициентов вариации содержания НАО в прорастающем семени ярового ячменя по МФФ ПС в зависимости от года репродукции семян (среднее по 8-ми сортам)

Коэффициент вариации, %

МФФ

аскорбиновая кислота

глутатион

2007

сухое

Прор-к

0,00 0,02

точка

0,35

в генотип (фэтрА) а год репродукции (фэщр В)

□ взаимодействия в сипа влияния повторений

в влияние случайных факторов

■ генотип йэктор А) вгодрелродук1$1и{((ащ>В|

□ взаимодействия псила влияния повторений

в влияние шчзйных факторов

Аскорбиновая кислота Глутатион

Рисунок 3 - Факторная структура общей дисперсии признаков «содержание аскорбиновой кислоты в сухом семени» и «содержание глутатиона в сухом семени» четырёх сортов ярового ячменя

Ведущая роль в накоплении ОЯН в «СС» принадлежит взаимодействию факторов «генотип-среда» (67,6%), а затем следует влияние генотипа (26,1%). Влияние гидрометеорологические условия года репродукции имеет очень низкое значение (4,3%). Это свидетельствует о том, что изученные

генотипы имеют разную реакцию на внешние условия по накоплению восстановленного вБН в «СС». Содержание АК и содержание ОБН в «СС» имеет слабую отрицательную корреляцию (г = -0,13), что ещё раз подтверждает результаты факторного анализа.

3.13. Корреляционный анализ содержания АК и С8Н в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя. Содержание АК в сухом и её содержание в прорастающем семени имеет очень низкую и среднюю корреляцию в фазы «Т» и «к-3». Для семян-04 корреляция практически нулевая в этих двух фазах, что может говорить об отсутствии взаимосвязи между содержанием АК в сухом и прорастающем семени. Корреляционный анализ содержания вБН в «СС» и его содержания в прорастающих семенах выявил практически по всем МФФ ПС положительную среднюю и даже сильную корреляцию (от г=0,31 до г=0,83). Причем, в семенах-04 корреляция отмечается наиболее высокая, а в семенах-07 более низкая. Содержание АК в «СС» и её содержание в прорастающих семенах имеет среднюю положительную корреляцию (от 1=0,37 до г =0,51). Таким образом, количество АК, накопленное в семени на материнском растении, на 14-26% (согласно коэффициента детерминации) определяет её содержание по всем фазам прорастания.

Таблица 2 - Корреляция между содержанием АК, СБН в сухом семени и их содержанием по МФФ ПС ярового ячменя (среднее по 8 сортам за три года)

НАО Коэффициент корреляции (г) по МФФ ПС

Точка к-2 к-3 проросток

АК 0,51 0,37 0,48 0,38

вБИ 0,51 0,52 0,35 0,26

Между содержанием АК и в8Н имеется низкая отрицательная корреляционная связь как в «СС», так и по всем МФФ ПС: кроме фазы «к-

3».

Можно предположить, что в период образования и роста корешков содержание восстановленного С8Н снижается, так как он интенсивно используется на регенерацию АК.

и

3.1.4. Характеристика аскорбат-глутатионового цикла в прорастающих семенах ярового ячменя. Содержание АК и ОБН возрастает до МФФ «к-3», а затем снижается, при этом их содержание и значения ОРА различаются(рисунок 5). В «СС» ярового ячменя содержание вБН превосходит содержание АК в 14 раз. В процессе дальнейшего прорастания семени содержание ОБН превосходит содержание АК по микрофазам в 7...8 раз. За период набухания («СС» - фаза «Т») содержание ОБН и АК увеличивается в 2,9 и 5,7 раза, соответственно. После наклёвывания семян до фазы «к-3» содержание ОБН и АК возрастает только в 1,8 и 1,5 раза, соответственно. К моменту становления проростка (за период «к-3» - «П») содержание АК остаётся на том же уровне, а содержание С8Н снижается на 13%. Максимальные различия в содержании АК и ОБН наблюдаются в двух МФФ ПС - «СС» и «к-3». При кажущемся сходстве формы кривых содержание АК и ОБН в межфазные периоды изменяется по-разному, что свидетельствует об изменении напряжённости оксидантного статуса в тканях зародыша. Всё это свидетельствует о неоднозначности функционирования аскорбат-глутатионового цикла в разные фазы прорастания семян и наличии генотипической вариабельности.

Аскорбиновая кислота и глутатион

Рисунок 5 - Содержание компонентов аскорбат-глутатионового цикла по фазам прорастания семян ярового ячменя (среднее по 8-ми сортам за три года)

3.2. Состояние системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах ярового ячменя

3.2.1. Содержание компонентов системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах ярового ячменя. В сухих семенах всех сортов отсутствует восстановленная форма аскорбиновой кислоты; в процессе набухания АК появляется к фазе «Т» и достигает максимального значения в фазе «П», наименьшее количество ДАК наблюдается на стадии «СС». Содержание ДКГК превышает количество АК и ДАК на всех фазах прорастания семян (рисунок 6). Полученные нами результаты согласуется с данными других исследований [Бе ТиШо, Агп§ош, 2003; Тоттаз^ Расю11а, Аш§ош, 1999; Bonsager, 2010].

сухое точка к-2 к-3 проросток

сухое точка к-2 к-3 проросток

I АК - -а- -ДАК-А— ДКГК

Рисунок 6 - Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК по ММФ прорастания семян ярового ячменя четырех сортов в условиях оптимального увлажнения

У устойчивых сортов Стимул, Зерноградец 770 в период интенсивного роста корешков (фазы «к-2», «к-3») содержание ДАК снижается, а у неустойчивых в эти периоды оно превышает содержание АК. Можно предположить, что устойчивость к дефициту влаги проявляется уже в условиях оптимального увлажнения.

Средние данные по изменению содержания компонентов системы АК. Содержание кислот в среднем по всем сортам возрастает в процессе прорастания семени, а вот процентное отношение содержания каждой кислоты от их суммы варьирует в достаточно узких границах около горизонтального положения (рисунок 7). Это может свидетельствовать о том, что при прорастании семени ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения с момента его наклёвывания и до формирования проростка система АК функционирует стабильно, а соотношение кислот не меняется радикально. Происходящий в МФФ ПС «к-2» и «к-3» «перехлёст» кривых содержания АК и ДАК может быть проявлением изменения эффективности процессов регенерации АК в период интенсивного формирования и роста корешков.

Рисунок 7 - Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК по ММФ ПС ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения в % от суммы всех кислот (среднее по 4-м сортам)

3.2.2 Интенсивность изменения количества компонентов системы аскорбиновой кислоты за межфазные периоды. Приняв за меру интенсивности процессов отношение изменения содержания каждой кислоты за период между очередными МФФ ПС к продолжительности межфазного периода в часах [Козяева, 2009], мы более дифференцированно оценили направленность процессов изменения количества АК, ДАК и ДКГК (рисунок 8). Между двумя парами сортов выявлены различия: у устойчивых к дефициту влаги сортов Стимул и Зерноградец 770, в отличие от менее устойчивых сортов Мамлюк и Приазовский 9, интенсивность накопления

устойчивых сортов Мамлюк и Приазовский 9, интенсивность накопления АК снижается в период роста корешков, но никогда не принимает нулевых или отрицательных значений.

Стимул

Рисунок 8 - Интенсивность процессов изменения содержания АК, ДАК и ДКГК по МФФ прорастания семян ярового ячменя при проращивании в условиях оптимального увлажнения

3.23 Оценка напряженности окислительно-восстановительных

процессов в прорастающих семенах ярового ячменя. Для оценки напряженности окислительно-восстановительных процессов в растительных тканях, часто используют соотношение АК и ДАК. Для этого содержание АК выражают в процентах от суммарного содержания АК и ДАК. Доля АК в сумме восстановленной и окисленной форм меняется по МФФ ПС у всех изученных сортов и имеет разные значения. Средние данные доли АК у устойчивых сортов выше, чем у неустойчивых (рисунок 9).

Таким образом, впервые показаны особенности изменения компонентов системы аскорбиновой кислоты по МФФ ПС ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения, а также выявлены различия между сортами с разной устойчивостью к дефициту влаги в период прорастания семян.

Рисунок 9 - Изменение доли АК в сумме (АК+ДАК) по МФФ ПС ярового ячменя четырёх сортов (2007г)

3.3. Содержание восстановленного глутатиона в прорастающих семенах ярового ячменя 33.1. Динамика содержания восстановленного глутатиона по МФФ ПС.

У всех сортов в «СС» вБН уже присутствует, а затем в процессе прорастания семян количество вБН увеличивается от МФФ «СС» до фазы «П» (рисунок 10). В прорастающем семени сортов Стимул и Зерноградец 770 плато на графике наступает сразу после наклёвывания семени, а у сортов Мамлюк и Приазовский 9 - в период интенсивного роста корешков (МФФ «к-2»- «к-3»).

£

^ 150 -

-Стимул

■ Зерноградец 770

250 -200 -150 -100 -

> Мамлюк ■ -ш- - Приазовский 9

Рисунок 10 — Изменение содержания восстановленного ОБН в прорастающих семенах четырёх сортов ярового ячменя по МФФ ПС

3.3.2. Интенсивность изменения количества ввН за межфазные периоды. Интенсивность накопления вБН у устойчивых сортов возрастает за период «СС»-«Т», затем снижается и вновь возрастет в критический период роста корешков (рисунок 11).

Рисунок 11 - Изменение интенсивности накопления вБН в прорастающем семени четырёх сортов ярового ячменя

Сорта Мамлюк и Приазовский 9 характеризуются увеличением скорости накопления вБН от фазы «СС» до «к-2». К межфазному периоду «к-2»-«к-3» у обоих сортов происходит существенное снижение интенсивности накопления СБН, а к межфазному периоду «к-3»-«П» скорость накопления ОБН вновь возрастает, а у сорта Приазовский 9 остаётся без изменений.

3.4. Анализ функционирования аскобат-глутатионового цикла на основании данных по содержанию аскорбиновой кислоты и глутатиона по МФФ ПС Применение методов раздельного определения АК (как компонента системы АК) и ОБН (с реактивом Эллмана) позволило более детально проанализировать функционирование аскорбат-глутатионового цикла через соотношение количеств АК и СБН в каждой МФФ ПС. Для семян устойчивых сортов Стимул и Зерноградец 770 характерно постоянное

превышение количества ОБН над количеством АК до полного прорастания семян (рисунок 12).

сухое точка к-2 к-3 проросток

3 250 -^ 200 -

сухое -точка к-2 к-3 проросток

Рисунок 12 - Содержание восстановленных аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающих семенах ярового ячменя по МФФ ПС

У семян менее устойчивых сортов Мамлюк и Приазовский 9 в наклюнувшихся семенах (фаза «Т») содержание АК превышает содержание ОБН, что свидетельствует об интенсивном восстановлении ДАК в АК, возможно, за счёт ОБН. Однако далее содержание АК остаётся практически на том же уровне до фазы «к-3» и увеличивается только к фазе «П». Содержание ОБН после наклёвывания семян существенно возрастает до формирования проростка.

Молярное соотношение количеств АК и <767/ рассчитали, используя данные их содержания по МФФ ПС в прорастающем семени и молярные массы: М(АК)=176,13г/моль; М{О5ц)=307,ЗЗг/моль (таблица 3). Для регенерации одной молекулы АК требуются две молекулы ОБН, поэтому эквивалентное соотношение 68Н:АК для оптимального функционирования аскорбат-глутатионового цикла должно быть 2:1. Молярное соотношение С8Н:АК минимально в сухом семени, оно резко возрастает к МФФ «П».

Таблица 3 - Содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона (цМ/г АСМ) и их соотношение в прорастающих семенах ярового ячменя по МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения

сорт Компонент Микрофенологические фазы

AK-GSH цикла точка к-2 к-3 проросток

АК, цМ/г АСМ 1,1 1,6 1,9 5,5

Стимул GSH, цМ/г АСМ 2,1 2,2 3,4 6,1

GSH/AK 2,0 1,3 1,8 1,1

АК, цМ/г АСМ 2,2 2,2 2,2 4,9

Мамлюк GSH, цМ/г АСМ 0,5 4,0 5,0 9,2

GSH/AK 0,2 1,8 2,2 1,9

АК, цМ/г АСМ 0,7 3,5 3,8 5,8

Зерноградец 770 GSH, цМ/г АСМ 2,4 2,7 4,9 6,9

GSH/AK 3,4 0,8 1,3 1,2

АК, цМ/г АСМ 1,8 1,8 1,5 2,9

Приазовский 9 GSH, цМ/г АСМ 0,7 4,0 5,6 7,5

GSH/AK 0,4 2,3 3,7 2,6

В наклюнувшемся семени устойчивых сортов Стимул и Зерноградец 770 соотношение ОБНгАК имеет оптимальное значение (2,0 и 3,4, соответственно), а неустойчивых сортов Мамлюк и Приазовский 9 минимальное (0,2 и 0,4, соответственно).

Интенсивность процессов накопления АК и вБН (в цМ/гАСМ*ч"') в прорастающих семенах четырёх сортов ярового ячменя представлена на рисунке 13. Существенное отличие между сортами отмечено в межфазный период «СС»-«Т». У устойчивых сортов возрастает интенсивность накопления как АК, так и ОБН, а у неустойчивых возрастание интенсивности накопления АК происходит за счёт расходования ОБН, в результате чего снижается интенсивность его накопления. К межфазному периоду «Т»-«к-2» у сортов Стимул и Зерноградец 770 изменение интенсивности накопления АК и ОБН находится в противофазе: интенсивность АК возрастает, а вБН снижается. У неустойчивых сортов Мамлюк и Приазовский 9 в межфазный

период «Т»-«к-2» наблюдается увеличение интенсивности накопления ОБН, но при этом снижение скорости накопления АК.

Рисунок 13 - Интенсивность накопления АК и GSH в прорастающих семенах ярового ячменя устойчивого сорта Стимул и менее устойчивого сорта Мамлюк

Сравнительный анализ результатов изучения функциональной активности аскорбат-глутатионового цикла различными методами. Нами были использованы три метода изучения содержания АК и GSH.: 1) метод определения АК, GSH и OPA по методу Петга в модификации Прокошева (далее метод 1); 2) количественное определение АК, ДАК и ДКГК в растительных тканях (далее метод 2); 3) определение восстановленного глутатиона на основе реакции с реактивом Эллмана (далее метод 3). Все три метода дают сопоставимые результаты как по форме кривых, так и по абсолютным значениям, однако имеются и отличия. Так, в сухих семенах методом 1 определяется наличие АК, а по методу 2 она не выявляется, что соответствует современным представлениям. Оба метода выявили существенное увеличение содержания АК от «СС» к фазе «Т». Существенным различием полученных данных является то, что при определении АК за период «к-3»-«П» по методу 1 количество АК остаётся без изменений, а при определении методом 2 наблюдается рост содержания АК. Изменение количества GSH имеет практически линейный характер, отличия наблюдаются только к фазе «П» - при определении методом 1 (рисунок 14-а) происходит снижение содержания GSH, а при определении методом 3 (рисунок 14-6) сохраняется увеличение содержания до фазы «П».

Стимул

Мамлюк

0.2

0,35

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 : 0,2 0,1 0,0

3 з: <д О

к-3 проросток

сухое точка

Рисунок 14 - Изменение содержания и интенсивности накопления АК и вБН в прорастающих семенах ярового ячменя, полученные различными методиками: а - изменение содержания АК и вБН по методу Пета в модификации Прокошева; б - изменение содержания АК по методу Соколовского и изменение содержания ОБН ( с реактивом Эллмана).

Таким образом, содержание НАО АК и вБН можно определять в прорастающих семенах широко распространенным методом 1, однако, нужно с осторожностью интерпретировать данные по содержанию восстановленной аскорбиновой кислоты в сухих семенах, а также по содержанию восстановленных аскорбиновой кислоты и глутатиона в проростках. Достоверную характеристику функционирования аскорбат-глутатионового цикла даёт применение методов 2 и 3.

Выводы

1. Впервые показан характер изменения содержания низкомолекулярных антиоксидантов АК и ОБН в тканях зародыша по микрофенологическим фазам прорастания семени ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения.

2. Содержание АК, вБИ возрастает в тканях зародыша в процессе прорастания семени ярового ячменя. Существенное увеличение содержания АК и вБН происходит до наклёвывания семени: АК в 5...9 раз, вЗН в 2...4

раза. За весь период прорастания (от сухого семени до проростка) в среднем содержание АКувеличивается в 8...10раз, в8Н -в4...5раз.

3. Сорта ярового ячменя разнятся по содержанию АК и ОБН в тканях зародыша семени и по характеру изменения их содержания по МФФ ПС. Максимальное варьирование содержания АК (14,6-27,1%) и вБН (24,445,1%) выявлено в сухом семени, несколько меньшее — в наклюнувшемся семени, а затем значения Квар к МФФ «проросток» постепенно снижаются в 2,2 раза.

4. Ужесточение гидротермических условий года репродукции семян ярового ячменя по-разному влияет на содержание АК и вБН в зародыше прорастающего семени по всем МФФ ПС: в острозасушливом 2007г. содержание АК было минимальным, а содержание ОБН - средним между значениями оптимального и умеренно засушливого годов.

5.Факторная структура общей дисперсии признака «содержание АК в сухом семени» сортов ярового ячменя свидетельствует, что на накопление АК в семени на материнском растении оказывают среднее влияние факторы генотип (35%) и гидротермические условия года репродукции семян (34,8%), несколько меньшее — взаимодействие этих факторов (27,8%). На накопление С8Н сильное влияние оказывает фактор «взаимодействие генотип-среда» (67,6%), среднее - генотип (21,6%) и слабое - «взаимодействие генотип-среда» (4,3%).

6. Зависимость между содержанием вБИ в сухом и прорастающем семени по МФФ ПС имеет среднюю положительную корреляцию (по сортам от 1=0,31 до г=0,83). Содержание АК и ОБН в сухом и прорастающем семени имеет слабую отрицательную корреляцию (от г=-0,01 до г=-0,45 по МФФ ПС), что может служить косвенным доказательством их взаимодействия в аскорбат-глутатионовом цикле.

7. Впервые показано, что сорта ярового ячменя разнятся по содержанию в зародыше сухого семени дегидроаскорбиновой кислоты: у одних сортов она присутствует, у других - нет. В процессе прорастания семян ярового ячменя

происходит постепенное увеличение содержания компонентов аскорбиновой кислоты: аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот. Период формирования и роста зародышевой корневой системы проростка ярового ячменя (МФФ ПС «к-2» и «к-3») является критическим периодом для функционирования системы аскорбиновой кислоты, в этот период проявляются сортовые различия.

8. Впервые показано, что устойчивые к дефициту влаги в период прорастания семян сорта ярового ячменя Стимул и Зерноградец 770 по сравнению с менее устойчивыми сортами Мамлюк и Приазовский 9 в период интенсивного роста корешков в процессе прорастания семени характеризуются более высокой интенсивностью накопления АК и ОБН, более высокой долей АК с сумме кислот (АК+ДАК), более высоким молярным соотношением ОБН-.АК в МФФ «точка», что свидетельствует о различной напряженности окислительного статуса клеток и, возможно, связано с устойчивостью к засухе.

9. Применение различных методов определения АК и вБН даёт сходные результаты, кроме содержания АК в сухом семени. Для сравнительного анализа функциональной активности аскорбат-глутатионового цикла в прорастающем семени ярового ячменя можно использовать нетрудоёмкий производительный метод Петга в модификации Прокошева, а содержание АК в сухом семени целесообразно оценивать методом Соколовского и др. (1974).

Предложения производству. В программах селекционных работ по созданию сортов ярового ячменя, устойчивых к различным стрессам в период прорастания семян, можно использовать оценку селекционного материала на содержание АК и СБН в сухих и прорастающих семенах. На основе данных по сравнительной устойчивости к окислительному стрессу сорта ярового ячменя и партии семян одного сорта можно рекомендовать к высеву в регионах, где наиболее часто наблюдаются различные неблагоприятные условия в период прорастания семян. Теоретические положения диссертации можно использовать при чтении курса лекций по

дисциплине «Физиологические основы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды».

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, определённых ВАК

1. Ковалёва О.Н. Влияние экологических факторов на содержание антиоксидантов в прорастающих семенах ярового ячменя / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова // Научная мысль Кавказа, г.Ростов-на-Дону. 2010.-с. 97-100.

2. Ковалёва О.Н. Сравнительный анализ содержания низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя / О. Н. Ковалёва, Е.А. Спичак, A.C. Казакова // Вестник Мичуринского Государственного аграрного университета, г. Мичуринск. 2011. № 1(ч.1). -С. 117-122.

3. Ковалёва О.Н. Экофизиологическое влияние на содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона в семенах ярового ячменя //Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. Режим доступа: http: // ej.kubagro.ru/201 l/01/pdf/06.pdf. №70(06) - 2011.

Публикации в других изданиях

4. Ковалёва О.Н. Содержание низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающих семенах ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения и модельной засухи / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова // Материалы международной научно-практической конференции Состояние и перспективы развития агрономической науки, мат. межд. научно-практической конференции, п. Персиановский, 2007. - с. 123-129.

5. Ковалёва О.Н. Изменение содержания аскорбиновой кислоты и глутатиона в семенах ярового ячменя при проращивании их в условиях оптимального увлажнения / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова //

Межвузовский сборник научных трудов. Совершенствование технологий в АПК. - Зерноград, 2007. - С. 201-207.

6. Ковалёва О.Н. Оценка сортов ярового ячменя зерноградской и Краснодарской селекции на устойчивость к окислительному стрессу в период прорастания семян / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова, Замащиков

B.В., Спичак Е.А. // Вестник аграрной науки Дона. Выпуск 3. 2008г — с. 12-19.

7. Ковалёва О. Н. Влияние водного стресса на ход изменения количества низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающих семенах ярового ячменя / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова // 3-я международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Г. Ростов-на-Дону, 2009. - С. 89.

8. Ковалёва О.Н. Изменение компонентов системы аскорбиновой кислоты в семенах ярового ячменя, отличающихся по устойчивости к засухе / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова, Чеботарёва Е.С. // Межрегиональный Пагуошский симпозиум «Наука и высшая школа Чеченской республики: перспективы развития межрегионального и международного научно-технического сотрудничества», тезисы докладов, г. Грозный, 2010г. —

C.408- 411.

9. Ковалёва О.Н. Особенности функционирования компонентов системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах ярового ячменя / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова // 5-я Общероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы современной науки и образования», сборник материалов, г. Красноярск, 2010.-С. 228-231.

Ю.Ковалёва О.Н. Содержание компонентов системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах двух сортов ярового ячменя, отличающихся по устойчивости к засухе / О. Н. Ковалёва, А. С. Казакова // Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», тезисы докладов, г. Москва, 2010. — С. 185-186.

ЛР 65-13 от 15.02.99. Подписано в печать 27.06.2011. Формат 60x84/16. Уч.-изд. л, 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 210.

РИО ФГОУ ВПО АЧГАА 347740, г. Зерноград Ростовской области, ул. Советская, 15.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалёва, Ольга Николаевна

С"Ч| Специальность 06.01.05. - Селекция и семеноводство

СО Tf

СО Диссертация cnj на соискание учёной степени о кандидата биологических наук

Научный руководитель — А.С. Казакова, доктор биологических наук, профессор

Краснодар

Содержание

Введение.

1. Состояние вопроса и обзор литературы.

1.1 Народно-хозяйственное значение, производство и потребление ярового ячменя. ^

1.2 Морфологические особенности и биология развития ярового ячменя.«.

1.3 Закономерности прорастания семян.

1.4 Окислительный стресс и система антиоксидантной защиты растений.

1.4.1. Активные формы кислорода и причины их образования.

1.4.2. Антиоксидантная система растительной клетки.

1.4.3. Аскорбиновая кислота и ее значение в растительной клетке. 3 \

1.4.4. Глутатион и его значение в растительной клетке.

1.4.5. Функционирование аскорбат-глутатионового цикла в прорастающих семенах.

1.5. Содержание АК и ОБН в сухих и прорастающих семенах основных зерновых культур.

1.6. Целесообразность использования в селекции и семеноводстве изучения содержания АК и ОБН в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя.

2. Материал и методика исследований. ^

2.1 Место и условия проведения опытов.

2.2 Объект исследования.

2.3 Метеорологические условия.

2.4 Методика исследований.

3. Результаты исследований. gg

3.1 Особенности функционирования аскорбат-глутатионового цикла в прорастающих семенах ярового ячменя разных сортов.

3.1.1 Содержание аскорбиновой кислоты, глутатиона и значения общей редуцирующей активности.

3.1.2. Влияние гидротермических условий года репродукции семян на содержание НАО в прорастающих семенах ярового ячменя.

3.1.3. Корреляционный анализ содержания АК и GSH в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя.

3.1.^Характеристика аскорбат-глутатионовогот цикла в прорастающих семенах ярового ячменя.

3.2. Состояние системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах ярового ячменя.

3.2.1. Содержание компонентов системы аскорбиновой кислоты в прорастающих семенах ярового ячменя.

3.2.2 Интенсивность изменения количества компонентов системы аскорбиновой кислоты за межфазные периоды.

3.2.3 Оценка напряженности окислительно-восстановительных процессов в прорастающих семенах ярового ячменя. Ш

3.3. Содержание восстановленного глутатиона в прорастающих семенах ярового ячменя.

3.3.1. Динамика содержания восстановленного глутатиона по МФФ ПС.

3.3.2. Интенсивность изменения количества восстановленного глутатиона за межфазные периоды.

3. 4. Анализ функционирования аскобат-глутатионового цикла на основании данных по содержанию аскорбиновой кислоты и глутатиона по МФФ ПС.

Выводы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающих семенах различных сортов ярового ячменя"

Одной из главных причин снижения урожайности высокопродуктивных сельскохозяйственных растений является их недостаточная устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Поэтому чрезвычайно важно знать основные показатели, которые могут характеризовать устойчивость растений к тем или иным неблагоприятным факторам среды. Условия среды часто становятся для растений стрессовыми, тогда нарушается нормальный метаболизм, подавляется рост, изменяются процессы развития и, в экстремальных случаях, наступает смерть организма. Однако растения могут выдержать и адаптироваться к неблагоприятной обстановке. Устойчивость к абиотическим стрессам также основана на генетически детерминированных защитных программах. Восприятие клеткой внешнего сигнала о «неблагополучии» запускают сигнальные системы, ведущие к экспрессии генов, продукты которых необходимы для репарации повреждений, восстановления гомеостаза и акклиматизации к новым условиям.

Важная роль в повышении урожайности и качества зерновых культур, в том числе ячменя, принадлежит селекции. В связи с изменением климатических условий по годам, недостатком удобрений и ядохимикатов, понижением уровня технологии возделывания ячменя, связанного с некоторыми экономическими трудностями на данном этапе, требования к вновь создаваемым сортам значительно возрастают.

Ячмень относится к культурам раннего срока сева, поэтому его высевают, как только почва приобретет мягкое пластическое состояние. Однако в условиях юга Российской Федерации в период высева семян часто наблюдается почвенно-весенняя засуха. Попадая в сухую почву, семена долго не прорастают, и часть семян гибнет, получаются изреженные всходы и низкий урожай. От способности семян поглощать воду при ее малом количестве и быстро прорастать зависит густота растений и урожайность, поэтому особое значение имеет выявление механизмов засухоустойчивости и разработка критериев для ее оценки.

В результате нарушений нормального функционирования биохимических циклов повышается содержание свободных радикалов в тканях, и в частности активных форм кислорода (АФК), которые повреждают саму клетку и ее структуры. Против этого действует система антиоксидантной защиты, которая гасит эти свободные радикалы. Антиоксидантная система (АОС) состоит из высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений, к последним относятся аскорбиновая кислота и глутатион. Эти соединения в клетке могут переходить из окисленного в восстановленное состояние и тем самым тушить свободные радикалы. В связи с этим представляется актуальным рассмотреть АОС для диагностики сортовой устойчивости ярового ячменя к окислительному стрессу в период прорастания.

Актуальность темы. Исследования содержания компонентов антиоксидантной системы в период прорастания семян ярового ячменя представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии, что поможет разработать надежные критерии оценки селекционных образцов на устойчивость к различным стрессам, которым может быть подвергнуто семя в период прорастания. Для однозначного понимания роли низкомолекулярных антиоксидантов (НАО), таких как аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (вБН), необходимо изучить их содержание в определённые фазы прорастания в условиях нормального водообеспечения растительной клетки, и оценить работу аскорбат-глутатионового цикла в индивидуальном семени.

Цель исследований - Выявить особенности изменения содержания низкомолекулярных антиоксидантов аскорбиновой кислоты и глутатиона в прорастающем семени различных сортов семян ярового ячменя за разные годы репродукции в условиях оптимального увлажнения.

Задачи исследований:

• провести анализ современного состояния проблемы участия НАО в устойчивости к окислительному стрессу сухих и прорастающих семян, проростков и вегетирующих растений зерновых культур;

• определить энергию прорастания и всхожесть семян разных сортов ярового ячменя при проращивании в условиях оптимального и недостаточного увлажнения;

• определить содержание АК, GSH и значения общей редуцирующей активности (OPA) в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения;

• установить влияние гидротермических условий года репродукции семян на содержание НАО в сухих и прорастающих семенах по микрофенологическим фазам;

• выявить корреляционные связи содержания АК и GSH в сухих и прорастающих семенах;

• изучить содержание и интенсивность накопления компонентов системы аскорбиновой кислоты в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя;

• изучить содержание и интенсивность накопления восстановленного глутатиона в сухих и прорастающих семенах ярового ячменя;

• провести анализ функционирования аскобат-глутатионового цикла на основании данных по содержанию аскорбиновой кислоты и глутатиона в семенах по микрофенологическим фазам прорастания.

Научная новизна. Впервые изучена динамика содержания низкомолекулярных антиоксидантов АК и GSH в прорастающем семени ярового ячменя районированных сортов селекции двух ведущих центров юга России - Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко и ВНИИЗК им. И.Г. Калиненко (г. Зерноград Ростовской области) в условиях оптимального увлажнения. Выявлены общие закономерности и сортовая специфика содержания НАО по микрофенологическим фазам прорастания семян (МФФ

ПС). Установлены закономерности изменения количества компонентов системы аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона и интенсивности этого процесса в прорастающем семени в условиях оптимального увлажнения у устойчивых и неустойчивых к почвенной засухе сортов ярового ячменя. Показано влияние генотипа и условий весенне-летнего периода года формирования семян на содержание АК и ОЭН в сухом семени. Установлено изменение молярного соотношения АК и вЭН по фазам прорастания семени. Показано, что содержание АК и С8Н в сухом и прорастающем семени имеют отрицательную корреляцию. Сорта, отличающиеся по устойчивости к дефициту влаги в период прорастания семян имеют отличия в содержании в8Н и компонентов системы АК. Положения, выносимые на защиту. Динамика содержания низкомолекулярных антиоксидантов АК и вБН в прорастающем семени ярового ячменя по МФФ ПС. Влияние генотипа и гидротермических условий года репродукции семян на содержание НАО в сухом и прорастающем семени по МФФ ПС. Корреляция содержания АК и в8Н в сухом и прорастающем семени. Сравнительная характеристика сортов, отличающихся устойчивостью к дефициту влаги в период прорастания семян, по содержанию НАО в прорастающих семенах в условиях оптимального увлажнения.

Практическая значимость. В программах селекционных работ по созданию сортов ярового ячменя, устойчивых к различным стрессам в период прорастания семян, можно использовать оценку селекционного материала на содержание АК и в8Н в сухих и прорастающих семенах. На основе данных по сравнительной устойчивости к окислительному стрессу сорта ярового ячменя и партии семян одного сорта можно рекомендовать к высеву в регионах, где наиболее часто наблюдаются различные неблагоприятные условия в период прорастания семян. Теоретические положения диссертации можно использовать при чтении курса лекций по дисциплине «Физиологические основы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды».

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Ковалёва, Ольга Николаевна

132 Выводы

1. Впервые показан характер изменения содержания низкомолекулярных антиоксидантов АК и вБН в тканях зародыша по микрофенологическим фазам прорастания семени ярового ячменя в условиях оптимального увлажнения.

2. Содержание АК, ввН возрастает в тканях зародыша в процессе прорастания семени ярового ячменя. Существенное увеличение содержания АК и ОЗН происходит до наклевывания семени: АК в 5.9 раз, ОЗН в 2.4 раза. За весь период прорастания (от сухого семени до проростка) в среднем содержание АК увеличивается в 8. 10 раз, ОЗН -в 4.5 раз.

3. Сорта ярового ячменя разнятся по содержанию АК и ОЗН в тканях зародыша семени и по характеру изменения их содержания по МФФ ПС. Максимальное варьирование содержания АК (14,6-27,1%) и ввН (24,445,1%) выявлено в сухом семени, несколько меньшее - в наклюнувшемся семени, а затем значения Квар к МФФ «проросток» постепенно снижаются в 2,2 раза.

4. Ужесточение гидротермических условий года репродукции семян ярового ячменя по-разному влияет на содержание АК и ОЗН в зародыше прорастающего семени по всем МФФ ПС: в острозасушливом 2007г. содержание АК было минимальным, а содержание ОЗН - средним между значениями оптимального и умеренно засушливого годов.

5. Факторная структура общей дисперсии признака «содержание АК в сухом семени» сортов ярового ячменя свидетельствует, что на накопление АК в семени на материнском растении оказывают среднее влияние факторы генотип (35%) и гидротермические условия года репродукции семян (34,8%), несколько меньшее - взаимодействие этих факторов (27,8%). На накопление ОЗН сильное влияние оказывает фактор «взаимодействие генотип-среда» (67,6%), среднее — генотип (21,6%) и слабое - «взаимодействие генотип-среда» (4,3%).

6. Зависимость между содержанием С8Н в сухом и прорастающем семени по МФФ ПС имеет среднюю положительную корреляцию (по сортам от г=0,31 до г=0,83). Содержание АК и СБН в сухом и прорастающем семени имеет слабую отрицательную корреляцию (от г=-0,01 до г=-0,45 по МФФ ПС), что может служить косвенным доказательством их взаимодействия в аскорбат-глутатионовом цикле.

7. Впервые показано, что сорта ярового ячменя разнятся по содержанию в зародыше сухого семени дегидроаскорбиновой кислоты: у одних сортов она присутствует, у других — нет. В процессе прорастания семян ярового ячменя происходит постепенное увеличение содержания компонентов аскорбиновой кислоты: аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот. Период формирования и роста зародышевой корневой системы проростка ярового ячменя (МФФ ПС «к-2» и «к-3») является критическим периодом для функционирования системы аскорбиновой кислоты, в этот период проявляются сортовые различия.

8. Впервые показано, что устойчивые к дефициту влаги в период прорастания семян сорта ярового ячменя Стимул и Зерноградец 770 по сравнению с менее устойчивыми сортами Мамлюк и Приазовский 9 в период интенсивного роста корешков в процессе прорастания семени характеризуются более высокой интенсивностью накопления АК и вБИ, более высокой долей АК с сумме кислот (АК+ДАК), более высоким молярным соотношением С8Н:АК в МФФ «точка», что свидетельствует о различной напряженности окислительного статуса клеток и, возможно, связано с устойчивостью к засухе.

9. Применение различных методов определения АК и ОЭН даёт сходные результаты, кроме содержания АК в сухом семени. Для сравнительного анализа функциональной активности аскорбат-глутатионового цикла в прорастающем семени ярового ячменя можно использовать нетрудоёмкий производительный метод Петта в модификации Прокошева, а содержание АК в сухом семени целесообразно оценивать методом Соколовского и др. (1974).

135

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Ковалёва, Ольга Николаевна, Краснодар

1. Антонова, Г. Ф. Аскорбиновая кислота и развитие клеток ксилемы и флоэмы в стволе сосны обыкновенной / Г. Ф. Антонова, В. В.Стасова, Т. Н. Вараксина // Физиология растений. 2009. - Т.56,№ 2. - С. 210-219

2. Басистов, А. А. Исходный материал для селекции ячменя в условиях орошения Средней Азии / Басистов А. А. // Матер. Всесоюз. Семинара-совещания селекционеров. Ташкент. - 1982. - С. 221-225.

3. Борисонник, З.К. Урожайность ярового ячменя в зависимости от метеорологических и агротехнических факторов / З.К. Борисонник // Доклады ВАСХНИЛГ- 1989.- С. 184-197

4. Борисоник, В. Б. Роль зародышевых и узловых корней в формировании продуктивности растений ячменя и овса / В. Б. Борисоник // Бюл. Всесоюз. науч.- исслед. ин-та кукурузы. — Днепропетровск. 1984. — 1 (63).-С. 54-57.

5. Борисова, Г.Г. Учебно-методический комплекс дисциплины "Растение и стресс" / Г.Г. Борисова, М.Г. Малеева, Н.В. Чукина // Федер. агентство по образованию, Урал. гос. ун-т, ¿ЮПЦ "Экология и природопользование". — Екатеринбург. 2008. — 273 с.

6. Верхотуров, В.В. Взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы: автореф. дис. . канд. биологических наук Иркутск. - 1999. — 20с.

7. Верхотуров, В.В. Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при хранении, прорастании и переработке: автореф. дис. . доктора биологических наук Москва. - 2008. — 40с.

8. Ю.Грязнов A.A. Ячмень карабалыкский / A.A. Грязнов. — Кустанай. 1996. -123с.

9. Гуськов, Е.П Генетика окислительного стресса / Е.П. Гуськов, Шкурат Т.П., Т.В. Вардуни, Е.В. Машкина, И.О. Покудина, Е.И. Шиманская // Ростов н/Д. 2009. - 156с.

10. Девятлин, ВА. Тр. Ботан. ин-та АН СССР / В. А. Девятлин // Москва. -1959. Сер. 6. Вып. 7. С. 345-360.

11. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // — Москва. -1979.-416 с.

12. Ерешко, A.C. Ячмень: от селекции к производству / А. С. Ерешко. -Ростов-на-Дону. 2005. - 184с.

13. Казакова, A.C. Шкала микрофенологических фаз прорастания семян ярового ячменя. /A.C. Казакова, С.Ю. Козяева // Сельскохозяйственная биология. 2009.- № 3. - с. 88-92

14. Козяева, С.Ю. Микрофенологические фазы прорастания семян ячменя: автореф. дис. канд. биологических наук — Краснодар. 2009. — 26с.

15. Кения, М.В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.В. Кения, А.И., Лукаш, Е.П. Гуськов //Успехи современной биологии. 1993. — т. 113. — вып.4.- с. 456-470.

16. Клебанов, Г.И., Антиоксидантная активность сыворотки крови / Г.И. Клебанов, Б.О. Теселкин, И.В. Бабенкова // Вестн. РАМН. 1999. - № 2. С. 15-22.

17. Кобылянский, В. Д. Теоретическое и практическое значение коллекции ржи зернофуражных культур / В. Д. Кобылянский, М.В. Лукьянова, H.A. Родионова // Сб. науч. тр. по прикл. бот., ген. и сел. Л., 1987. - Т. 100. -С. 40-52.

18. Колупаев, Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стессоров: образование и возможные функции / Колупаев, Ю.Е. // Вестн. Харьковского нац. аграрн. ун-та. Сер. Биология. 2007. - Вып. 3. - С. 6-26.

19. Конарев, В.Г., Молекулярно-генетические подходы к анализу исходного материала на комбинационную ценность и прогнозирование гетерозиса / В.Г. Конарев, М.А. Камалитдинова и др. // Физиология растений в помощь селекции. — Москва. 1974. — С. 124-142.

20. Коренев, Г.В. Растениеводство с основами селекции и семеноводства / Г.В. Коренев, П.И. Подгорный, С.Н. Щербак; под ред. Г.В. Коренева // 3-е изд., перераб. и доп. Москва. -1990. — 487 с.

21. Кочетова, Е.А. О различии сортов ячменя по семенам и проросткам / Е.А. Кочетова // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. — Ленинград.- 1971. — Т. 44, вып. 3.-С. 69-82.

22. Кузнецов, В.В. Физиология растений / В.В. Кузнецов, Г.А Дмитриева // Москва.- 2005. 735 с.

23. Кузьмин, В.П. Вопросы селекции сельскохозяйственных культур / В.П. Кузьмин //Алма-Ата. 1978. - С. 61-147.

24. Кулинский, В. И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В. И. Кулинский // Соросовский Образовательный журнал 1999.- №1. — С. 2-7.

25. Курсанов, A.JI. У физиологов Англии и Шотландии / A.JI. Курсанов // Физиология растений. 1960. —Т. 7, вып. 6. — С. 748 — 755.t.

26. Лошак, И.Ф., Особенности селекции ярового ячменя на устойчивость к < засухе в Северном Казахстане / И.Ф. Лошак, Н.Д. Логачёв // Повышение засухоустойчивости зерновых культур. — Москва.- 1970. — С. 172-176.

27. Меныцикова, Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т.113. - С. 442-455.

28. Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений / Мерзляк, М.Н. // Соросовский образовательный журнал. — 1999. № 9. — С. 20 - 26.

29. Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки / Мерзляк, М.Н. // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений, Москва. 1989. - Т. 6. -168 с.

30. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментативными системами / Д.И. Метелица. Москва. - 1982. - 256 с.

31. Мецлер, Д. Биохимия / Д. Мецлер // Москва.- 1980. Т. 2. - 606 с.

32. Мокроносов, А.Т. Фотосинтез. Физиолого-экологические и биохимические аспекты / А.Т. Мокроносов, В.Ф. Гавриленко, Т.В. Жигалова; под ред. И.П. Ермакова. // Москва. 2006. - 436 с.

33. Обручева, Н.В. Физиология инициации прорастания семян / Н.В. Обручева, О.В. Антипова.//Физиология растений. 1997. - т. 44, № 2 - с. 287-302

34. Обручева, Н.В. Поступление воды как фактор растяжения клеток / Н.В. Обручева.// Украинский ботанический журнал. 2008. - т. 65, №4 - С. 596-603

35. Овчаров, К.Е. Роль витаминов в жизни растений / К.Е. Овчаров.

36. Москва. 1958. - 286 с. 44,Овчаров, К.Е. Физиология формирования и прорастания семян / К.Е. Овчаров - Москва. -1976. - 255 с.

37. Пахомова В.М. Основы фитострессологии / В.М. Пахомова. Казань. -1999.-102с.

38. Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебное пособие / О.Г. Полесская. Москва. - 2007. — 140 с.

39. Полесская О.Г. Изменение активности антиоксидантных ферментов в листьях и корнях пшеницы в зависимости от формы и дозы азота в среде / О.Г. Полесская, Е.И. Каширина, Н.Д. Алехина // Физиология растений. — 2004. Т. 51 - № 5. - С. 686-691.

40. Панова, Э. Оценка коллекции сортообразцов на засухоустойчивость / Э. Панова, С. Портуровская // Научные труды Ставропольского СХИ. — 1977.-Т. 1. — с. 35 — 37.

41. Рогожин, В.В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин // СПб.- 2004. 240с.

42. Рогожина, Т.В. Роль компонентов антиоксидантной системы в механизмах прорастания зёрен пшеницы / Т.В. Рогожина, В.В. Рогожин// Агроэкология. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2010. - № 11 (73), 201 - С. 31-38

43. Санадзе, Г.А. Биогенный изопрен / Г.А. Санадзе // Физиология растений. Москва. - 2004. - Т. 51 (6). - С. 810-824.

44. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести: ГОСТ 12038-66; Введен 01.07.86. Москва. - 1985.- 57С.

45. Сокол, A.A. Ячменное поле Дона: Опыт возделывания и рекомендации / Сокол A.A.// Ростов н/Д. 1985. - 112с.

46. Спивак, Е. А. Активность аскорбат-глутатионового цикла в проростках ячменя (Hordeum vulgare) при засухе / Спивак Е. А., Шалыго Н. В. // Изв. Нац. академии наук Беларуси, серия биологических наук // Минск. 2010. - №3 — С. 73-77

47. Сурин, H.A. Ячмень в Восточной Сибири (итоги и перспективы): Дис. . .д-ра с.-х. наук / H.A. Сурин: Красноярск. - 1983. - 397с.

48. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. Москва. - 2002. — 294 с.

49. Тиунов, JI.A. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / JI.A. Тиунов // Вестн. РАМН. 1995. - № 3. - С. 9-13.

50. Тишков, Н.И. Исходный материал и некоторые методы селекции в степной зоне Южного Урала: Дис. .канд. с.-х. наук / Н.И. Тишков. — Ленинград. 1983. - 229 с.

51. Тетерятченко, К. Г. Анатомо-биологический метод в селекции при создании моделей сортов мягкой озимой пшеницы высокоинтенсивного типа / К. Г. Тетерятченко // Физиол.- генет. основы повышения продуктивности зерновых культур. Москва. - 1975. - С. 253-267.

52. Третьяков, H.H. Практикум по физиологии растений / H.H. Третьяков.-Москва. 2003. -288с.

53. Трофимовская А.Я. Ячмень / А.Я. Трофимовская Ленинград. - 1972. -296с.

54. Удовенко, Г.В. Влияние экстремальных условий среды на структуру урожая сельскохозяйственных растений / Г.В. Удовенко, Э.А. Гончаров — Ленинград. -1982. 164с.

55. Удовенко, Г.В. Информативность некоторых физиолого-биохимических параметров в связи с устойчивостью сортов пшеницы к засухе / Г.В. Удовенко, H.H. Кожуппсо // С.-х. биология.- 1980. Т.15, № 3. — С. 359365.

56. Филиппов, Е.Г. Технология возделывания ячменя ярового / Е.Г. Филлиппов, Н.Г. Янковский — Ростов н/Д. 2009. - 48 с.

57. Хавинсон, В.Х. Свободно-радикальное окисление и старение / В.Х. Хавинсон, В.А. Баринов, A.B. Арутюнян, В.В. Малинин // СПб. 2003. -327 с.

58. Чеснокова, Н.П. Общая характеристика источников образования свободных радикалов и антиоксидантных систем / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи соврем, естествознания. 2006. -№7.-С. 37-41.

59. Чупахина, Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений / Г.Н. Чупахина. — Калининград. 1997. - с.127

60. Шаскольский, В. Перспективы обогащения продуктов питания витамином С / В. Шаскольский, Н. Шаскольская// "Хлебопродукты" Москва. 2005. -№10. - С. 40-41.

61. П1ижнева, И.А. Аквапорины тонопласта и плазмалеммы из осевых органов семян бобов в процессе прорастания / И.А. Шижнева, Г.В.

62. Новикова, Н.В. Обручева // Докл. акад. наук. 2007. - т. 413, №1. - СЛ16-119

63. Шевякова Н.И. Изменение активности пероксидазной системы в процессе стесс-индуцированного формирования САМ / Н.И. Шевякова, JI.A. Стеценко, А.Б. Мещеряков, В.В. Кузнецов // Физиология растений. — Т. 49. № 5. - 2002. - С. 670-677.

64. Ци, Ю. Ч. Сверхэкспрессия гена глутатион-8-трансферазы повышает солеустойчивость растений арабидопсиса / Ю. Ч. Ци, В. Ц. Лю, JI. Ю. Цю, Ш. М. Чжан, JI. Ma, X. Чжан // Физиология растений. 2010. -т. 57, №2.- С. 245-253

65. Эзау, К. Анатомия растений / К. Эзау Москва. -1980. - Кн.1,2. - 558с.78 .Янковский, О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы (эволюционные, экологические и медико-биологические аспекты) / О.Ю. Янковский // СПб. 2000. - 294с.

66. Ячмень. Под редакцией докт. с/х наук Г.Ф. Никитенко М. - 1973. - 255с.

67. Джеймс, В. Дыхание растений / В. Джеймс.- Москва. 1956. - 439с.

68. Alscher R. G., Erturk N., Heath L. S. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany. Vol. 53. 2002. P. 1331-1341.

69. Alscher R. G. Biosynthesis and antioxidant function of glutathione in plants / Physiologia plantarum, 1989. Vol. 77, P. 457-464.

70. Arican, E. Effects of hyperbaric oxygenation on cultured barley embryos / E., Arican, N. Gozukirmizi // Acta Biologica Hungarica 2008.-Volume 59, Number 4.- P.453-464.

71. Arrigoni O. Ascorbate System and Plant Development // J. Bioenerg. Biomembr. 1994. V. 26. P. 407-419.

72. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: Scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. Vol. 50.1999. P. 601-639.

73. Bewley D. J. Seed Germination and Dormancy / The Plant Cell, 1997, July, Vol. 9, P. 1055-1 066.

74. Bonsager B. C., Shahpiri A., Finnie C., Svensson B. Proteomic and activity profiles of ascorbate—glutathione cycle enzymes in germinating barley embryo / Phytochemistry Volume 71, Issues 14-15, October 2010. P. 16501656

75. Bor, M, F. Ozdemir and I. Turkan, The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in leaves of sugar beet Beta vulgaris L. and wild beet, Beta maritime L. Plant Sci., 2003. 164: 77-84.

76. Cakmak I., Strbas D., Marschner H. Activities of Hydrogen Peroxide-Scavenging Enzymes in Germinating Wheat Seeds / Journal of Experimental Botany, January 1993.-Vol. 44, No. 258, P. 127-132.

77. Cano A., Artes F., Arnao M.B., Sanchez-Bravo J., Acosta M. Influence of peroxides, ascorbate and glutathione on germination and growth in Lupinus albus L. / Biologia plantarum, Vol. 39 (3), 1997. P. 457-461.

78. Chiang Y.-J., Wu Y.-X, Chiang M.-Y., Wang C.-Y. Role of Antioxidative System in Paraquat Resistance of Tall Fleabane (Conyza sumatrensis) / Weed Science: May 2008, Vol. 56, No. 3, pp. 350-355.

79. Conklin P. L., Barth C. Ascorbic acid, a familiar small molecule in-terwined in the response of plants to ozone, pathogens and the onset of senescence. Plant, Cell and Environment. Vol. 27.2004. P. 959-970.

80. Dat J., Vandenabeele S., Vranova E., Van Montagu M., Inze D., Van Breusegem F. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences. Vol. 57. 2000. P. 779-795.

81. De Tullio M. C., Arrigoni O. The ascorbic acid system in seeds: to protect and to serve// Seed Science Research (2003), 13: 249-260

82. Eshdat Y., Holland D., Faltin Z., Ben-Hayyim G. Plant glutathione peroxidases. Physiol Plantarum. Vol. 100.1997. P. 234-240.

83. Esfandiari E. The study of drought tolerance in wheat cultivars through biochemical, physiological and agronomical parameters. Ph.D Thesis, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz-Iran., 2007.

84. Foyer C. H., Noctor G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant, Cell and Environment. Vol. 28. 2005. P. 1056-1071.

85. Fontaine O., Billard J. P., Huault C. Effect of glutathione on dormancy breakage in barley seeds / Plant Growth Regulation, Vol. 16,1995. P. 55-58

86. Jimenez A., Hernandez J. A., del Rio L. A., Sevilla F. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and pero-xisomes of pea leaves. Plant Physiol. Vol. 114.1997. P. 275-284.

87. Joseph B., Jini D. Development of Salt Stress-tolerant Plants by Gene Manipulation of Antioxidant Enzymes / Asian Journal of Agricultural Research 5 (1): 17-27, 2011

88. Kesavan, P.C. Chemical Modification of Postirradiation Damage under Varying Oxygen Concentrations in Barley Seeds / P.C. Kesavan, S.P. Singh, N.K. Sah // International Journal of Radiation Biology -1991.- Vol. 59, No. 3.-P. 729-737

89. Kirlin W.G., Cai J., Thompson S.A., Diaz D., Kavanagh T.J., Jones D.P. Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers /Free Radic Biol Med. -1999.- Dec; 27(11-12), P. 1208-18.

90. Kranner I., Birtic S., Anderson K.M., Pritchard H.W. Glutathione half-cell reduction potential: A universal stress marker and modulator of programmed cell death? Free Radical Biology and Medicine , 40, 2006 P. 2155-2165.

91. Loewus F.A. Biosynthesis and Metabolism of Ascorbic Acid in Plants and Analogs of Ascorbic Acid in Fungi // Phytochemistry. 1999. V. 52. P. 193-210.

92. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science. Vol. 7 (9). 2002. P. 405-410.

93. Mohsenzadeh S., Saffari B., Mohabatkar H. A new member of Tau-class glutathione s-transferase from barley leaves / EXCLI Journal 2009. - Vol. 8 P. 190-194.

94. Munne-Bosch S., Falk J. New insights into the function of tocopherols in plants. Planta. Vol. 218. 2004. P. 323-326.

95. Noctor G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annu / G. Noctor, C.H. Foyer // Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.- 1998.-Vol. 49.- P. 249-279.

96. Scavenging, and Role in Cell signaling. Plant Physiology. Vol. 141.2006. P. 330-335.

97. Rivero R. M., Ruiz J. M., Sanchez E., Romero L. Does grafting provide tomato plants an advantage against H202 production under conditions of thermal shock? /Physiologia plantarum -117: 44-50. 2003

98. Schafer F.Q., Buettner G.R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulphide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine 30, 2001. P. 1191-1212.

99. Singh S.P., Kesavan P.S. Mechanistic aspects of modification of radiobiological damage in barley seeds by glutathione and buthionine sulfoximine /Indian J Exp Biol. 1996.- Mar; 34(3), P. 247-51.

100. Seal H., Zammit R., Scotf P., Flowers T. J., Kranner U. Glutathione half-cell reduction potential and a-tocopherol as viability markers during the prolonged storage of Suaeda maritima seeds / Seed Science Research — 2010. — Vol. 20, P. 47-53

101. Smirnoff N. Ascorbic acid: metabolism and functions of a multi facetted molecule / N. Smirnoff/ Current Opinion in Plant Biology.- 2000. Vol. 3.- P. 229-235.

102. Shao H. B., Z.S. Liang M. A., Shao B.C. Wang Changes of anti-oxidative enzymes and membrane peroxidation for soil water deficits among 10 wheat genotypes at seedling stage / Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Vol. 42, 2005.-P. 107-113.

103. Shao H.-B., Chu L.-Y., Lu Z.-H., Kang C.-M. Primary Antioxidant Free Radical Scavenging and Redox Signaling Pathways in Higher Plant Cells // Int. J. Biol. Sci. 2008. V. 4. P. 8-14.

104. Shin S.-Y., Kim I.-S., Kim Y.-H., Park H.-M., Lee J.-Y., Kang H.-G., Yoon H.-S. Scavenging Reactive Oxygen Species by Rice Dehydroascorbate Reductase Alleviates Oxidative Stresses in Escherichia coli // Mol. Cells OS, December 31, 2008, P. 616-620

105. Siess H. Antioxidant Functions of Vitamins Vitamin E and Vitamin C, p-Carotene, and other Carotenoids and Intercellular Communication via Gap Juncctions / H. Siess, W. Stahl // Int. J. Vitam. Nutr. Res. - 1997. - V. 67. - P. 364-367.

106. Srivalli B., Sharma G., Khanna-Chopra R. Antioxidant Defense System in an Upland Rice Cultivar Subjected to Increasing Intensity of Water Stress Following by Recovery // Physiol. Plant. 2003. V. 119. P. 508-512.

107. Sumugat R.S. Glutathione dynamics in Arabidopsis seed development and germination / Masters of Science in Horticulture dissertation, Virginia, USA. — 2004.

108. Takahama U., Oniki T. Flavonoids and some other phenolics as substrates of peroxidase: physiological significance of the redox reactions. J. Plant Res. Vol. 113.2000. P. 301-309.

109. Tamas, L. Cadmium-Induced Inhibition of Apoplastic Ascorbate Oxidase in Barley Roots / L. Tamas, B. Bocoval, J. Huttoval, I. Mistrik, M. Olle // Plant Growth Regulation.- Jnaunary 2006.- Vol. 48, Num. 1.- p41-49.

110. Tavili, A.S. Hydropriming, ascorbic and salicylic acid influence on germination of Agropyron elongatum Host, seeds under salt stress Teiccr./ A.S. Tavili, S. Zare, A. Enayati // Res. J. Seed Sci. 2009.- № 2. - p. 16-22.

111. Tommasi F., Paciolla C., Arrigoni O. The ascorbate system in recalcitrant and orthodox seeds// Physiologia Plantarum Volume 105, Issue 2,pages 193-198, Febuary 1999

112. Tommasi F., Paciolla C., de Pinto M. C., De Gara L. A comparative study of glutathione and ascorbate metabolism during germination of Pinus pinea L. seeds / Journal of Experimental Botany, Vol. 52, No. 361, 2001. P. 16471654

113. Zhang J., Kirkham M. B. Enzymatic responses of the ascorbate-glutathione cycle to drought in sorghum and sunflower plants / Plant Science V. 113, Issue 2, 19 January 1996, P. 139-147

114. Zielinski H., Honke J., Troszynska A., Kozlowska H. Reduced-Oxidized Glutathione Status as a Potential Index of Oxidative Stress in Mature Cereal Grain // American Association of Cereal Chemists, Vol. 76, No. 6, 1999. - P. 944-948

115. Zielinski H., Ceglinska A., Michalska A. Antioxidant contents and properties as quality indices of rye cultivars / Food Chemistry Vol. 104, Issue 3 2007, -P. 980-988

116. Zhu P., Oe T., Blair I.A. Determination of cellular redox status by stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of glutathione and glutathione disulfide / Rapid Commun Mass Spectrom. 2008. -Vol. 22(4), P. 432-40.