Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Диагностика вирусных инфекций на примере вируса табачной мозаики с помощью лазерной спектроскопии

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Диагностика вирусных инфекций на примере вируса табачной мозаики с помощью лазерной спектроскопии"

На правах рукописи

ПИСКАРЕВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ПРИМЕРЕ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Специальность: 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -2006

Диссертация выполнена на кафедре защиты растений Российского университета дружбы народов и в РНЦ «Курчатовский институт»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, профессор Горчаков В.В. Научный консультант:

доктор физико-математических наук, Москаленко И.В. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Григорьев М.Ф. кандидат биологических наук, профессор Стройков Ю.М.

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита состоится «8» ноября 2006 года в «15]0» на заседании диссертационного совета К 212.203.06 в Российском университете дружбы народов по адресу 117198, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат разослан «26» сентября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ЗаецВ.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для сельского хозяйства всех стран мира встала проблема борьбы с болезнями культурных растений с применением самых разнообразных способов. Известно, что в современной экологической обстановке ущерб от вредных организмов значителен. В Африке потери от вредителей, болезней и сорняков достигают 44% от потенциального урожая, в Юго-Восточной Азии - 43%, в Латинской Америке — 35% (Помазков, 2000). По данным ФАО (2003) потери от заболевания растений наносят колоссальные убытки экономике различных стран на колоссальные суммы - только по Европе они исчисляются несколькими сотнями миллионами долларов, в Азии — более 200 млн. долларов, Южная и Северная Америка — более 500 млн. долларов, в России эта цифра близка к 20-25 млн. долларов. Таким образом, мировой ущерб, наносимый сельскому хозяйству различными заболеваниями растений близок к цифре в 1 млрд. долларов.

Борьба с наиболее распространенными болезнями требует больших затрат и усилий. В настоящее время потери сельскохозяйственной продукции обусловлены воздействием антропогенных, стрессовых факторов и приемов, используемых при интенсивных технологиях. В результате организмы активируются и переходят в разряд вредоносных, мутируют, повышается их вредоносность и устойчивость к фунгицидам.

Одной из распространенных форм заболеваний являются вирусные. Вирусы, микоплазмы, вироиды поражают все живые организмы, часто являются причиной массовых заболеваний, приводящих к тяжелым последствиям. В настоящее время известно около 700 возбудителей вирусной этиологии и их количество постоянно пополняется (Келдыш, Помазков, 2003).

Широкое распространение вирусных заболеваний, отсутствие приемов массового оздоровления в полевых условиях требует затратных мероприятий по производству оздоровленного посадочного материала. Для борьбы же с распространением и вредоносностью вирусных заболеваний требуется

3

внедрение целого комплекса мероприятий: использование приемов ранней диагностики, карантин и сертификацию посадочного материала, контроль за источниками инфекции, селекцию устойчивых к заболеванию сортов и гибридов (Келдыш, Помазков, 2003).

Возникает потребность в разработке новых методов диагностики, которые бы были быстрыми, обеспечивали мониторинг заболевания и включались в систему оздоровительных мероприятий. Разработка теоретических предпосылок и внедрение методологических подходов для различных систем защиты растений от болезней создает основу для разработки новых решений борьбы с болезнями растений. С этими целями очень эффективно распространяются физические, биофизические, физиологические и другие методы исследований.

В последние годы во многих странах мира среди биофизических методов большое внимание уделяется интенсивному внедрению лазера в биологические исследования. Уникальное свойства лазера открыло широкие возможности его применения в различных областях диагностики. Эффективность лазерного сканирование широко известно в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии, устойчивости к внешним воздействиям (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).

Традиционный подход к определению заболевания растений включает в себя визуальное наблюдение за состоянием растения. Проявление внешних признаков заболевания наблюдается тогда, когда заболевание принимает хронический характер, борьба с ним становится затруднительной, а признаки заболевания не являются специфичными. Препаративные же методы продолжительны по времени, дорогостоящи.

Актуальность данной работы связана с тем, что в настоящее время появилась лазерная диагностическая аппаратура для исследования в различных областях науки, таких как медицина, биология, микробиология и

т.д. Представляется достаточно перспективным использование метода лазерной фотолюминесценции для определения болезней растений на ранней стадии. Этот метод позволяет: во-первых, определить болезни растений на ранней стадии развития, когда другие методы не позволяют определить болезни с необходимой точностью и, во-вторых, метод лазерной фотолюминесценции позволяет проводить диагностику растений в режиме реального времени (on line). Преимуществом данного метода является возможность проводить исследования бесконтактным способом, не повреждая растение и сканируя большие площади посевов, например, установив лазерную диагностическую аппаратуру на передвижное транспортное средство (Пискарёв, 2004).

В настоящей работе нами поставлена следующая цель - показать возможность и практическую осуществимость применения современных лазеров для диагностики вирусных заболеваний.

Цель и задачи работы. Для выполнения поставленной цели необходимо выполнить следующие задачи:

1. Разработка концепции диагностической системы, основанной на использовании метода лазерной фотолюминесценции, способности ее работы в неблагоприятных внешних условиях и обладающей однотипной конфигурацией основной подсистемы — источника зондирующего лазерного излучения;

2. Сборка, наладка и калибровка диагностического лазерного стенда для отработки методики фотолюминесцентного анализа болезней растений на ранних стадиях;

3. Проведение экспериментов со здоровыми растениями и растениями на ранней стадии заболевания вируса табачной мозаики с целью разработки методики фотолюминесцентного анализа с использованием импульсно-периодического эксимерного лазера.

4. Выделение общих критериев для определения заболевания вирусом табачной мозаики на основе сканирования с помощью импульсно-периодического эксимерного лазера.

Научная новизна.

1. Впервые для диагностирования заболевания ВТМ овощных растений была использована установка, сконструированная на основе эксимерного лазера, показавшая преимущества дистанционного диагностирования.

2. Показано, что увеличение длины волны фотолюминесценции растений является признаком заболевания ВТМ после предварительного облучения ультрафиолетом с длиной волны света 308 нм.

3. Установлено, что растения, испытывающие недостаток азотного питания, но имеющие визуальные признаки ВТМ, характеризуются более короткой волной фотолюминесценции, чем растения в благоприятных условиях питания.

Практическая значимость. На основе большого экспериментального материала подтвержденного статистическим анализом, рекомендуемый метод диагностирования заболевания ВТМ овощных растений может быть использован в овощных хозяйствах. В качестве диагностического признака заболевания является увеличение длины волны фотолюминесценции облученного ультрафиолетовым светом растения. Апробация работы. Результаты исследования автора докладывались на научных конференциях Аграрного факультета РУДН в 2002 — 2006 годах, на международной научной конференции ПНИИАЗ в 2004 году. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 статей. Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 127 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, экспериментальной части, обсуждения,

выводов и рекомендаций. Список литературы представлен 143 источниками, из них _53 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследования были выбраны гибриды растений томатов и огурцов, представленные в таблице 1 схемы опытов.

Таблица 1

Гибриды растений, взятые в качестве объектов исследования (2002-2006 гг.)

Вид растения Гибриды контроль инфицированный

томаты Бенито Р1 + +

Торбей + +

Полфаст Р1 + +

огурцы Амур Р1 + +

Адам Р1 + +

Атлантис Р1 + +

Калунга Р1*

Джулия Р1 + -

Московский Юбилейный Р1 +

Романс + -

Примечание: гибрид огурца Калунга Р1 был исследован на фотолюминесценцию растения с недостатком азота.

Повторность - 5-кратная. Результаты исследований обрабатывались статистически (Доспехов, 1979). Использовали импульсно-периодический эксимерный лазер для выявления заболевания растений на ранней стадии.

Экспериментальная установка обеспечивала выбор длины волны и энергии, обеспечивающих вторичный сигнал фотолюминесценции с максимальным разрешением по амплитуде и спектру.

Семена растения были высеяны в кассеты в июле. Кассеты позволяют получать максимально выровненные растения с мощной корневой системой.

Заражение рассады проводилось в 25-дневном возрасте в стадии 3-4 листьев механическим способом. В качестве материала для заражения растений был взят дикий штамм вируса ВТМ - 1Л.

Для подтверждения результатов и получения точной информации о заболевании - образцы заражённого материала были направлены в лабораторию молекулярной вирусологии ВНИИСБ РАСХН, где они были исследованы с помощью метода ПЦР на наличие вируса ВТМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирус ВТМ по признакам внешнего проявления близок к симптомам недостатка азота в растении. Для получения достоверного результата и проверки объективности патологической оценки были взяты в качестве образцов для исследования растения огурца с явным недостатком азота, который можно наблюдать визуально. Это также было сделано с целью, чтобы правильно обозначить картину заболевания и увидеть различия между физиологическими и патологическими поражениями.

Лабораторный стенд для анализа светового излучения.

В ходе проведения эксперимента был собран лабораторный стенд, включающий в себя эксимерный лазер. Рабочая смесь ХеС1. Длина волны (Х„) 308 нм, энергия в импульсе Еимп= 180-200 мДж. Частота повторений импульсов до 100 Гц. Устройство для уменьшения энергии эксимерного лазера (подавитель) - используется для достижения уровня

энергии, обеспечивающий сохранность биологического объекта и обеспечение необходимого уровня регистрируемого сигнала. Для фиксирования времени начала испускания использован фотодатчик ФЭК-29.

В качестве монохроматора, позволяющего выделять из исследуемого светового сигнала монохроматические линии в широком диапазоне длин волн, использовано устройство МДР-23 с широким диапазоном спектрального разрешения (Х=0,23 нм в нашем случае). Для изучения временных характеристик сигналов фотолюминесценции, а также для точного (ручного) съёма некоторых наиболее характерных участков спектра использовали цифровой осциллограф TDS - 3032 В. Исследуемый объект в виде образцов заражённых растений помещался либо в специальную кварцевую кювету, либо в многопроходною кварцевую кювету. Лазерное излучение направляется на объект исследования через ослабители мощности лазерного излучения. Часть лазерного излучения через кварцевую пластину отводится на фотодатчик ФЭК, который выдаёт синхроимпульс для начала работы системы регистрации состоящей из осциллографов, стробируемого интегратора и компьютера системы управления и регистрации.

Используемые в установке высокоточные приборы обеспечили высокую разрешаемость системы, стабильность и воспроизводимость результатов исследований.

Анализ растений огурцов и томатов на заражаемость ВТМ.

Для выявления факта заболевания растений в результате проведенного заражения вирусом были проведены исследования различных гибридов огурца и томатов на наличие вируса ВТМ. Результаты диагностики вируса табачной мозаики методом ОТ-ПЦР (RT-PCR) (обратная транскрипция -полимеразная цепная реакция) представлены ниже.

Нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для диагностики ВТМ не приводится, т.к. является интеллектуальной собственностью лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИСБ РАСХН.

Присутствие полимеразной цепной реакции (ПЦР) на актин у растений, взятых в качестве контроля для проверки корректности подготовки проб приведено на рисунке 1.

нмнш

■И

Рис.1. Проверка растений на заражение ВТМ.

Приведенные материалы показывают, что выбранные в качестве контроля растения по данным анализа на ПЦР не заражены ВТМ.

Те же гибриды были подвергнуты заражению ВТМ и их восприимчивость к болезни была также проверена перед проведением опытов. Результаты исследований (рис. 2) показали, что из 12 зараженных гибридов только три были реально заражены.

Амплифицнруемый фрагмент размером 800 пар нуклеотидов

Рис. 2. Проверка растений на восприятие ВТМ

Таким образом, из всех испытанных гибридов только томаты Торбей Н, Полфаст Р1 и Бенито Р1 оказались восприимчивы к ВТМ (табл. 2). Дополнительного анализа причин отсутствия реакции у других

гибридов мы не проводили, но были вынуждены взять для проверки дополнительные гибриды огурца для дальнейшего проведения опытов.

Таблица 2

Перечень сортов, подвергшихся заражению ВТМ, и их реакция'

Номер образца 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 п 12 контроль контроль

Ген актина растений + + + + + +■ + .X. + "1" -

ВТМ + + + - - - - +

1. Томат гибрид Торбей Р1

2. Томат гибрид Полфаст

3. Томат гибрид Бенито Р1

4. Огурец гибрид Джулия Р1

5. Огурец гибрид Московский

6. Огурец гибрид Романс Р1

7. Томат гибрид Торбей

8. Томат гибрид Полфаст Р1

9. Томат гибрид Бенито Ю.Огурец гибрид Джулия Р1 11 .Огурец гибрид Московский 12.0гурец гибрид Романс Р1

Примечание:

- Минус контроль (вместо вируса в ПЦР-смесь добавляется вода) + Плюс контроль (генно - инженерная конструкция содержащая полную ДНК-копию ВТМ штамма Ш)

Т.к. в результате тестирования в гибридах огурцов Джулия Р1, Московский Юбилейный Р1, Романс И не был обнаружен вирус, они были заменены другими гибридами: Адам Р1, Амур Р1 и Атлантис И. Результаты тестирования приведены ниже на рисунках 3 и 4, а также в таблице 3.

• -

1 д 3 * д 6 -

Рис. 3. ПЦР на актин растений (проверка корректности пробоподготовки и ОТ)

Амплифицируемын фрагмент размером 800 пар нуклеотидов

Рис. 4. ПЦР на ВТМ

Таблица 3

Перечень сортов, подвергшихся заражению ВТМ, и их реакция

Номер образца 1 2 3 4 5 6 контроль контроль

Ген актина растений - + + + + + -

ВТМ - - - + + + - +

1. Огурец гибрид Амур Р1

2. Огурец гибрид Адам Р1

3. Огурец гибрид Атлантис Р1

4. Огурец гибрид Амур Р1

5. Огурец гибрид Адам Р1

6. Огурец гибрид Атлантис Р1

>

Не инокулированные растения (минус контроль)

Инокулированные ВТМ растения

'Примечание:

- Минус контроль (вместо вируса в ПЦР-смесь добавляется вода) + Плюс контроль (генно - инженерная конструкция содержащая полную ДНК-копию ВТМ штамма 1Л)

Таким образом, были отобраны растения, которые оказались действительно восприимчивы к ВТМ.

Особенности фотолюминесценции растений огурца под влиянием заражения

ВТМ.

В ответ на облучение ультрафиолетовым излучением с длиной волны света 308 нм растения испускают несколько пиков излучения, характеризующихся уменьшением амплитуды и возрастанием длины волны испускаемого света. Характеристика этих пиков фотолюминесценции является основными параметрами, характеризующими состояние растения.

В таблице 4 скомпонованы результаты проведённых экспериментов с растениями огурцов и представлена разница сдвигов пиков фотолюминесценции. Приводится характеристика двух основных пиков фотолюминесценции.

Таблица 4

Влияние ВТМ на фотолюминесценцию гибридов огурцов

Гибрид Повторность эксперимента Пик фотолюминесценции Длина волны здорового растения, нм Длина волны больного растения, нм Разница между пиками, нм

1 381 417 36

2 383 414 31

3 Первый 380 417 37

4 380 417 37

5 379 420 41

среднее 380,6±1,51 417=12,12 36,4*3,61

Амур /*7 1 419 432 13

2 420 440 20

3 Второй 417 435 18

4 424 433 9

5 423 435 12

среднее 420,6±1,60 435±3,08 14,4±4,51

1 410 425 15

г 414 425 11

3 Первый 410 425 15

4 408 426 18

5 409 425 16

АдамП среднее 410,2±2,88 425=ь3.08 15±2,55

1 420 436 16

2 423 432 9

3 Второй 421 434 13

4 421 434 13

5 424 437 13

среднее 421,8^2,05 434,6±1,95 12,8±2,49

1 416 428 12

2 Первый 417 429 12

3 416 425 9

4 416 426 10

5 416 426 10

среднее 416,2±0,4б 426,8±1,63 10,6±1,34

Р1 1 425 438 13

2 425 440 15

3 Второй 426 438 12

4 428 439 11

5 425 438 13

среднее 425,8±1,39 438,6±0,89 12,8±1,48

При облучении лазерным излучением с длиной волны 308 нм листьев гибрида огурца Амур Р1 установлено, что длина волны излучения здорового растения для первого пика фотолюминесценции варьировала от 379 до 383 нм. Для второго пика характерен разброс - от 417 до 424 нм.

У гибрида Адам Б1 наблюдались те же закономерности что и у предыдущего гибрида. Первый и второй пики фотолюминесценции у растений сдвигались в длинноволновую область: первый пик у больного растения был в среднем равен 425 нм, а у здорового — 410 нм. Колебания длины волны испускаемого света были от 408 до 411 нм у здоровых растений и у больных - 425 - 426 нм. Второй пик фотолюминесценции равнялся

соответственно 434 и 421 нм. Длина волны излучения колебалась от 420 до 424 нм у здоровых и от 432 до 437 нм у больных растений. Смещение пиков фотолюминесценции заражённого растения в сторону длинноволновой области также хорошо наблюдается.

Анализ фотолюминесценции гибрида огурца Атлантис Р1 показал, что под влиянием вируса табачной мозаики спектр фотолюминесценции сдвигается в длинноволновую зону. Так у здоровых растений первый пик варьировал от 416 до 417 нм, а у больных от 425 до 429 нм. Второй пик фотолюминесценции наблюдался в диапазоне 425 — 428 нм у здоровых растений и в диапазоне 438-440 нм у больных. Результаты статистического анализа приведены в следующей таблице 5.

Таблица 5

Сводная таблица дисперсионного анализа результатов опыта с растениями огурцов

Фактор А Фактор В Среднее по фактору А НСРо95 = 1,22

Амур Р1 Адам Атлантис Р1

Первый пик фотолюминесценции (нм)

380,6 410,2 416,2 402,33

417,0 425,2 426,5 433,0

Среднее по фактору В 398,8 417,7 426,5 412,67

НСР095= 1,50

Второй пик фотолюминесценции (нм)

Амур Р1 Адам Р1 Атлантис Р1 Среднее по фактору А НСР095 = 1,59

420,6 421,8 425,8 427,33

435,0 434,6 438,6 436,07

Среднее по фактору В 427,8 426,2 432,2 431,69

НСРо95= 1,95

Статистический анализ показывает, что различия длины волны пиков фотолюминесценции у сортов огурцов статистически достоверны. Заражение

растений ВТМ вызывает статистически достоверное увеличение длины волны света по сравнению с контрольными растениями.

Особенности фотолюминесценции растений томатов под влиянием заражения ВТМ.

В качестве образцов для исследования брали заражённые и здоровые листья томата. Длина волны облучения не изменялась и была аналогична эксперименту с растениями огурца и равнялась 308 нм. Заражение растений проводилось одновременно с растениями огурца и проходило идентично. Для исследования взяты 3 гибрида томатов, проверенных на заражаемость ВТМ. Была проведена проверка возможности отражения или'люминесценции воды. Результаты фотолюминесценции гибридов томата приведены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние ВТМ на фотолюминесценцию гибридов Томата

Гибрид Номер эксперимента Пик фотолюминесценции Длина волны здорового растения, нм Длина волны больного растения, нм Разница между пиками, нм

1 414 428 14

2 415 426 11

3 1 417 426 9

4 412 426 14

Торбей F7 5 412 426 14

среднее 414,042,12 426,4±0,8> 12,4±1,55

1 431 441 ! 10

2 430 440 10

3 2 429 438 9

4 428 440 12

5 429 442 13

среднее 429,4±1,14 440,2*1,48 10,8±1,55

1 423 433 10

2 1 423 432 9

Полфаст П 3 424 433 9

4 425 434 9

5 423 433 10

среднее 423,6±0,84 433,0*0,71 9,4±0,55

1 436 444 8

2 435 445 10

3 2 434 448 14

4 434 447 13

5 434 444 10

среднее 434,6±0,99 445,6*1,82 11,0*2,45

1 423 435 12

2 424 434 10

3 1 424 434 10

4 425 433 8

Бенито Р1 5 423 433 10

среднее 423,8±0,84 433,8*0-84 10,0*1,41

1 443 467 24

2 445 468 23

3 2 444 467 23

4 442 467 25

5 442 467 25

среднее 443,2±1,30 467,2*0,45 24,0*1,01

Растения томатов гибрида Торбей Р1 показали наличие двух основных пиков фотолюминесценции. У незараженных растений первый пик фотолюминесценции колебался в пределах волны света от 412 до 417 нм.

Второй пик колебался в пределах длины света от 428 до 431 нм. При заражении также обнаруживаются два пика, но длина волны их сдвигается в длинноволновую часть спектра (красную часть спектра). Так первый пик заражённого растения колеблется от 426 до 428 нм, а второй - от 438 до 442 нм.

Сканирование гибрида Полфаст Р1 показало аналогичные результаты, что гибрида Торбей Р1. Здоровые растения испускали световые излучения в несколько более длинных диапазонах волн. Первый пик имел спектр излучения, варьировавший в диапазоне 423 - 425 нм, а второй в диапазоне от 434 до 436 нм. Заражение ВТМ привело к сдвигу излучения в более длинную область: первый пик варьировал в диапазоне 432 - 434 нм, а второй в диапазоне 444 - 448 нм.

Полфаст Р1 динамично и быстроразвивающийся гибрид, сильно восприимчивый к вирусу ВТМ. Первые пики фотолюминесценции различаются на 10 нм. На больном растении первый пик фотолюминесценции равен 433 нм, в то время, на здоровом растении его длина волны равнялась 423 нм. Вторые пики фотолюминесценции соответственно равны 445 нм и 434 нм.

Заключительным в серии экспериментов с томатами использовали гибрид Бенито Б1. У этого гибрида также отмечено два основных пика фотолюминесценции. Длина волны первого пика изменялась от 423 до 425 нм у здоровых растений и от 433 до 435 нм у больных. Для второго пика характерны изменения в более длинноволновой части спектра. У здоровых растений от 442 до 445 нм и у больных - 467-468 нм. Статистический анализ представлен в таблице 7.

Таблица 7

Сводная таблица дисперсионного анализа результатов опыта с растениями томатов

Фактор А Фактор В Среднее по фактору А НСР095 = 0,88

Торбей Fl Полфаст Fl Бенито Fl

Первый пик фотолюминесценции (нм)

414,0 423,6 423,8 420,47

426,4 433,0 433,8 431,07

Среднее по фактору В 420,2 428,3 428,8 425,77

НСРо95= 1,08

Второй пик фотолюминесценции (нм)

Торбей Fl Полфаст Fl Бенито Fl Среднее по фактору А НСР„,5= 1,01

429,4 434,6 443,2 435,73

440,2 445,6 467,2 451,00

Среднее по фактору В 434,8 440,1 455,2 443,77

НСР095= 1,24

Статистический анализ показывает, что различия длины волны пиков фотолюминесценции у сортов томатов статистически достоверны. Заражение растений ВТМ вызывает статистически достоверное увеличение длины волны света по сравнению с контрольными растениями.

Особенности фотолюминесценции растений при недостатке азота.

Вирус ВТМ по признакам внешнего проявления близок к симптомам недостатка азота в растении. Для получения достоверного результата и проверки объективности патологической оценки были взяты в качестве образцов для исследования растения огурца с явным недостатком азота, который можно наблюдать визуально. Это также было сделано с целью -правильно обозначить картину заболевания и увидеть различия между

физиологическими и патологическими поражениями. Было проведено изучение фотолюминесценции этих растений (табл. 8). Для этого использовали установку, которая подробно описана ранее.

Таблица 8

Влияние недостатка азота на фотолюминесценцию растений огурца

Гибрид Номер эксперимента Пик фотолюминесценции Длина волны при нормальном питании, нм Длина волны при недостатке азота, нм Разница между пиками, нм

1 405 340 65

2 404 342 62

3 Первый 405 348 57

4 405 340 65

5 405 342 63

Калунга п среднее 405 342 63

НСР оо1 12,6

1 422 366 56

2 423 368 55

3 Второй 423 368 55

4 422 364 58

5 422 365 57

среднее 422 368 55

НСР оо1 12,09

Данные таблицы показывают, что недостаток азота у гибрида Калунга Р1 сдвигает спектр излучения фотолюминесценции в коротковолновую часть спектра. Длина волны излучения первого пика уменьшилась на 63 нм по сравнению нормально обеспеченным азотом растением и на 55 нм для второго пика. Эти результаты показывают, что изменения длины волны пиков фотолюминесценции в более короткую часть

спектра может быть использовано для диагностирования состояния растений, в частности, обеспеченностью элементами питания. Статистически анализ показал, что для первого пика НСР 001 равняется 12,6 и эта величина значительно ниже фактических различий, а для второго эти результаты достоверны при НСР 001 равным 12,09.

Это показывает, что изменения длины волны пиков фотолюминесценции в более короткую часть спектра может быть использовано для диагностирования состояния растений, в частности, обеспеченностью элементами питания.

Сравнительная характеристика различных методов диагностики вируса ВТМ и азотного голодания

В таблицах 9 и 10 приведены параметры основных методов, используемых для диагностики вируса ВТМ и азотного голодания в сравнении с лазерной фотолюминесценцией.

Таблица 9

Сравнительная характеристика различных методов диагностики вируса ВТМ на примере растений томата и огурца

Анализ Достоверность (чувствительность) Время проведения, час Стоимость реактивов, евро

ПЦР' 99,6% от 8 (в зависимости от количества проб) 237 (96 тестов)

ифа" (Серологический) 75-85% от 8 237 (96 тестов)

Лазерная 85-90% 0,4-0,5 750

фотолюминесценция или on-line (1500 тестов)

По данным: www.agrodiagnostica.ru.www.biovitrurn.ru.

www.chimmed.ru.www.pasteur-nii.spb.ru.

Таблица 10

Сравнительная характеристика методов определения азотного голодания

Анализ Достоверность" Время проведения, мин Стоимость, евро Трудоёмкость***

Листовая диагностика* 90-95% 30-50 от 3,5 (один элемент) Да

Тканевая диагностика* 90-95% 30-50 от 3,5 (один элемент) Да

Лазерная фотолюминесценция 90-95% 15 0,5 (один тест) Нет

* По данным: www.tdahp.ru.ru.www.ikc.omgau.ru:

** Основывается: - для листовой диагностики - фотохимическая активность суспензии хлоропластов;

- для тканевой - содержание нитратного азота в клеточном соке растений;

*** Для получения достоверного результата необходимо собрать 150-200 образцов с 1 га.

выводы

Установка для определения фотолюминесценции растений с использованием эксимерного лазера показала

работоспособность, высокую чувствительность, стабильность получаемых результатов и их воспроизводимость в сравнении с существующими методами диагностики вирусных заболеваний растений.

Результаты экспериментов свидетельствуют о возможности диагностики растений, заражённых ВТМ на ранней стадии в режиме реального времени (on-line).

Экспериментально доказано, что исходной дня диагностики ВТМ и отличия ВТМ от азотного голодания растения является УФ-область излучения с установленной длиной волны (X) равная 308 нм. На других длинах волн зондирующего излучения сигнал фотолюминесценции практически не регистрируется.

Растения томатов и огурцов заражённые ВТМ, характеризуются фотолюминесценцией с длиной волны света, превышающей длину волны света здоровых растений: УФ часть спектра для здоровых растений и длинноволновая часть спектра для больных: Томата:

Торбей F1: первый пик —414,0нм/426,4нм,

второй пик - 429,4нм/440,2нм; Полфаст F1: первый пик — 423,6нм/433,0нм,

второй пик — 434,6нм/445,6нм; Бенитио F1: первый пик - 423,8нм/433,8нм,

второй пик — 443,3нм/467,2нм;

380,бнм/417нм, 420,6нм/435нм; 410,2нм/425нм, 421,8нм/434,6нм; 416,2нм/426,8нм, 425,8нм/438,6нм.

Статистический анализ показывает, что различия длины волны пиков фотолюминесценции у гибридов томатов и огурцов статистически достоверны. Заражение растений ВТМ вызывает статистически достоверное увеличение длины волны света по сравнению с контрольными растениями:

- для огурцов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НСР095 = 1>22; среднее по фактору В НСР095 = 1,95;

второй пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НСР095 = 1.59; среднее по фактору В НСР095 = 1.95;

- для томатов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НСР095 = 0,88;

среднее по фактору В НСР095 =1.08;

второй пик фотолюминесценции-. среднее по фактору А НСР095 = 1,01; среднее по фактору В НСР095 = 1,24;

У гибрида огурца Калунга Р1, испытывающего недостаток азота, пики фотолюминесценции проявляются в коротковолновой части спектра на длинах волн 342 - 367 нм, в то время как при полноценном питании пики спектров фотолюминесценции наблюдаются в длинноволновой области 25

Огурца: Амур Р1:

Адам Р1:

Атлантис Б1:

первый пик второй пик ■ первый пик второй пик ■ первый пик второй пик ■

спектра: 405-422 нм. Недостаток азота сдвигает спектр излучения в коротковолновую УФ часть спектра для первого пика на +63 нМ и на +55 нМ для второго пика. Статистически это подтверждено: первый пик HCPooi = 12,6; второй пик HCPooi = 12,09.

7. Усиление люминесцентного сигнала в полосе 425-480 нм достоверно коррелирует с развитием ВТМ.

8. Установлено, что лазерное излучение с длиной волны 308 нм позволяет диагностировать растение, не повреждая его.

9. Основными показателями при диагностике ВТМ являются первые два пика люминесценции, с максимальной амплитудой по высоте и ширине спектра, аналогичные показатели установлены для растений испытывающих азотное голодание.

10. Лазерная фотолюминесценция в сравнении с другими методами диагностики вирусных заболеваний имеет ряд преимуществ:

1. Во времени получения результата: 15 минут или on-line;

2. Высокой достоверности: 85-90%;

3. Меньшей трудоёмкости: не требует значительных физических усилий при калибровке, настройке и запуске аппаратуры;

4. Не требовательна к выбору образца для анализа: достаточно использовать инфицированную часть растения, например, лист;

5. Не высокой стоимости анализа: 0,5 евро один тест.

Список опубликованных работ

1. Пискарёв А.Ю. Применение лазерной аппаратуры для оценки

патологического состояния растений. Технологические основы экономического развития сельского социума. Сборник материалов Международной научно-практической конференции, 12-14 мая 2005 года. Прикаспийский НИИ аридного земледелия, солёные займища Астраханской области. -М.: Изд-во «Современные тетради», 2005. -С. 456-460;

2. Пискарёв А.Ю. Сельское хозяйство Дании. Концепции, практика и перспективы современного земледелия. Материалы научной конференции аграрного факультета, 15-16 апреля 2003 года: -М.: Изд-во РУДН, 2003. - С. 115-116;

3. Пискарёв А.Ю. Диагностика заболеваний растений методом лазерной фотолюминесценции. Агробиологические проблемы современного сельскохозяйственного производства: Материалы научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых учёных и сотрудников Аграрного факультета: -М.: Изд-во РУДН. - 2004 г. - С. 11-12;

4. Пискарёв А.Ю. Ботанический сад г. Копенгагена (Дания). Агробиологические проблемы современного сельскохозяйственного производства: Материалы научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых учёных и сотрудников Аграрного факультета: -М.: Изд-во РУДН. - 2004 г. - С. 17-19;

5. Пискарёв А.Ю., Москаленко И.В., Молодцов H.A. Применение лазерной аппаратуры в диагностике заболеваний растений. Современные аграрные преобразования: проблемы и пути их решения. Материалы межвузовской научно-практической конференции студентов, аспирантов и преподавателей аграрных вузов РФ. -М.: Изд-во ООО «МиК», 2005. - С. 53-55;

6. Пискарёв А.Ю. Теплицы ботанического сада г. Копенгагена (Дания). Агробиологические проблемы современного сельскохозяйственного производства: Материалы научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых учёных и сотрудников Аграрного факультета: -М.: Изд-во РУДН. - 2004 г. - С. 22-24;

7. Пискарёв А.Ю. Гибриды сладкого перца. Гавриш. 2004. №5.-С.41;

8. Пискарёв А.Ю. Крупноплодные томаты: Веласко Р], Спейстар Ралли Р,. Гавриш. 2005. №2. -С. 38-39.

9. Пискарёв А.Ю. Гладкоплодные гибриды Р, огурца для осеннего и продлённого оборотов. Гавриш. 2005. №4. -С.7-8;

10.Пискарёв А.Ю. Феррари Р, — перец нового поколения. Гавриш. 2005. №5. -С.4;

Аннотация

На сегодняшний день существует множество методов диагностики вирусных заболеваний: микроскопический, серологический, молекулярный, микробиологический, однако эти методы продолжительны по времени и дорогостоящи.

Настоящая работа основана на использовании лазерного оборудования в диагностике вирусных заболеваний, в частности ВТМ. Основные преимущества научной работы заключаются в следующем: раннее распознавание заболевания, высокая точность и сравнительная дешевизна анализа.

Эксперимент заключается в облучении инфицированного растения флуоресцентным излучением. Высота и частоты волн определяют патологическое состояние растения.

Annotation

Today there are a lot of methods to detect plant viruses: microscopical method, serum diagnostics, microbiological method and molecular method; however these methods are quite long and expensive.

This work is based on using laser equipment in plant diseases diagnostics specifically ToMV. It gives main principal advantages: earliness in detection, high degree of accuracy, comparative cheapness of analysis.

Experiment rests on raying infected plant by fluorescence emanation. Peaks of waves and their frequencies indicate the pathological state of examine plant.

Принято к исполнению 21/09/2006 Исполнено 22/09/2006

Заказ № 652 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пискарев, Александр Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Теоретические основы применения лазеров в биологии

1.2. Механизм действия лазерного излучения с биообъектами

1.3. Механизм светочувствительности биологических систем.

1.4. Роль нелинейно-оптических процессов.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСА ВТМ.

2.1. Общая характеристика группы тобамовирусов.

2.2. Морфология вирионов, распространение и хозяева.

2.3. Цитопатология, тельца включений.

2.4. Структура генома.

2.5. Классификация тобамовирусов.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Объекты исследований и схема опытов.

3.2. Условия проведения опытов.

3.3. Конструкция диагностической системы.

3.4. Особенности конструкции аналитической стационарной лазерной установки.

4. ВЫЯВЛЕНИЕ ЗАРАЖЁННЫХ ВТМ РАСТЕНИЙ

4.1. Оценка заражённости томатов и огурцов ВТМ.

4.2. Особенности фотолюминесценции растений томатов, заражённых ВТМ.

4.3. Особенности фотолюминесценции растений огурца, заражённых ВТМ.

4.4. Исследование фотолюминесценции растений, испытывающих недостаток азота.

4.5. Сравнительная характеристика различных методов диагностики вируса ВТМ и азотного голодания.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Диагностика вирусных инфекций на примере вируса табачной мозаики с помощью лазерной спектроскопии"

Для сельского хозяйства всех стран мира встала проблема борьбы с болезнями культурных растений с применением самых разнообразных способов. Известно, что в современной экологической обстановке ущерб от вредных организмов значителен. В Африке потери от вредителей, болезней и сорняков достигают 44% от потенциального урожая, в Юго-Восточной Азии - 43%, в Латинской Америке - 35% (Помазков, 2000). По данным ФАО (2003) потери от заболевания растений в различных странах наносят колоссальные убытки экономике. В Западной Европе они составляют миллионы долларов, в Азии - более 200 млн., Южная и Северная Америка -более 500 млн., в России эта цифра близка к 20-25 млн. долларов. Таким образом, мировой ущерб, наносимый сельскому хозяйству различными заболеваниями растений близок к цифре в 1 млрд. долларов.

В связи с этим борьба с наиболее распространенными болезнями требует больших затрат и усилий. В настоящее время потери сельскохозяйственной продукции обусловлены воздействием антропогенных, стрессовых факторов и приемов, используемых при интенсивных технологиях. В результате организмы активируются и переходят в разряд вредоносных, у патогенов повышается вредоносность и устойчивость к фунгицидам.

Одной из распространенных форм заболеваний и трудно поддающейся диагностике являются вирусные. Вирусы, микоплазмы, вироиды поражают все живые организмы, часто являются причиной массовых заболеваний, приводящих к тяжелым последствиям. В настоящее время известно около 700 возбудителей вирусной этиологии и их количество постоянно пополняется (Келдыш, Помазков, 2003).

Широкое распространение вирусных заболеваний, отсутствие приемов массового оздоровления в полевых условиях требует затрат на производство оздоровленного посадочного материала. Для ограничения распространения и снижения вредоносности вирусных заболеваний требуется осуществление целого комплекса мероприятий: использование приемов ранней диагностики, карантина и сертификации посадочного материала, контроль за источниками инфекции, селекция устойчивых к заболеванию сортов и гибридов (Келдыш, Помазков, 2003).

Возникает потребность в разработке новых методов диагностики, для быстрого мониторинга заболеваний и оздоровительных мероприятий. Разработка теоретических предпосылок и внедрение методологических подходов для различных систем защиты растений от болезней создает основу для разработки физических, биофизических, физиологических и других методов исследований.

Еще К.А. Тимирязев указывал, что, электрофизиологические методы перспективны для определения «степени жизнеспособности организма растений». Широко используют частотную дисперсию импеданса, динамику электрических потенциалов для диагностики устойчивости и эффективности использования пестицидов при защите растений (Горчаков, 1992 ). В других работах эти методы использовали при анализе водного режима, обеспеченности элементами питания, степенью заболевания (Мелещенко, 1959; ОгеепИеш дХ а1.,1972; Горчаков, 1994). Другие исследователи (Тарусов, Китляев, 1974) показали, что электрофизиологические параметры несут информацию о генетической программированное™ и являются интегральными показателями сложных физиолого-биохимических процессов при воздействии на растение факторов внешней среды.

Ценность полученной информации подчеркивается строго количественными измерениями параметров, воспроизводимостью полученных результатов. Другой особенностью метода является информационность в определении ответных реакций организма на действие факторов среды и стрессовые воздействия, адаптационные возможности растительного организма. Применительно к сельскому хозяйству использование метода позволит определять устойчивость к неблагоприятным факторам среды, например, недостатку питания и воздействию возбудителей болезней (ВТМ).

В последние годы во многих странах мира среди биофизических методов большое внимание уделяется интенсивному внедрению лазера в биологические исследования. Уникальное свойства лазера открыло широкие возможности его применения в различных областях диагностики. Эффективность лазерного сканирование широко известно в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).

Современное развитие исследований в области воздействия излучения с веществом характеризуется многофункциональностью, привлечением многих разделов физики для интерпретации получаемых результатов, практической ценностью, необходимостью создания новых информационных, промышленных и медицинских технологий (Аграфонов, Балахчи, Бирюлина и др, 2004).

Традиционный подход к диагностике заболеваний растений включает в себя визуальное наблюдение за состоянием растения: проявлением внешних признаков заболевания. Как правило, в такой момент, заболевание принимает хронический характер, и борьба с ним становится затруднительной. Существенно и то, что, внешние признаки заболевания не всегда являются специфичными. Препаративные же методы диагностики заболеваний растений продолжительны по времени и дорогостоящи.

Актуальность данной работы связана с возможностью использования лазерной диагностической аппаратуры для определения болезней растений на ранней стадии. Этот метод позволяет: определить болезни растений на ранней стадии развития и проводить диагностику растений в режиме реального времени (on line). Преимуществом данного метода является возможность проводить исследования бесконтактным способом - не повреждая растение (Пискарёв, 2004).

В России лазеры применяются уже более 30 лет. Лазеры могут испускать свет в узком спектральном диапазоне в виде направленного сфокусированного, высококогерентного, монохроматического, поляризованного пучка электромагнитных волн (Физика: энциклопедический словарь, 1991).

В зависимости от характера взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями различают три вида фотобиологических эффектов, которые могут быть использованы для диагностики: фотодеструктивное воздействие, при котором тепловой, гидродинамический, фотохимический эффекты света вызывают деструкцию тканей. Этот вид лазерного излучения взаимодействия используется в лазерной хирургии;

- фотофизическое и фотохимическое воздействие, при котором поглощённый живыми тканями свет возбуждает в них атомы и молекулы, вызывает фотохимические и фотофизические реакции. На этом основывается принцип биолюминесценции - люминесценции организмов, связанная с процессами из жизнедеятельности. Наблюдается у бактерий, грибов, простейших, насекомых, растений;

- невозмущающее воздействие, когда живой объект не меняет своих свойств в процессе взаимодействия со светом. Это такие эффекты, как рассеивание, отражение и проникновение. Этот вид также используют в лазерной спектроскопии.

Фотобиологической активностью свет обладает в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра. Фотобиологические процессы достаточно разнообразны и специфичны (Фёдоров, 1988).

В настоящей работе нами поставлена цель - показать возможность и практическую осуществимость применения современных лазеров для диагностики вирусных заболеваний. В процессе реализации поставленной цели выполнялись следующие задачи:

1. Разработка концепции диагностической системы, основанной на использовании метода лазерной фотолюминесценции;

2. Сборка, наладка и калибровка диагностического лазерного стенда для отработки методики фотолюминесцентного анализа болезней растений на ранних стадиях;

3. Проведение экспериментов со здоровыми растениями и растениями на ранней стадии заболевания вируса табачной мозаики с целью разработки методики фотолюминесцентного анализа с использованием импульсно-периодического эксимерного лазера.

4. Выделение общих критериев для определения заболевания вирусом табачной мозаики на основе сканирования с помощью импульсно-периодического эксимерного лазера.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые для диагностирования заболевания ВТМ овощных растений была использована установка, сконструированная на основе эксимерного лазера, показавшая преимущества дистанционного диагностирования.

2. Показано, что увеличение длины волны фотолюминесценции растений является признаком заболевания ВТМ после предварительного облучения ультрафиолетом с длиной волны света 308 нм.

3. Установлено, что растения, испытывающие недостаток азотного питания, но имеющие визуальные признаки ВТМ, характеризуются более короткой волной фотолюминесценции, чем растения в благоприятных условиях питания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Пискарев, Александр Юрьевич

выводы

Установка для определения фотолюминесценции растений с использованием эксимерного лазера показала работоспособность, высокую чувствительность, стабильность получаемых результатов и их воспроизводимость в сравнении с существующими методами диагностики вирусных заболеваний растений.

Результаты экспериментов свидетельствуют о возможности диагностики растений, заражённых ВТМ на ранней стадии в режиме реального времени (on-line).

Экспериментально доказано, что исходной для диагностики ВТМ и отличия ВТМ от азотного голодания растения является УФ-область излучения с установленной длиной волны (X) равная 308 нм. На других длинах волн зондирующего излучения сигнал фотолюминесценции практически не регистрируется.

Растения томатов и огурцов заражённые ВТМ, характеризуются фотолюминесценцией с длиной волны света, превышающей длину волны света здоровых растений: УФ часть спектра для здоровых растений и длинноволновая часть спектра для больных:

Торбей F1: первый пик - 414,0нм/426,4нм, второй пик - 429,4нм/440,2нм; Полфаст F1: первый пик - 423,6нм/433,0нм, второй пик - 434,6нм/445,6нм; Бенитио F1: первый пик - 423,8нм/433,8нм, второй пик - 443,3нм/467,2нм;

Амур Б1: первый пик - 3 80,6нм/417нм, второй пик - 420,6нм/435нм;

Адам : первый пик - 410,2нм/425нм, второй пик - 421,8нм/434,6нм;

Атлантис Б1: первый пик - 416,2нм/426,8нм, второй пик - 425,8нм/438,6нм.

Статистический анализ показывает, что различия длины волны пиков фотолюминесценции у гибридов томатов и огурцов статистически достоверны. Заражение растений ВТМ вызывает статистически достоверное увеличение длины волны света по сравнению с контрольными растениями:

- для огурцов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НС^р 1,22; среднее по фактору В НС1^Л,95; второй пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НС5у= 1,59; среднее по фактору В НС^= 1,95;

- для томатов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НС^= 0,88; среднее по фактору В НС^= 1,08; второй пик фотолюминесценции: среднее по фактору А НС^,= 1,01; среднее по фактору В НО^р.1,24;

У гибрида огурца Калунга Б1, испытывающего недостаток азота, пики фотолюминесценции проявляются в коротковолновой части спектра на длинах волн 342 - 367 нм, в то время как при полноценном питании пики спектров фотолюминесценции наблюдаются в длинноволновой области спектра: 405-422 нм. Недостаток азота сдвигает спектр излучения в коротковолновую УФ часть спектра для первого пика на +63 нМ и на +55 нМ для второго пика. Статистически это подтверждено: первый пик HCPooi = 12,6; второй пик HCPooi = 12,09.

7. Усиление люминесцентного сигнала в полосе 425-480 нм достоверно коррелирует с развитием ВТМ.

8. Установлено, что лазерное излучение с длиной волны 308 нм позволяет диагностировать растение, не повреждая его.

9. Основными показателями при диагностике ВТМ являются первые два пика люминесценции, с максимальной амплитудой по высоте и ширине спектра, аналогичные показатели установлены для растений испытывающих азотное голодание.

10. Лазерная фотолюминесценция в сравнении с другими методами диагностики вирусных заболеваний имеет ряд преимуществ:

1. Во времени получения результата: 15 минут или on-line;

2. Высокой достоверности: 85-90%;

3. Меньшей трудоёмкости: не требует значительных физических усилий при калибровке, настройке и запуске аппаратуры;

4. Не требовательна к выбору образца для анализа: достаточно использовать инфицированную часть растения, например, лист;

5. Не высокой стоимости анализа: 0,5 евро один тест.

5. Заключение

Проведенные эксперименты показали, что лазерная установка перспективна для диагностирования заражения овощных культур ВТМ. Установка показала стабильность параметров волны света, примененной для облучения растений. Подобные установки использовали in vivo для диагностики таких заболеваний, как рак и неоплазия (образование опухолей) рядом исследователей (Anidjar, Cussenot, Avillier and others, 1998; Qu, MacAuley, Lam and Palcic, 1995; Ramanujam, Folien Mitchell, Mahadevan, Thomsen and others, 1996; Turner, Ramanujam, Ghosh and others, 1998; Zeng, Weiss, Cline and others, 1998).

Успешно использовали данный метод в биохимии для диагностирования белковых соединений in vivo, которые синтезируются при формировании ответной реакции на внешнее воздействие (Richards-Kortum, 1995) и определения начальной стадии паранекроза и границу его распространения (Москаленко, Прилуцкий, 2000), что было нами заимствовано.

В работе Qiyin Fang, Thanassis Papaioannou, Javier A. Jo, Russel Vaitha, and Kumar Shastry (2003) авторы подтверждают принципы использования современного оптоволоконного лазерного оборудования на биологических объектах in vivo. Система позволяет использовать различные световые источники и оптоволоконные провода для выборочного и дистанционного возбуждения света в режиме доставка/сбор информации, которые используются в различных биологических задачах. Положительные результаты получены при диагностике различных заболеваний в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии, устойчивости к воздействиям факторов внешней среды (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).

Это подтверждает применение установки для диагностирования заболевания растений ВТМ. В результате облучения различных растений были получены результаты, позволяющие точно характеризовать состояние растений: повреждение ВТМ, недостаток азотного питания. Однозначный ответ также был при облучении воды, показавший отсутствие ответной реакции (см. стр. 84).

В ходе проведённых экспериментов были выявлены значительные различия показателей фотолюминесценции у растений инокулированных вирусом ВТМ и растений не подвергшимся заболеванию. Установлено, что у растений зараженных вирусом табачной мозаики появляются 2 пика фотолюминесценции, характеризующиеся возрастанием длины волны света. В большинстве экспериментов этот показатель превысил 10 нм и является существенной величиной. Основные показатели снимались по первым двум пикам фотолюминесценции, которые приходились на длину волны от 380 до 460 нм. Необходимо отметить, что все пики фотолюминесценции больных растений сдвигались в длинноволновую (красную) область, тем самым, являясь характерным диагностическим показателем.

У растений, испытывающих недостаток азота, пики фотолюминесценции проявляются в коротковолновой части спектра на длинах волн 340 - 360 нм, в то время как при полноценном питании пики спектров фотолюминесценции наблюдаются в длинноволновой области. Эти различия также существенны.

Применение лазера в диагностике патологических процессов у растений основывается на оптическом зондировании тканей. При этом в полной мере используются уникальные свойства лазерного излучения: монохроматичность, когерентность, поляризованность, направленность, возможность генерации от непрерывного излучения до сверхкоротких импульсов. Оптическое зондирование тканей позволяет получить информацию как о структурно-пространственных параметрах объектов (молекул, клеток и органов в целом), так и о состоянии жизнедеятельности (Козлов, 1996), что было подтверждено нами в проведённых экспериментах у заражённых и здоровых растений.

Фотолюминесценция растений, прежде всего, связана с изменением направленности метаболических процессов, вызванных внешними факторами. Так, в экспериментах (Москаленко, Прилуцкий, 2000) с экстрактами из тела светящегося рачка СурйсНпа установлено, что на этой модели для люминесценции необходимы вода, кислород и окисляющее вещество - в данном случае липопротеид люциферин, окисляемый ферментом люциферазой с выходом конечного продукта реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) в виде липоперекиси. Наиболее сильная люминесценция (первичная и (или) вторичная) в деградирующих тканях отмечается на стадии необратимой денатурации с модификацией сульфгидрильных (8Н2) групп белковых молекул в дисульфидные мостики (Б-Б), т.е. при потере водорода и одного электрона на каждую сульфгидрильную группу и при увеличении «жёсткости» молекулярной конструкции. На основании перечисленных данных можно сказать, что в биологических объектах в общем случае усиление люминесцентного свечения сопряжено с потерей определёнными молекулярными комплексами или радикализированными атомами электродонорных свойств с превращением их в агенты электроакцепторного действия (радикализация биологических молекул).

Упомянутыми авторами также установлено, что при облучении разнообразных образцов тканей и жидких белковых сред организма млекопитающих (облучение УФ лазером, X = 308 нм) усиление люминесцентного сигнала в полосе 400 нм достоверно коррелирует с развитием некробиоза на уровне необратимого повреждения клеточных мембран и белковых коллоидов. Данный эффект хорошо воспроизводится при действии сильных факторов перекисного (радикального) окисления и автолиза, но отсутствует при действии слабого окислителя типа формальдегида. Эффект усиления флюоресценции при некробиозе практически универсален и отражает процессы перекисной деградации липидов, разрушение клеточных оболочек, потерю противоокислительных электродонорных свойств, связанных, в частности, с диеновыми связями С=С, образование жёстких макромолекулярных структур, «армированных» предположительно дисульфидными мостиками S-S.

В работе Jonathan D. Pitts и Mary-Arm Мусек (2001) были получены спектры фотолюминесценции с разницей в 3 нм, что было достаточно для определения широкого спектра частот биологических флюороворов.

Малов А.Н., Малов С.Н., Чёрный В.В., (1997) отмечают селективность лазерного воздействия (изменения индуцируются только в больных биосистемах, на здоровые воздействие не сказывается) и то, что эффект наблюдается при очень малых интенсивностях и поглощаемых энергетических дозах. Экспериментально было установлено, что лазерное излучение действует как на биологические клеточные структуры, так и на отдельную клетку.

В тканевой лазерной спектроскопии, свет используется для зондирования эндогенных биологических флуорофоров, таких как коллаген, эластин, никотинамидадениндинуклеотид и триптофан. Так как ткани являются неоднородной средой, сигналы флуоресценции, измеренные in vivo отражают, морфологическую и оптическую абсорбцию ткани, а также разрушенные места, как местная биохимия (Richards-Kortum, 1995). Поэтому эти сигналы, полученные безвредным путём, являются ценным источником детальной информации о микросреде и заболевании ткани.

В своих работах Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П. (2003) отмечают перспективность использования лазера в селекции сельскохозяйственных растений, показано, что при непрерывном воздействии лазерного излучения видимой области спектра можно получить высокий выход мутантных форм.

Настоящая экспериментальная работа позволяет в режиме реального времени определить начальную стадию развития ВТМ на растениях томата и огурца, а также отличить вирусное происхождение инфекции от азотного голодания. Работа основана на регистрации спектра люминесценции под действием УФ излучения лазера исследуемых здоровых и заражённых образцов, в которых происходили некротические процессы или возникал риск развития некроза. Для сравнения использовали образцы растений, в которых заведомо отсутствовали явления некроза. Для проведения экспериментов был создан стенд, где использовалась лазерная установка на базе ХеС1 эксимерного лазера, а измерения проводились на длине зондирующего излучения X - 308 нм. На других длинах волн зондирующего излучения сигнал фотолюминесценции практически не регистрировался.

Для увеличения точности измерений и получения надёжных временных характеристик фотолюминесценции в подсистему детектирования был включён осциллограф ТекйошсБ, что увеличило разрешающую способность спектра с АХ= 0,91 нм до ДА,=0,23 нм и увеличило точность измерений. Лабораторные измерения спектров фотолюминесценции для объекта ВТМ обеспечили возможность изучения характерных пиков спектров фотолюминесценции, тонкую структуру в районе этих пиков, значения сигналов фотолюминесценции как функцию концентрации и временные характеристики сигналов фотолюминесценции, соответствующих спектральным пикам.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Пискарев, Александр Юрьевич, Москва

1. Аграфонов Ю.В., Балахчи А.Г., Дорогибид Я.С., Малов А.Н. Влияние структуры примембранной воды на эффект лазерной биостимуляции. Люминесценция и сопутствующие явления. Иркутск: ИГУ, 1999. -С. 65-70;

2. Аграфонов Ю.В., Тихонов Д.А., Саркисов Г.Н., Мартынов Г.А. Дипольная жидкость вблизи поверхности. Метод теории возмущения. Синглетное приближение. Коллоидный журнал. Т.54,1992. С. 3-13;

3. Аграфонов Ю.В. Структура жидкости вблизи твёрдой цилиндрической поверхности. Коллоидный журнал. Т. 54, 1994. С. 473-474;

4. Аграфонов Ю.В., Балахчи А.Г., Бирюлина Т.В. и др. Граничные структуры жидкости и голографические регистрирующие среды. Компьютерная оптика, вып. 19,1999. С. 118 - 124;

5. Аграфонов Ю.В., Липов Д.Б., Малов А.Н., Овчинкин A.B. Проблемы эксплуатации волоконно-оптических систем связи. Компьютерная оптика, вып. 19,1999. С. 159-164;

6. Байбеков И.М., Касымов А.Х., Козлов В.И. и др. Морфологические основы низкоинтенсивной лазеротерапии. Ташкент: Изд-во им. Ибн Сины, 1991.-223 е.;

7. Броудай M., Мерей Дж. Физические основы микроэлектроники. М.: Мир, 1985.-496 е.;

8. Буйлин В.А. Низкоинтенсивная лазерная терапия с применением матричных импульсных лазеров. М.: ТОО «Фирма «Техника», 1996. -118с.

9. Ю.Волькенштейн М.В. Общая биофизика. М.: Наука, 1978. - 592 е.;

10. Воккен Г.Г. Радиобиология. М.: Высшая школа, 1967. - 232 е.;

11. Вундерлих Б. Физика макромолекул. Т.1. М.: Мир, 1976. - 624 е.;

12. Вундерлих Б. Физика макромолекул. Т. 2. М.: Мир, 1976. - 574 е.; М.Выговский Ю.Н., Дработурин П.А., Коноп А.Г., Малов А.Н. Желатинглицериновые красные регистрирующие системы с метиленовым голубым. Компьютерная оптика, вып. 18, 1999.- С. 133-138;

13. Выговский Ю.Н., Кручилин JI.E., Малов А.Н., Малов С.Н., Петров A.A. Лазерный отжиг коллоидных голографических регистрирующих сред. Компьютерная оптика, вып. 19,1999.-С. 125-128;

14. Гиббс А. Харрисон Б. Основы вирусологии растений. Москва: «Мир». 1978;

15. Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. -М.: Наука, 1989.-344 е.;

16. ГОСТ Р 50723-94 Лазерная безопасность. Общие требования безопасности при разработке и эксплуатации лазерных изделий. М.: Издательство стандартов, 1995. - 34 е.;

17. Гольдин М. И. Вирусные включения в растительной клетке и природа вирусов. М. 1963;

18. Горчаков В.В. Биофизика. Учебное пособие для с/х вузов. Москва, ОООМиК. 2006,-144 е.;

19. Горчаков В.В. Методология электрофизиологического анализа адаптации растений к условиям среды. Вестник РУДН. Сельскохозяйственная серия, М. 1994. -С. 70-77;

20. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. М. Обл.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. — 236 е.;

21. Грибовский В.П. Полупроводниковые лазеры. Мн.: Университетское, 1988.-304 е.;

22. Гримблатов В.М. Современная аппаратура и проблемы низкоинтенсивной лазерной терапии. Применение лазеров в биологии и медицине (Сборник). Киев, 1996, - С. 123-127;

23. Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П. Селекция и семеноводство культивируемых растений. Под ред. Ю.Л. Гужова. М.: Мир, 2003. -С. 244-251;

24. Делоне Н.Б. Взаимодействие лазерного излучения с веществом. М.: Наука, 1989.-280 е.;

25. Девятков Н.Д., Голанд М.Б., Бецкий О.В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М.: Радио и связь, 1991. -168 е.;

26. Денисюк Ю.Н., Ганжерли Н.М. Псевдоглубокая голограмма, её свойства и возможности применения. -Л.: ФТИ АН СССР. 64 е.;

27. Демтрёдер В. Лазерная спектроскопия основные принципы и техника эксперимента. -М.: Наука, 1985;

28. Джеймс Т.Х. Теория фотографического процесса. Л.: Химия, 1980. -642 е.;

29. Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии. М.: Респект, 1992. -122 е.;

30. Инюшин В.М. Лазерный свет и живой организм. Алма-Ата, 1970. - 46 е.;

31. Инюшин В.М., Чекуров П.Р. Биостимуляция лучом лазера и биоплазма.- Алма-Ата, «Казахстан», 1975. 120 е.;

32. Карлов Н.В., Кириченко H.A., Лукьянчук Б.С. Лазерная термохимия. -М.: ЦентрКом, 1994. 368 е.;

33. Кадомцев Б.Б. Динамика и информация. 2-е изд. М.: Редакция журнала «Успехи физических наук», 1999. - 400 е.;

34. Каргин В.А., Слонимский Г.Л. Краткие очерки по физико-химии полимеров. М.: Химия, 1967. - 232 е.;

35. Кару Т.И. Фотобиология низкоинтенсивной лазерной терапии. Итоги науки и техники. Серия физ. Основы лазера и пучков. Технология. ВИНИТИ, 1989. т.4. - С. 44 - 84;

36. Кейси Х., Паниш М. Лазеры на гетероструктурах. М., т.2., 1981. -364 е.;

37. Келдыш М.А., Помазков Ю.И., Вирусы, вироиды, микоплазмы. -М: РУДН, 2003. 146 е.;

38. Климонтович Ю.А. Статистическая теория открытых систем. М.: ТОО «Янус». - 624 е.;

39. Козлов В.И., Мельман Е.П., Нейко Е.М., Шутка В.В. Гистофизиология капилляров. Спб.: Наука, 1994. - 234 е.;

40. Козлов В.И. Развитие лазерной медицины России. РУДН. ГНЦ лазерной медицины России Минздрава РФ. М.: Россия, 1996. - С. 1-5;

41. Крюков А.И., Шерстюк В.П., Дилунг И.И. Фотоперенос электрона и его прикладные аспекты. Киев: Наук. Думка, 1982. - 240 е.;

42. Кригер Ю.А. Биофизика. Под ред. Тарусова Б.Н. и Колье О.Р. -М.: Высшая школа. 468 е.;

43. Моро У. Микролитография. В 2-х тт. М.: Мир, 1990. С. 605-632;

44. Малов А.Н., Малов С.Н., Чёрный В.В. Физические основы лазерной терапии. Иркутск: ИФ ИЛФ СО РАН, 1997. - Препринт 2. - 46 е.;

45. Малов А.Н., Костюк М.Г. Модельный анализ основных биологических процессов в низкоинтенсивной лазерной терапии. Laser Market, 1995, Nl.-C. 37-39;

46. Мартынов Г.А. Проблема фазовых переходов в статистической механике. УФН, 1969. С. 595 - 624;

47. Мелещенко С.Н. Об особенностях и информационной роли импедансных измерений на растительных объектах. Труды АФИ, 1969, в. 24, с . 74-77;

48. Москвин C.B. Лазерная терапия, как современный этап развития гелиотерапии (исторический аспект). Лазерная медицина. Т. 1. Вып.1, 1997.-С.45-49;

49. Пискарёв А.Ю. Сельское хозяйство Дании. Концепции, практика и перспективы современного земледелия. Материалы научной конференции аграрного факультета, 15-16 апреля 2003 года: -М.: Изд-во РУДН, 2003.-С. 115-116;

50. Планк М. Принцип сохранения энергии. M.-JL: ГОНТИ, 1938. -236 с.;

51. Помазков Ю.И. Значение и перспективы защиты растений в реализации потенциальной продуктивности. В сб. «Достижения и перспективы в области тропического земледелия и животноводства». М., РУДН.2000, -С. 34-44

52. Попов Е.М. Проблема белка. Том 3: Структурная организация белка. -М.: Наука, 1997.-604 е.;

53. Прохончуков A.A., Жижина H.A. Лазеры в стоматологии. Лазеры в клинической медицине. Руководство для врачей. Под. ред. С.Д. Плетнёва. М.: Медицина, 1996. - С. 283-303;

54. Романовский Ю.М., Степанова Н.В., Чернавский Д.С. Математическая биофизика. М.: Наука, 1984. - 304 е.;

55. Рубин А.Б. Биофизика. М.: Высшая школа, 1987. -С. 305 - 319;

56. Сандитов Д.С., Бартенев Г.М. Физические свойства неупорядочных структур (Молекулярно-кинетические и термодинамические процессы в неорганических стёклах и полимерах). Новосибирск: Наука, 1982. -256 с.;

57. Саркисов Г.Н. Приближённые уравнения теории жидкостей в статистической термодинамике классических жидких систем. УФН, 1969.-С. 625-642;

58. Солименко С., Крозиньяни Б., Ди Порто П. Дифракция и волноводное распространение оптического излучения. М.: Мир, 1989. - 664 е.;

59. Справочник по лазерам. Под. ред. A.M. Прохорова, пер. с англ. — т. 1-2, М., 1978;

60. Справочник по лазерной технике: Пер. с нем. М.: Энергоатомиздат, 1991.-544 е.;

61. Сучкова JI.B. Партенокарпические огурцы для всех видов тепличных сооружений и открытого грунта. М., 2003. - 16 е.;

62. Тарусов Б.Н., Китляев Б.Н. Биофизические основы прогнозирования производственных показателей растений. В сб. «Биофизика растений», материалы 1-го симпозиума по молекулярной и прикладной биофизике. Краснодар, 1974 -С. 5;

63. Титов Н.М., Москвин С.В. Фирма «Техника» разработчик лазерной медицинской аппаратуры. Лазер-маркет, (3-4), 1993. - С. 18-19;

64. Тихонов Д.А., Аграфонов Ю.В., Мартынов Г.А. и др. Коллоидный журнал. Т.53,1991.-С. 911;

65. Федер Е. Фракталы. М.: Мир, 1991. - 254 е.;

66. Федёров Б.Ф. Лазеры. Основы устройства и применение. — М.: ДОСААФ, 1988.- 190 е.;

67. Фридрисхсберг Д.С. Курс коллоидной химии. СПб.: Химия, 1995. -400 е.;

68. Чибисов К.В. Общая фотография. М.: Искусство, 1984. - 446 е.;

69. Электроника: Энциклопедический словарь. М.: Сов. Энциклопедия, 1991.-688 е.;

70. Эмиссия признака соматический эбриодогенез у баклажана. О.О. Тимина, А.Н. Малов, B.C. Фещенко. Международный симпозиум по селекции и семеноводству овощных культур. М.: РАСХН, 1999. -С. 354-359;

71. Agrafonov Yu. V., Martynov G.A., Sarkisov G.N. Molecular Physics, 1980. V. 39. N. 4. P. 963;

72. Alfano R.R., Tata D.B., Cordero J., Tomashefsky P., Longo F.W. and Alfano M.A., IEEE J. Quantum Electron. 20,1507,1984;

73. Anderssonengels S., Johansson J., Svanberg K., and Svanberg S. Photochem. Photobiol. 53, 807. 1991;

74. Anna L. Showden. A Colour Atlas of Post-Harvest Diseases and Disorders of Fruits and Vegetables. Volume 2: Vegetables. Published by Wolfe Scientific Ltd. 1991.-416p.;

75. Anidjar M., Cussenot 0., Avillier S., Ettori D., Teillac P., and LeDuc A. In Advances in Optical Biopsy and Optical Mammography, edited by R.R. Alfano (The New York Academy of Science, New York, vol. 838, 1998. -p. 130;

76. Atabecov J.G., Taliansky M.E. (1990). Expression of a plant virus coded transport function by different virus genomes. Adv. Virus Res. 39, pp.201-248;

77. Dougherty T.J. Laser Focus, 19, №7, 55,1992;

78. Dawson W. 0., Beck D.L., Knorr D.A. and Grantham G. L. (1986). cDNA cloning of the complete genom of tobacco mosaic virus and production of infectious transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83,1932-1836;

79. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Novikov V.K., Agranovsky A.A., Morozov S.Yu., Efimov V.A., Casper R., Atabekov J.G. (1994). Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBS Lett. 350, 5-8;

80. Glanzmann T., Ballini J.P., H. van den Bergh, and Wagnieres G, Rev. Sci. Instrum. 70,4067,1999;

81. Goelet P., Lomonossoff G.P., Butler P.J.G. et al. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 5818-5822;

82. Greenhem C.G. Randall P.J.,Hard M.M. Electrical parameters in relation to phosphorous and calcium deficiencien in subterroneum clover (trifolium subterroneum L.). J.Exp. Bot., 1972, v.74, pp. 197-209;

83. Gu Qiao. Analogy between life phenomen and laser. Chin. J. Infrared. Res. A., 1989. 8, №1, pp. 69-74;

84. Hayashi H., Kinuwaki Y., Yoshinaga M. (1965). Inhibition of anaphylactic release of vascular permeability factor or histamine by specific protease inhibitor in tissue culture. Nature. 208,1007-1008;

85. Jeys T. and Ripin D. UV Luminescence Spectroscopy and Discrimination of Bioaerosols. Federal Bio-Chem Detection R&D Opportunities, Biological-Chemical Detection Symposium, Washington DC, 9 June 2004;

86. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed. (Kluwer Academic/Plenum, New York, 1999);

87. Lewandowski D. J. and Dawson W.O. Enciclopedia of Virology plus. Copyright Academic Press, 1995.;

88. Moscalenko I., Molodtsov N. Detection and identification of biological agents in real-time with the help of portable laser-based point detector. International conference on contamination soil. Franz Bordeaux. V.3, pp. 70-77;

89. Maloletov S.M., Kalinkin V.V., Malov A.N., Sherstyuk V.P. On the feasibility of designing self-developing media with high diffraction efficiency. Scientific and applied photography. 1993, 33, №3, pp. 448-455;

90. Malov A.N., Malov S.N., Feshchenko V.S. Resonance nature of laser biostimulation from the point of view of quasi-optics. Laser Physics, 1996, 6, №5, pp. 979-982;

91. Namba K., Pattanaek R., Stubbs G. (1989). Visualisation of intact tobacco mosaic virus at 2,8 A0 resolution dy X-ray fiber diffraction. J. Mol. Biol. 208, pp. 307-325;

92. Oulamara A., Tribillon G., Duvernoy J. Biological activity measurement on botanical speciemen surfaces using a temporal decorrelation effect of laser speckle. J. Mod. Opt., 1989. №36, №2, pp. 165179;

93. Qiyin Fang, Thanassis Papaioannou, Javier A.Jo, Russel Vaitha and Kumar Shastry. Time domain laser-induced fluorescence spectroscopy apparatus for clinical diagnostics. Review of scientific instruments, vol. 75, N 1, January, 2004. - pp. 151 - 162;

94. Qu J., MacAuley C., Lam S., and Palcic B. Opt. Eng. (Bellingham) 34,3334,1995;

95. Ohno T., Aoyagi M., Yamanashi Y., Saito H., Ikawa S., Meshi T., Okada Y. (1984). Nucleotide sequence of the tobacco mosaic virus (tomato strain) genome and comparison with the common strain genome. J Biochem (Tokyo). 96,1915-1923;

96. Pelham H.R., Jackson R.J. (1976) An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. 67, pp. 247256;

97. Pitts J.D., Sloboda R.D., Dragnev K.H., Dmitrovsky E., and Mysek M.A., Biomed J. Opt. 6, 31,2001;

98. Pitts J.D. and Mary-Ann Macek. Design and development of a rapid acquisition laser based fluorometer with simultaneous spectral andtemporal resolution. Review of scientific instruments, vol. 72, N 7, July 2001;

99. Ramanujam N. Neoplasia 2, 89,2000;

100. Ramanujam N, Follen Mitchell M., Mahadevan A., Thomsen S., Malpica A., Wright T., Atkinson N., and R. Richards-Kortum. Lasers Surg. Med. 19,46,1996;

101. Richards Kortum R. and Sevick- Muraca, Annu. Rev. Phys. Chem. 47, 555, 1996;

102. Richards-Kortum R. In Optical Thermal Response of Laser-Irradiated Tissue, edited by A.J. Welch and M. J. C. van Gemert (Plenum, New York), 1995,-p. 667;

103. Rowlinson J.S., Widom B. Molecular Theory of Capillarity. -Oxford: Clarendon Press, 1982;

104. Saito T., Yamanaka K. and Okada Y. (1990). Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology. 176,329-336;

105. Sciences et Avenir. Voir l'invisible. December 1995. -147p;

106. Soifer V.A., Kotlyar V.V., Doscovich L.L. Iterative methods for diffractive optical elements computation. London: Taylor&Francis Ltd., 1997.-240 p.;

107. Solis I., Garsia-Arenal F. (1990). The complete nucleotide sequence of the genomic RNA of the tobamovirus tobacco mild green mosaic virus. Virology. 177,553-558;

108. Takamatsu N., Watanabe Y., Meshi T., Okada Y. (1990). Mutational analysis of the pseudoknot region in the 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. J. Virol. 64,3686-3693;

109. Tumor K., Ramanujam N., Ghosh J., and R. Richards-Kortum, IEEE Trans. Biomed. Eng. 45,953,1998;

110. Ugaki M., Tomiyama M., Kakutani T., Hidaka S., Kiguchi T., Nagata R., Sato T., Motoyoshi F., Nishiguchi M. (1991). The complete nucleotide sequence of cucumber green mottle mosaic virus (SH strain) genomic RNA. J. Gen. Virol. 72,1487-1495;

111. Van Belkum A., Abrahams J.P., Pleij C.W., Bosch L. (1985). Five pseudoknots are present at the 204 nucleotides long 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. Nucleic Acids Res. 13,7673-7686;

112. Vigovsky Y.N., Malov A.N., Malov S.N., Fetschenko V.S., Konop S.P. Proc. SPIE (OIST-97), v. 3347,1997. p. 314-324;

113. Vigovsky Y.N., Konop S.P., Malov A.N., Malov S.N. Photoinduced phase transitions in hologram recording in layers of dichromated gelatin. Laser Physics, vol. 8, N4,1988, pp. 901-915;

114. Wagnieres G.A., Star W.A. and Wilson B.C. Photochem. Photobiol. 68,603(1998);

115. Webster R., Granoff A. Enciclopedia of virology plus. Copyright Academic Press. 1995.;