Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности

Дмитриенко, Марина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности"

2оо?-А

На правах рукописи

ДМИТРИЕНКО МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИИ

HELICOBACTER PYLORI ПО УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете) и в Обществе с Ограниченной Ответственностью «Ассоциация Медицины и Аналитики»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Гинак Анатолий Иосифович

Научный консультант: кандидат физико-математических наук Мамаев Михаил Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Седых Николай Васильевич

кандидат технических наук Джагацпанян Игорь Эдуардович

Ведущая организация: Санкт-Петербур1 ский Государственный медиципский Университет им И.П.Павлова

Защита состоится 7, 2003 года в г / часов на заседании

Диссертационного совета Д 212.230.04 при Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (техническом университете) по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26, СПбТИ(ТУ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного Технологического института (технического университета). Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26, СПбТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан / 2003 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета , , г.^г^у^ ^'Т Т.Б. Лисицкая

I библиотека ' 1

1 с. Петербург/ , л

' оэ щ шЛ/уд

Введение

Актуальность

Бактерия Helicobacter pylori обитает на слизистой оболочке желудка человека и других млекопитающих и вызывает заболевание, названное хеликобактериозом. Инфекция Нpylori является одной из наиболее распространенных на Земле; ею инфицировано около половины человечества, в разных странах от 20 до 95% населения. В России уровень инфицирования составляет 70-80 %.

Присутствие микроорганизмов на слизистой оболочке желудка (СОЖ) вызывает постепенное изменение слизистой и приводит к таким заболеваниям желудочно-кишечного тракта, как хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка и др.

Бактерия Нpylori была огкрыта почти 20 лет назад; за это время изучены свойства микроорганизма, его метаболизм, ферментная система, взаимодействие с макроорганизмом. Это открытие называют «революцией в гастроэнтерологии», так как оно коренным образом изменило представления о сущности, патогенезе и терапевтическом подходе к целому ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с данной инфекцией.

Мнение большинства врачей-исследователей сейчас однозначно - бактерия H.pylori оказывает патогенное влияние на организм человека, следовательно, эту инфекцию необходимо своевременно обнаруживать и лечить, не допуская развития тяжелой патологии. Таким образом, разработка методов определения инфекции Н. pylori является весьма актуальной задачей. Более того, требуются новые диагностические технологии, позволяющие быстро и достоверно определить хеликобактериоз у пациента.

Существующие методы определения H.pylori (бактериологические, морфологические, биохимические, иммунологические, молекулярные) настолько громоздки, что не могут быть использованы для массовой серийной диагностики. Необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод обнаружения бактерии Нpylori, а также реализовать этот метод в удобных и недорогих тестах для широкого применения в медицинской практике.

Детектирование хеликобактериоза может проводиться по продуктам реакции уреазиого гидролиза карбамида - специфической реакции, которая обеспечивает бактерии возможность выживания в агрессивной кислой среде желудка. Данный метод определения инфекции H.pylori по уреазной активности является косвенным, но позволяет достичь весьма высоких показателей чувствительности и специфичности.

Цель работы

Разработка специфичного, чувствительного, экспрессного и удобного метода определения уреазной активности (УА) биологического материала in vitro и совершенствование метода определения УА in vivo.

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:

- определить закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении УЛ /и vivo и in vitro; выявить лимитирующие стадии этих процессов и оптимизировать определение УА;

- разработать технологию изготовления экспресс-тестов для определения УА биологического материала in vitro;

- рассмотреть различные типы детектирующих устройств для определения инфекции Нpylori по УА in vivo, определить технические требования к ним;

- оценить диагностическую эффективность новых тестов для инвазивного и неинвазивного определения инфекции H.pylori по УА и апробировать их на клиническом материале.

Научная новизна работы

- Впервые определение инфекции H.pylori по ее уреазной активности рассмотрено как комплексный процесс,- выявлены лимитирующие стадии при прохождении процесса in vivo и т vitro и определены пути совершенствования биохимического метода определения бактерии;

- исследованы процессы переноса субстрата карбамида к уреазе бактерии, обитающей на поверхности СОЖ, а также продуктов ферментативного гидролиза из зоны реакции;

- впервые разработана физико-химическая индикационная система на плоском волокнистом носителе для определения уреазной активности биологического материала, в т.ч. биоптатов СОЖ;

- на основании выявленных особенностей механизма процесса усовершенствован метод определения уреазной активности in vivo;

- показана применимость разработанного метода для диагностики инфекции H.pylori, проведено сопоставление его специфичности и чувствительности с аналогичными характеристиками применяемых в медицинской практике методов;

- разработана комплексная схема диагностики хеликобактериоза, включающая инвазивныс и неинвазивные методики.

Практическая значимость

Разработан новый метод определения уреазной активности биологических объектов; на основе предложенного метода разработан ХЕЛПИЛ-тест - экспресс-тест для оценки уреазной активности биологического материала т vitro.

Разработана рецептура и технология производства ХЕЛПИЛ-теста, определены его специфичность н чувствительность.

Модифицирована методика неинвазивного определения хеликобактериоза (ХЕЛИК-тест) с помощью индикаторных трубок в качестве детекторов, в результате повышена чувствительность определения и уменьшено время обследования.

Разработан новый способ определения хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора.

Разработан комплекс методик диагностики H.pylori, включающий инвазивное и неинвазивное определение хеликобактериоза. ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тесты прошли клинические испытания и рекомендованы Министерством Здравоохранения России к серийному производству и практическому применению в медицинских учреждениях России. Разработанные тесты

проверены в научно-исследовательских медицинских и лечебных учреждениях города Санкт-Петербурга и других городов России, в т.ч. в Санкт-Петербургской Педиатрической Академии, Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного образования, Санкт-Петербургском Медицинском Университете, Военно-Медицинской Академии, Санкт-Петербург; Научно-Исследовательском институте Скорой помощи, Санкт-Петербург. Представлены отзывы и акты апробации тестов для диагностики хеликобактериоза

Разработаны и утверждены Методические рекомендации по методикам определения уреазной активности и диагностики хеликобактериоза.

Разработаны Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза по уреазной активности биоптата (ш vitro) ХЕЛПИЛ-тест-«АМА» ТУ 9398-001-45564088-2003 и Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза дыхательным методом (in vivo) ХЕЛИК-тест-«АМА» ТУ 9398-002-45564088-2003, проведены их технические приемочные испытания, а также клинические испытания на базе кафедры педиатрии ФПК и ПП Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической академии, кафедры детских болезней №2 Российского государственного медицинского университета (г. Москва) и Научного центра Здоровья детей РАМН (г.Москва). По результатам этих испытаний Министерство Здравоохранения РФ рекомендовало тесты к серийному производству и практическому применению в медицинской практике, к внесению в Реестр изделий медицинского назначения.

Апробация работы

Основные результаты были представлены в постерном докладе на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (25 - 29 мая 1998 года, Санкт-Петербург), постерном сообщении на 22" Международном Симпозиуме по Хроматографии ISC-98 (13 - 18 сентября 1998 года, Рим), в докладе на Ш Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori (7 апреля 2000 года, Москва), докладе на УШ Восьмой Российской гастроэнтерологической Неделе (18-21 ноября 2002 года, Москва), постерном сообщении на 15" Европейском Конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине EUROMEDLAB-2003 (1-5 июня 2003 года, Барселона).

Проект "Аналитический комплекс для диагностики хеликобактериоза" занял первое место в городском конкурсе научных работ "Внедрение-97", проводимом под эгидой Союза Ученых Санкт-Петербурга.

По результатам работы опубликовано 8 статей, 3 тезиса докладов, получен Патент РФ на изобретение «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления», RU №2184781.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 25 рисунков и 15 таблиц. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, благодарностей, приложений (протокол проверки, отзывы, акт технических испытаний, протоколы клинических испытаний, выписка из протокола комиссии МЗ РФ) и библиографии (178 наименований).

Объекты и методы исследования

Объектом исследования является микроорганизм Я pylori и его уреазная система.

В исследованиях использовали: в качестве модельного вещества - уреазу (карба-мид-амидогидролаза) из бобов гороха Canavalia ensi-formis производства фирмы Toyobo Enzymes (Япония), поставленную компанией Sorachim, Франция;

кислотно-основные индикаторы: бромфеноловый синий, бромтимоловый синий, бромкрезоловый пур- ——

пурный, феноловый красный; Рисунок 1 - Бактерия Helicobacter pylori

различные виды волокнистых носителей (фильтро- со жгутиками на одном конце

вальная бумага, бумага-основа для экспресс-тестов [no Н. Enroth, 1999]

марки 1и 2, бумага-основа для индикаторной ленты, неотбеленная хлопковая индикаторная лента);

в качестве модифицирующих и стабилизирующих добавок - сульфат магния, лимонная кислота.

Апробацию тестов для определения уреазной активности in vitro, а также их клинические испытания проводили на пробах биологического материала (чаще всего биоптатов СОЖ), отбираемых в ходе фиброэндогастродуоденоскопического исследования (ФЭГДС) с помощью эндоскопов фирмы «Olympus ХР20» по общепринятой методике взятия биоггтатов без премедикации. Во время ФЭГДС проводили биопсию слизистой оболочки антрального отдела желудка (1-2 биоптата), у части пациентов при наличии показаний - антрального отдела, тела желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки.

При клинических испытаниях дыхательного нагрузочного теста анализировали воздух ротовой полости in vivo у пациентов с различными заболеваниями ЖКТ, инфицированных H.pylori (НР+) и неинфицированных данной инфекцией (HP—). Те же самые пациенты параллельно обследовались микробиологическим, гистологическим, серологическим методом и методом полимеразно-цепной реакции. При обследовании детей во всех случаях было получено согласие родителей.

Проверку работоспособности индикаторных трубок проводили с помощью модельных газовоздушных смесей с необходимым содержанием паров аммиака и воды. Для этого нами было разработано и изготовлено проверочное статическое устройство. Контроль содержания аммиака проводили с помощью поверенного измерителя - электрохимического газоанализатора аммиака «MI'JT-19.7»NH3

Оценку и фиксирование результатов индикации колористического анализа проводили как визуально, так и с помощью компьютерной обработки отсканированных и цифровых фотографических изображений.

Полученные результаты измерения концентрации паров аммиака обрабатывали по ОСТ 616-2446-80 «Статистическая обработка результатов наблюдений при измерениях концентраций паров химических веществ в воздухе».

Результаты и их обсуждение В основе биохимического метода определения уреазной активности лежит способность фермента уреазы специфически осуществлять гидролиз карбамида:

уреаза

H2N-CO-NH2 + Н20-► 2NH3t + COjf (1)

По изменению концентрации реагентов можно судить о скорости протекания реакции, и следовательно, об активности фермента. Обычно определение активности производят по газообразным продуктам реакции (1) - аммиаку и углекислому газу манометрически, колориметрически, потенциометрически и т.п.

Биохимический метод определения уреазной активности может быть использован для обнаружения H.pylori in vivo и in vitro.

Процесс детектирования бактерии Нpylori биохимическим методом состоит из нескольких основных стадий:

1. Приведение в контакт фермента - уреазы и субстрата - карбамида (мочевины). При анализе in vitro для этого обычно биологический материал, содержащий микробную уреазу (биоптат СОЖ, двенадцатиперстной кишки, желудочное содержимое, слизистый секрет желудка, слюнную жидкость и т.п.), помещают в раствор или гель с карбамидом; при анализе in vivo -наоборот, карбамид в капсуле или в растворе вводят в анализируемый отдел желудочно-кишечного тракта.

2. Реакция ферментативного i идролиза карбамида под действием уреазы IIpylori.

3. Миграция продуктов реакции из зоны реакции.

4. Химическая или физическая индикация продуктов реакции.

1. Ферментативный гидролиз карбамида Реакция ферментативного гидролиза карбамида под действием уреазы Нpylori, как и другие гидролитические реакции, является двухсубстратной реакцией. Детальное рассмотрение зависимостей скорости реакции от концентрации обоих субстратов (вода и карбамид) позволили дискриминировать механизмы и определить возможную последовательность стадий. Установлено, что реакция протекает по механизму образования тройного комплекса, когда активный центр фермента уреазы образует комплексы последовательно с первым и вторым субстратом: К, К2 к

Е ES! ES,S2 -* Е + Р, (2)

где Ki, Кг - соответствующие константы равновесия.

При этом биохимическое определение Нpylori и in vivo, и in vitro можно рассматривать как систему, открытую по субстратам (карбамиду и воде) и по продуктам (аммиаку и углекислому газу). Концентрация фермента во время анализа предполагается постоянной. При этом кинетика

гидролиза in vitro оценивается при избытке субстрата, в то время как in vivo анализируется ход гидролиза определенной порции субстрата карбамида.

В связи с этим продолжительность стадии каталитического гидролиза под действием высокоактивной уреазы Нpylori при неинвазивном определении составляет доли секунды, а при инвазивном - от нескольких секунд до 2-3 минут. 2. Процессы переноса Описание процессов, имеющих место при обнаружении Яpylori по ее уреазной активности, требует рассмотрения процессов переноса веществ, участвующих в реакции, за счет капиллярных сил (in vitro) и диффузии (in vivo).

При определении in vitro перенос веществ определяется капиллярными процессами: сорбцией раствора фермента из биологического образца волокнистым сорбентом (время - от одной до нескольких секунд), в то время как при определении in vivo перенос веществ более сложен и длится как минимум несколько мину-i.

Особенности неинвазивного определения H.pylori определяются тем, что микроорганизм обитает на слизистой оболочке желудка (СОЖ) под толстым слоем вязкой желудочной слизи (рисунок 2).

При проведении тестирования субстрат карбамид проникает через эту слизь к поверхности СОЖ и бактериальным клеткам, затем часть субстрата гидролизуется поверхностной уреазой, а часть диффундирует через клеточную мембрану внутрь клетки и взаимодействует с находящейся в периплазматическом пространстве уреазой.

Образующиеся в ходе гидролиза газообразные продукты (СО2 и NH3) диффундируют сквозь клеточную мембрану из клетки Нpylori, затем углекислый газ легко удаляется из кислой среды, частично проникает в кровь и через кровеносную систему и легкие быстро появляется в воздухе ротовой полости.

Аналогичные процессы, осложненные кислотно-основным взаимодействием с кислой средой в желудке и окислительно-восстановотельным взаимодействием с активными формами кислорода, протекают и при выделении аммиака. Образующиеся продукты, по-видимому, преимущественно не поступают в кровь, а через нижний пищеводный сфинктер и пищевод выходят в ротовую полость и могут быть там обнаружены.

Все процессы переноса in vivo можно условно разделить на следующие стадии:

- доставка субстрата карбамида в желудок;

- миграция растворенного карбамида сквозь слой слизи к местам скопления бактерий;

- диффузия карбамида сквозь клеточную мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки;

- внутриклеточная диффузия;

- диффузия продуктов реакции через клеточную мембрану наружу;

^ • жеяуд очное

- - роде р жим ое

' ' ^ •.

pH=l,S-2Í5

Рисунок 2 - Схема протекания процессов ш vivo

- дальнейшая миграция газообразных продуктов сквозь слизь в желудочную полость, а затем через пищевод и легкие - в ротовую полость.

Время, необходимое для диффузии карбамида сквозь клеточную мембрану, составляет порядка минуты. Внешне-диффузионные процессы длятся примерно столько же - 0,5 - 2 минуты. Суммарно процессы переноса имеют длительность порядка нескольких минут.

3. Индикация продуктов реакции

В нашей работе для индикации продуктов гидролиза под действием уреазы H.pyiori были использованы цветные реакции с кислотно-основными индикаторами, нанесенными на различные носители - волокнистые при определении in vitro и гранулированные при определении in vivo. Кинетика данных процессов исследована достаточно хорошо, процесс определения оптимизирован. Время прохождения цветной реакции составляет в среднем доли секунды.

Кроме того, в качестве детектирующего устройства использованы электрохимические сенсоры аммиака, время установления выходного сигнала с такого сенсора составляет 10-30 с.

Таким образом, изучение механизма процесса определения уреазной активности in vivo позволило определить стадию переноса в качестве лимитирующей. Это позволяет усовершенствовать неинвазивное определение Hpylori за счет уменьшения времени миграционных процессов, в первую очередь, за счет повышения скорости диффузии реагентов в зону и из зоны реакции.

Разработанные методы (in vitro, in vivo). Сущность и новизна

Определение уреазной активности in vitro

Нами разработан метод определения уреазной активности, отличительными особенностями которого являются:

проведение реакции в условиях дефицита жидкой фазы;

минимизация процессов переноса веществ за счет помещения всех необходимых реагентов -субстрата и индикатора - на пористый носитель;

активная роль данного носителя — не только сорбция раствора определяемого компонента из биологического образца, но и создание оптимальных условий протекания реакции - по значению рН и гидрофильным свойствам поверхности, а также прохождение реакции на поверхности волокон.

С целью реализации биохимического метода определения H.pyiori in vitro была создана физико-химическая индикационная система на плоском волокнистом носителе для определения уреазной активности биологического материала, в т.ч. биоптатов слизистой оболочки желудка.

Определение рН биодтатов

Предварительно нами был определен рабочий диапазон значений рН биологического материала. Чаще всего анализу подвергаются образцы (биоптаты) СОЖ, отбираемые в ходе ФЭГДС. Значения рН.биоптата определяли у пациентов с различными заболеваниями верхних

отделов желудочно-кишечного тракта. Определение pH проводили с помощью специально изготовленных для этого тест-билетов на основе пористого волокнистого носителя.

Значения pH биоптатов определяли у НР(+) и НР(-) взрослых пациентов и детей с различными вариантами гастродуоденальной патологии (поверхностный антральный гастрит, хронический гастрит, нодулярный гастродуоденит, язвенная болезнь желудка, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, рак желудка). В ходе проведения ФЭГДС брали пробы СО желудка и двенадцатиперстной кишки в местах наиболее вероятного нахождения бактерий Нpylori. Затем оценивались значения pH данных биоптатов.

Было определено, что у неинфицированных бактерией H.pylori детей значения pH биошата равны 6,0±0,4, а у инфицированных - 5,0±0,5, т.е. кислотность увеличивается. У взрослых наблюдается несколько иная картина: значения pH биоптата у HP-негативных пациентов равно 6,2±0,3, в то время как у HP-позитивных - 6,7±0,5 т.е. кислотность биоптата уменьшается. В то же время известно, что нормальное значение тканевого pH равно 6,5-6,7. Таким образом, разрабатываемое средство определения уреазной активности должно обеспечить резкий переход окраски тест-билета при наличии у биоптата У А в диапазоне pH 5,0-7,0 без ложного срабатывания в отсутствие УА.

ХЕЛПИЛ-тест

При разработке теста нами испытаны различные волокнистые носители, оптимизирована рецептура, соотношение реагентов; оценено влияние модификаторов на чувствительность определения (ПАВ, компяексообразователей и веществ, образующих кристаллогидраты). Кроме того, выявлено влияние технологии изготовления на характеристики теста.

В результате получена рецептура ХЕЛПИЛ-теста, описанная в Патенте России на изобретение №2184781 «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления».

При нанесении на поверхность ХЕЛПИЛ-теста анализируемого раствора или биоптата сначала происходит увлажнение поверхности (сорбция). Затем - при наличии УА - влажная часть тест-билета начинает изменять свой цвет с желтого на синий (см. рисунок 3). Размер и интенсивность окрашивания изменившего цвет пятна зависит от количества и активности попавшей на тест уреазы. Индикационный эффект развивается за время от 5с до 150 с, через 10-20 минут цвет начинает бледнеть из-за испарения влаги.

Результат определения (цвет и размер появившегося синего пятна) фиксировали как визуально, так и с помощью сканирования или фотографирования прореагировавших тестов. Полученные изображения обрабатывали с помощью компьютерных программ (например, Photoshop версии 4.0-7.0), получая

ИР- НР+

Рисунок 3 - Пример инаикадионного эффекта на ХЕЛПИЛ-тесте

при этом результаты в цифровом выражении: цвет в координатах RGB и размер пятна в единицах площади.

Таблица 1 - Оптимизация состава ХЕЛПИЛ-теста

Оптимизируемый параметр Требуемые характеристики Компонент теста Оптимальные величины

Носитель - Химические чистота и нейтральность по отношению к индикаторной системе. - Гидрофильность поверхности. - Сорбционная способность - Рыхлая структура поверхности - Белый цвет основы Волокнистый носитель — бумага-основа для экспресс-тестов марка 1 Плотность — 3,8-4,9 г/дм2 рН 5,5-6,5

Субстрат - Специфичность по отношению к ферменту - Чистота препарата - Избыток по сравнению с ферментом Карбамид, хч, перекристаллизованный 0,2 - 5,0 г/дм2

Индикатор - Интервал перехода - в области рН от 4,0 до 8,5 - Контрастное изменение цвета - Желательно - отсутствие красных тонов во избежание ложноположи-тельных результатов Бромтимоловый синий 0,5 -1,0 мг/дм2

Модификатор - Внесение Н20 в виде кристаллогидратов Сульфат магния 3,0-5,0 г/дм'

Технология изготовления - Последовательное нанесение компонентов - Образование длинных игольчатых кристаллов карбамида Медленная сушка на холоду и при повышенной влажности

Определение уреазной активности in vivo

При реализации биохимического метода обнаружения Нpylori in vivo оценка активности микробного фермента ведется по продуктам реакции (1) гидролиза карбамида в выдыхаемом воздухе. Чаще всего диагностика инфекции осуществляется по С02 измененного изотопного состава (содержащих 13С или 14С). ХЕЛИК-тест, разработанный Е.А.Корниенко и В.Е.Милейко в 1996 году, позволяет вести определение уреазной активности in vivo, применяя карбамид нормального изотопного состава и оценивать уреазную активность по изменению содержания аммиака в воздухе ротовой полости после приема пациентом т.н. «нагрузки» - порции карбамида нормального изотопного состава.

ХЕЛИК-тест может выполняться с различными способами детектирования сигнала: линейно-колористически с помощью пассивных дозиметров (ПД) или линейно-колористических газоанализаторов - индикаторных трубок (ИТ), с помощью ион-дрейфовой спектрометрии (НДС), волюмометрически, электрохимически и др. Сопоставление результатов одновременного измерения различными способами показало высокую степень их совпадения.

В данной работе в качестве измерителей содержания аммиака мы использовали пассивные дозиметры, индикаторные трубки и электрохимические сенсоры.

Пассивные дозиметры для определения аммиака

Определение аммиака может проводиться с помощью простейших тест-систем — пассивных дозиметров. Диагностически значимыми для обнаружения инфекции П.ру1оп являются концентрации МНз в интервале от 0,5 до 20,0 мг/м3. Нами был разработан ряд пассивных дозиметров для обнаружения в воздухе паров аммиака в указанном диапазоне концентраций на основе различных носителей.

Все пассивные дозиметры идентичны по химическому принципу, так как на сорбенты нанесен кислотно-основной индикатор (бромфеноловый синий или один из его аналогов, традиционно использующихся для определения аммиака).

Пассивные дозиметры состоят из тонкого (в одно зерно) слоя сорбента или волокнистого материала, заключенного между слоями прозрачного полимера. Они являются очень плоскими кюветами с размерами 0,2x12x25 или 0,2x5x5 мм, где окрашивание желтого сорбента в синий цвет под воздействием аммиака происходит по мере его проникновения от открытой щели в глубину. Развитие фронта характеризуется логарифмической зависимостью от концентрации для заданного времени оценки. Оценка может производиться как визуально, так и с использованием технических средств.

Таблица 2 - Разработанные пассивные дозиметры для измерения концентрации аммиака

Название Размер Сцнз, Сорбеаг т, ДС,

(маркировка) отверстия, мм мг/м3 (носитель) мин %

ПД-Ш3 Щель 0,2 0,5-10 КСК 5 20

ПД-Ш3эо Щель 0,2 0,1-2,5 КСК' 5 30

ПД-Шзбм Щель 0,2 1-10 бумага 5 20

ПД-Шзцн Щель 0,2 5-50 ТЛ 10 30

ПД-ЫНзПороговый открытый 1,0 СМКН 3 20

Примечание: КСК - силикагель марки КСК (кислотной обработки) с диаметром зерен 0,16-0,25 мм; КСК1- силикагель КСК с диаметром зерен 0,16-0,25, активированный виброобработкой; Бумага- бумага для биохимических тестов; ТЛ — текстильная лента атласная; СМКН - стабилизированный и модифицированный кремневый носитель с диаметром зерен 0,16-0,20 мм; V - объем газовой пробы, аспирируемой через ИТ; т - время анализа; АС-общая погрешность измерения концешрашга.

Проверку работоспособности пассивных дозиметров проводили на базе предприятия «ОПТЭК» в августе 1996 года. Проверка показала, что чувствительность (т.е. минимальная определяемая концентрация) пассивных дозиметров на аммиак составила не менее 2 мг/м3. Средняя длина окрашенного слоя прямо пропорциональна концентрации аммиака в воздухе в диапазоне концентрации 2-10 мг/м3.

Пассивные дозиметры, помещенные в зону дыхания, позволяют уверенно контролировать наличие аммиака в выдыхаемом воздухе за время не более трех минут, а за 5-10 минут оценить содержание аммиака в диагностических концентрациях.

Индикаторные трубки как детектор содержания аммиака

Для оценки содержания аммиака нами использованы индикаторные трубки (ИТ). При изготовлении ИТ была реализована известная цветная реакция на аммиак с индикатором бромфеноловым синим, нанесенным на различные типы носителей.

Были определены 5 типов ИТ, различающихся по своей химической чувствительности в зависимости от индикаторной рецептуры, типа сорбента и размера его зерен, а также определены нормативные показатели для каждого из типов.

Характеристики различных типов ИТ приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Характеристики различных типов ИТ

Тип Носитель Фракция Длина индикаторного слоя /слов. МИ Время аспирации т, мин Нормативный показатель /р,мм Допустимое СКО

1 Силикагель КСК 0 16-0,25 20 5 5.0 2,0

2 Кварц 0.25-0.315 30 5 17,0 4,0

3 Кварц 0.315-0.40 30 5 8,5 2,0

4 Кварц 0.25-0.315 36 5 18,0 3,0

5 Кварц 0.25-0.315 36 3 16,0 3,0

Правильность определения содержания аммиака с помощью индикаторных трубок и работоспособность индикаторных рецептур контролировалась нами с помощью специального устройства. Определение содержания аммиака в воздухе ротовой полости с помощью ИТ ведется в условиях повышенной влажности (90-100% отн.) и температуры (28-37°С) паровоздушой смеси (ПВО). Учитывая, что определяемые концентрации паров аммиака должны быть на уровне 0,5 -20,0 мг/м3, разработать и аттестовать образцовую установку для генерации требуемой ПВС оказалось сложно. Основная причина затруднений заключалась в сорбции аммиака на стенках установки и в соединительных шлангах, невоспроизводимости результатов генерирования ПВС и отсутствии аттестованной методики контроля создаваемой концентрации.

Мы изготовили макетное Устройство для статического генерирования ПВС, которое может быть использовано для контроля изготавливаемых ИТ. Принцип работы данного устройства основан на постоянстве концентрации насыщенных паров НгО и ИНз в замкнутом объеме над раствором МН(С1 при определенном значении рН раствора и постоянной температуре жидкой и газовой фаз.

Дополнительный контроль содержания аммиака проводили с помощью поверенного измерителя - электрохимического газоанализатора аммиака «МГЛ-19.7»МН3. Был определен диапазон регистрируемых концентраций аммиака 1-20 мг/м3. Градуировочная зависимость применяемых ИТ по отношению к показаниям электрохимического анализатора приведена на рисунке 4.

График градуировочной зависимости показывает пропорциональность сигналов ИТ (длины меняющего цвет индикаторного слоя) н показаний электрохимического датчика в диапазоне концентрации аммиака 0-20 мг/м3. Даже учитывая систематическую погрешность определения концентрации аммиака с помощью электрохимического метода (в первую очередь низкую селективность и высокую инерционность датчика, особенно в условиях повышенной температуры и влажности), можно сделать вывод о применимости изготавливаемых нами ИТ в качестве простейшего измерителя концентрации аммиака.

При создании методики контроля работоспособности ИТ нами определялась зависимость показаний (длины изменившего цвет слоя индикаторного порошка в ИТ) от различных влияющих факторов. Была подтверждена зависимость наблюдаемого индикационного эффекта от температуры создаваемой паро-воздушной смеси, а также от pH раствора NH<C1.

Таким образом, была разработана методика контроля работоспособности ИТ для проведения ХЕЛИК-теста. При этом не определялись истинные значения концентрации паров аммиака в анализируемой ПВО (в силу отсутствия аттестованных методик создания и определения концентрации). Пригодность ИТ для определения инфекции H.pylori определялась исходя из требований медицинских работников по разнице показаний у НР(+) и ПР(-) пациентов.

Диагностика хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора

Диагностика инфекции Нpylori может проводиться и с электрохимическим сенсором (ЭС) аммиака в качестве детектора. Мы использовали в качестве измерителя аммиака электрохимический газоанализатор аммиака «МГЛ-19.7»ЫНз, а в качестве методики определения хеликобактерноза-нагрузочный дыхательный ХЕЛИК-тест. Дня проверки сопоставимости результата анализ проводили параллельно с помощью индикаторных трубок и с электрохимическим анали затором, после этого результат подтверждался независимым третьим способом (морфологическим или микробиологическим).

Пример такого обследования НР(+) пациента приведен на рисунке 5. Таким образом, показана возможность

помощью ИТ и

с*™, МГ/М5

Рисунок 4 - Зависимость длины изменившего цвет слоя ИТ !„„„ от концентрации аммиака Сцт

20» 16-X

X 12

/Kz;

0123456789 10

t, НИН

Рисунок 5 - Пример обследования пациента с

использования электрохимического сенсора аммиака в качестве детектора при диагностике хеликобактериоза. Данный вариант ХЕЛИК-теста был опробован, дал положительный результат. На его основе разработан прибор, который позволяет повысить чувствительность и достоверность определения, сократив при этом время обследования пациента. Оформлена Заявка на изобретение «Способ пеинвазивной диагностики инфекции Helicobacter pylori ин виво и устройство для его реализации» (Корниенко Е.А., Дмитриенко М. А., 2003, приоритет от 11 апреля 2003 года).

Повышение чувствительности ХЕЛИК-теста

Модификацию дыхательного ХЕЛИК-теста проводили на основании результатов изучения кинетики процесса неинвазивного определения H.pylori in vivo.

Нами разработан модифицированный ХЕЛИК-тест, когда нагрузка дополнительно содержит средство для облегчения проникновения карбамида к стенкам желудка и выноса паров аммиака в ротовую полость. В качестве указанного средства может быть применен всасывающийся антацид, например, бикарбонат натрия (питьевая сода), или невсасывающийся антацид, например, альмагель или фосфалюгель, а также газированная вода. В таблице 4 приведены результаты тестирования при использовании различных вариантов нагрузки.

Таблица 4 - Модификации нагрузки в ХЕЛИК-тесте

НР(-) НР(+)

Число Значение Л1, мм* Число Значение А1, мм*

Вид нагрузки паци- через 5 через 10 паци- через 5 через 10

ентов минут минут ентов минут минут

Карбамид (ХЕЛИК-тест) 20 0,5 0,7 120 2,7 4,8

Карбамид и питьевая сода 15 1,0 1,7 84 3,4 5,1

Питьевая сода И 0 0 39 0,6 1,2

Карбамид и альмагель 17 2,0 84 5,6 7,2

Альмагель - - - 22 1,0 2,0

Карбамид и газированная вода 14 1,0 2,1 88 6.8 8,9

Газированная вода 4 0 0 25 0 0

* в таблице приведены средние значения прироста показаний А I (увеличение длины изменявшего цвет индикатора в индикаторной трубке) для неинфишрованных НР(-) и инфицированных НР (+) пациентов

Прием газированной воды не повышал концентрацию аммиака по сравнению с исходной, прием только лишь соды или альмагеля повышал концентрацию аммиака весьма незначительно. После приема соды с карбамидом прирост концентрации аммиака у НР(+) пациентов не имел достоверных отличий по сравнению с нагрузкой чистым карбамидом (5,1мм, р>0,05), после приема альмагеля с карбамидом он был достоверно выше (7,2 мм, р<0,05), что связано с длительным антацидным действием препарата. Наиболее достоверный прирост наблюдался при

последовательном приеме карбамида и газированной воды (8,9мм, р<0,01), что объясняется увеличением площади контакта жидкой и газовой фаз и более интенсивной эвакуацией паров аммиака из желудка в ротовую полость. У НР(-) пациентов не наблюдалось статистически значимого увеличения содержания аммиака после приема любого из использованных веществ с карбамидом.

Таким образом, повышение чувствительности ХЕЛИК-теста и уменьшение сомнительных и ложноотрицательных результатов может быть достигнуто при использовании карбамида в сочетании с антацидами или газированной водой.

Это усовершенствование позволяет повысить чувствительность определения инфекции H.pylori, особенно при низких уровнях инфицирования, увеличить достоверность результата анализа и сократить время проведения обследования. Данный вариант ХЕЛИК-теста был опробован, показал хорошие результаты и был оформлен как заявка на изобретение «Способ диагностики хеликобактериоза ин виво» (Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., 2002, приоритет от 19 апреля 2002).

Применение ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов в медицине

Апробация ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов как устройств для определения инфекции Я pylori проводилась на базе нескольких медицинских учреждений Санкт-Петербурга.

В Приложениях к диссертационной работе приведены акты проверки работоспособности разработанных тестов и сравнения их показаний с результатами, полученными другими методами, традиционно применяемыми врачами-гастроэнтерологами. В таблице 5 приведены результаты проверки работоспособности ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов.

Проверка показала, что тесты являются быстрыми, удобными и точными способами диагностики хеликобактериоза, которые позволяют получить результат уже в ходе исследования. Тесты не имеют противопоказаний и могут бьггь рекомендованы для широкого использования в клинической практике.

Врачами-практиками были отмечены такие достоинства ХЕЛПИЛ-тестов, как удобство применения в серийной работе, экспрессность, пригодность исследованного биоптата для дальнейшего гистологического или бактериологического изучения.

Разработаны и утверждены Методические рекомендации по методикам определения уреазной активности и диагностики хеликобактериоза Разработаны Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза по уреазной активности биоптата (ш vitro) ХЕЛПИЛ-тест-«АМА» ТУ 9398-001-45564088-2003 и Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза дыхательным методом (in vivo) ХЕЛИК-тест-«АМА» ТУ 9398-002-45564088-2003, проведены их технические приемочные и клинические испытания, по результатам этих испытаний Министерство Здравоохранения РФ рекомендовало тесты к серийному производству и практическому применению в медицинской практике, к внесению в Реестр изделий медицинского назначения.

Таблица 5 - Результаты проверки работоспособности ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов

Место проведения Методы сравнения Количество пациентов, чел. Показатели

ХЕЛПИЛ-тест ХЕЛИК-тест

Чувствительность, % Специфичность, % Чувствительность,Vo Специфичность,*/«

Детская инфекционная больница №5, г.Санкт-Петербург Гистологический 520 95±4 96±3 9б±4 92±3

Серологический («Elisa»), Бактериологический 100 95+4 96±3 9б±4 92J.3

Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет, кафедра клинической лабораторной диагностики Бактерио-скопический (цитология мазков-отпечатков), Иммуно-фермектный (Biometrica) 170 95±3 94±3 96±3 9б±3

Медицинская Академия Последипломного Образования, Санкт-Петербург, клиника кафедры гастроэнтерологии Эндоскопический 116 97±4 98±4 - -

Серологический 35

Цитологический 80

Воепяо-Медиципская Академия, кафедра хирургии Гистологический 85 9б±3 97±2 - -

Государственная Педиатрическая Медицинская Академия, Санкт-Петербург, кафедра педиатрии Гистологический 500 95±4 9б±3 95±4 92±3

Бактериологический 45

Серологический 96

Российский Государственный медицинский университет, г.Москва, кафедра детских болезней Метод полимеразной цепной реакции 200 92±4 94±4 9U3 90±3

Схема диагностики H.pylori

Разработанные нами ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тесты и их модификации позволили создать комплекс методик и на их основе разработать алгоритм диагностики инфекции

Схема диагностики с помощью разработанных тестов (рисунок б) сочетается со схемой диагностического алгоритма заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта, принятого на IX съезде педиатров России в 2001 году.

Все пациенты с жалобами на боли в животе должны быть обследованы на наличие Нpylori неинвазивными методами, например, ХЕЛИК-тестом. При отсутствии этих микроорганизмов пациенты должны быть обследованы всеми доступными инструментальными и лабораторными методами для постановки правильного диагноза.

Рисунох 6 - Схема диагностики инфекции Нpylori

Пациентам, у которых впервые выделена Яpylori, при наличии абдоминального синдрома может быть назначена эрадикационная терапия. Тем пациентам, у которых H.pylori выявляется повторно, необходимо провести более детальное обследование - в частности, обследовать инвазивно, провести ФЭГДС со взятием биопсии. Далее следует подтвердить хеликобактериоз, определив уреазную активность биоптата с помощью ХЕЛПИЛ-теста, а также по тем же биоптатам определить свойства штамма микроорганизма для назначения адекватной терапии. Контроль за эрадикацией следует проводить неинвазивным путем (ХЕЛИК-тестом) через 4-6 недель после окончания лечения. Кроме того, рекомендуется проводить диагностику хеликобактериоза ближайшим родственникам больных и при необходимости также назначать им эрадикационную терапию.

Данная схема обеспечивает комплексную достоверную и доступную диагностику инфекции Нpylori и контроль эффективности терапии.

Выводы

1. Разработан специфичный, чувствительный, экспрессный и удобный метод определения уреазной активности биологического материала in vitro. На основе разработанного метода создана аналитическая тест-система для экспресс-тестирования биологического материала и диагностики хеликобактериоза по его уреазной активности ХЕЛПИЛ-тест. Тест-система имеет чувствительность 92-97%, специфичность 94-98%, время анализа - не более 3 минут.

2. Усовершенствован способ определения уреазной активности in vivo ХЕЛИК-тесг. Модифицированный способ характеризуется более высокой чувствительностью определения и меньшим временем обследования.

3. Проанализированы закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении уреазной активности т vitro и in vivo, определение УА рассмотрено как комплексный процесс. Определены лимитирующие стадии и пути оптимизации определения уреазной активности.

4. Разработана технология изготовления экспресс-тестов для определения уреазной активности биологического материала in vitro.

5. Рассмотрены различные типы детектирующих устройств для определения инфекции

H.pylori по УА in vivo: пассивные дозиметры, линейно-колористические трубки, электрохимические сенсоры. Установлены технические требования к детекторам. Определены характеристики различных типов детекторов и области их применения. Разработаны методики контроля работоспособности различных детектирующих тест-систем.

6. Оценена диагностическая эффективность тест-систем для инвазивного и неинвазивного определения инфекции H.pylori по УА, проведена их апробация на клиническом материале. Успешно проведены технические и клинические испытания. Создан комплекс аналитических методик и средств обнаружения инфекции по ее уреазной активности. Предложена схема диагностики инфекции Нpylori с применением разработанных ХЕЛПИЛ- и модифицированных ХЕЛИК-тестов. Схема обеспечивает достоверное, комплексное и доступное определение хеликобактериоза и контроль за результатом его терапии.

Основные положения и результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

I. Патент 2184781 РФ. Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления / Дмитриенко М.А., Корниенко Е.А., Милейко В.Е. - №97117123; Заявл.30.09.97; Опубл. 10.07.2002. Бюл. 19 - С.494.

2. Милейко В.Е, Дмитриенко М.А. Пассивный газоаналитический дозиметр для медицинской диагностики / Тез. Докл. П Всеросс. научно-практической конф. - Санкт-Петербург,1997. - Т.2. -С. 178.

3. Дементьева С., Дмитриенко М, Милейко В. Скрининговая диагностика Helicobacter pylori / Тез. докл. П Росс, фестиваля «Здоровый мир», V Нац. Конгресса по проф. медицине и валеологии; II Росс, конференция руководителей здравоохранения «Медицинские, оздоровительные и рекреационные технологии. Стандарты. Качество», 22-24 июня 1998г. - Санкт-Петербург, 1998 -С.75.

4. В.Милейко, М.Дмитриенко. Определение аммиака и диоксида углерода в выдыхаемом воздухе // Тез. докл. ХХП МежД- Симп. по Хроматографии ISC-98, 13-18 сентября 1998г. - Рим,1998 -Р416.

5. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Милейко В.Е., Самокиш В.А., Вашкевич О.В., Нажиганов О.Н. Комплекс биохимических методов диагностики Helicobacter pylori / Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии и Колопроктологии. - 1998. - Т. VIII. - №.5. - Приложение №5. -С.280-281.

6. Успенская А.Р., Дмитриенко М.А., Керзиков А.Ф. Влияние обсеменения желудка Helicobacter pylori на возникновение постгастрорезекционных анастомозитов / Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии и Колопроктологии. - 2001. - Т. XI. №2. - Приложение №13. . С.97.

7. Войцицкий А.Н., Лебедев Н.Н., Кузьмин-Крутецкий М.И., Дмитриенко М.А., Цурупа С.Д., Успенская А.Р., Чвиров А.В.. Диагностика H-pylori быстрым уреазным тестом у больных с хроническими заболеваниями желудка и двенадцати-перстной кишки / Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии и Колопроктологии. - 2001. - Т. XI. №2. - Приложение №13. -С.27.

8. Войцицкий А.Н., Дмитриенко М.А., Стойко Ю.М., Шанин В.Ю., Коровин А.Е. Изменение регенераторной способности эпителия слизистой желудка и 12-перстной кишки и защитных способностей к патогенной микрофлоре при нарушении вегетативной сегментарной иннервации / Клиническая патофизиология. - 2001. - №2. - С.44-47.

9. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Нажиганов О.Н., Ревнов В.Б. Методы определения уреазной активности в диагностике инфекции Helicobacter pylori / в кн.: Современные технологии диагностики и лечения детей и подростков. Сб. научн. Тр / Комитет по здравоохранению. - СПб.,

2001.-С.156.

10. Стойко Ю.М., Шанин В.Ю., Войцицкий А Н, Дмитриенко М.А., Сергин А.Е. Секреторная функция и защитные способности эпителия слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки после нарушения вегетативной иннервации (экспериментальные исследования) / Клиническая патофизиология. - 2002. - №2. - С43-45.

11. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Дмитриенко М.А., Нажиганов О.Н., Вашкевич О.В., Самокиш В.А. Методы оценки уреазной активности in vivo и in vitro и их место в диагностике инфекции Helicobacter pylori // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. -

2002.-Т. X. - №2. - С.37-39.

12. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Ломакина Е.А. / Аммиачный дыхательный тест в диагностике инфекции Helicobacter pylori / - Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии и Колопроктологии. -2002. - Т. XII. - №5. - Приложение №17. - С.ЗО.

»10976

SoojJ

( '

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Дмитриенко, Марина Александровна

Введение.

Глава 1. Обзор и обсуждение литературы.

1.1. Helicobacter pylori, история открытия, свойства микроорганизма, эпидемиология инфекции и ассоциированность ее с другими заболеваниями.

1.2. Хеликобактериоз и методы его диагностики.

1.3. Уреаза, ее свойства и методы исследования.

1.4. Методы определения уреазной активности.

1.5. Уреазная система Helicobacter pylori.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

Глава 3. Процесс определения Helicobacter pylori по уреазной активности.

3.1. Кинетика ферментативного гидролиза карбамида.

3.2. Кинетика диффузионных процессов.

3.3.Обнаружение продуктов реакции гидролиза. Линейноколористический метод индикации веществ.

3.4. Формулирование требований к разрабатываемым тест-системам.

Глава 4. Разработка способа определения уреазной активности in vitro.

4.1. Определение рН биоптата.

4.2. Оптимизация индикаторной системы.

4.3. ХЕЛПИЛ-тест.

4.4. Проверка ХЕЛПИЛ-теста

Глава 5. Способы определения уреазной активности in vivo.

5.1. ХЕЛИК-тест как метод определения уреазной активности in vivo.

5.2. Пассивные дозиметры для определения аммиака.

5.3. Индикаторные трубки как детектор содержания аммиака.

5.4. Диагностика хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора.

5.5. Повышение чувствительности ХЕЛИК-теста.

Глава 6. Оценка возможности применения ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-теста для диагностики хеликобактериоза в медицинской лечебной и исследовательской практике.

6.1. Применение ХЕЛПИЛ- и ХЕЛИК-тестов в медицине.

6.2. Схема диагностики инфекции Helicobacter pylori.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности"

Бактерия Helicobacter pylori обитает на слизистой оболочке желудка человека и других млекопитающих и вызывает заболевание, названное хеликобактериозом. Инфекция H.pylori является одной из наиболее распространенных на Земле; ею инфицировано около половины человечества, в разных странах от 20 до 95% населения. В России уровень инфицирования составляет 70-80%.

Бактерия H.pylori была открыта почти 20 лет назад; за это время изучены свойства микроорганизма, его метаболизм, ферментная система, взаимодействие с макроорганизмом. Это открытие называют «революцией в гастроэнтерологии», так как оно коренным образом изменило представления о сущности, патогенезе и терапевтическом подходе к целому ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с данной инфекцией.

Мнение большинства врачей-исследователей сейчас однозначно — бактерия H.pylori оказывает патогенное влияние на организм человека, следовательно, эту инфекцию необходимо своевременно обнаруживать и лечить, не допуская развития тяжелой патологии. Таким образом, разработка методов определения инфекции Н. pylori является весьма актуальной задачей. Более того, требуются новые диагностические технологии, позволяющие быстро и достоверно определить хеликобактериоз у пациента.

Существующие методы определения H.pylori (бактериологические, морфологические, биохимические, иммунологические, молекулярные) настолько громоздки, что не могут быть использованы для массовой серийной диагностики. Необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод обнаружения бактерии H.pylori, а также реализовать этот метод в удобных и недорогих тестах для широкого применения в медицинской практике.

Детектирование хеликобактериоза может проводиться по продуктам реакции уреазного гидролиза карбамида - специфической реакции, которая обеспечивает бактерии возможность выживания в агрессивной кислой среде желудка. Данный метод определения инфекции H.pylori по уреазной активности является косвенным, но позволяет достичь весьма высоких показателей чувствительности и специфичности.

Цель работы

Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи: определить закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении УА in vivo и in vitro; выявить лимитирующие стадии этих процессов и оптимизировать определение УА;

- разработать способы определения инфекции H.pylori по УА in vivo и in vitro с различными вариантами получения и обработки аналитического сигнала; разработать технологию изготовления экспресс-тестов для определения УА биологического материала in vitro; оценить диагностическую эффективность новых тестов и апробировать их на клиническом материале.

Научная новизна работы

- Впервые определение инфекции H.pylori по ее уреазной активности рассмотрено как комплексный процесс; выявлены лимитирующие стадии при прохождении процесса in vivo и in vitro и определены пути совершенствования биохимического метода определения бактерии;

- разработана комплексная схема диагностики хеликобактериоза, включающая инвазивные и неинвазивные методики.

Практическая значимость

Разработана рецептура и технология производства ХЕЛПИЛ-теста, определены его специфичность и чувствительность.

Разработан новый способ определения хеликобактериоза с помощью электрохимического сенсора и устройство для этого способа определения.

Апробация работы

Основные результаты были представлены в постерном докладе на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (25 - 29 мая 1998 года, Санкт-Петербург), постерном сообщении на 22м Международном Симпозиуме по Хроматографии ISC-98 (13 - 18 сентября 1998 года, Рим), в докладе на III Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori (7 апреля 2000 года, Москва), докладе на VIII Восьмой Российской гастроэнтерологической неделе (18-21 ноября 2002 года, Москва), постерном сообщении на 15м Европейском Конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине EUROMEDLAB-2003 (1-5 июня 2003 года, Барселона).

По результатам работы опубликовано 8 статей, 3 тезиса^ докладов, получен Патент РФ на изобретение «Способ диагностики хеликобактериоза по оценке уреазной активности биологического материала и устройство для его осуществления» RU №2184781, оформлены заявки на Патенты на патенты «Способ диагностики хеликобактериоза ин виво» (Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., 2002), приоритет от 19.04.2002 и «Способ неинвазивной диагностики инфекции Helicobacter pylori ин виво и устройство для его реализации» (Дмитриенко М.А., Корниенко Е.А., 2003), приоритет от 11.04.2003.

Разработанные тесты проверены в научно-исследовательских медицинских и лечебных учреждениях города Санкт-Петербурга и других городов России, в т.ч. в Санкт-Петербургской Педиатрической Академии,

Санкт-Петербургской Медицинской Академии Последипломного образования, Санкт-Петербургском Медицинском Университете, Военно-Медицинской Академии (г.Санкт-Петербург), " Научно-Исследовательском институте Скорой помощи (г.Санкт-Петербург). Представлены отзывы и акты апробации тестов для диагностики хеликобактериоза.

Разработаны Методические рекомендации по методикам определения уреазной активности и диагностики хеликобактериоза.

Разработаны Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза по уреазной активности биоптата (in vitro) ХЕЛПИЛ-тест-«АМА» ТУ 9398001-45564088-2003 и Устройства для экспресс-диагностики хеликобактериоза дыхательным методом (in vivo) ХЕЛИК-тест-«АМА» ТУ 9398-002-45564088-2003, проведены их технические приемочные испытания, а также клинические испытания на базе кафедры педиатрии ФПК и 1111 Санкт-Петербургской Государственной Педиатрической академии, кафедры детских болезней №2 Российского государственного медицинского университета (г. Москва) и Научного центра Здоровья детей РАМН (г. Москва). По результатам этих испытаний Министерство Здравоохранения РФ рекомендовало тесты к серийному производству и практическому применению в медицинской практике, к внесению в Реестр изделий медицинского назначения.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 25 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, благодарностей, приложений (протокол проверки, отзывы, акт технических испытаний, протоколы клинических испытаний, выписка из протокола комиссии МЗ РФ) и библиографии (178 наименований).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дмитриенко, Марина Александровна

139 ВЫВОДЫ

2. Усовершенствован способ определения уреазной активности in vivo ХЕЛИК-тест. Модифицированный способ характеризуется более высокой чувствительностью определения и меньшим временем обследования.

3. Проанализированы закономерности физико-химических процессов, происходящих при определении уреазной активности in vitro и in vivo, определение УА рассмотрено как комплексный процесс. Определены лимитирующие стадии и пути оптимизации определения уреазной активности.

5. Рассмотрены различные типы детектирующих устройств для определения инфекции H.pylori по УА in vivo: пассивные дозиметры, линейно-колористические трубки, электрохимические сенсоры. Установлены технические требования к детекторам. Определены характеристики различных типов детекторов и области их применения. Разработаны методики контроля работоспособности различных детектирующих тест-систем.

6. Оценена диагностическая эффективность тест-систем для инвазивного и неинвазивного определения инфекции H.pylori по УА, проведена их апробация на клиническом материале. Успешно проведены технические и клинические испытания. Создан комплекс аналитических методик и средств обнаружения инфекции по ее уреазной активности. Предложена схема диагностики инфекции H.pylori с применением разработанных ХЕЛПИЛ- и модифицированных ХЕЛИК-тестов. Схема обеспечивает достоверное, комплексное и доступное определение хеликобактериоза и контроль за результатом его терапии.

141

Благодарности

В первую очередь я бы хотела выразить признательность научному руководителю профессору Анатолию Иосифовичу Гинаку за высокую требовательность и вдохновляющую поддержку работы. Со студенческой поры Ваш научный опыт, умение видеть практическую применимость сугубо исследовательских работ вдохновляла нас и пробуждала интерес к научной деятельности.

Огромное спасибо научному консультанту Михаилу Аркадьевичу Мамаеву за бесконечное терпение и поддержку в самые трудные моменты, за многие часы обсуждений результатов, за то, что он научил обращать внимание на мельчайшие детали - в постановке исследований, в их осуществлении и в представлении.

Я благодарна профессору Елене Александровне Корниенко за всю ту неоценимую помощь, которую она оказывала во время совместной работы. Врач и исследователь мирового уровня, умеющий совмещать широту научных интересов с глубиной понимания и тщательностью проведения исследований, она организовала эффективную проверку качества разрабатываемых методик и тест-систем, что привело к созданию первых в России тестов для определения HP, принятых МЗ РФ.

Хочу поблагодарить Виктора Евгеньевича Милейко, который познакомил меня с проблемой, легшей в основу данной работы. Плодотворная совместная работа открыла для нас новые перспективы профессиональной деятельности и побудила основать предприятие ООО «АМА».

Сердечное спасибо моим коллегам, сотрудникам ООО «АМА» Ирине Георгиевне Шургалиной и Надежде Александровне Сухаревой за их самоотверженную работу по обеспечению качества и стабильности разработанных нами тестов и методик.

Особенная признательность в моей душе - моему сыну, коллеге и помощнику Вадиму Сергеевичу Дмитриенко. Его поддержка, постоянный интерес и неусыпное внимание обеспечило высокий уровень работы.

Огромное спасибо врачам, с чьим участием выполнялась эта работа: Олегу Николаевичу Нажиганову, Людмиле Ивановне Назаренко, Алле Руслановне Успенской, Анатолию Николаевичу Войцицкому, Лине Анатольевне Хоровской, Сергею Викторовичу Бельмеру, Павлу Владимировичу Антонову, Борису Давидовичу Старостину, Владимиру Леонидовичу Эмануэлю, Елене Николаевне Лаптевой, Светлане Васильевне Гольбиц, Розе Ходжаевне Сиражиддиновой, Александру Владимировичу Иванову и многим другим.

Благодарю Льва Исааковича Головенчица, который оказал неоценимую помощь в правильном оформлении технической документации, что помогло пройти требуемые процессы в Министерстве Здравоохранения, за организацию технических испытаний тестов и за ценные технические и конструкторские советы.

Хочу также выразить признательность Владимиру Петровичу Челибанову и сотрудникам «Лаборатории ЛЭК» и «ОПТЭК» за оказанную помощь, научные консультации и предоставление возможности работы на хорошем оборудовании.

Спасибо Николаю Александровичу Погинайко за вдохновляющую веру в возможность выполнения данной работы - с самого первого дня до последнего, и за мягкую поддержку работы.

Благодарю сотрудников кафедры молекулярной биотехнологии Дмитрия Олеговича Виноходова и Екатерину Борисовну Аронову за их поддержку, за ценные советы по форме представления диссертационной работы и реферата, а также Ученого секретаря Диссертационного совета Татьяну Борисовну Лисицкую за внимательное отношение и рекомендации по поводу оформления сопутствующих документов.

Хочу выразить признательность Владимиру Андреевичу Самокишу — Вы всегда были для меня примером подлинно научной деятельности, способной творить чудеса. Спасибо за школу теоретической и практической исследовательской деятельности, а также за консультирование по поводу данной работы.

Спасибо Игорю Александровичу Морозову за его интерес к простейшим тест-системам диагностики инфекции Helicobacter pylori и за организацию широкомасштабных сопоставительных испытаний тестов.

От всего сердца благодарю моих родителей Валентину Ивановну Лыкову и Авенира Ивановича Митина за веру в реальность завершения диссертации, за поддержку при выполнении работы, а также за реализацию промышленного производства тестов.

Техническая помощь и компьютерное обеспечение Андрея Чухонина позволили выполнить работу на надлежащем уровне, а участие в работе Николая Мамаева и Сергея Григорьева - разработать новый перспективный прибор для определения хеликобактериоза.

Благодарю Уильяма Стюарта Аллисона за поддержку работы и веру в ее перспективность. Спасибо также Марине Тадеушевне Грохочинской, Маргарите Александровне Козловой, Татьяне Михайловне Сипенковой, Нине Борисовне Савковой, Людмиле Викторовне Кравцовой, Михаилу Ивановичу Тюрикову, Юрию Валерьевичу и Ирине Борисовне Степановым, Светлане Александровне Дементьевой, Сергею Алексеевичу Дмитриенко и многим другим за профессиональную помощь и дружескую поддержку в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Дмитриенко, Марина Александровна, Санкт-Петербург

1. ГОСТ 12.1.014-84. Система стандартов безопасности труда. Воздух рабочей зоны. Метод измерения концентраций вредных веществ индикаторными трубками. - М.: Издательство стандартов, 1986.- 14 с.

2. ОСТ 6-16-2446-80 Статистическая обработка результатов наблюдений при измерениях концентраций паров химических веществ в воздухе.

3. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения органов пищеварения. — МЗ РФ, М., 1998.-48 с.

4. МИ 1552-86. Методические указания. Государственная система обеспечения единства измерений. Измерения прямые однократные. Оценивание погрешностей результатов измерений. М.: Издательство стандартов. 1987, —8 с.

5. РД 52.04.186-89. Руководство по контролю загрязнения атмосферы. М.: ГК СССР по гидрометеорологии, МЗ СССР, 1991.-693 с.

6. Методика МЗ № 1637-77 от 18.04.1977. Фотометрическое определение аммиака. В кн.: Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Справ. Изд. М.: Химия, 1993. — С.36.

7. Методика МЗ № 4471-87 от 21.12.1987. Ионометрическое определение аммиака. В кн.: Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Справ. Изд. — М.: Химия, 1993. — С.35.

8. Ю.Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам. 1993. - 362 с.

9. П.Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: Триада-Х, 1998. — 496 с.

10. Аруин Л.И. Роль Helicobacter pylori в формировании морфологического субстрата язвенной болезни // Материалы VIII тематической сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. — 18 мая 1999. — Уфа, 1999. -СЛ.

11. Байбаков Ф.Б., Шарапов В.М. Контроль примесей в сжатых газах. М.: Химия, 1989.-160 с.

12. Баранская Е.К. История открытия Helicobacter pylori. II Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии / Под ред. В.Т.Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л. Лапиной. М.: Триада-Х, 1999. - С.54-62.

13. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: Наука, 1979. - 312 с.

14. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977. - 280 с.

15. Березин И.В., Савин Ю.В. Основы биохимии. М.: Издательство МГУ, 1990.-254 с.

16. Богданов Ю.М., Зубов Л.А., Смирнова Г.П. и др. Значение Helicobacter pylori в детской гастроэнтерологической практике // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол.колопроктол. 1997. — Т.7. - N2. - С.11 - 16.

17. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. JL: Химия, 1986. - 432 с.

18. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. — М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

19. Варфоломеев С.Д., Судьина Г.Ф. Кинетика реакций с иммобилизованными ферментами. -М.: Издательство МГУ, 1980. — 158 с.

20. Грызунов В.В., Лобжанидзе А.А., Боржак М.П. Язва желудка, ассоциированная с раком легкого // Гастробюллетень. Материалы 3-го Российского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2001». — 2001. — N.2-3. — С. 29.

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М.: Мир, 1982. 1120 с.

22. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. — М.: Мир, 1994. — 268 с.

23. Джагацпанян И.Э. Автоматизированный измерительный модуль для диагностики хеликобактериоза: Автореф. дис.канд. техн. наук / СПбГТИ. СПб., 1995. - 20 с.

24. Жебрун А.Б., Сафонова Н.В., Довгаль С.Г., Милейко В.Е., Фаловский М.В. (Российская Федерация). Способ диагностики хеликобактериоза / Патент 2091796 RU, МПК 6 G01 N 33/497.- 93029859/14; Заявл. 28.05.1993; Опубл. 27.09.97, Бюл. № 27. С.396.

25. Зайцева К.К., Калинин А.В., Спесивцев В.Н. Helicobacter (Campilobacter) pylori и их роль в развитии хронического гастрита и язвенной болезни. — М.: НПО «Союзмединформ», 1991. — 56 с.

26. Иванов А.В., Милейко В.Е. (Российская Федерация). Способ исследования уреазной активности / Пат. 2189592 RU, МПК 7 G 01 N 33/497. 98110329/14; Заявл. 15.05.1998; Опубл. 10.12.2001, Бюл. № 34. С.310.

27. Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. — М.: Триада-Х, 1999. — 255 с.

28. Корниенко Е.А. Современная диагностика инфекции Helicobacter pylori. СПб., 2002. 20 с.

29. Корниенко Е.А. Клиника, диагностика и лечение гастродуоденальной патологии, ассоциированной с инфекцией Helicobacter pylori, у детей.:

30. Дисс. докт. мед. наук. СПб., 1999. — 463 с.

31. Корниенко Е.А., Антонов П.В. Особенности функциональной диспепсии у детей // Гастробюллетень. — Материалы 3-го Российского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2001». 2001. - N.2-3. - С. 44.

32. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Дмитриенко М.А. и др. Методы оценки уреазной активности in vivo и in vitro и их место в диагностике инфекции Helicobacter pylori // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол.,

Информация о работе

Дмитриенко, Марина Александровна
кандидата технических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Диагностика инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы