Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме

Нсангу Молу Мама Дезире

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме"

На правах рукописи

Нсангу Молу Мама Дезире

ии3057Б9У

Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2007

003057697

Работа выполнена на кафедре биохимии и в лаборар нуклеиновых кислот ГОУВПО «Казанский государственны* В.И. Ульянова-Ленина»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Абрамова Зинаида Иванов: ю

доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовни (кафедра микробиологии Казане coro государственного университета, г. Казань)

кандидат биологических наук, врач КДЛ высшей категории Сатарова Лилия Ирековна, (лаборатория иммунологии клинико-диагностического цен'

»[««регионального ¡тра, г. Казань

Ведущая организация: ГОУВПО "Казанский медицине Федерального агентства по здравоохранению и социальному

кии университет развитию.

Защита состоится "22" марта 2007г. в 13ч на заседании Совета Д 212.081.08 при Казанском государственном униве^ г.Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КГУ, аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

гории биохимии университет им.

диссертационного ситете по адресу: 209.

Автореферат разослан " " февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, д.б.н.

З.И. Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Бронхиальную астму, относят к заболеваниям, опосредованным торможением программируемой клеточной гибели (ПКГ). Считается, что ПКГ при воспалениях проявляется на завершающих этапах, где ей принадлежит важная роль, поскольку в этот период происходит устранение активированных клеток иммунной системы, выполнивших свои функции. То же относится к аллергическому воспалению, при котором упомянутая элиминация эффекторных клеток к тому же затруднена в связи с их способностью к самоподдержанию. Исследования процессов ПКГ лимфоцитов при развитии заболевания свидетельствуют об устойчивости данных клеток к апоптозу, что проявляется в замедлении фрагментации ДНК этих клеток при инкубации в среде in vitro и in vivo (Melis et al., 2000, 1998; Green, Scott, 1998), что приводит к нарушению элиминации лимфоцитов из легких, а также возникновению гиперреактивности бронхов. Фрагментация хромосом - один из важных признаков ПКГ. В настоящее время биохимические и генетические исследования показали, что фрагментация хромосом является комплексным биохимическим процессом, в котором участвует группа нуклеаз с различными активностями и субстратной специфичностью. Уникальность дезоксирибонуклеаз заключается в том, что они эффективно катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи - самой стабильной из всех химических связей, найденных в биологических молекулах (Westheimer, 1987). ДНКазы имеют важное значение в процессах нуклеинового обмена и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека (Mashra,2002). «Апоптотические» нуклеазы действуют кооперативно между собой и с другими не нуклеазными кофакторами для реализации поступенчатой фрагментации хромосом и деградации ДНК. Важен тот факт, что помимо непосредственного участия в разборке погибающей клетки, апоптотическая деградация ДНК может облегчить смерть клетки и другие события, например, элиминация апоптотических клеток. Более того, некоторые апоптотические нуклеазы, видимо, могут касаться и иных аспектов развития у животных и человека, включая иммунные ответы и их нарушение. Идентификация новых апоптотических нуклеаз и анализ их функций в апоптозе и в процессе развития должна проложить путь для дальнейших исследований по раскрытию новых функций этих нуклеаз, чтобы определять скрытые связи между апоптотической деградацией ДНК и заболеваниями человека (Parrish, Deng, 2006).

Таким образом, объяснимо наше внимание к изучению свойств нуклеаз лимфоцитов, выделенных из периферической крови пациентов с атопической бронхиальной астмой (АБА), и возможной роли этих нуклеаз в индукции аутоиммунных элементов при развитии заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью работы была сравнительная характеристика ядерных и гранулярных нуклеаз лимфоцитов от пациентов с атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания.

Для достижения поставленной цели необходимо было р« задачи:

1. Выделить фракцию Т лимфоцитов из периферической

шить следующие

крови больных с

АБА и относительно здоровых доноров. Получить из них секреторные гранулы.

2. Изучить динамику структуры лейкоцитарной формул АБА с различной степенью тяжести и провести ультраструктурный анализ лимфоцитов.

3. Определить наличие нуклеазной активности в экстракте лимфоцитов методом зимографии (электрофорез в ПААГ-ДСН-ДНК) и выделить фракции цитоплазматических белков, хроматина ядер и секреторных исследуемых лимфоцитов.

4. Изучить субстратную специфичность, влияние ионо^ двухвалентных металлов и рН на энзиматическую активность ядерных и гранулярных белков.

' 5. Изучить динамику ДНКазной активности белков степени тяжести АБА.

Научная новизна

В работе исследована нуклеазная активность клеток

у пациентов с сравнительный

гранул

при различной

специфического

иммунного ответа, которые привлекаются в очаг воспалейия при ХОБЛ-лимфоцитов. Впервые установлены морфологические отлития в структуре лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и пациентов с АБА. У пациентов с интермиттирующей и легкой персистирующей астмой морфологические признаки раннего апоптоза: маргинация хроматина, выпячивания ядерной оболочки, вдавливания и выпячившия клеточной поверхности,- коррелируют с биохимическими - образованием крупных фрагментов ДНК. Установлена обратная корреляция м;жду тяжестью заболевания и количеством Т-лимфоцитов

В секреторных гранулах СБ4+Т-лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА впервые установлено наличие ДНКазной активности, которая соответствует Са2+-зависимому белку с молекулярной ^ассой 66 кДа, активность которого напрямую коррелирует с тяжестью АБА.

В лимфоцитах пациентов с АБА впервые выявлены |цве активности: Са2+,М§2+- и Мё2+(Мп2> зависимая ДНКазная активности. Причем в клетках пациентов с АБА выше Мп2+ активность, а в клетках здоровых доноров Са2+--2+ У

шя во фракциях

ионам цинка, а

,Mg -ДНКазная активность. Особенно выражены эти отли э белков, связанных с хроматином. Показано, что в лимфоцитах г ациентов с АБА с развитием болезни уровень ядерной кальций-магниевой активности падает, она становится более устойчивой к действию ингибитора -уровень М§2+(Мп2+)-зависимой активности возрастает.

Практическая значимость. Установленные особенности морфологии и количественных показателей лимфоцитов при развитии заболевания; обнаруженная грануло-ассоциированная ДНКазная активнэсть позволяет выдвигать предположение об аутоиммунных элементах развития заболевания, т.к. аналогичная нуклеазная активность локализована в секреторных гранулах Т4 и Т8 - лимфоцитах у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (Pio,R et

al., 1998). Модифицированы методы определения нуклеазной активности белков цитоплазмы и хроматина лимфоцитов здоровых доноров и при ХОБЛ, что позволяет использовать их как новые дополнительные молекулярно-биохимических маркеры при диагностике нарушений при атопических, аллергических и аутоиммунных патологиях и при постановке диагноза.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа в течение 2001-2005 гг. выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ Г/Р 01.200300073). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных результатах исследований автора.

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические изменения в структуре лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА являются отражением биохимических изменений апоптотического процесса в лимфоцитах при развитии астмы.

2. Роль ДНКазной активности в апоптозе определяется тем, что фрагментация ДНК в лимфоцитах связана с увеличением уровня содержания ионов кальция, хелатированием внутриклеточного цинка или с закислением среды.

3. Нарушение ДНКазной активности «апоптотических» нуклеаз лимфоцитов -причина торможения апоптоза лимфоцитов при астме.

4. Обнаружение Zn-независимой ДНКазной активности в гранулах Т-лимфоцитов - элемент аутоиммунного процесса при развитии астмы.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на 10 школе - конференции «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006); научно-практической конференции молодых ученых Казанской государственной медицинской академии (Казань, 2006); конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» в 2006, а также на ежегодных итоговых научных конференциях КазГУ в 2005-2006 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 175 стр. компьютерной верстки, содержит 9 таблиц, 30 рисунков. Список цитируемой литературы включает 250 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров (15) и больных атопической бронхиальной астмой (66) (мужчины/женщины: 41/25; возраст ± SD:31±15). Диагноз атопической формы БА ставился на основании данных аллергического анамнеза, результатов кожных проб с бытовыми, эпидермальнымии, пыльцевыми аллергенами, провокационных назальных и ингаляционных тестов. Стандартное исследование периферической крови (общий анализ с

лейкоцитарной формулой) проводили в лаборатории пульмонологического отделения РКБ МЗ РТ г. Казани.

Лимфоциты из периферической крови выделяли методом равновесного центрифугирования (Ра1е1 Б е1 а1., 1995) в растворе фиколл-верографина (р=1.077 г/см). Суспензию лимфоцитов собирали и промьвали в растворе Хенкса. Рабочая концентрация лимфоцитов содержала 2x10'

Ультраструктурное исследование проводилось центрифугированием лимфоцитах, которые последователь»!) фиксировали в

клеток в 1 мл. ija осажденных

2,5%-ом глутаровом альдегиде на 0.1М Na-фосфатном бу

1%-ом растворе OsC>4 в течение 1 ч. Полученные образцы заключали в Эпон-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция) на электронном микроскопе Hitachi HU-125E.

Получение белковых фракций хроматина. Для полз фракций хроматина и цитоплазмы лимфоцитов испо фракционирования белков хроматина, основанный на диссоциации цитоплазматических и ядерных белков в возрастающей ионной силы (Георгиев и др., 1969). В ступенчатом увеличении ионной силы раствора диссощ определенные фракции белков. Для диссоциации использовали 0,01, 0,15, 0,4 М

раствора NaCl в 0,01 М трис буфере, pH 7,2 (Беляева и др., 197 Экстракция цитоплазматических гранул лимфоците

фере (pH 7,2) и

и просматривали

чения белковых льзовали метод последовательной растворах ЫаС1 результате при ируются только

Р)-

в. Секреторные

гранулы из лимфоцитов выделяли методом описанным в работе (Podack et al.,1984) на градиенте плотности перколла. После разрушения лимфоцитов и центрифугирования получали "постядерный" суперш тант, наслаивали на градиенте плотности перколла ( центрифугировали при 19500 об/мин в течение 35 мин (Ве Перколл удаляли из фракций центрифугированием при течение 2,5 ч, при этом изперколла формировался плотйый осадок, над которым располагался беловатый слой надосадка содержаи его секреторные гранулы.

Получение плазмидной ДНК pBR 322. Для амплификации ДНК pBR 322 использовали бактериальную культуру / Eschericha coli Hb 1С 1 бактерий, их лизис, выделение и очистку проводили по методу (Маниатис, 1984). ДНК pBR322 очищали от РНК гель-хроматографией на колонке Sepharose CL-4B.

Специфичность отношения нуклеаз лимфоцитов ко вторичной структуре

который э=1,080г/см) и eckman SW41Ti. 45000 об/мин в

ДНК изучали электрофорезом в 0,7 % агарозном суперспиральную ДНК рВЯ 322 и регистрируя переход формь|[ (открытое ковалентно-замкнутое кольцо) до формы III Концентрация белка-фермента в исследуемых фракциях составляла 0,3-0,5мг/мл. Реакцию останавливали добавлений содержащей: 10% ДДС-Ыа / 0,1% БФС / 50% глицерин проводили в горизонтальном направлении на пластинках раз*

геле используя I через форму II ([линейная ДНК), уравнивалась и ¡м 2 мкл смеси, а. Электрофорез [еры 10x10x3 мм

при силе тока 4 мА/см в течение 1,0-1,5 ч при 20°С. Гель регистрировали на видеосистеме для регистрации гелей "DNA Analyzer" (НПФ "Литех", Россия).

Ферментативную активность исследуемых белковых фракций определяли по приросту продуктов гидролиза ДНК (Белова и др., 1970). Активность выражали в спектрофотометрических единицах увеличения кислоторастворимых продуктов при гидролизе нДНК или дДНК при длине волны 260 нм за 60 мин инкубации при 37° С на 1мг белка (удельная активность) или на 1 мл ферментного раствора (общая активность).

ДНКазную активность в белковом экстракте гранул лимфоцитов определяли по способности гидролизовать геномную ДНК- морского ежа. Реакционная проба объемом 50 мкл содержала: 25 мкл нДНК (50 мкг/мл) / 15 мкл 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5) / 5 мкл различных активаторов (Са2+, Mg2+, Мп2+или Zn2+), 5 мкл экстракта гранул (0,35мг/мл). Для количественного определения ДНКазной активности и сравнительного анализа результатов, гели были сканированы и обработаны с помощью программы «Scion image» (Pió et al., 1998). Активность выражали как индекс фрагментации (F.I, %).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) Электрофорез белков в 10% ПААГ с ДДС-Na вели по методике Лаеммли (Laemmli, 1970). Молекулярную массу определяли в присутствии 0,1%-ного ДДС-Na. Электрофорез проводили при комнатной температуре при силе тока 10мА до внедрения проб в концентрирующий гель, концентрирование белков проводили при 20мА. Основной режим - 40мА, продолжительность электрофореза 2 часа.

Обнаружение ДНК аз в ПААГ-SDS-IIHK. Для приготовления геля ПААГ-ДНК 20мл 10% ПААГ смешивали с 1мл раствора ДНК до конечной концентрации ДНК в геле 20 мкг/мл. Гель после электрофореза промывали в дН20 и в буфере (1мМ №2ЭДТА / 40мМ трис-HCl рН 7.6 /2мМ MgCl2). Для активации нуклеаз, находящихся в геле, последний помещали в инкубирующий буфер (10 мМ трис-HCl рН 7,6/ 1мМ СаС12/ 50мМ NaCl2/ 10 мМ MgCl2), выдерживали 18-24 ч при 37°С, затем добавляли этидиум бромид. Результаты реакции регистрировали при помощи видеосистеме для регистрации гелей "DNA Analyzer" (НПФ "Литех", Россия).

Математический анализ полученных результатов проводился на персональном компьютере с использованием пакета программ "Excel (Microsoft office 2003)". Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса и Т-критерия Манна - Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя точный метод Фишера. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена- rs

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Особенности морфологических и количественных показателей лимфоцитов периферической крови при развитии атопической астмы

Патогенез АБА определяется, как специфический воспалительный процесс в бронхиальной стенке, в котором эозинофилы, макрофаги и Т-

лимфоциты играют центральную роль. Если Т-лимфоци-ы при развитии аллергических реакций, после выполнения своей функции не элиминируются путем апоптоза, это приводит к возникновению аутоиммунного заболевания, обусловленного присутствием в данной системе зрелых аутореактивных лимфоцитов. Следует отметь, что при АБА большинство Т-лимфоцитов, инфильтрованных в дыхательные пути, также не апоптозируются, при этом предполагается, что стойкость воспаления дыхательных путей зависит от повышенной выживаемости лимфоцитов в слизистой бронхов (\Ч£По1а .е!а1.,1999).

В связи с этим важна количественная и морфологически характеристика лимфоцитов периферической крови у больных с АБА различной степени тяжести.

Так как число лейкоцитов в крови отражает состояние защитных сил организма, мы изучили показатели общего анализа крови у здоровых доноров и пациентов с АБА и проследили изменение форменных элементов крови. Их уровень наглядно позвол не только каких лейкоцитов много, а каких мало, НФ

содержания яет представить, и помогает в

определении степени тяжести заболевания. Например, в норме

содержание лимфоцитов в крови взрослого человека сос всех лейкоцитов, а одной из причин повышения числг. абсолютного лимфоцитоза - является развитие брою (Соколова,! 998).

тавляет 25-35% лимфоцитов -иальной астмы

Таблица 1. Количественный анализ содержания лейкоцитов в периферической крови

больных АБА.

Лейкоциты: АБА 6,18x10% N » 6,3х109 /л

Содержание форменных элементов, в % от 2 количества лейк эцитов:

при АБА в норме (Г>. )

лимфоциты 27.3 30 4-

нейтрофилы 63.5 59 Т

моноциты 5.7 6,6

эозинофилы 4.6 2,5

В настоящей работе показано, что при лейкоцитов в крови в среднем составило 6,18x10

АБА

Об

содержание лейкоцитов в группе больных было связано количества лимфоцитов и моноцитов. Содержание эозинофилов было выше у пациентов с АБА по сравнени донорами (табл.1).

По некоторым данным для диагностики АБ.

лейкоцитарной формулы не обязательно, так как оно показано только при

| цее количество

примем пониженное

с уменьшением яейтрофилов и о со здоровыми

определение

подозрении на вторичную инфекцию. Тем не менее.

структуры лейкоцитарной формулы, в данной работе были установлены

при изучении

особенности в изменении количества форменных элементов крови в зависимости от тяжести астмы (табл.2).

Таблица 2. Изменения структуры лейкоцитарной формулы периферической крови пациентов с АБА в зависимости от тяжести

Степень тяжести Интермит-тирующая,% Персистирующая, %: N. % Р

легкая средняя тяжелая

Клетки :

лимфоциты 28,8 37,8 25,4 17,3 30 0,05

нейтрофилы 61,9 52,4 65 74,6 59 0,04

моноциты 5,9 4,5 6,5 5,8 6,6 1 0,3

эозинофилы 3,7 5,4 4,8 4,3 2,5 Т 0,26

Математический анализ этих результатов показал, что по трем из четырех параметров лейкоцитарной формулы динамика изменения форменных элементов крови в зависимости от тяжести АБА достоверна (р<0,05). При этом обращает на себя внимание падение количества клеток при повышении степени тяжести заболевания (рис.1).

Далее мы изучили взаимосвязь уровня содержания лимфоцитов в периферической крови в зависимости от тяжести заболевания с использованием непараметрического Т- критерия Манна-Уитни и соответствующих структурных единиц (медиана и перцентили).

Рис. 1. Изменение количества лимфоцитов в зависимости от тяжести АБА.

В результате установлено, что различия в количестве лимфоцитов между легким и тяжелым персистирующими течениями АБА достоверны на уровне значимости 95% (р = 0,05) (рис.1).

С помощью методов корреляционного анализа было установлено, что в обследованной группе пациентов с АБА существует обратная корреляционная зависимость между количеством лимфоцитов и степенью тяжести заболевания (г = - 0,3, р =0,04) (рис.2.). Связан - ли факт снижения количества лимфоцитов в крови с апоптозом или с действием цитотоксических Т-лимфоцитов, которые могут уничтожать другие субпопуляции Т-клеток?

Рис.2. Обратная яционная мость между еством

цитов в

ерической крови тью течения

Чтобы ответить на данный вопрос, мы изучили ультраструктуру лимфоцитов на разных стадиях заболевания (рис.3).

Электронно-микроскопический анализ структуры лимфоцитов

Из полученных данных следует, что клетки здоровых и больных доноров имеют различную морфологию. Причем, выявленные изменения в морфологии клеток больных с АБА, по-видимому, обусловлены апоптозом.

Лимфоциты у больных АБА с интермиттирующим течением имеют признаки апоптотических клеток (рис.3,Б). Ядра приобретают лопастной вид, обычно далее происходит его коллапс и распад на микроядра. В клетках обнаруживается маргинация хроматина, сущность которой заключается в концентрации хроматина по периферии ядра в виде полусфер или глыбок. На клеточной поверхности появляются вдавливания и выпячивания. В лимфоцитах больных с тяжелым персистирующим течением АБА (рис. 3,в) обнаруживаются довольно глубокие вдавливания ядерных мембран, происходит фрагментация ядер и обнаруживаются фрагменты ядра, ограниченные мембраной внутри клетки. Среди тонких ультраструктурных изменений, характерных для поздних стадий апоггтоза, обнаружено изменение цитолеммы и поверхнос тных структур. В первую очередь утрата микроворсинок и десмосом. На отдельных клетках появляются выпячивания и пузыри на мембране - блеббин и. Нет четко видимых мембранных структур клетки - однако, наблюдаются крупные вакуоли. Но целостность мембран самих лимфоцитов не нарушена.

Следует отметить, что большинство изученных электронно-микроскопических образцов лимфоцитов пациентов с тяжелым персистирующим течением АБА имели подобную морфологию.

Таким образом, среди исследованных образцов было обнаружено довольно много клеток, с признаками позднего апоптоза, но не р клавшихся на апоптотические тельца, что может быть свидетельством нарушения биохимического (т.е. нуклеазного) состава лимфоцитов.

Рис.J, V-[i> [растр} ктура .¡нмфопи юн крови злоровых доноров (Л), вациентов с интермитгиругащей (К) и тяжелой перс тиетирующей ЛЬ A i В).

2. Характеристика куКлеатого состава лимфоцитов

Морфологические преобразования в лимфоцитах, обнаруженные и процессе развития заболевания, выражены в разной степени распадов внутриклеточный компонентов. Одно из основных проявлений апоглоза на б и ох им и ческом уровне в ядре клетки состоит по фрагментации ядра {Егорова. 20011 Сначала происходит образование крупных фрагментов, содержащих, примерно. 300 т. п, о., несколько позже - 50-30 т. п.О. Результаты этих биохимических процессов коррелируют с морфологическими признаками:

конденсация хроматина, выпячивания ядерной мембраны и др. Полагают, что именно тгот начальный этан фрагментации хроматина является ключевыч, после которого процесс становится необратимым {Погорелов . Козииен, 1995Следующий этап фрагментации ДНК - межнуклсосомпая деградация. при которой образуются фрагменты 180-200 и.о. Обычно они выявляются к виде «лесенки» при электрофорезе (Казанежа, ] 478).

Рис: 4. Электрофоре:рамча ДНК ичЛимфоцитов пациентов с АЬА ра!.1ИчнпЙ степенью гяжести. 1 -ДНК pBR."i22: 2- хромосомная ДНК морского ежа: з. 4. 5 хромсомиая Д]1К ядер лййфошнпв . на шггермн гнр\ гашеЛ. легкой перс истиру(ОШей й тяжелой перепетирующей ЛБА. соответственно: 6. 7 - DNA WHindlH и DN'A-lsddeg соответственно. Электрофорез а ]%-о>,| агарознпм геле. 3.5ч при напряжении 40 В Шина геля 10см у,

I 1ояаление таких фрагментов ДНК обеспечивается активацией Ca . Mg -зависимой эн дону кде азы, и как считает автор работы, только после межнуклеосомной деградации ДНК аноптоз в норме вступает в необратимую фазу и образуются апоптотичеекие тельца.

В данной работе при исследовании структуры ДНК, выделенной из ядер лимфоцитов периферической крови пациентов с ABA. которые имели характерные морфологические изменения апоптбти чески х клеток, четкой фрагментации ДНК в виде «апоптотичеекой лесенки» обнаружено не было (рис. 4). Из представленного рисунка следует, что только у пациентов с интермнпирукнней АБА и ядрах лимфоцитов обнаруживаются фраг мспгы ДНК длиной около 1000 п.о. В ядрах пациентов с персистируюшей АБА такой картины не наблюдали. Осуществление различных этапов деградации ДНК нри айолтоте связывают с проявлением активности разных ферментов, поэтому мы предположили, что происходит нарушение функционирования нуклеаз . [имфоцитов при развитии АЬА, что может приводить и к торможению межнуклеоеомной деградации ДНК,

В связи с недостаточность*© информации среди дос гулцых нам литературных источников по этому вопрос;, мы йровели сравнительный анализ нуклеазно! о состава лимфоци тов относительно здоровых доноров и пациентов с астмой.

ДМК рВГ<322 была использована для изучения взаимодействия ДНКазы лимфоцитов со структурными формами (рис.5).

г-.........■ ■■ ■—......................■-------'

Pitt 5. РаеШеплЖие ДНК pBR 322 ауклеазоЙ лимфоцнтои i¡ присутствий ионов С'а' и !y[g" ! „ суперспиральная. !1-кольцевая. III —в ** »♦ - ^ линейная формы нлазмидной

П ДНК.

О ] 2,5 5_10 20 40 60 - мин

Как следует из рие,5 ДНКаза лимфоцитов здоровых доноров расщепляет полученную "сунерспиальнукг' ДНК (I форма) до "открытого" кольца (!! форма) уже в первые минуты реакции, через 60 мин молекулы линейной ДНК полностью гидролизованы.

При изучении взаимодействия ядерных и цйтоплазматических белков лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА с п л ал ми д ной ДНК установлено, что характер расщеплений изменяется: активность снижается и через 20 мин не только не обнаруживается линейная ДНК, но и остается су i lepen и рал ь пая Д1IK.

Анализ нуклеазйой активности белковых экстрактов из лимфоцитов крови пациентов е АБА метолом зимографии в присутствии ионов Ca" и Mg" выявил две основные активности (рис.6): среди цитоилазматических белков в области 29 к Да, среди ядерных белов, примерно. 40 кДа. которые отличались от юны активности очищенной ДНКаЗЫ i. С ионами Мп~" в данных условиях выявлена небольшая зона активности, примерно. 3! кДа. На денатурированной ДНК в данных условиях нуклеазяой активности среди белков лимфоцитов обнаружено не было, кроме зоны активности ДНКазы L Результаты зимографии (рис.6) в денатурирующих условиях, показывают. что обнаруженные в цитоплазматнческих и ядерных белках нуклеазные активности являются мономерными пептидными цепями.

11рй исследовании кат ионной зависимости инкубация цитоплазматнческих и ядерных белков в среде с различной комбинацией ионов Mg" . Mit" и Ca" показала, что в обеих фракциях проявляется Mg" -зависимая активность, которая усиливается, примерно, в 2-3 paia в среде с ионами Мп" Эн зиматическая активность цито плазматических белков (при равной

концентраций по белку) была выше активности ядерных белков ^нмфоцитов. Добавление ионов Са?' в инкубационную среду с Mg"" или Mrf приводило к повышению активности (рис.7).

Л'а до р ОЖК Активаторы J.

Мн (ÄM)

Ca;Mg(l;50 мМ> Zu (ImM)

+ 4- -

бЗКДа— §|gV,v,

W-" -ms.

.. .:• - v - "

Г ■■ ■ «И

ДНКал 1 29 КДа

- *

Ж -

к -, . TV .

—-

№ дорожки Активаторы | 1 2 3 4 & 6 7

Мп (25мМ) — — — — — + +

Cn:Mgil;SO мМ> + + + + + — _ !

Zu (1мМ | — + — + — I

40 КДа--

ДИКаза 1 -

Ijhc,6, Активность питиилазмэтических (А) и ядерных (В] белкой лимфоцитов пациенте» с ДВА. Дорожки 2. 3. 6 - ле1 кая. лорояжи 4. 5, 7 - гяж^лая персистируюшая АБА: " >л-.'К]рс,форе( л ПААГ-ДДС-нД1 Ж.

ар ьм <р=. С-й Лечсй те^.зи^е

Тр*егос течений

Рис.7. К;м ионная швисимоетъ ДВКазмой актив ноет Склков лнмфошлов лйр кфери чеевдй крови пяииентоя с ЛЬ А. (ф р.0.11 - иф'оп.шяяатяческис ое.жи. (фр:ОЬ -белки чромаюна.

Нуклеазпые активности белков лимфоцитов кропи при тяжелой переистирующей астме и йшбйро вались присутствием ионов Zn' (риШ?), В среде с ионами У^ в 3-4 рача. а в среде с ионами Мп" в 15 раз.

ь ао

I»] |

2. 15 9

« 10 -

фр С О1

летное ?ечен/е

.а.«.

Фр 0 01 | ов з тяжелое -^ечсиле

Фр.ОЛ)

Фр, од

I т

V £ 1£-ч

I 1

|М£1 [ 0.4

*р ... С: | мI

Т. 1 ■: Г. ЗЬЧНН«

Рис.8, Щияйане Zn "" на уровень нуклеазной активности лимфоцитов крон» с \ЬА

Следует отметить, что результаты реакции показывают, что при тяжелой астме ядерные белки менее чуве ¡пепельны к сипергичесхом) действию полов Мё:'(Мп" )и Са: .

Гаким образом, н данной работе были выявлены лве нуклеазные активности - Са~ Л%" - (штоплаэматическая, мол. м. — 29 к Да) и М{Г (Мп" )-зависимая (ядерная, мол. м. - 40 к Да), которые чувствительны к наличию в

среде ингибитора (.ионов Zn ). особенно М|[ (Мп" (-зависимая активность при тяжелой персисгнрующей астме.

Лимфоциты периферической крови пациентов е тяжелой перс и старую щей астмой характеризуются серьезными морфологическими изменениями структурных компонентов по сравнению с клетками здоровых доноров и пациентов с иптермитгирующей ДВА.

Ипгибиругощее действие ионов цинка на белки лимфоцитов с признаками апоптоза может быть связано с данными, что ионы цинка способны блокировать межнуклеосомную деградацию ДНК. По данным литературных источников на апоптотическнх клетках показано, что пуклеаза, которая способствует межнуклеоеомиой деградации ДНК - это Са .Мв" зависимая активность, а продукты деградации более ранних этапов апотоза (фрагменты ДНК в 30-300 т.и.о.} - результат работы М«~ -зависимой активности {ОЬегКашшег « а1., 1993).

В этой связи обращает на себя внимание апоп готическая ДНКаза-гамма, обнаруженная и выделенная из ядер тимонитов крыс (мол. м.ЗЗ кДа), для работы которой требуются одновременно ионы Са-* и причем эта

потребность частично подавляется ионами Мп (Шцапн е1 а!, 2003).

В данной работе был обнаружен высокий уровень проявления Мп-завиеимой активности на легкой стадии АБА и высокий ответ энзиматической активности при кальций-марганцевом синергизме.

Рис.9, "Электрофореграмма изменении ДНКазной активноеги белковых фракций в присутствие ионов лвухпалентных Ме"т: Ca.Mg"*: Mir. Дорожки: 1.2.5.6 пито плач маги чес к и с белки; дорожки; 4.7. К-ядерные белки.

Ото позволяет предположить, что при развит ии АБЛ в лимфоцитах, выполнивших свою функцию происходи]■ нарушение в функционировании Са*' и Mg' - зависимой активности, в результате не происходит м е ж н у к леосомя ая

Активаторы*!' К

| (1тМ:50гоМ) .1 Мп'". (23тМ)

'¿,Щ

am - Е.5Е7-

Sflfi- «««¡j шт

23.13

отар! ш

течение АБА

Леткое

Тяжелое

деф^дация ДНК » гакщ лимфоцитах., ню приводит к торможению анотоза этих клеток.

J Ï 4 г i Т J Î tXHE Ullj M; СьЯе Я; С«Л[ 4S Л.Т Т,Т Л.Т Т.Т

Фц.Ш

S У

Рис. 10. Изменения -)н!има1 и ческой активности белкой лимфоцитов крови » i n от гяжссти ,>\.

Как следует из следующего рис.10, соотношении Между кальций-магниевой и марганцевой активностями среди цитоплазматических белков, ¡¡с зависимо от тяжести АБА, примерно, одинаковое 1.03 к O.S. соответственно. Срели ядерных белков дисбаланс и уровне кальций-магниевой и марганцевой активностями изменяется в сторону повышения марганцевой активности. При легкой степени астмы уровень активности по индексу фрагментации выше, примерно, на 20%, а при тяжелой астме уровень марганцевой активности повышается более чем в 3 раза.

Следовательно, можно предположить, что Mg" (Мп )-активйость может подавлять активность Ca^.Mg" -зависимой активности, что ведет к торможению межнуклеосомной деградации ДНК

Дезок^ирибонуклеа^Ь) секреторные гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА

Изучение нуклеазпо! о состава гранул связано с ролью этих нуклеаз в развитии заболеваний, характеризующихся нарушениями в иммунном ответе. Имму иная система атакует аугологичеекие ткани, привода к глубоким

изменениям, В этом случае ткани инфильтрируются ! -лимфоцитами, некоторых и) них с цитото ксичес Ш й активностью (цитотокс и чес ки е Т-лимфошед'. 11ТЛ>, что дри водит к Опосредованному ауто ийруиному заболеванию.

Лимфоцит-опосредованный цитолиз связывают с работой специфической нуклеазной активностью нитото ксичес к и л клеток (Pió, R. et.ai 1998.). Эта кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Са"' и ишибируетея 7.п" . специфична К лнДНК.У больных рассеянным склерозом данная нуклеазная активность повышается и становится чувствительной к оксиду азога. но теряет чувствительность ионам цинка.

Некоторые моменты при развитии астмы и орган-специфических аутоиммунных заболеваний (например, инфильтрация лимфоцитов в оча!е заболевания) подвели нас к изучению нуклеазной активности секреторных гранул лимфоцитов крови пациентов с ЛБА.

Как следует из рис. И в гранулах здоровых доноров к больных с АБА обнаружена С а' и Мс" зависимая ДНКазная активность, которая различается по степени активности как в норме и при патологии, гак и при лерсистеицин воспаления.

ДНКазную активность в белковом экстракте гранул лимфоцитов определяли по способности гидролизовать геномную ДНК- морского ежа в буферной системе при рН 7,5 б присутствии ионов Са"" и Mg:' и установили , что активность, выраженная как "индекс фрагментации", была обнаружена как в клетках здоровых доноров, так и пациентов с АБА (рис.11). Индивидуальные показатели различались разбросом, вероятно, отражая иммунный статус заболевания каждого пациента.

(В)

£ 40

Ь 35

\ а

I п

■9»

í ÍD й

§ 15

I 1С Н ч

1 5

З.Д, ¡лежое д.евяег таяетде

Кктерзишрук-щее перше трущее тггенкяДБА

?т> ■ 1- ДНКазная активнеегь в гран\;шх лимфоцитов пациентов с ЛБА и члоровото донора, (F.i) . " —■" -среднее значение для каждой группы.

Чтобы убедиться, чго ДНКазная активность присутствует в белковом экстракте гранул, выделенных из лимфоцитов и определить ее молекулярную

Электрофорез к ПЛЛГ-ДСП с чагтолимери'ювамной

Д11К.

1 - белковый экстракт гранул;

2 -белки нитоття ©гранул;

2- ДНКа ¡а 1 мол.масса 31 к Да.

— 68000 Да

1 2 3

45000 Да

29000 Да

1 - белковый же факт гранул на

и нгермйт и ру ю и ¡ей стадии;

2 - белковый экстракт гранул на переистирукчцей стадии:

3 - маркеры : й8кДл-КСЛ, 45кДа-ЯЛ, 20кДа-

ка рбойнййд рача: (окрашивание нитратом серёбра):

Рис. 12. ()прсдйленнс нуклеашой аюиниости гранул методом 'шмо! рафии в 11АА1 '-ДСН-нДИК [еле (Л) н ее йилекулярНйВ Мпссы (К).

массу, мы использовали высокочувствительный меюд "пиеКл^е ¿улхщгап'Г, то есть визуализировали реакцию в геле I¡ААГ'-ДСН. содержащем ДНК. (рис, I Г.. ). Как следует из рисунка в геле с нДНК была обнаружена одна полоса на дорожке 3 С ДМКазой! (мол. масса 3 ! кДа) и одна широкая полиса на дорожке ! с белковым экстрактом гранул, с большей молекулярной массой. Окрска геля позволила показать, что полоса состоит из двух близко расположенных полос менее интенсивной с мол. массой 68 кДа и более выраженной -66 к Да, В геле с денатурированной ДНК - активисть не была выявлена, Нуклеазная активность определялась в образцах секреторных гранул лимфоцитов крови е интермиттируюшей и персистирукзщей астмой. I !ри определении физико-химических свойств обнаруженной ДНКазной активности, мы изучили кат ионную зависимость, влипие ингибитора 1/.п~ ) и рН средь!. Данные параметры определялись в лрапаратах, полученных из гранул лимфоцитов пациентов с различной степенью тяжести астмы.

ДНКазная активность гранул при всех степенях тяжести повышалась, когда в икубациоиную среду при рН 7,5 добавляли Са" .

(К1

<■* 50

Iх

£ та

н ю

= о

с< (мм» ил 1 1л дао

ол

12 часов

Рис, 13, Кат и о н пая зависимость активности ДНКаз. Ьелковый экстракт гранул лимфоцитов здоровогп дояфра (А) и больно™ ЛБА с тяжелым персистярукипим течением (К| инкубировали с натшшой Д1 !К (40 мк: мл) в 20м М грнс-НС1-буфере. рН 7.? 50мМ М^" . И каждую проб; лобав.тнли соответствующие кон цен грации иолов Са* и 7л' . Время реакции; (А) 6 часов. (Б) 12 часов.

Рис.13 показывает фрагментацию ДНК типичного эксперимента, в котором использовали белковые экстракты здоровых доноров и пациентов с

501

— -

1 зо ■

с го •

С» (мМ) ОД

Время реакции: б часов

тяжелой формой астмы. Этот эксперимент проводили пять раз и во всех случаях высокая степень активности была при добавлении 1 мМ Са2+. Добавление 1 мМ 7х\* приводило к ингибиции энзиматической активности, причем у здоровых на 73%, а у пациентов с тяжелой формой астмы на 45%. Выяснили, что при легком течении заболевания ДНКазная активность снижена по сравнению с тяжелым течением. Добавление 2п2+ ингибировало энзиматическую активность, примерно, на 50% в обоих случаях.

Таким образом, следует отметить, что ингибирующее действие ионов цинка ослаблено при персистенции астмы по сравнению с контролем (относительно здоровые доноры).

Нами была проведена серия экспериментов по изучению зависимости ДНКазной активности белковых экстрактов гранул лимфоцитов крови пациентов с легким и тяжелым персистирующим течением астмы от рН (рис.14). Фрагментацию ДНК определили при значениях рН 8.0, 7.0, и 5.0 в присутствии только ионов М§2+ (Рис. 14.А) и в присутствии ионов М§2+ и Са2+ (Рис.14.Б). Для каждой пробы определяли количественный уровень активности в виде "индекса фрагментации (рис.14). ДНКазная активность ассоциированная с гранулами лимфоцитов крови пациентов с разной степенью тяжести заболевания повышалась при закислении среды и добавления ионов кальция.

Рис.14. Влияние рН на ДНКазную. активность гранул лимфоцитов больных АБА на легкой персистирующей (А) и больных АБА на тяжелой персистирующей стадиях (Б). Активность выражена как "индекс фрагментации" (Р.1) ■ - ионы Са 2++М82+>-ионыМ82+.

На тяжелой стадии при общем повышении активности на фоне подкисления среды, максимальный "индекс фрагментации" был отмечен при рН 7,0.

Не исключено, что это связано с проявлением ДНКазных активностей, поэтому мы изучили изменение активности белкового экстракта гранул при добавлении ионов Мп2+. В ходе эксперимента установлено, что в присутствии ионов Мп2+ ДНКазная активность белкового экстракта гранул ниже. Однако добавление ионов Са2+ в инкубационную среду с Мп2+ приводит повышению

активности как на легкой, так и тяжелой стадии на 121,6 и 105,4 %, соответственно, то есть в присутствии ионов марганца активность более чувствительна на повышение кальция в среде.

« щ

Ьэо

5 К

* 211 а

? 15

I 1а $

■л*

■

а б

а б а б

а -легкая, 5 - тяжелая персистирующая степени тяжести АВА,

Ионы:

Степень Мп" МЙ^ Мп+Са

тяжести! Индекс фрагментации (РЛ, %);

легкая 12,5 16,0 27,7 19.4

тяжелая 20,3 23,5 41,7 31,4

Увеличение Р.1.,% на

62,4% 46,0% 50,5% 61,0%

• «V. ЖъУ, л. и^ИЛ V*1/ VI

фрагментации (Б) при развитии заболевания.

СаД^

Са^+йп

: 21) I Времн реакции лнн Лкшн'пфы

Легкое течение

Тяже .тле течезше

Стелешь псигтн

Степень тяжести—» Легкое течение Тяжелое течение

Ионы-> Саг\Щ1+ \ Са^МЁ^+гп" Са'М^+гп'"

№ дорожки I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ¡1 12

Время , мин 0 60 120 0 60 120 0 60 120 0 60 120

Форма К % % % %

д н К 1 68 65 21 8 67 30 10 60 10 65 48 31

иг 15 19 4 10 21 28 7 11

11 32 35 64 73 33 66 80 | 40 69 72 35 45 58

Рис.16. Влияние ионов Йг на активность грану я-ассоциированных нуклеаз, К-еубетрат до реакции.

По результатам рис.15 можно предположить,что при развитии тяжести заболевания происходит повышение гранулярной Мп2+-зависимой активности (индекс фрагментации повышается на 62,4%) и Са 2+и М£2-зависимой активности (на 61%).

ДНКзная активность в основном гидролизует плазмидную ДНК до кольцевой ДНК, активность проявляет устойчивость к действию ионов Zn2+ (рис.16).

Таким образом, показано, что в секреторных гранулах лимфоцитов локализуются ДНКаза, которая соответствует Са2+-зависимому белку с молекулярной массой 66 кДа. Активность этого белка повышалась при использовании дцДНК в заполимеризованной в геле. При использовании в качестве субстрата плазмидной ДНК pBR322 показано, что в ДНКаза произвидит одноцепочечные разрывы и не чувствительна к ионам Zn2+, как ингибитору.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы многими исследователями доказано, что нарушение ПКГ (апоптоза) может играть определенную роль в развитии воспаления дыхательных путей при атопической бронхиальной астме (Невзорова и др., 2001). Гиперактивация С04+-Т-клеток в периферической крови и тканях дыхательных путей служит важным патологическим критерием респираторных аллергозов, поэтому значительное накопление активированных лимфоцитов, возможно, является следствием ингибирования процессов апоптоза. Однако механизмы устойчивости лимфоцитов к апоптозу до конца не раскрыты.

По данным литературы уже описана экспрессия ДНКазной активности ассоциированной с цитоплазматическими гранулами в активированных CD4+-Т-лимфоцитах после инкубации РВМС из здоровых доноров в присутствии иммуномодулирующих пептидов. Описано несколько эндонуклеаз в различных клетках, некоторым из этих нуклеаз отводится роль во фрагментации ДНК при апоптозе. Индукция этой активности в активированных С04+-лимфоцитах человека и участие Т-клеток в аутоиммунных заболеваниях (Pió et al., 1998) натолкнула нас на изучение нуклеазного состава лимфоцитов и, в частности, на изучение возможного присутствия гранул-ассоциированных ДНКаз в Т-лимфоцитах крови пациентов с АБА.

В данной работе впервые показано, что помимо повышения ядерной Mg2+(Mn2+)-3aBHCHMoñ активности, деградирующей ДНК-клеток только на крупные фрагменты (до 30 т.п.о.), (что может способствовать торможению межнуклеосомной деградации ДНК и, как следствие, торможению образования апоптотических телец), Т4-лимфоциты из периферической крови больных атопической астмой различной степени тяжести содержат белки с ДНКазной активностью в секреторных гранулах. Эта гранул-ассоциированная ДНКаза соответствует кальций-зависимому белку, активность которого выше при кислом рН и при использовании дцДНК, обнаруженному группой Lopez-Moratalla N. (1998). Хотя еще не ясна роль этой ДНКазной активности, можно

предположить, что это еще один цитолитичеекий фактор. Эта мысль согласуется с идеей, что экспрессия энзимов содержащихся в секреторных гранулах может быть ассоциирована (Henkart, 1994) с цитолитическим потенциалом Т-лимфоцитов, и что цитолитичеекий механизм ЦТЛ связан с активным трансфертом ДНК-фрагментирующего цитотокси1 еского фактора в клетки-мишени. Можно предполагать, что описанная на^и активность(ти) участвуют не только во фрагментации ДНК в клетках мишешх, но и в апоптозе самих Т-лимфоцитов. Это предположение совпадает с наблюдениями, что в тимоцитах паралелльно с увеличением концентрации Се2+ и связывания внутриклеточного Zn2+ (Мамонтова, Кайдашев, 2004; Oshimi et al., 1995; Ring et al., 1994) происходит увеличение фрагментации ДНК как слег: ствие закисления. С другой стороны, показано, что ЦТК могут быть вовлечен ы в повреждения тканей-мишеней. Например, гранул-ассоциированная ДНКазная активность CD4+(Pio et al., 1998) повышена у больных циррозом печек и, эта активноеть была ниже у пациентов с болезнью Гравса, что коррелирует с более глубоким (при циррозе печени) иммунорегуляторным расстройством. ДНКазная активность была еще ниже у пациентов с рассеянным склерозом. В данной работе также была обнаружена определенная динамика изменения нуклеазной активности при развитии тяжести астмы. Таким образом, обнаруженные активности могут играть определенную роль в протек; аутоиммунных заболеваний, но и при АБА. На роль аутоимм; шита в патогенезе астмы и атопии через функционирование Т-лимфоцитов указывали Urboniene et al., 2005; Epttem et al., 2002; 1997; De Jong et al., 1997; Chau-Chin^ et al., 1996.

В плане дальнейшей работы по данной теме предан ассоциацию данной активности с Тх/Тс- клетками, т.к. лим4 мишенях при атонических и аллергических заболеваниях и хелперов, среднее соотношение CD4/CD8 составляет 7:1 (Курчшко, 2002). И в их дисбалансе видят одну из причин персистирующего воспаления

шагается изучить оциты в органах-неют фенотип Т-

крови доноров с Г-клеток. улы у доноров с э заболевания и

копии выявлены

ВЫВОДЫ

1. Получена фракция лимфоцитов из периферической АБА и относительно здоровых доноров на 95%, состоящая из

2. Изучена динамика структуры лейкоцитарной форм АБА. Установлена обратная корреляция между тяжесты количеством Т-лимфоцитов (г= -0,3; р=0,04).

3. Методом трансмиссионной электронной микрос морфологические отличия в структуре лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и пациентов с АБА. У пациентов с интермиттирующей и легкой персистирующей астмой морфологические призн хроматина, выпячивания ядерной оболочки, вдавливания клеточной поверхности,- коррелируют с биохимическим крупных фрагментов ДНК).

4. Методом зимографии с использованием заполимер изованной нДНК обнаружены нуклеазные активности в цитоплазматических (29кДа) и в ядерных

аки: маргинация выпячивания и (образованием

(40кДа) фракциях белков лимфоцитов. Установлена обратная корреляция между тяжестью астмы и нуклеазной активностью.

5. Показано, что с развитием болезни уровень ядерной кальций-магниевой активности падает, она становится более устойчивой к действию ингибитора - ионам цинка, а уровень \^2+(Мп2+)-завнсимой активности возрастает.

6. Установлено наличие ДНКазной активности, ассоциированной с секреторными гранулами лимфоцитов, которая соответствует Са2+-зависимому белку с молекулярной массой 66 кДа, активность которого коррелирует с тяжестью АБА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Нсангу, М.М.Д. Ядерные и гранулярные нуклеазы лимфоцитов при атопической бронхиальной астме /М.М.Д. Нсангу, С.А.Д. Водунон, З.И Абрамова //Деп. В ВИНИТИ .- № 186.- 2006,- 44с.

2«Нсангу, М.М.Д. Нуклеазная активность лимфоцитов больных бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания / М.М.Д. Нсангу, З.И. Абрамова // Биология-наука XXI века: сб. тез / 10-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых.- Пущино, 2006. - С.86.

3. Нсангу, М.М.Д. Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека: активность, субстратная специфичность и локализация в норме и при бронхиальной астме /М.М.Д. Нсангу, A.B. Лунцов // Научно-практическая конференция молодых ученых: Тезисы докладов. Казань, 19 апреля 2006 г. / Под ред. д.м.н., профессора А.П. Цибулькина. - Казань, 2006. - С.80 - 81.

4. Абрамова, З.И. Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови

человека при бронхиаьной астме. / З.И. Абрамова, М.М.Д. Нсангу. ¡В.Г. Винтер // Ученые записки Казанского государственного университета.- 2006,- Т. 148. «Серия естественные науки», кн. З.-С.123-137.

5* Курбанов, P.A. Изучение гидролизующей активности антител к ДНК и ДНКаз лимфоцитов больных бронхиальной астмой /P.A. Курбанов, М.М.Д Нсангу // VI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века». Тезисы докладов. Казань, 28 апреля 2006г. - Казань: Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, 2006. - С.67.

6* Нсангу, М.М.Д. Особенности морфологических показателей и количественная оценка лимфоцитов периферической крови больных АБА в зависимости от тяжести заболевания/М.М.Д. Нсангу, A.C. Водунон, З.И. Абрамова, A.B. Лунцов, В. Н. Цибулькина // Казанский медицинский журнал. -2007г.- Т. 88,№ 2. - С.182-185.

Факс биолого-почвенного факультета КГУ : 8432387121.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 19.02.2007г. Усл. п.л 1,25. Заказ № К-6334. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нсангу Молу Мама Дезире

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Некоторые аспекты клинической, социальной и диагностической картины бронхиальной астмы

1.1. Иммунный и не иммунный механизмы возникновения АБА

1.2. Аутоаллергия и астма

1.3. Иммунокомпетентные клетки

2. Программируемая клеточная гибель при АБА

2.1. Варианты программируемой гибели клеток

2.2. Апоптоз лимфоцитов при атопической бронхиальной астме

2.3. Особенности биохимических процессов при апоптозе

2.3.1. Структурная организация ДНК

2.3.2. Апоптоз и фрагментация ДНК

3. Нуклеазы 32 3.1 .Общая характеристика нуклеодеполимераз

3.2. Некоторые физико-химические свойства "апоптотических" ДНКаз

3.3. Изменение активности ДНКаз в зависимости от состояния организма

3.3.1. ДНКазы в раннем эмбриогенезе и в процессе развития

3.3.2. Активность ДНКаз в процессе старения организма

3.3.3. Активность ДНКаз при вирусных инфекциях

3.3.4. ДНКазы при воздействии на клетки ядов, антиметаболитов, канцерогенов и мутагенов

3.3.5. ДНКазы при заболеваниях с признаками энзимопатий

3.3.6. Активность ДНКаз при опухолевом процессе

3.3.7. ДНКазы при лучевой болезни

3.4. ДНКазы при апоптозе

3.4.1. Активация апоптотических нуклеаз

3.4.2. "Апоптотические" нуклеазы

3.5. Нуклеазы клеток при аутоиммуных заболеваниях

3.6. Методы анализа апоптотических нуклеаз

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме"

Бронхиальную астму, относят к заболеваниям, опосредованным торможением программируемой клеточной гибели (ПКГ). Считается, что ПКГ при воспалениях проявляется на завершающих этапах, где ей принадлежит важная роль, поскольку в этот период происходит устранение активированных клеток иммунной системы, выполнивших свои функции. То же относится к аллергическому воспалению, при котором упомянутая элиминация эффекторных клеток к тому же затруднена в связи с их способностью к самоподдержанию. Исследования процессов ПКГ лимфоцитов при развитии заболевания свидетельствуют об устойчивости данных клеток к апоптозу, что проявляется в замедлении фрагментации ДНК этих клеток при инкубации в среде in vitro и in vivo (Melis et al., 2000, 1998; Green, Scott, 1998), что приводит к нарушению элиминации лимфоцитов из легких, а также возникновению гиперреактивности бронхов. Фрагментация хромосом - один из важных биохимических признаков ПКГ, тем не менее, ее роль при ПКГ и механизм действия остаются не ясными. В настоящее время биохимические и генетические исследования показали, что фрагментация хромосом является комплексным биохимическим процессом, в котором участвует группа нуклеаз с различными активностями и субстратной специфичностью. Уникальность дезоксирибонуклеаз заключается в том, что они эффективно катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи - самой стабильной из всех химических связей, найденных в биологических молекулах. ДНКазы имеют значение в процессах нуклеинового обмена и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки анти-ДНК антител и развитию различного рода аутоиммунных заболеваний (Барановский, и др. 2004). «Апоптотические» нуклеазы действуют кооперативно между собой и с другими не нуклеазными кофакторами для реализации поступенчатой фрагментации хромосом и деградации ДНК. Важен тот факт, что помимо непосредственного участия в разборке погибающей клетки, апоптотическая деградация ДНК может облегчить смерть клетки и другие апоптотические события, например, элиминация апоптотических клеток. Более того, некоторые апоптотические нуклеазы, видимо, могут касаться и иных аспектов развития у животных и человека, включая иммунные ответы и их нарушение. Идентификация новых апоптотических нуклеаз и анализ их функций в апоптозе и в процессе развития должна проложить путь для дальнейших исследований по раскрытию новых функций "апоптотических" нуклеаз, чтобы определять скрытые связи между апоптотической деградацией ДНК и заболеваниями человека (Parrish, Deng, 2006).

Таким образом, объяснимо наше внимание к изучению свойств нуклеаз лимфоцитов, выделенных из периферической крови пациентов с АБА, и возможной роли этих нуклеаз в индукции аутоиммунных элементов при развитии заболевания.

Цель работы - сравнительная характеристика ядерных и гранулярных нуклеаз лимфоцитов от больных с атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить фракцию Т лимфоцитов из периферической крови больных с АБА и относительно здоровых доноров. Получить из них секреторные гранулы.

2. Изучить динамику структуры лейкоцитарной формулы у больных АБА с различной степенью тяжести и провести сравнительный ультраструктурный анализ лимфоцитов.

4. Изучить субстратную специфичность, влияние ионов двухвалентных металлов и рН на энзиматическую активность ядерных и гранулярных белков.

5. Изучить динамику ДНКазной активности белков при различной степени тяжести АБА.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Нсангу Молу Мама Дезире

выводы

1. Получена фракция лимфоцитов из периферической крови пациентов с АБА и относительно здоровых доноров на 95%, состоящая из Т-клеток.

2. Изучена динамика структуры лейкоцитарной формулы у пациентов с АБА. Установлена обратная корреляция между тяжестью заболевания и количеством Т-лимфоцитов (г= -0,3; р=0,04).

3. Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлены морфологические отличия в структуре лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и пациентов с АБА. У пациентов с интермиттирующей и легкой персистирующей астмой морфологические признаки: маргинация хроматина, выпячивания ядерной оболочки, вдавливания и выпячивания клеточной поверхности,- коррелируют с биохимическими (образованием крупных фрагментовДНК).

4. Методом зимографии с использованием заполимеризованной нДНК обнаружены нуклеазные активности в цитоплазматических (29кДа) и в ядерных (40кДа) фракциях белков лимфоцитов. Установлена обратная корреляция между тяжестью астмы и нуклеазной активностью.

5. Показано, что с развитием болезни уровень ядерной кальций-магниевой активности падает, она становится более устойчивой к действию ингибитора - ионам цинка, а уровень М§2+(Мп2+)-зависимой активности возрастает.

6. Установлено наличие ДНКазной активности, ассоциированной с секреторными гранулами лимфоцитов, которая соответствует Са -зависимому белку с молекулярной массой 66 кДа, активность которого коррелирует с тяжестью АБА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нсангу Молу Мама Дезире, Казань

1. Барановский, А.Г. Дезоксирибонуклеазы человека/А.Г.Барановский, В.Н.Бунева, П.А.Невинский// Биохимия.-2004.-Т.69.-С.587-601.

2. Барышников, А.Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз)/ А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин // Российский онкологический журнал. -1996.-№ 1,-С. 58-60.

3. Белоусова, М.А. Изучение процессов деполимеризации нуклеиновых кислот в клетках нормальных тканей и опухолей / М.А. Белоусова // Биохимия.- 1958. Т.23, № 5.- С. 783-790.

4. Белушкина, Н.Н. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний /Н.Н. Белушкина, С.Е Северин //Архив пат.-2001.-Т.63,№1.-С.51-60.

5. Белушкина, Н.Н. Молекулярные основы апоптоза / Н. Н. Белушкина, Хасан Хамад Али, С. Е. Северин // Вопросы биол. мед. и фарм. химии .-1998, №4.-С. 15-23.

6. Богданов, Г.Н. Нуклеазы рыб и их изменения в постнатальном онтогенезе / Г.Н. Богданов, В.М. Шмонина // Вопросы онкологии. 1975. - Т. 21,№4.-С. 28-31.

7. Бойчук, С.В. Апоптоз лимфоцитов при атопической бронхиальной астме./С.В.Бойчук, И.Г.Мустафин, Р.С.Фассахов и др.//Пульмонология.-2003.-№5.-С.38-44.

8. Васильев, В.К. Обратимость возрастных изменений ДНК / В.К. Васильев, С.К. Борисов // Биофизические и биохимические аспекты функционирования живых систем.- М.: Наука, 1989. С. 102-106.

9. Глузман, Д.Ф. Цитохимическое исследование активности деполимераз нуклеиновых кислот и неспецифических фосфомоноэстераз в процессе развития лейкоза, индуцированного РНК / Д.Ф. Глузман // Вопросы эксперим. онкологии. 1968.- № 3.- С. 58-66.

10. Дашкевич, B.C. Исследование состояния ДНК в интенсивно делящихся клетках / B.C. Дашкевич, Г.Д. Бердышев, Р.И. Салганик // Биохимия. 1966.Т. 31, № 3. - С. 548-555.

11. Диденко, Г.Г. Активность дезоксирибонуклеазы и гексокиназы в сыворотке крови мышей при действии уретана и некоторых писцитидов / Г.Г. Диденко, Г.Д. Гупалович // Вопросы онкологии. 1975. - Т.21, № 1. - С. 5761.

12. Дубровский, И.Б. Особенности эндогенной Са,М£-зависимой эндонуклеазной активности в ядрах тканей быка и крысы разного возраста / И.Б. Дубровский, С.Н. Храпунов, Г.Д. Бердышев // Мол. Генет. Биофиз. (Киев). 1985.- № 10.- С. -104-108.

13. Егорова, А. Б. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А. Б. Егорова, Ю.А. Успенская, С.В. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая // Успехи соврем. Биологии. 2001. - Т. 121.- № 5. - С. 9-13.

14. Иванник, Б.П. Активность АП-эндонуклеаз в тимоцитах нормальных и облученных крыс // Б.П. Иванник, Н.И. Рябченко // Радиобиология. 1982,- Т. 22, № 5.- С. 597-602.

15. Ильинских, Н. Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность / Н. Н. Ильинских, В. В. Новицкий, Н. Н. Ванчугова, И. Н. Ильинских. Томск : Изд-во ТГУ, 1992. - 270с.

16. Ильинских, Н.Н. Инфекционный мутагенез / Н.Н. Ильинских, Е.Ф. Бочаров, И.Н Ильинских.- Новосибирск: Наука, 1992. 168с.

17. Кайдашев, И.П. Апоптоз как общебиологический процесс / И.П Кайдашев // Проблеми екологп та медицини. 1998. - Т. 2.- №5-6. - С. 9-13.

18. Клиническая иммунология. Руководство для врачей/ Под ред. акад. РАМН Е.И.Соколова.-М.: Медицина, 1989.-272 С.

19. Ковальчук, JI.B. CD4+CD25+ иммунорегуляторные (супрессорные?) Т-лимфоциты человека ex vivo и in vitro в норме и при патологии / JI.B. Ковальчук, С.А. Павлюк // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. - № 5 - С. 40-45.

20. Колюбаева, С.Н. Исследование эндонуклеазной активности при щелочном и кислом значениях рН и сыворотке крови при общем у-облучении / С.Н. Колюбаева, Г.С. Новоселова, В.Е. Комар // Радиобиология. 1985. - Т. 25, №5.- С. 676-677.

21. Курченко, A.I. Особливост1 iMyHHoi вщповщ1 при атошчному дерматит / A.I. Курченко // Украшський журнал дерматологи, венерологи, косметологи.-2002. № 1.-С. 13-17.

22. Куцый, М.П. Участие протеаз в апоптозе / М. П. Куцый, В. А. Кузнецова, А. И. Газиев // Биохимия. 1999. - Т. 64, № 2. - С. 149-163.

23. Линцов, А.Е. Анализ цитогенетического действия иммуномодулирующей терапии у больных бронхиальной астмой: Автореф. Дис: канд.биол. наук / А.Е. Линцов. СПб, 1992. - 20с.

24. Липская, Л.А. Зависимая от ионов кальция и магния эндонуклеаза 37кДа активируется при индуцированном колхицином апоптозе в клетках HL-60 / Л.А. Липская // Цитология. 1994. - Т. 36, № з.- С. 303-309.

25. Лихачев, А.Я. Возрастные особенности репарации повреждений ДНК, вызванные канцерогенными агентами // Усп. совр. биологии. 1990. - Т. 110, №2(5).- С. 180-191.

26. Мамонтова, Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев // Аллергология. 2005. - № 4. - С. 15-23.

27. Манских, В.Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза / В.Н. Манских // Бюллетень сибирской медицины.-2004.-№1 .-С.63-70.

28. Мензорова, Н.И. Исследование субстратной специфичности Са ,Mg -зависимой дезоксирибонуклказы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius /Мензорова Н.И., Рассказов В.А.//Биохимия.-1981.- Т.46, №5.- С.872-880.

29. Минеев, В.Н. Апоптоз и реактивность рибосомальных цистронов клеток периферической крови при бронхиальной астме/В.Н.Минеев, И.И.Нестерович, Е.С.Оранская и др.//Аллергия.-2003.-№1.-С.15-19.

30. Никонова, М.Ф. Апоптоз и пролиферация клеток как альтернативные формы ответаТ-лимфоцитов на стимуляцию/А.Ф.Никонова, М.М.Литвина, И.И.Варваломеева и др.//Иммунология.-1999.-№2.-С.20-23.

31. Новиков, B.C. Физиологические аспекты / B.C. Новиков, В.Н. Цыган // Росс, физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 1997. - Т. 83.- № 4. - С.14-23.

32. Паткин, Е.Л. Одноцепочечные разрывы ДНК в хромосомах ранных зародышей мышей / Е.Л. Паткин, М.Е. Кустова, Е.М. Нониашвили // Цитология. 1995. - Т. 37, № 5/6.- С. 458-463.

33. Погорелов, В.М. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом гемопоэзе / В.М. Погорелов, Г.И. Козинец // Гематология и трансфузиология. 1995. -Т. 40.- № 5. - С. 21-25.

34. Потапенко, А.И. Дефекты вторичной структуры ДНК, опознаваемые нуклеазой S1: возможная роль в старении соматических клеток млекопитающих / А.И. Потапенко // Цитология.- 1994.- Т.36,№7.- С.749-750.

35. Райхлин, Н.Т. / Н.Т. Райхлин, А.Н Райхлин. // Вопросы онкологии.-2002.-Т.48,№2.-С. 159-171

36. Ревякина, В.А.Бронхиальная астма у детей. Современные вопросы по проблеме/В.А.Ревякина //Медицинский научный и учебно-методический журнал.-2006.-№31 .-СЗ-22.

37. Розинова, Н.Н. Возрастная эволюция хронических неспецифических заболеваний легких: от ребенка док взрослому/ Н.Н. Розинова, М.Н.Ковалевская, Н.Г.Хмелькова и др //Рос. вестн. перинатал. и педиатрии.-1995.-№5.-С.5-11.

38. Рябченко, Н.И. Влияние облученмя алкилирующих агентов на распад хроматина в нормальных и малигнизированных лимфоидных клетках / Н.И. Рябченко, В. Юрашкова, Б.П. Иванник и др. // Радиобиология. 1991. - Т. 31, № 1.- С. 22-27.

39. Сальников, К.В. Экстрахромосомная ДНК в клетках млекопитающих / К.В. Сальников//Цитология, 1990.-Т. 32, № П.-С. 1061-1071.

40. Сейлиев, А.А. Изучение спектра ядерных дезоксирибонуклеаз (ДНКаз) клеток тимуса крыс в норме и после общерентгеновского облучения / А.А. Сейлиев, Н.Б. Звонарев, К.П. Хансон // Радиобиология. 1991.- Т. 30, № 1.-С. 20-27.

41. Семенов, А.В. Элементы цитоскелета и патогенез аллергических реакций: цитоскелет и его участие в аптогенезе аллергических реакций (обзор литературы) / А.В. Семенов // Клинич. лаб. диагностика. 2003. - № 2.-С. 3-8.

42. Сепиашвили, Р.И. Апоптоз в иммунологических процессах / Р.И. Сепиашвили, М.Г. Шубич, Н. В. Колесникова // Аллергология и иммунология.- 2000. № 1. - С. 15-23.

43. Сигарев, В.А. Связывание экзогенной ДНК сперматозоидами / В.А. Сигарев, И.В. Кузнецова // Пробл. репродуукции. -1996. №2,- С. 18-20.

44. Солиев, Ф.Л. Анализ репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах больных бронхиальной астмой / Ф.Л. Солиев, Е.Н. Барабанова, А.Е. Линцов и др. // Цитология. 1995. - Т. 37, № /6,- С. 465-469.

45. Съяксте, Н.И. Ферментативные активности ядерного матрикса / Н.И. Съяксте, Т.Е. Съяксте//Биохимия. 1994.-Т.59, № П.-С. 1663-1673.

46. Татарская, Р.И. Нуклеазы. Биологическая роль / Р.И. Татарская // Мол. биол. 1976,а. - Т. ЮС. 235-259.

47. Татарская, Р.И. Нуклеазы. Биологическая роль / Р.И. Татарская // Мол. биол. 1976,6. - Т. 10.- С. 477-479.

48. Уманский С.Р Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы //Усп.совр.биол.-1982.-Т.93 ,вып. 1 .-С. 139-148

49. Уманский, С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы / С.Р. Уманский // Молекулярная биология. -1996. -Т. 30. вып. 3. - С. 487-498.

50. Федосеева, В.Н., Порядин Г.В. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы / В.Н. Федосеева, Г.В. Порядин. М.: Атмосфера, 2002. - 160 с.

51. Фильченков, А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций / А.А. Фильченков // Биохимия. -2003. -Т. 68, № 4.-С. 453-466.

52. Фрейдлин, И.С. Иммунная система и ее дефекты / И.С. Фрейдлин. -Руководство для врачей.-СПб, 1998. 113 с.

53. Хаитов, P.M. Иммунология: учебник / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

54. Хурсин, Н.Е. Изменения активности ДНКаз при лимфогранулематозе у детей / Н.Е. Хурсин, Г.Н. Анистратенко, В.Г. Бабенко, С.С. Киреева // Онкология (Киев).- 1979. № 14.- С. 81-83.

55. Чернушенко Е.Ф. Иммунология бронхиальной астмы // Укр. пульмон. журн. 2000. - № 2, дополнение. - С. 19 - 21.

56. Чернушенко, Е.Ф. Актуальные проблемы иммунологии / Е.Ф. Чернушенко // Укра'шський пульмонолопчний журнал.-2003.-№ 2. С. 94-96.

57. Чучалин А.Г.Федеральная целевая программа. «Концепция развития пульмонологической службы России на 2002-2007г.» //www. spiro. ru/info/federal.html)

58. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (Совместный доклад Национального института Сердце, Легкие, Кровь (США) и Всемироной Организации Здравоохранения) // М.: изд-во "Атмосфера", 2002.-160с.

59. Шань, Л. Аномалии эмбриогенеза у трансгенных Danio rerio(pisces) / Л. Шань, А.О. Бенюмов, В.А. Голиченков //Генетика.-1994. №30(прил.). 180с.

60. Шигина Ю. Качество жизни /Профилактика.- 2004, №6 (www/profilaktika.ru)

61. Щит, И. Негативное действие экзогенной ДНК на оплодотворение и ранний эмбриогенез кролика в опытах по опосредованному сперматозоидами переносу генов / И.Ю.Щит, А.В.Кузнецов, С.А.Каурова и др // Проблемы репродукции.-1998.-№4.-С.5-10.

62. Ярилин, А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах / А.А. Ярилин // Иммунология. -1996. -№ 6 С. 10-21.

63. Aggarwal, S. Increased apoptosis of T cell subsets in aging humans: altered expression of Fas (CD95), Fas-ligand, Bcl-2 and Bax / S. Aggarwal // Immunol. -1998.-V .60, N4. -P. 1627-1637.

64. Akdis, M. T helper (Th) 2 predominance in atopic diseases is due to preferential apoptosis of circulating memory/effector Thl cells / M. Akdis, A. Trautmann, S. Klunker et al. // FASEB J. 2003. - V. 17, № 9. - P. 1026-1035

65. Ali, F.M. A two-step procedure for obtaining normal peripheral blood T-lymphocytes using continuous equilibrium density gradient centrifiigation onpercoll/ F.M. Ali, A.May, G.D.McLaren, et al.//J Immunol Methods.-1982.-V. 12.-P. 185-91

66. Alnemri, E.S. Activation of internucleosomal DNA cleavage in human СЕМ lymphocytes by glucocorticoid and novobiocin / E.S. Alnemri, G. Litwack //J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 17323-17333.

67. Ames, B.M. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging / B.M. Ames, M.K. Shigenada, T.M. Hagen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1993. -V90,№ 17.-P. 915-7922.

68. Anania, A. Immunologic aspects of allergic and non-allergic asthma / A. Anania, S. Fassio, G. Cascio / /Minerva Med. -1998. -V. 89, № 3.- P. 49-56.

69. Anderson, J.E. Restriction endonucleases and modification methylases /J.E. Anderson // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. - V. 3. - P. 24-30.

70. Bailly, V. Esherishea coli endonuclease II is not an endonuclease but a,(3-elimination catalyst / V. Bailly, W. Verly // Biochem. J. 1987. - V. 242.- P. 565572.

71. Bajt, M.L. Nuclear translocation of endonuclease G and apoptosis-inducing factor during acetaminophen-induced liver cell injury / M.L. Bajt, C. Cover, J.J. Lemasters, et al. // Toxicological Sciences. -2006. -V. 94, N. l.-P. 217-225.

72. Baker, K. P. Molecular cloning and characterization of human and murine DNase II. / K. P. Baker, W. F. Baron, W. J. Henzel et al. // Gene. 1998. - V. 215, N.2.-P. 281-9.

73. Barry, M. A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis / M. A. Barry, A. Eastman // Arch Biochem Biophys. 1993. - V. 300,N. l.-P. 440-50.

74. Basnakian, A.G. Cisplatin nephrotoxicity is mediated by deoxyribonuclease I /A.G Basnakian., E.O. Apostolov., X Yun., et al. //J.Am. Soc. Nephrol.-2005.-V.16.-P.697-702.

75. Basso, D. Deoxyribonuclease I serum activity in pancreatic cancer / D. Basso, M. Piera Panozzo, C. Fabris et al. // Bull Cancer. 1990. - V. 77, N. 4. -P. 385-7.

76. Boyum, A. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality/ A. Boyum, D. Lovhaug, L. Trasland et al. //Scand. J. Immunol.-1991.-V.34.-P.697-712.

77. Budd, R.C. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis / R.C. Budd // J. Clin. Invest. 2002. -V. 109, № 4 .- P. 437-442.

78. Busse, W. W. Asthma / W. W. Busse, R.F.Lemanska // NEJM. -2001. V. 344.-P. 350-362.

79. Campbell, V. W. The effect of divalent cations on the mode of action of DNase I. The initial reaction products produced from covalently closed circular DNA / V. W. Campbell, D. A. Jackson // J Biol Chem. 1980. - V. 255, N. 8. - P. 3726-3735.

80. Chan, H. K. Effects of additives on heat denaturation of rhDNase in solutions /Н. K. Chan, K. L. Au-Yeung, I. Gonda // Pharm Res. 1996. - V. 13. -P. 756-761.

81. Chen, C. Ceramide paths in human lung cell death//Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.-2000.-V.22.-P.460-468.

82. Chen, M. Initiator caspases in apoptosis signaling pathways / M. Chen , J. Wang // Apoptosis. 2002. - V. 7, № 4. - P. 313-319.

83. Chau-Ching, L. Lymphocyte-mediated cytolysis and disease / L. Chau-Ching, L.H.Y .Young et al. // N. Engl. J. Med. -1996. -V. 335. -P. 1651-1659.

84. Chinnaiyan, A. The cell death machine / A. Chinnaiyan, V. Dixit // Curr.Biol. 1996. - V. 6. - P. 552-562.

85. Cohen, J.J. Apoptosis and programmed cell death in immunity / J.J. Cohen, R.C. Duke, V.F. Fadok, K.S. Sellins // Annu. Rev. Immunol. -1992. V. 10. P. 267-293.

86. Compton, M.M. Identification of a glucocorticoid-induced nuclease in thymocytes / M.M. Compton, J.A. Cidlowski // J. Biol. Chem.- 1987.- V. 262. P. 8288-8292.

87. Corrigan, C.J. T lymphocyte activation in acute severe asthma / C.J. Corrigan, A. Haetnell, A.D. Kay //Lancet.-1988.-V.-P.l 129-1132.

88. Daoust, R. The distribution of deoxyribonucleases in normal, cirrhotic and neoplastic rat liver / R. Daoust, A. Cantero //J. Histochem. -1959. -V.7.-P.139-142.

89. Dayton, M.A. Augmented nuclease activity during cellular senescence in vitro/M.A.Dayton, P.Nahreini,A. Sivastava //J.Cell Biochem.-1989.-V.39.-P.75-85

90. De Jong, J.W. Peripheral blood lymphocyte cell subjects with chrronic obstructive pulmonary disease: association with smoking, IgE and lung function / J.W De Jong, B. Van Der Belt-Gritter, G.H. Koeter, D.S. Postma // Respir Med. -1997. -V.91.-P. 67-76.

91. De Maria, A. Dnase I and the fragmented chromatin during nuclear degradation in adult bovine lens fibers / A. De Maria, C. Arruti // Mol Vis. 2004. - V. 0.- P. 74-82.

92. Deng, G. Suppression of apoptosis in a cytotoxic T-cell Line by Interleukin2-mediated gene transcription and deregulated expression of the protooncogene bcl-2 / G. Deng, E.R. Podack // Proceeding of Nat. Acad,of Scin.-1993.-V. 90. -P. 2189-2193.

93. Druilhe, A. Apoptosis, proliferation, and expression of Bcl-2, Fas, and Fas ligand in bronchial biopsies from asthmatics / A. Druilhe, B. Wallaert, A. Tsicopoulos // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998. - V.19, № 5. - P. 747-757.

94. Edinger, A.L. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy / A.L. Edinger, C.B. Thompson // Curr Opin Cell Biol. 2004.- V. 16, № 6.- P. 663-669.

95. Eisenberg, J. D. Safety of repeated intermittent courses of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease in patients with cystic fibrosis / J. D. Eisenberg, M. L. Aitken, H. L. Dorkin et al. // J Pediatr. 1997. - V. 131, N. 1. -P. 118-24.

96. Enary, M. A caspase-activated DNAse that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD / M. Enari, H. Sakahira, H. Yokoyama et al. // Nature. -1998.-V. 391.-P. 43-50.

97. Erjefalt J.S., Persson C.G.A. New aspects of degranulation and fates of airway mucosal eosinophils / J.S. Erjefalt, C.G.A. Persson // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - V. 161. - P. 2074-2085.

98. Ferrer, L. DNA fragmentation and identification of dying cells in X-ray-induced cell death in the developing drain / L. Ferrer, F. Munell, A.M. Planas // Int. J. Dev. Neurosci. 1995. - V.13, № p. 21-28.

99. Ferrero, S. Asthma in women with endometriosis/S. Ferrero, P.Petrera, B.M. Colombo et al //Hum.Reprod.-2005.-V.20.-P.35-3517.

100. Feucht, HE. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll)/HE.Feucht, M.R.Hadam, F.Frank, G.Riethmuller .// J Immunol Methods.-1980.-V.38.-P.43-51.

101. Franklin, W. DNA deoxyribophosphodiesterase / W. Franklin, T. Lindahl // EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 3617-3622.

102. Fulop, T.Jr.Changes in apoptosis of human polymorphonuclear granulocytes with aging/T.Jr.Fulop, C.Fouquet, P.allaire et al.//Mech.Ageing Dev.-1997.-V.96, N.1-3.-P.13-34.

103. Gaido, M.L. Identification, purification and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes / M.L. Gaido, J.A. Cidlowski //J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 18580-18585.

104. Gerlf, J.A. Understanding enzyme-catalyzed proton abstraction from carbon acids: Details of stepwise mechanisms for P-elimination reaction / J.A. Gerlf, P.G. Gassman //J. Am. Chem. Soc. 1993. - V. 114. - P. 5928-5934.

105. Gerschenson, M. Endonuclease G from mammalian nuclei is identical to the major endonuclease of mitochondria / M. Gerschenson , K. L. Houmiel, R. L. Low // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23, N. 1. - P. 88-97.

106. Gottlieb, R. A. Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification / R. A. Gottlieb, J. Nordberg, E. Skowronski et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V. 93, N. 2. - P. 654-658.

107. Green, D.R. Activation-induced apoptosis in lymphocytes / D.R. Green, D.W. Scott // Curr.Opin. Immunol. 1994. -V. 6, № 3.- P. 476-487.

108. Greenstein, J.P. Biochemistry of cancer / J.P. Greenstein.- New York, 1947. -300p.

109. Han, D. Age-related enhancement of tumor necrosis factor(TNF) production in mice / D.Han, T.Hosokcava, A. Aoike et al // Mech.Ageing Dev.-1995. V. 84. -P. 39-54.

110. Hanafiisa, H. Transforming activity of the c-src gene / H. Hanafusa, H. Iba, T. Takeya, F.R. Cross // In: cancer cells. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., 1984. -V. 2.- Oncogens and viral genes. P. 1-7.

111. Harosh, I. Mechanism of action of deoxyribonuclease II from human lymphoblasts /1. Harosh, D. M. Binninger, P.V. Harris et al. // Eur J Biochem. -1991. V. 202, N. 2. - P. 479-484.

112. Hewish, D.R. Chromatin sub-structure.The digestion of chromstin DNA at regylary spased sites bya nuclear DNAse /D.R. Hewish, L.A. Burgoyne //Bioch.Biophus.Res./Com.-l 973 .-V/52.-P.504-510.

113. Hibino, Y. Enhancement of an Mg-dependent nuclease activity in rat liver cells exposed to cisplantin / Y. Hibino, E. Kusashio, T. Terakawa, N. Sugano // Biochem. And Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 202, № 2.- P. 748-756.

114. Higami, Y. Involvement of DNAse gamma in apoptotic DNA fragmentation in histiocytic necrotizing lymphadenitis/ Y. Higami, К. To, H. Ohtani et al. //Virchows Arch.-2003.-V.443, N.2.- P. 170-174.

115. Higashi, N. Human monocytes in a long-term culture with IL-2 show high tumoricidal activity against various tumor cells/ N. Higashi, Y. Nishimura, M.Higuchi et al /Immunotherapy.-1991.-V.10.- P.247-255.

116. Huang, K. J. Endonuclease G, a candidate human enzyme for the initiation of genomic inversion in herpes simplex type 1 virus / K. J. Huang, В. V.

117. Zemelman, I. R. Lehman I I J Biol Chem. 2002. - V. 277, N. 23. - P. 2107121079.

118. Hughes, Cidlowski J.A. Potassium is critical regulator of apoptotic enzymes in vitro and in vivo / F.M.Jr. Hughes., J.A. Cidlowski //Adv. Enzyme Regul.-2000.-V.39.-P. 157-171.

119. Hussein, M.R. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms / M.R. Hussein //Hum.Repord.Update.-2005.-V. 11, N.2.-162-178.

120. Ito, K. Phosphodiesterase I in human urine: purification and characterization of the enzyme / K. Ito, T. Yamamoto, N. Minamiura // J Biochem (Tokyo). 1987. -V. 102,N. 2.-P. 359-367.

121. Jones, S. J. Site-directed mutagenesis of the catalytic residues of bovine pancreatic deoxyribonuclease I / S. J. Jones, A. F. Worrall, B. A. Connolly // J Mol Biol. 1996. - V. 264, N. 5. - P. 1 154-1163.

122. Junowicz, E. Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. II. The effect of different bivalent metals on the specificity of degradation of DNA / E. Junowicz , J. H. Spencer // Biochim Biophys Acta. 1973. - V. 312, N. l.-P. 85-102.

123. Kaidashev, I/P/ Atopic patients have altered not only Fas- but also HLA-I and HLAII-mediatea apoptosis of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)/I.P.Kaidashev, J.L.Gregorczyk, M.L.Kowalski et al./Лмунолоп та алерголопа.-2002.-№2.-С.76-81.

124. Kaladze, N.N. The dynamics of apoptosis parameters in children with bronchial asthma during the course of sanatorium treatment./ N.N. Kaladze, S.V. Trishina, Z.Z. Ametshaeva // УкраУнський пульмонолопчний журнал.-2004.-№ 3.- С. 27-29.

125. Kay, A Another road to making embryonic pattern /A.Kay //Biologist (London). 2002. - V. 49, N. 6. - P. 261 -264.

126. Khodarev, N.N. Ca,Mg-dependent endonuclease: a putative compton target in cell transformation and death / N.N. Khodarev, I.V. Chupirina, T.I. Tkacheva et al. // Cell. Proliferat. 1995. - V. 28, № 5. - P. 296-301.

127. Kogg, J. С. Leukocyte traffic in the lung / J. C. Kogg, С. M. Doerschux //Anni. Rev. Physiol. 1995. - V.57. - P.97-114.

128. Kopinski, P. Apoptosis of alveolar lymphocytes in sarcoidosis and in control group is more frequentin smokers then in nonsmoking persons/ P. Kopinski, G.Przybylsk., B.Balicka-Slusarczyk et al//Przegl Lek.-2006.-V.63.-P.841-847.

129. Kornberg, A. Supplement to DNA replication / A. Kornberg/ San Francisco: W. H. Freeman & Co, 1982. - P. 1-203.

130. Kowal, K. Changes in monocyte phenotype and function during allergen specific immunotherapy / K. Kowal, L.D. DuBuske, A. Bodzenta-Lukaszyk // Asthma. 2003. - V. 4.- P. 33-35.

131. Krieser, R.J. The cloning and expression of human deoxyribonuclease II. A possible role in apoptosis / R.J. Krieser, A. Eastman // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273,№47.-P. 30909-30914.

132. Lambert, M.W. Nuclear deoxyribonuclease activity in human lymphoblastoid and mouse melanoma cells. A comparative study / M.W. Lambert, S.S. Lee, A.O. Okoroduru, W.C. Lambert // Biochem. Biophys. Acta. 1982. - V. 699, №3.- P. 192-202.

133. Lamer, B. Why is dying of asthma and way?//J. Pediatr.-1988.-1 V.l 15 P.838-840.

134. Laskowski, M.M. Nuclease: Historical perspectives / M.M. Laskowski // In: Meeting Nucleases, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. 1982. - P. 1-21.

135. Lenardo, M.J. Autocrine feedback death and the regulation of mature T-lymphocyte antigen responses / M.J. Lenardo, S. Boehme, L. Chen, et al. // Int. rev. immunol. -1995. -V. 13. -P. 115-134.

136. Li, L. Y. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. / L. Y. Li, X. Luo, X. Wang // Nature. 2001. - V. 412, N. 6842. -P. 95-99.

137. Liu, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis / X. Liu, H. Zou, C. Slaughter et al. // Cell. 1997. - V. 89, N. 2. - P. 175-184.

138. Low, R. L. Endonuclease G isolation and assays / R. L. Low, M. Gerschenson // Methods Mol Biol. 2002. - V. 197. - P. 331-349.

139. MacLea, K. S. Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease II alpha / K. S. MacLea, R. J. Krieser, A. Eastman // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - V. 292, N. 2. - P. 415-421.

140. Maione, B. Activation of endogenous nucleases in mature sperm cell upon interaction with exogenous DNA / B. Maione, C. Pittogi, L. Achene, et al // DNA & Cell Biol. 1997.

141. Martin, S.J. Induction of apoptosis in Human leukemia HC-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis / S.J. Martin, S.V. Lennon, A.M. Bonham, V.G. Cotter//J. Immunol. 1990.- V. 145.-P. 1859-1867.

142. Masbaugh, D. Further characterization of hyman fibroblast apurinic/apyrimidinic DNA endonucleases / D. Masbaugh, S. Linn // J. Biol. Chem. 1980. - V. 25. -P. 11743-11752.

143. Matyasova, J On the degradation of chromatin to nucleosomes in tymocytes of X-irradiated mice / J. Matyasova, M. Skalka, M.Cejkova // Fol. Biol. (Prague). -1984.-V. 30. -P. 123-136.

144. Mcllroy, D. An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation provided by phagocytes. / D. Mcllroy, M. Tanaka, H. Sakahira et al. // Genes Dev. 2000. -V. 14, N.5.-P. 549-58.

145. Melis, M. Fluticasone induces apoptosis in peripheral T lymphocyte: a comparison between asthmatic and normal subjects / M. Melis, A. Siena, E.Pase//Eur.Respir.J.-2002.-V. 19.-P.257-266.

146. Melis, M. (eds.) Effects of zafirlucats on peripheral-blood-lymphocytes apoptosis in asthma/ M. Melis, A. Siena, A. Vignola //Abstracts of Europ. Respir Society. Annual Congress.-Berlin, 1998.-P.1984

147. Mishra, N.C. Nucleases: molecular biology and applications / N.C. Mishra. John Wiley & Sons. - Noboken, 2000. - 350p.

148. Moreira, ME. Apoptotic cell and phagocyte interplay: recognition and consequences in different cell systems / M. E. Moreira, M.A. Barcinski // An Acad Bras Cienc. 2004. - V. 76, № 1. - P. 93-115.

149. Morisson, A. Deoxyribonucleic acid, nucleotidyltransferase and deoxyribonuclease from cultivated cells infected with herpex simplex virus (BBA 825i) /A.Morisson, E.Chaudun, Y.Courtois et al. //Cell. -1990. -V. 62.-P.1143-1151.

150. Mountz J.D. Cell death and longevity: implications of Fas-mediated apoptosis in T-cell senescence /J.D.Mountz, J.Wu, T. Zhou et al. //Immunol. Rev.-1997.-V.160.-P.19-30

151. Mukherjee, S.K. The effects of adging and neurodegeneration on apoptosis-associated DNA-fragmentation and the benefits of nicotinamide / S.K. Mukherjee, J.D. Adams // Mol. Chem. Neuropathol. 1997. - V. 32, N 1-3. - P. 59-74.

152. Nadano, D. Purification and characterization of genetically polymorphic deoxyribonuclease I from human kidney / D. Nadano, T. Yasuda, K. Kishi // J Biochem (Tokyo). 1991. - V. 110, N. 3. - P. 321-323.

153. Nagata, S. Apoptotic DNA fragmentation / S. Nagata // Exp.Cell. Res. -2000.-V. 256.-P. 12-18.

154. Nagata, S. Degradation of chromosomal DNA during apoptosis/ S. Nagata, H. Nagase, K. Kawane, et al. // Cell Death Differ. 2003. - V. 10. - P. 108-116.

155. Napirei, M. Comparative characterization of rat deoxyribonuclease 1 (Dnase 1) and murine deoxyribonuclease 1- like 3 (Dnase 113) / M. Napirei, S. Wulf, D. Eulitz et al. // Biochem J. 2005. V. 389(Pt2). - P. 355-364.

156. Napirei, M. Expression pattern of the deoxyribonuclease 1 gene: lessons from the Dnase 1 knockout mouse / M. Napirei, A. Ricken, D. Eulitz et al. // Biochem J. 2004. - V. 380(Pt 3). - P. 929-337.

157. Nerd, C.M. Pulmonare immune cells in health and disease platelets / С. M. Nerd, C. P. Page // Eur. Respi J. 1994. - N 7. - P. 1145-1160.

158. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? / E.A. Nigg // Nat Rev Cancer. 2002. - V. 2, № 11. p. 815-25.

159. Nikonova, L,V. Properties of some nuclear nucleases of rat thymocytes and their changes in radiation-iduced apoptosis / L,V. Nikonova, I.P. Beletsky, S.R. Umansky // Eur.J.Biochem. 1993. - V. 215, N3. - P. 93-901.

160. Nitahara, J.A. Intracellular calcium, DNAse activity and miocyte apoptosis in aging Fischer 344 rats / J.A Nitahara, W. Cheng, Y. Liu et al. // J. Mol. Cardiol. 1998. -V. 30, N.3.-P. 519-535.

161. Nomoto,Y. Apoptosis and Fas/FasLigand mRNA expression in acute immune complex alveolitis in mice/Y.Nomoto, K.Kuwano, N.Hagimoto et al.//Eur.RespirJ.-1997.-V.10.-P.2351-2359.

162. Oberhammer, F. Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation / F. Oberhammer, J. W. Wilson, C. Dive et al. // EMBO J. 1993. -V. 12, N. 9. P. 3679-84.

163. Odaka, C. Role of macrophage lysosomal enzymes in the degradation of nucleosomes of apoptotic cells / C. Odaka, T. Mizuochi // J Immunol. 1999. - V. 163,N. 10.-P. 5346-5352.

164. Ogier-Denis, E. Autophagy: a barrier or an adaptive response to cancer / E. Ogier-Denis, P. Codogno // Biochim Biophys Acta.- 2003. V. 1603, № 2. - P. 113-128.

165. Ohsato, T. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization in intermembrane space / T. Ohsato, N. Ishihara, T. Muta et al. // Eur J Biochem. 2002. - V. 269, N. 23. P. 5765-5770.

166. Oki, S. Invariant Naturel Killer T(iNKT) cells in asthma: a yjvel insight into the pathogenesis of asthma and therapentic implication of glycolipid ligands for allergic diseases/S.Oki, S. Miyake//AUergol Int.-2007-V.l,N.56.-P.7-14.

167. Okoroduru, O.A. Nuclear DNAse in normal and Xeroderma pigmentosum lymphoblastoid cells / O.A. Okoroduru, W. Clark, M.W. Lambert // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. - V. 108, № 2.- P. 576-584.

168. Olins, A.L. Spheroid chromatin units (^-bodies) / A.L. Olins, D.E. Olins //Science. 1974. - V. 183. - P. 330-332.

169. Oliveri, M. DNase I mediates internucleosomal DNA degradation in human cells undergoing drug-induced apoptosis / M. Oliveri, A. Daga, C. Cantoni, C. Lunardi et al. // Eur. J. Immunol. 2001. - V. 31, № 3. - P. 743-751.

170. Oneda,K. Dexamethasone involuced apoptos in peripheral T-limphocytes from patient with astma/k.Oneda//Arevugi.-V.49.-P. 13-22

171. Pan, C. Q. Improved potency of hyperactive and actin-resistant human DNase I variants for treatment of cystic fibrosis and systemic lupus erythematosus / C. Q. Pan, Т. H. Dodge, D. L. Baker et al. // J Biol Chem. 1998. - V. 273, N. 29.-P. 18374-18381.

172. Parrish, J.Z. Cuts can kill: the roles of apoptotic nucleases in cell death and animal development / J.Z. Parrish, X. Deng // Chromosoma. 2006. - V. 115, № 2. - P. 89-97.

173. Patel, D. Separation of T and В lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells using density perturbation methods/D.Patel, C.P.Rubbi, D.Rickwood // Clin Chim Acta.-1995 -V.240.-P 187-93

174. Peitsch, M.C. Characterisation of the endogenous deoxyribonuclease involved in nuclear DNA fragmentation during apoptosis (programmad cell death) /М.С. Peitsch, B. Polzar, H. Stephan et al. // EMBO J. 1993. - V. 12.- P. 371-377.

175. Perez, G. Identification of potassium-dependent and-independent components of the apoptotic machinery in mouse ovarian germ cells and granulose cells/ G.Perez, D.V Matavei, A.M. Trbovich et al.//Biology of reproduct.-2000.-V.63.-P.1358-1369.

176. Pio, R. Nitric oxide activates granule-associated DNase in human monocytes / R. Pio, M.J. Lopez Zabalza, A. Rouzaut et al. // Biology chemistry. - 1998. -V.2-P. 165-173.

177. Pio, R. Granule associated DNase in T4 and T8 lymphocytes from patients with autoimmune diseases / R. Pio, A. Gonzalez, M. J. Lopez-Zabalza et al. // Biochimica et Biophysica Acta. 1998. -V. 1406. - P. 51-61.

178. Podack, E.R. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural., biochemical and functional characterization/ E.R. Podack., P.J. Konigsberg//J.Exp.Med.-1984.-V.1.-P.695-710.

179. Price, P. A. The essential role of Ca2+ in the activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease /Р.А. Price//J Biol Chem. -1975. -V. 250. P. 1981-1986.

180. Ramandanis, G. Correlation between serum and tissue deoxyribonuclease levels in breast cancer patients / G. Ramandanis, N. Agnantis, J. Garas et al. // Anticancer Res. 1982. - V. 2, N. 4. - P. 213-218.

181. Riley, D. E. Deoxyribonuclease 1 generates single-stranded gaps in chromatin deoxyribonucleic acid / D. E. Riley // Biochemistry. 1980. - V. 19, N. l.-P. 2977-2992.

182. Rittner, G. Family studies in scleroderma (systemic sclerosis) demonstrating an HLA-linked increased chromosomal breakage rate in cultured lymphocytes / G. Rittner, G. Schwanitz, M.P. Baur//Hum. Genet. 1988. - V. 81. - P. 64-70.

183. Rottem, M. Allergic and autoimmune effectors pathways/ M. Rottem, M.E. Gershwin, Y. Shoenfeld // Dev. Immunol. 2002. - V. 9, N. 3. - P. 161-167.

184. Sakahira, H. Cleavege of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis / H. Sakahira, M. Enari, S. Nagata //Nature. 1998. -V.91.-P. 96-99.

185. Sakkas, D. Nature of DNA damage in ejaculated human spermatozoa and the possible involvement of apoptosis / D. Sakkas, O. Moffatt, G. C. Manicardi et al. // Biol Reprod. 2002. - V. 66, N. 4. - P. 1061-1067.

186. Schmidt, B. The major fraction of deoxyribonuclease activity from human urinary proteins. Purification and properties / B. Schmidt, S. Peil, R. K. Zahn. // J Clin Chem Clin Biochem.- 1978.- V. 16, N. 11.-P. 607-12.

187. Schneider, P. Characterization of Fas(Apo-l,CD95)-Fas ligand interaction / P. Schneider, J.-L. Bodmer, Holler N. et al. // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272, № 30.-P. 18827-18833.

188. Schuster, M.Lymphocytes migrate from the blood into bronchoalveolar lavage and lung parenchyma in the asthma model of the brown norway rat//M.Schuster, T.Tscherning, N.Krug et al.,//Am.J.Respir Crit Care Med.-2000.-V.161.-P.558-566.

189. Schwartzman, R.A. Glucocorticoid induced apoptosis of lymphoid cell / R.A Schwartzman, J.A. Cidlowski // Inter. Arch. Allergy immunol. 1994. -V. 105, № 4.-P. 347-354.

190. Shah, P. L. In vivo effects of recombinant human DNase I on sputum in patients with cystic fibrosis / P. L. Shah, S. F. Scott, R. A. Knight et al. // Thorax. -1996. -V. 51, N. 2.-P. 119-125.

191. Shah, P. L. Two years experience with recombinant human DNase I in the treatment of pulmonary disease in cystic fibrosis / P. L. Shah, S. F. Scott, D. M. Geddes et al. // Respir Med. 1995. - V. 89, N. 7. - P. 499-502.

192. Shak, S. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum / S. Shak, D. J. Capon , R. Marsters et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1990. - V.87, N. 23. - P. 9188-92.

193. Shi, H.-Z. CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in allergy and asthma. H.-Z. Shi, X.-J. Qin // Allergy.- 1999.- V. 60, Issue 8, P. 986-995.

194. Shiokawa, D. Characterization of human Dnase I family endonucleases and activation of Dnase gamma during apoptosis/ D. Shiokawa, S. Tanuma //Biochemistry .-2001 .-V.9.-P. 143-152;

195. Shiokawa, D. Involvement of Dnase gamma in apoptosis associated with myogenic differentuation of C2C12 Cells/ D Shiokawa, T. Kobayashi, S.Tanuma //J.Biol.Chem.-2002.-V.277.-P.31031 -31037.

196. Shiokawa D. Purification and properties of Dnase gamma from apoptotic rat thymocytes/ D. Shiokawa, H. Ohyama, T. Yamada et al. /Bioche J.-1997.-V.326 (Pt 3).-P.675-668;

197. Shiokawa, D. Indentification of an endonuclease responsible for apoptosis in rat tymocytes / D. Shiokawa, H. Ohyama, T. Jamada et al. // Eur. J. Biochem. -1994.-V. 226 № l.-P. 23-30.

198. Shiokawa, D. Isolation and characterization of the DLAD/Dlad genes, which lie head-to-head with the genes for urate oxidase / D. Shiokawa, S. I. Tanuma //Biochem Biophys Res Commun. 2001. - V. 288, N. 5. - P. 1119-1128.

199. Shrivastawa, K.P. Studies on the levels of DNA, RNA, protein and DNAses in developing and old chick brain / K.P. Shrivastawa, R.K. Subba // J. Neurochem.- 1975.-V. 25.-P. 1205-1210

200. Sierakowska, H. Mammalian nucleolytic enzymes / H. Sierakowska, D. Shugar // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1977. - V. 20. - P. 59-130.

201. Sinch, N.J. Age dependent properties of acid and alkine DNases in chick brain / N.J. Sinch, R.P. Shrivastava, C.S. Paulsose, R.R. Subba // Indian J. Biochem. Biophys. 1982. - V. 19, N. 2.- P. 86-90.

202. Skalka, M. Postirraditaion damage to thymus chromatin result of enzymic degradation to nucleosomes / M. Skalka, J. Matyasova, M. Cejkova // Stud. Biophys. - 1981.-V. 85.-P. 71-72.

203. Spandidos, D.A. Serum desoxyribonucleases in patients with breast cancer / D.A. Spandidos, S. G. Ramandani, J. Garas // Eur. J. Cancer. 1980. - V. 16, № 12.-P. 1615-1619.

204. Spiering, A.L. Drosophila apurinic/apyrimidinic DNA endonucleases / A.L. Spiering, W.A. Deutsch // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 3222-3228.

205. Stein, G. Non-histone proteins and gene regulation / G. Stein, J. Stein, LJ. Kleinsmith // Eukaryotic genes: struct, active and regul. London e.a., 1983. Ch. 3.- P. 31-51.

206. Stennicke, H.R. Caspases-controlling intracellular signals by protease zymogenactivation / H.R. Stennicke, G.S. Salven // Biochem. Biophys. Acta. -2000.-V. 1477.-P. 299-306.

207. Su С. M. Longetivity-dependent organ-specific accumulation of DNA damage in two closely related murine species / C.M. Su, D.E. Brasch, A. Turturro // Mech. Ageing. Dev. 1989. - V. 27, N. 2.- P. 237-247.

208. Subba, R.K.W. Changes in DNA, RNA, protein and the activities of acid and alkaline DNAses in grey and white matter regions of developing and aging rat / R.K.W. Subba, R.K. Subba //Mech. Age. Develop. 1982. -V. 18. - P. - 225-238.

209. Suck, D. DNA recognition by DNase /D.Suck//J Mol Recognit- 1994. -V.7.-P.123-129

210. Sun, D. Y. Separate metabolic pathways leading to DNA fragmentation and apoptotic chromatin condensation / D. Y. Sun, S. Jiang, L. M. Zheng et al. // J. Exp. Med. 1994. - V.179. - P.559-568.

211. Suvarchala, E. Changes in DNAse and DNA-polymerase activities in different tissues of chick with age / E. Suvarchala, C. Ratnavatchi, P.D. Rebecs, R.K. Subba//Indian J.Biochem. And Biophys. -1991. -V. 31, № 29. P. 6769-6773.

212. Szopa, J. Is the 65 kDa protein direct signal for the nuclease release from nuclear matrix, starting the apoptotic cascade? / J. Szopa, R. Adamiec //Acta Bioch. Polonica.- 1993.- V.40, № 2.- P.209-212.

213. Takahashi, T. Surface alloantigens of plasma cells / T. Takahashi, L.J. Old, E. A. Boyse // J Exp Med. 1970. - V. 131, N. 6. - P. 1325-1341.

214. Tanuma, S.-L. Multiple form of nuclear deoxyribonuclease in rat thymocytes / S.-L. Tanuma, D. Shiokawa // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 203, № 2. - P. 789-797.

215. Taos, N.M. Indudtion of single-stranded DNA breaks in T-cell leukemia virus or bovine leukemia virus //J. Cell. Biochem.- 1994,-Suppl. 18C.- P.216.

216. Thoma, F. Nucleosome positioning //Biochim. Biophys. Acta. Gene Struct, and Express.- 1992.- Vol.1130, №1.- P. 1-19.

217. Thornberry, N. A. Caspases: enemies within / N. A. Thornberry, Y. Lazebnik // Science. 2002. - V. 281, № 5381. - P. 1312-1316.

218. Tournut, R. Cancer pancreatitis and the defection of the isoenzymes of DNAse, RNAse and amylase / R. Tournut, B.J. Allan, T.T. White // Clin. Chim. Acta.- 1978.- V.88, №2.- P.345-353.

219. Trautmann, A. T cells and eosinophils cooperate in the induction of bronchial epithelial cell apoptosis in asthma / A. rautmann, P. Schmid-Glendelmeier, K. Kruger et al. // J. Allergy Clin Immunol. 2002. - V. 09. - P. 329-337.

220. Tsumori, К. T cells of atopic asthmatics preferentially infiltrate into human bronchial xenografts in SCID mice / K. Tsumori, H. Kohrogi, T. Goto Et al. // J. Immunol. 2003. - V. 170, N. 11. - P. 5712-5718.

221. Tsutsumi, S. Association of DNase I phenotype 2 with colorectal carcinoma risk in Japanese populations / S. Tsutsumi, H. Takeshita, T. Yasuda et al. // Cancer Lett. -2000. V. 159, N. l.-P. 109-112.

222. Ulmer, A.J. Isolation and subfractionation of human peripheral bloodmononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifiigation on Percoll./ AJ.Ulmer, W.Scholz, M.Ernst et al.// Immunobiology.- 1984.-V.166.-P.:238-50

223. Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease/ D. Urboniene, R. Sakalauskas, B. Sitkauskiene // Medicina(Kaunas). 2005. - V. 41, N. 3. - P.190-195.

224. Vandenbark, A. Differential susceptibility of human Thl versus Th2 cells to induction of anergy and apoptosis by ECDI/antigen-coupled antigen-presenting cells/A.Vandenbark, D.Barnes, T.Finn et al.//Int. immunol.-2000.-V. 12. -P.57-66.

225. Vignola, A.M. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma/ A.M. Vignola, P. Chanez, A.M. Campbell, et al. // Am J Respire Crit Care Med.- 1998.-V.157.- P.403-409;

226. Vignola, A.M. Apoptosis and airway inflammation in asthma/ A.M. Vignola, G. Chiappara, R.Gagliardo et al.//Apoptosis.-2001.-V.5.-P.473-485/

227. Wadano, A. Isolation and characterization of multiple forms of ovine pancreatic deoxyribonuclease / A. Wadano, P.A. Hobus, P.-H. Liao//Biochemistiy. 1979. - V. 18, № 18.-P. 4121-4130.

228. Walker, P.R. Endonuclease activities associated with high molecular weight and internucleosomal DNA fragmentation in apoptosis / P. R. Walker, V. M. Weaver, Lach et al. // Exp. Cell Res. 1994. - V. 213. - P. 100-106.

229. Wang, X. Mechanisms of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans / X. Wang, C. Yang, J. Chai et al. // Science. 2002. - V. 298, №5598.-P. 1587-1592.

230. Weston, S. A. X-ray structure of the DNase I-d(GGTATACC)2 complex at 2.3A resolution/S.A.Weston, A.Lahm, D.Suck//J Mol Biol.-1992.-V.226-P. 12371256.

231. Widlak, P. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I / P. Widlak, L.Y. Li, X. Wang et al. // J Biol Chem. 2001. - V. 276, N. 51.- P. 48404-48409.

232. Widlak, P. Ionic and cofactor requirements for the activity of the apoptotic endonuclease DFF40/CAD / P. Widlak, W. T. Garrard // Mol Cell Biochem. -2001.-V. 218, N. 1-2. P. 125-130.

233. Wu, Y.-C. NUC-1, a Caenorhabditis elegans Dnase II homolog, function in an inermediate step of DNA degradation during apoptosis/ Y.-C.-Wu, G.M. Stan field, H.R. Horvitz //Genes @ Dev.-2000.-V.14.-P.536-548.

234. Wyllie, A. An endonuclease at last // Nature.- 1998.- V.391.-P.20-21.

235. Xerri, L. Frequent nuclear localization of ICAD and cytoplasmic co-expression of caspase-8 and caspase-3 in human lymphomas / L. Xerri, F. Palmerini, E. Devilard et al. // J Pathol. 2000. - V. 192, N. 2. - P. 194-202.

236. Xie, Z.J. Morphological observation of tumor infitrating immunocytes in human cancer/Z.J. Xie, L.M.Jia, Y.C. He et aI.//World J.Gastroenterol.-2006.-V.12.-P1757-1760.

237. Yakovlev, A. G. Role of DNAS1L3 in Ca2+- and Mg2+-dependent cleavage of DNA into oligonucleosomal and high molecular mass fragments / A.G. Yakovlev, G. Wang, B.A. Stoica et al. // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27, № 9. -P. 1999-2005.

238. Yasuda, T. Human seminal deoxyribonuclease I (DNase I): purification, enzymological and immunological characterization and origin / T. Yasuda, K. Sawazaki, D.Nadano et al. // Clin Chim Acta. 1993. - V. 218, N. 1. - P. 5-16.

239. Yasuhido, J. Chromatin endonuclease of rat hepatotumor induced by anazodye / J. Yasuhido, H. Hibino // Biochem. Intern.-1982,- V.4, №2.- P.229-231.

240. Yoshida A. Human Apurinic /Apyrimidinic endonuclease (Apel) and its N-terminal truncated form (AN34) are involved in DNA fragmentation during apoptosis/ A. Yoshida, Y. Urasaki, M. Walthman et al. //J. Biol.Chem.-2003.-V.278.- P.37768-37776.

241. Yoshihara, K. Ca ,Mg -dependent endonuclease antibody detects specifically a class of chromatin-bound endonuclease / K. Yoshihara, K. Ota, T. Ide et al. // Biophys Res Commun. 1997. - V. 236, N. 2. - P. 423-426.

242. Zhivotovsky, B. Role of nuclease in apoptosis / B. Zhivotovsky, D. Wade, P. Nicotera et al.//Intern. Arch. Allergy. Immunol. -1995. -V.105, № 4. P. 333-336.

Информация о работе

Нсангу Молу Мама Дезире
кандидата биологических наук
Казань, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Дезоксирибонуклеазы лимфоцитов периферической крови человека в норме и при атопической бронхиальной астме - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы