Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие стрессовых факторов на хромосомы соматических клеток дрозофилы в условиях нарушенного синтеза белков теплового шока

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Действие стрессовых факторов на хромосомы соматических клеток дрозофилы в условиях нарушенного синтеза белков теплового шока"

Р Г Б од

... • | ^ •*«

* I ? " ' ,

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ДЕЙСТВИЕ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ НА ХРОМОСОМЫ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ДРОЗОФИЛЫ В УСЛОВИЯХ НАРУШЕННОГО СИНТЕЗА БЕЖОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

Специальность: 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наух

На правах рукописи

КУЩЮВА Кляв Анатольевна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук старший научный сотрудник Л А. Мамон

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Е Я Шварцман

кандидат биологических наук доцент А. Д. Харазова

Ведущее учреждение: Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН

Защита диссертации состоится "¡2." ЛхЗх^Л 1995 г. в ¡Ь ч на заседании специализированного Совета Д. 063.57. 21. по защите диссертаций на соискание, ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном •университете по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СШГУ, кафедра генетики к селекции.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СШГУ.

Автореферат разослан "Х?>" **-' ¿.^^■••-У

.1994 г.

Учений секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

проф. Л. 3. Кайданов

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Жизнедеятельность организмов протекает в изменяющихся условиях окружающей среды. Некоторые из этих изменений (повышение температуры, отсутствие достаточного количества кислорода и др.) способны вызвать в клетке состояние физиологического стресса и привести к глубоким функциональным нарушениям, затрагивающим важнейшие клеточные структуры и функции. Однако после окончания стрессовых воздействий клетка может вернуть исходную целостность и исходный метаболизм. Это свойстео нивой клетки было открыто еще в 30-е гг. Д. Н. Насоновым (Насонов, 1937). Обратимое состояние клетки после действия стрессовых факторов было названо им паранекрозом.

Состояние физиологического стресса сопровождается активацией небольшой группы высококонсервативных генов , кодирующих так называемые белки теплового шока (БТШ), которые необходимы для защиты многих клеточных структур от повреждающего действия стрессовых факторов. Мишенью для действия стрессовых факторов являются как цитоплазматические структуры, так и генетический аппарат клетки. Известно, что стрессовые факторы могут модифицировать мутационный процесс, индуцированный мутагенными факторами (Тихомирова, 1980), внося, таким образом, вклад в генотипическую изменчивость орга-ни?ма. Поэтому актуальным является решение вопроса о том, какую роль играют БТШ в защите и восстановлении генетического аппарата клетки после действия стрессовых факторов.

В качестве экспериментального подхода для решения этого вопроса может служить исследование эффекта воздействий стрессовыми факторами на организмы, у которых нарушен синтез этих белков. К таким организмам относятся особи мутантной линии 0. .те1апоеаз1ег 1(1)Ьз403, характеризуются запаздыванием включения защитной системы в ответ на тепловое воздействие. Поскольку ген, мутантная аллель которого 1(1)1э403 приводит к подобному эффекту, до сих пор не клонирован и продукт его неизвестен, необходимо было использование других экспериментальных подходов, вызывающих временное нарушение синтеза БТШ в ответ на.температурное воздействие у особей другого генотипа, что позеолило бы более точно выявить функ-

ции этих белков. Таким подходом молет быть тепловое воздействие на личинок дикого типа в анаэробных условиях, при котором наблюдается временный блок экспрессии генов БТШ.

Ранее было показано, что высокая температура эффективно индуцирует нерасхождения и потери половых хромосом в потомстве самок мутантной линии дрозофилы l(i)ts403 (Мамон и др., 1990). . Механизм данного эффекта до сих пор остается неизвестным. Его выяснению способствовал бы цитологический анализ повреждений генетического аппарата клетки после стрессового воздействия на особей с нормальным и дефектным функционированием системы ВГИ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов участия БТШ в защите генетического аппарата клетки от повреддающгго действия стрессовых факторов. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1). Подобрать дозы стрессовых факторов, изоэффективные по повреждающему действию на личинок с нарушенным синтезом БТШ.

2). Изучить динамику синтеза . БТШ в клетках нервных ганглиев личинок дрозофилы в зависимости от генотипа и характера функционирования системы БТШ после действия стрессовых факторов.

3). Провести цитологический анализ повреждающего эффекта стрессовых факторов на хромосомы нейробластов личинок дрозофилы, характеризующихся нормальным и нарушенным синтезом БТШ.

4). Оценить продиферативную активность клеток нервных ганглиев личинок с нормальным и нарушенным функционированием системы БТШ после действия стрессовых факторов.

. Научная новизна работы. Впервые использовался новый подход для временного блокирования индукции генов БТШ у организмов с нормальным функционированием данной защитной системы - проведение теплового воздействия в анаэробных условиях. Предложен критерий для оценки повреждающего действия стрессовых факторов - время регрессии пуфов теплового шока в .политенных хромосомах личинок дрозофилы.

Проведен параллельный анализ динамики синтеза БТШ и таких клеточных параметров, как соотношение различных типов метафазных пластинок, пролиферативная активность клеток в

нервных ганглиях личинок с нормальным и нарушенным синтезом БТШ в ходе восстановления после стрессовых воздействий. Результаты работы позволяют предположить участие ВТШ в ликвидации слипаний хромосом и восстановлении клеточной пролиферации после действия стрессовых факторов.

Практическая ценность работы. Показана важная роль БТШ в восстановлении генетического аппарата клетки и ее способности к делениям после действия стрессовых факторов. Полученные результаты указывают на необходимость учитывать характер функционирования БТШ у организмов при изучении эффектов стрессовых факторов. Показано, что комбинация определенных факторов приводит к нарушениям системы БТШ и к усилению повреждающих воздействий окружающей среды.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра", Гродно, 1990; докладывались на заседании Научной сессии, посвященной 75-летнему юбилею кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Объем работы. Диссертация изложена на 153 стр. , состоит из введения, 4 глав и выводов, содержит 9 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 203 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали личинок третьего возраста D. nielanogaster двух линий: l(l)ts403, дефектной по синтезу БТШ, и линии дикого типа Кантон С.

Личинок подвергали действию высокой температуры 37°С в водном ультратермостате UTU-3. Для создания анаэробных условий личинок погружали в раствор Зфрусси-Бидла при температуре 24+1° С. Комбинированное действие высокой температуры и анаэробных условий осуществляли, погружая личинок в раствор Эфрусси-Бидла при температуре 3/>С.

Приготовление препаратов политенных хромосом.. Выделяли слюнные железы личинок в растворе Эфрусси-Бидла, фиксировали их в растворе ацетоорсеина в течение 45.-60 мин и'раздавливали в 55%-ном растворе молочной кислоты. Исследовали локусы политенных хромосом 63В, 67В, 87А, 87C и 93D, в которых'расположены пуфы ТШ.

Эксперименты проводили в 3-х повторностях. В каждой

- б -

яовторности было проанализировано по 4 препарата на каэдый срок фиксации слюнных желез для всех вариантов опыта.

Электрофоретическое разделение белков. Пробы нервных ганглиев инкубировали в 10 мкл физиологического раствора, содержащего ®®3-метионин с активность 20-40 мкКи. Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле по методике, предложенной Лэммли и 5эвром (Laemmli, Favre, 1973) при концентрации концентрирующего геля 5%, разделяющего геля - 12%.

Сразу после окончания электрофореза гель обрабатывали в растворе диметилеульфоксида й в 22. 2Х-ном растворе 2,Б-дифе-кшкжеаэола, промывали и высушивали. После этого гель экспонировали с рентгеновской пленой РМ-1 при температуре -70°С в течение 7-14 суток.

Все эксперименты проводили в 3-х повторностях.

Оценку интенсивности синтеза ВТШ в клетках нервных ганглиев личинок двух линий в.контроле и после стрессовых воздействий проводили путем денситометрирования электрофо-реграмм на денситометре 2202 Lütroscan (LKB, Швеция).

Приготовление препаратов иитотнческих хромосом из нервных ганглиев личинок дрозофилы проводили по модифицированной методике, предложенной Халфер (Halfer, 1981), предварительно инкубируя ганглии в Ы растворе колхицина.

Далее препараты промывали в двух сменах буфера Соренсе-на и окрашивали в 3-5 %-ном растворе красителя Гимза.

При анализе подсчитывали и классифицировали присутствующие на препарате клетки с визуализированными хромосомами.

Эксперименты проводили в 3-х повторностях. В каждой повторности анализировали по 4 препарата на каздый срок фиксации нервных ганглиев для всех вариантов эксперимента.

Статистическую обработку проводили с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости оС=0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУВДВМЕ 5 1. Подбор иаозффскттта доз схрсссошл воздействий

Экспрессию -генов БТИ1 можно наблюдать на политенных хромосомах дрозофилы по появлению пуфов ТЕ При действии высокой температуры в анаэробных условиях пуфы ТШ индуцируются не сразу, а лишь спустя 10-20 мин после перенесения личинок в нормальные условия.

Известно, что система БТШ авторегулируется; при этом более продолжительное воздействие приводит к более поздней регрессии пуфов ТШ л нарушение системы БТШ та ¡еже вызывает более длительное, чем в норме, существование данных пуфов. Вследствие этого в качестве критерия при выборе сравниваемых доз стрессовых воздействий мы выбрали время регрессии пуфов ТШ после окончания стрессовых воздействий.

Результаты показывают, что нарушение нормального функционирования системы БТШ у личинок линии l(l)ts403 после теплового воздействия и у личинок линии Кантон С после действия высокой температурой в анаэробных условиях приводит к задержке регрессии пуфэв ТШ. При этом по времени регрессии пуфов ТШ эффект 30-минутного действия высокой температуры на личинок линии ](3)ts4D3 эквивалентен эффекту 13-минутного теплового воздействия в анаэробных условиях на личинок линии Кантон С.

§ 2. Динамика синтеза БТШ после действия стрсссових

факторов на личинок дрозофилы двух изучаемых лилий

Сопоставление динамики изменения относительной интенсивности синтеза БТШ для личинок двух линий после 30-минутного теплового воздействия выявило различия между линиями. Если у личинок линии Кантон С сразу после ТШ отмечен максимальный уровень суммарного синтеза ВТШ, а через 1 ч после во?действия этот показатель статистически значимо не отличается от контрольного уровня, то у личинок линии l(l)ts403 суммарный синтез БТШ достигает максимума только через 1 ч после теплового воздействия и снижается до контрольного уровня только через б ч после ТШ. Сразу после воздействия относительная интенсивность суммарного синтеза БТШ у личинок линии Кантон С статистически значимо выше таковой у личинок линии 1(1)ts403.

При изучении динамики изменения интенсивности синтеза БТШ в ходе восстановления после 13-минутного воздействия высокой температурой, анаэробными условиями и их комбинированного действия на личинок дикого типа из-за больших статистических ошибок для этого показателя в большинстве случаев не удалось выявить достоверных различий между разными вариантами эксперимента, поэтому можно говорить лишь о тенденциях.

Сразу после теплового воздействия наблюдается резкая индукция синтеза БТШ, но -в ходе воестановления личинок этот показатель быстро снижается и уже через 1 ч после воздействия не отличается от контрольного. Анаэробное воздействие в течение 13 мин вообще не приводят к индукции синтеза стрессовых белков. При действии высокой температуры в анаэробных условиях сразу после воздействия синтез БТШ остается на том же уровне, что и в контроле, и его повышение наблюдается только через 1 ч после воздействия; снижение индуцированного синтеза данных белков происходит только через б ч после воздействия.

Итак, можно отметить следующие сходные моменты в динамике синтеза БТШ после стрессовых воздействий в нервных ганглиях личинок, у которых было нарушено своевременное включение данной защитной системы: максимальный уровень синтеза этих белков наблюдается только через 1 ч после окончания воздействий и они дольше синтезируются на высоком уровне (по крайней мере в течение 4 ч после воздействий).

§ Я Цитологическое изучение хромосом нейробластав лтшюк дрозофилы двух линий после стрессовых воздействий

При изучении повреждающего эффекта стрессовых факторов, действующих на хромосомы. клеток нервных ганглиев личинок дрозофилы двух линий, выделили следующие типы метафазных пластинок: нормальная, с полностью или частично расправленными хромосомами; со слипанием хромосом; со слипанием сестринских хроматид; а также другие, которые мы объединили в класс "Прочие". Частота клеток последнего класса оставалась низкой и существенно не менялась после действия изучаемых стрессовых факторов.

В качестве контроля мы использовали уровень изучаемых показателей до начала воздействия.

Результаты анализа метафззных пластинок в клетках нервных ганглиев личинок двух линий после ЗО-минутного теплового воздействия представлены в табл. 1. Такое воздействие индуцирует значительные. изменения соотношения метафазных пластинок равного типа в клетках нервных ганглиев личинок обеих исследуемых линий, что можно наблюдать сразу после окончания воздействия. Однако уже через 1 ч после прекращения воздействия у личинок дикого типа частота всех типов ме-

Таблица!. Средняя частота иетафааиых плпстшюк разного типа в ¡слетках нервных ганглиев личтюк линий Кантон С и 1( 1)1в40Э в контроле и после тсшюратурпого воздействия в течение 30 иип

Линия Время после воздействия (Ч) Тип метафззных пластинок

Норма Слипание хромосом Слипание хроматид Прочие

Контроль 93.8 +0.7 2.9 +0. 5 0.9 +0.4 2.4 +0.3 *

0 63.6 й +4.8 24.0 й +5.2 1.9 +1.0 10.4 .+4.2

1 94.3 +0.8 * 2.8 +0.7 * 0.7 +0.2 * 2.3 +0.5

Кантон С 2 91.8 +0.7 * 4.8 й +0.7 * 1.0 +0.3 * 2. 4 +0. 5

4 93.7 +0.7 2.8 +0.4 0. 8 +0. 3 2.7 +0. 4

6 92.9 +1.0 2.6 +0.7 1. 1 +0. 4 3.4 +1.3

а 90. 4 +2.1 5.1 +2.3 1.0 +0. 4 3.6 +1.0

Контроль 92.8 +0.7. 2.4 +0. 5 0.8 +0,2 4.0 +0.5 *

0 42.1 Я +9.5 42.8 й +11.3 5.8 +3.1 9.3 +3.7

1 30. 8 К +9.9 * 64.2 й +9.8 * 10.9 й +3.7 * 4.0 +2.8

1(1)Ьэ403 2 85.3 й +1.8 * 9.5 й +1.6 * 3.9 Й +0.8 * 1.4 +0.5

4 92.1 +1.0 4. 6 й +0.9 1.1 +0.3 2.2 +0.6

6 89.2 +2.2 3.9 +1. 4 1.8 +0.8 5.0 +1.3

8 90. 4 +1.4 3.9 +1. 3 1.6 +0. 7 4.1 +1.2

Условные обозначения: и - статистически значимое (Р<0.05) отличие от контрольного уровня

* - статистически значимые (Р<0. 05) различия между линиями

тафаэных пластинок не отличается от контрольного уровня и в дальнейшем не изменяется (за исключением точки £ ч после воздействия, когда несколько повышена по сравнению с контролем частота слипаний хромосом). В то же время, у личинок линии 1(1)Ьг403 восстановление контрольного соотношения мета-фазных пластинок разных типов происходит только через б ч после окончания воздействия.

Результаты анализа метафазных пластинок в клетках нервных ганглиев личинок линии Кантон С после 13-мииутгого теплового воздействия, пребывания в анаэробных условиях и комбинированного действия этих факторов представлены в табл. 2. Все использованные способы воздействий вызывают изменение соотношения частоты метафазных пластинок разного типа в клетках нервных ганглиев личинок дикого типа по сравнению с контролем, что регистрируется сразу после окончания воздействий. Через 1 ч после теплового воздействия частота нормальных метафазных пластинок возвращается к контрольному уровню, а частота слипаний хромосом снижается и лишь незначительно превышает контрольный уровень. Во все последующие сроки фиксации нервных ганглиев после подобного воздействия у личинок сохраняется контрольное соотношение метафазных пластинок разных типов. После пребывания личинок в анаэробных условиях частота слипаний хромосом превышает . контрольный уровень в период до 2 ч восстановления, а также в точке 8 ч после воздействия. После комбинированного воздействия наблюдается более значительное падение частоты нормальных метафазных пластинок и повышение частоты слипаний хромосом, чем после действия каждого из факторов по отдельности. Частота этих клеток воэьрашдется к контрольному уровни лишь через б ч после воздействия, а через 8 ч после него она вновь отличается от контрольной.

Проверка на аддитивность показала, что эффект совместного применения двух изучаемых стрессовых факторов по критерию частоты нормальных метафазных пластинок оказался выше аддитивного в точках 1*2 ч после воздействия, а по критерию частоты метафазных пластинок со слипаниями хромосом - в точках 1 и 4 ч после воздействия.

Итак, мы показали, что первичная чувствительность клеток к повреждающему действию стрессовых факторов на хромосо-

- 11 -

Т а б л и ц а г. Средняя частота (2) иетафазных пластинок разного типа н платках нервных аянгжюв личинок дрозофилы линия Кантон С в контроле н после различных 1юад5йстиий в течение 13 чин

Вариант эксперимента Время после воздействия -(ч) Тип метафэзных пластинок

Норма Слипание хромосом Слипание хроматкд Прочие

Контроль 95.2 +0. 7 2.2 +0.5 0.5 +0.2 2. 1 +0. 7

0 82.3 # +3.2 а 12.5 # +2.6 * 2.8 +1.3 2. 4 +1. 4

1 89.9 +2.8 * 5.5 Я +1.1 * 0.8 +0. 4 * 3.8

Тепловое воздействие 2 93.7 +0.5 л 3.2 +0.7 * 1.2 +0.3 1.9 +0.4

4 94.4 +0.9 * 3.2 +0. 7 а 0.9 +0.3 1.5 +0.3

6 93.3 +1. 3 4.0 +1. 0 1.0 +0.3 1.7 +0.5

8 95. 2 +0.7 * 2.8 +0. 5 * 0.7 +0. 4 1.2 +0. А

0 84.4 « +3.5 6> 10.6 9 +3.6 @ 1.4 +0. б 3.6 ¿1.2 ®

Анаэробные 1 89.5 й +2.1 @ 7.7 И +1.7 е 1.2 +0.7 1. 5 +0.4

2 87.9 в ¿2. В <$ 6.9 +2.5 2. 2 # +0.6 3,1 +1.8

условия 4 90. 2 # +2. 2 5.0 +1.6 9 2.2 +0.8 2.6 +0.8

6 92. 9 +1. 4 4.0 +1.0 1.1 . +0.7 2.0 +0.5

8 91.8 +1.5 5.4 # +1.4 1.4 +0.4 1.4 +0.5

Таблица 2. Окончание

Езриант эксперимента Время после воздействия (ч) Тип метафазных пластинок

Норма Слипание хромосом Слипание хроматид Прочие

О 63. 4 # +6. 8 30. 8 / +5.8 5.8 +3.0 0.0 Я +0.1 @

Тепловое воздействие в 1 66.0 # +4.9 27.0 # +.3. 9 6.3 # +2.4 * 0.7 +0.7

2 63.8 # +10.2 23.3 # +7.8 * 11.2 +8. 2 1.7 +1.2

анаэробных условиях 4 81.6 # +4. Б * 15.9 # +4. 5 1.1 +0. б 1. 4 +0.6

6 93.0 +1.2 4.4 +1.0 1.2 +0.4 1.5 +0. 4

8 80. 7 # +5. 8 * 15.0 И +4. 8 * 3.7 , +1.7 0. Б +0.3

Условные обозначения:

а - статистически значимое (Р<0.05) отличие от контрольного уровня;

* - статистически вначимое (Р<0.05) различие вариантов "Тепловое воздействие" и "Тепловое воздействие в анаэробных условиях";

е - статистически значимое (Р<0.05) различие вариантов "Анаэробное воздействие" и "Тепловое воздействие в анаэробных ловиях".

достоверно не различается у,личинок с нормальным и нарушенным синтезом ВТШ. Однако отсутствие своевременного ответа на действие высокой температуры коррелирует с замедлением восстановительных процессов в митотических клетках после стрессовых воздействий. Полученные результаты позволяют предположить участие БТШ в ликвидации повреждений хромосом митотических клеток после действия стрессовых факторов.

При анализе препаратов нервных ганглиев были выявлены клетки с разной степенью пульверизации хромосом и аномальной агрегацией хроматина. Поскольку встречались переходные меаду этими вариантами типы клеток, мы обг«диншш их в один класс - клетки с аномальной морфологией хроматина. Известно, что

изучаемые нами стрессовые факторы вызывают преждевременную конденсацию хромосом, которая еыглядит как их пульверизация, а также аномальную агрегацию интерфазного хроматина. Но феномен пульверизации известен и для метафазных хромосом. Используемые нами методики не позволили выявить, на какой стадии клеточного цикла находятся наблюдаемые нами клетки с аномальной морфологией хроматика. В качестве показателя повреждающего действия стрессовых факторов мы сочли возможным рассматривать абсолютное число таких клеток на препарат.

' На рис. 1 отображены данные по числу клеток с аномальной морфологией хроматина для личинок двух исследуемых линий в ходе восстановления после 30-минутного теплового воздействия. Действие высокой температуры выэывгет сходное повышение числа таких клеток на ганглий личинок обеих исследуемых линий. Через 1 ч после воздействия их число возвращается к контрольному уровню у личинок обеих линий. Впоследствии число таких клеток у личинок линии Кантон С продолшет оставаться на уровне контроля, а у личинок линии К1)1э403 начиная с 2-х ч и вплоть до 8-ми ч после воздействия оно постоянно повышается, превышая во всех точках фиксации контрольный уровень. Через 2 и через 8 ч после воздействия наблюдаются достоверные различия мевду линиями по этому показателю.

Мы предполагаем, что наблюдаемые нами сразу после теплового воздействия у личинок обеих линий клетки с аномальной морфологией хроматина являются клетками фаз (32 или поздней 3, которые находились в этих фазах в момент воздействия и претерпели преждевременную конденсацию хроматина. Через 1 ч после воздействия уровень конденсации хроматина в таких клетках возвращается к норме за счет каких-то механизмов, по-видимому, не свяаанных с функционированием БТШ.

Накопление клеток с аномальной мор£ологией хроматина у мутантных личинок в период с 2 до 8 ч восстановления, может быть, является следствием того, что клетки, находившиеся в момент воздействия в интерфазе, начинают вступать в митоз. Возможно, вследствие недостатка в клетках мутантных личинок в момент воздействия БТШ, у них происходит нарушение нормальной конденсации хромосом в митозе.

13-минутное действие изучаемых стрессовых факторов на личинок дикого типа, как правило, не приводит к возрастанию

40-1

25-

зо

8

£ 25

5

о Я>Н

I-

103-

......

I-1-1-1-1-1-1-r^-1-1

«012345 « 7« sraux noon воздействия <t

Рис. 1. Динамика изменения числа клеток с аномальной морфологией хроматина в ганглиях личинок двух линий после 30-минутного теплового воздействия.

-- - линия Кантон С; ------- - линия l(l)ts403;

К - контрольный уровень;

• - статистически значимое (Р<0.05) отличие от контроля; О - статистически внзчимые (Р<0.05) различия между линиями.

—I-т-1-1-1-т~

2 S 4 5 в 7 вгкш поста воздействия ч

Рис.2. Динамика изменения числа клеток с аномальной морфологией хроматина в ганглиях личинок линии Кантон С после 13-минутного действия стрессовых факторов.

- - тепловое воздействие; --- - анаэробное воздействие;

----- - тепловое воздействие в анаэробных условиях;

К - контрольный уровень;

• - статистически значимое (Р<0. 05) отличие от контроля..

в их нервных ганглиях сразу после окончания воздействий числа клеток с аномальной морфологией хроматина, что видно иэ графиков, представленных на рис. 2. В данной серии экспериментов увеличение числа таких клеток выше контрольного уровня зарегистрировано только через 4 ч после воздействия высокой температурой в анаэробных условиях, однако эффект подобного комбинированного действия двух стрессовых факторов в этой точке фиксации не отличался от аддитивного.

Полученные нами результаты не позволяют сделать однозначного вывода об участии БТШ в нормализации процессов конденсации хроматина после стрессовых воздействий.

§ 4. Определение пролифоратнвиой шстивностн клеток транше ганглиев после стрессовых воздействий

Используемая нами методика приготовления препаратов нервных ганглиев и их анализа позволила нам определить суммарное число клеток, находящихся на стадии метафазы, в ганглии отдельной личинки. Этот показатель мы рассматривали в качестве меры лролиферативной активности клеток этой ткани.

На рис. 3 представлена динамика изменения числа метафаз-ных пластинок в ганглиях личинок двух линий после 30-минутного теплового воздействия. Сразу после теплового воздействия среднее число метафаз ¡¡а ганглий резко падает у личинок обеих линий. У личинок линии Кантон С уяе через 1 ч после такого воздействия происходит восстановление пролифэративной активности клеток до контрольного значения. У личинок му-тантяой линии этот показатель достигает контрольного уровня лишь через 4 ч после воздействия. К этому периоду исчезают достоверные различия между линиями по изучаемому показателю.

рис. 4 представлена динамика изменении среднего числа метадазных.пластинок на нервный ганглий у личинок линии Кантон С после 13-минутного действия высокой температуры, пребывания в анаэробных условиях и комбинированного действия этих факторов. Пребывание личинок в анаэробных условиях не оказывает влияния на пролиферативную активность кейроблас-тов. Действие высокой температуры в течение 13 мда на личинок в аэробных и анаэробных условиях вызывает снижение числа метафаз на ганглий сразу после воздействия.' Однако если уле через 1 ч после теплового воздействия в аэробных условиях

200-

180-

1«0-

g 1«-

с 120-

5

О 100-

5

я «о-

V

ÍO-

40-

20-

0-

Г 4 S «

вгоа пост квдгастюи ч

Рис.3. Динамика изменения числа метафааных пластинок на ганглий личинок двух линий после 30-минутного теплового воздействия.

--■ - линия Кантон С; ------- - линия 1(1)1з403;

К контрольный уровень;

• - статистически значимое ГР<0. 05) отличие от контроля; О - статистически значимые (Р<0. 05) различия между линиями.

зоо-|»0-180 j i« ¡ 120 , tool Hito <0 ra o-1

-i-1-1-1-r~

13 4 S в юш пост аэдсвстпн ч

Рис. 4. Динамика изменения числа метафазных пластинок на ганглий личинок линии Кантон С после 13-минутного действия стрессовых факторов.

-— тепловое воздействие;---- - анаэробное воздействие;

------ _ тепловое воздействие в анаэробных условиях;

К - контрольный уровень;

• - статистически значимое (Р<0. 05) отличие от контроля.

- 1? - .

данный показатель возврашдется к контрольному уровню, то после теплового воздействия в анаэробных условиях контрольного значения изучаемый показатель достигает только через 4 ч после воздействия.

Сравнение двух используемых экспериментальных систем показывает, что нарушение нормального синтеза БТШ вызывает сходное запаздывание восстановления пролиферативной активности клеток нервных ганглиев у личинок разных генотипов,

ВЫВОДЫ:

1. При нарушении своевременного включения системы белков теплового шока (у мутантной линии К1)Ьз403 при действии высокой температуры и у линии дикого типа Кантон С при тепловом воздействии в анаэробных условиях) происходит задержка регрессии пуфов теплового шо:<а в политенных хромосомах личинок. По времени регрессии данных пуфов ЗО-минутное тепловое воздействие в аэробных условиях на личинок, линии 1(1Нз403 изоэффективно 13-минутному тепловому воздействию в анаэробных условиях на личинок линии Кантон С.

2. 30-минутное тепловое воздействие на лнчинок линии 1(1Нз403 и 13-минутное действие высокой температуры в анаэробных условиях на личинок линии Кантон С вызывают сходную динамику синтеза белков теплового шока, которая отличается от динамики синтеза данных белков при тепловом воздействии в норме. Отличия заключаются в следующем: максимальный уровень синтеза этих белков наблюдается не сразу, а через 1 ч после окончания воздействия; их индуцированный синтез продолжается дольше, чем в условиях своевременного включения данной защитной системы.

3. Действие изучаемых стрессовых факторов приводит к увеличению частоты метафавных пластинок со слипаниями хромосом в нервных ганглиях личинок. В условиях нарушенного синтеза белков теплового шока восстановление . до контрольного уровня частоты клеток со слипаниями хромосом происходит медленнее, чем при нормальном синтезе данных белков.

4. Тепловое воздействие в течение 30 мин на личинок обеих исследуемых линий вызывает увеличение числа клеток с аномальной морфологией хроматина (пульверизация хромосом и агрегация хроматина). %рез 1 ч после воздействия чис но та-

ких клеток в ганглиях личинок обоих линий падает и не отличается от такового в контроле. В дальнейшем (с 2-х до 3-ми ч после воздействия) число таких клеток вновь превышает конт-ролькый уровень только у личинок мутантной линии. 13-минутное действие изучаемых стрессовых факторов на личинок линии Кантон С, как правило, не вызывает увеличения числа клеток с аномальной морфологией хроматина.

5. Б нервных ганглиях личинок исследуемых линий сразу после действия всех используемых стрессовых факторов (кроме 13-минутного анаэробного воздействия) наблюдается значительное снижение числа метафазных пластинок. В условиях нарушения включения системы белков теплового шока восстановление пролиферативной активности клеток происходит медленнее, чем в условиях нормального функционирования данной системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мамон Л. А. , Куцкова Ю. А. Особенности индукции пуфов теплового шока при одновременном действии высокой температуры и аноксии на личинок ОгоаорЬПа те1апоеазЬег // Структура и функции клеточного ядра: Тез. докл. X Всесоюзн. симп. Гродно, 1990. - С. 103.

2. Мамон Л А. , Куцкова Ю. А. Динамика индукции и регрессии вуффов 87А, 87С и 930 ъ политешшх хромосомах дрозофилы 'ОгозорЬПа те1апо£а$1.ег при действии аноксии и высокой температуры // Цитология. - 1991. - Т. 33. , N0 12. - С. 99-105.

3. Мамок Л. А. , Куцкова К1 А. Роль, белков теплового шока в восстановлении индуцированных высокой температурой повреждений митотических хромосом у 0гогорЫ1а те1апоеаз1сг // Генетика. - 1993. - .Т. 29, N0 4. - С. 804-512.

4. Мамон Л. А. , Куцкова 1а А.- Роль белков теплового шока в восстановлении клеточной пролиферации после воздействия высокой температурой на личинок ОгозорШа те1апоеаз1ег // Генетика. - 1993. - Т. 29, Ко 5. - С. 791-798.

5. Тихомирова М. М. , Ватти К. В. , Мамон Л. А. , Барабано-ва Л. В., Куцкова Ю. А. Механизмы, обеспечивающие устойчивость генетического материана клетки к стрессовым воздействиям // Генетика. - 1994. - Т. 30, N08. - С. 1097-1104.