Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие почвенной и атмосферной гипоксии на систему защиты растений от окислительной деструкции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Действие почвенной и атмосферной гипоксии на систему защиты растений от окислительной деструкции"

РГ6 Ой

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи УДК 577.150.3 + 561.522.4

ШАХНИНА Тамара Ивановна

ДЕЙСТВИЕ ПОЧВЕННОЙ И АТМОСФЕРНОЙ ГИПОКСИЯ НА СИСТЕМУ ЗАШИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ОКЙШТЕДЫШ ДЕСТРУКЦИИ

03.00.04 - биологическая химия 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущине - 1993

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук

Научные руководители : кандидат биологических наук

Закржевский Дмитрий Анатольевич, доктор биологических наук Биль Карл Яковлевич

Официальные оппоненты : доктор биологических наук

Музафаров Евгений Назибович, доктор биологических наук Мерзляк Марк Нисонович

Ведущая организация : Санкт - Петербургский Государственный

заседании специализированного совета Д.200.29.01 в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу : 142292, Пуадано, ИПФС РАН, конференцзал. ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЙПгС РАН Автореферат разослан "_//_ " 1993 г

Университет

Защита состоится

час. на

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

UBuiArf ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема устойчивости растений к неблагоприятным условиям окружающей среды, в том числе к дефициту кислорода, относится к основным направлениям биологии. Недостаток кислорода в почве или атмосфере является широко распространенным стрессовым фактором, ухудшающим рост и развитие растений. Быстрые темпы развития исследований в области гипоксии и аноксии в течение последних 10 - 15 лет привели к возникновение нового научного направления - изучения механизмов приспособления к гипо- и аноксии ( Гринева P.M., 1975; Чиркова Т.Б., 1965; Вартапетян Б.Б., 1985).

Дефицит кислорода возникает как в сельскохозяйственных посевах, так и в естественных условиях обитания растений, в результате заболоченности почв, обилкя осадков, образования корки льда в весенний период, паводков, в условиях высокогорья, а также при поливном земледелии и выращивании растений гидропонным способом.

Одни растения при затоплении погибают быстро, другие живут не только при дефиците, но и при полном отсутствии кислорода. Однако, для растений, как аэробов,речь может идти только о временном выживании при аноксии, поэтому даже временная способность переносить отсутствие кислорода представляет большой теоретический интерес как модель для познания путей адаптации растений (Гринева Г.14. , 1975, I960, Í9üti,i99'¿; 4иркова Т.В. ,i9cb,l9b2, 1984,1985,198b; вартапетян Б,Б.,1982; Мерзляк л.Н.,1989; Hunter M.U., Hethering А.И., Croivíord H.M.Í.I., 1963; Glinaki I., 3tep-nlessr ski W., 1984; Monk L.S., Fagestedt K.V., Crowford R.M.M., 1987).

К настоящему времени отрицательное действие почвенной гипоксии изучено преимущественно для корневой системы. Работы, посвященные исследованию особенностей функционирования фотосинтетического аппарата в этих условиях , немногочисленны (Казарян О.В.,Мвтян ri.A., 1967; Казарян Q.á.,I970; Космакова З.Е., Зверева Е.Г., 1973,1976; Закржевский д.А..Ладыгина Ü.H., 1989 ),

Одним из важных, но мало изученных неспецифических ответов растений на разные по природе стрессовые воздействия,является образование свободнорадикальных форм кислорода, которые вызывают перекисное окисление мембранных липидов, разрушение пигментов и клеточных структур в целом.

г

Растения располагают рядом защитных систем от активных форм кислорода. Эту роль выполняют каротиноидытокоферолы, аскорбиновая кислота, глутагион и ряд ферментов: пероксидаза, ката-лаза, глутатионредуктаза. Одним из важнейших ферментов, защищающих клетку от супероксидных радикалов, является супероксид-дисмутаза (СОД)

Регуляция процессов образования и нейтрализации активных форм кислорода при фотосинтезе и корневом питании растений может стать одним из эффективных способов повышения устойчивости растительных систем к неблагоприятным условиям среды, В связи с этим важность изучения защитных антиокислительных систем не вызывает сомнений.

Цель и основные задачи исследования. Основная цель иссле-дованая-изучение влияния почвенной и атмосферной гипоксии на систему защиты растений от окислительной деструкции. В связи с этим перед нами стояли задачи:

- исследовать особенности функционирования ферментов-де-токсикаторов активных форм кислорода в корнях и листьях растений, различающихся по устойчивости к дефициту Од

- изучить зависимость интенсивности процессов перекисного окисления липидов от условий аэрации растительных клеток

- сравнить активность СОД и содержание малонового диаль-дегида в корнях и листьях с целью выяснения возможной взаимосвязи устойчивости отдельных органов и растения в целом у культур с различной устойчивостью к дефициту кислорода

- исследовать взаимосвязь между активностью системы защиты растений от окислительной деструкции и интенсивностью и направленностью фотосинтетического углеродного метаболизма.

Научная новизна.В работе впервые проведен детальный анализ влияния почвенной и атмосферной гипоксии, а также их сочетания на систему защиты тканей корней и листьев от окислительного повреждения.

Впервые проведена сравнительная оценка активности СОД и содержания малонового диальдегида (МДА) в корнях и листьях, что позволяет лучше оценить адаптационные возможности целого растения в условиях гипоксии.

впервые использованы оригинальные методы определения""скорости диффузии в почве и величины устьичных сопротивлений листа, что позволяет ускорить и облегчить оценку доступности кислорода корневой системе растений и эндогенных факторов, лимитирующих фотосинтез.

Установлен фазовый характер в изменении активности ключевого фермента защиты от окислительного повреждения - супероксиддисму-тазы автотрофных и гетеротрофных тканей в условиях гипоксическо-го стресса. Выявлены фазы относительной стабильности фермента, его активации и ингибирования. Установлено, что продолжительность каждой из фаз определяется индивидуальной устойчивость» растений и дозой стрессового воздействия.

Показано, что в адаптации к гипоксическому стрессу принимают участие все зкизненноважные функции растений такие как рост, развитие, фотосинтез. Устойчивые виды характеризуются отсутствием снижения накопления биомассы и способность«) к релаксации фотосинтетическсго процесса.

Практическая ценность. Результаты исследований ферментов завиты от окислительной деструкции и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) могут быть использованы при ранней диагностике неблагополучного состояния растений, в селекционно-генетических исследованиях, направленных на создание форм, сортов к гибридов растений, устойчивых к действию неблагоприятных факторов, а также в учебных курсах по физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Результаты, представленные в диссертации, были доложены на Международном симпозиуме стран-членов СЭВ "Элементы газообмена листа и целого растения и их изменения в онтогенезе" (Москва.Пущино. 1965); Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино.1991); Всесоюзном соЕещании "Клеточные механизмы адаптации " (Чернигов. 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура п объем диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, о? глав экспериментальной части и выводов. Работа изложена

на ¡¿Остраницах машинописного текста, содержит /9- рисунков и Zé таблиц. Список цитируемой литературы включает //,Ç~наи-менований отечественных и /Z& зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. Опытными растениями являлись кукуруза £Zea mais Ь ) сорт KIQ 22-10, ячмень (Hordeum vulgare Ь ) сорт Московский -3, горох (ïisaum aativum L ) сорт Превосходный. Основным критерием подбора растений для опытов служила их чувствительность к почвенной гипоксии при переувлажнении. Кукуруза - культура высокоотзывчивая к гипоксическим воздействиям (Гринева Г.М.,1975; Чиркова Т.В., 1988 ). Растения ячменя в период всходов обладает меньшей восприимчивостью к недостатку Oj. чем овес, пшеница, кукуруза (Glinski I., Stepniewski W., 1984 ). Горох относится к культурам, которые плохо переживают условия затопления и гипоксию ( Гринева Г.М., 1975 ).

В ряде экспериментов были использованы растения традесканции .'( Tradescantia ilumicensia veil ), отличающейся высокой теневыносливостью и жизнеустойчивостью к условиям анаэробиоза, что делает её удобным объектом для исследования механизмов фотосинтеза в экстремальных условиях (Закржевский Д.А.,1968)

Условия культивирования растений. Растения ячменя выращивали в климатической камере KB - IP при 16 часовом фотопериодз, интенсивности света 35 тыс. люкс и температуре 22° днем и 10° ночью. В качестве субстрата использовали верховой торф pH 6,6 на питательной смеси Кнопа (Гродзинский A.M..Гродзинский A.M., 1973). до 10 суточного возраста растения выращивали при оптимальном водоснабжении ( 70 % полной полевой влагоемкости - 7С$ППВ)и скорости диффузии кислорода в прикорневой зоне - 120 мкг-м~^секГ Затем опытные растения переносили в условия переувлажнения (120? ППВ) и скорости диффузии кислорода в субстрате - 10 мкг-ц -секТ на 12 суток. Для изучения обратимости действия стрессового фактора часть растений возвращали к нормальным условиям водообеспе-ченности и через 7 суток использовали для анализов.

Для выращивания растений кукурузы и гороха в качестве субстрата использовали серую лессовую почву рНн 0= 7,3 и P%qj- 7,1,

содержащую 1,54 % органического материала,_15I-0,1_мм-фракции, —--------

80 ~%~0~Т-0 ,002 мм фракции и % глины.

Семена кукурузы и гороха предварительно проращивали на влажной фильтровальной бумаге при 20°в течение 3 дней. Затем в каждый вегетационный сосуд высевали по 3 растения и выставляли в камеры выращивания с заданными условиями: долгота дня 16 и 12 час, освещенность 50000 и 25000 люкс/м^ для кукурузы и гороха соответственно, при температуре 25° днем и 220 ночью.Условия кислородной доступности дифференцировали изменяя степень

оводнённости субстрата . Имели по 5 вариантов для каждой культуры, где скорость диффузии О2 в почве изменялась для кукурузы от 120 до 6 , а для гороха от 162 до 8 мкг< м~?сек7 т.е. до полного насыщения почвы водой. В последних вариантах уровень воды над поверхностью субстрата составлял 10-15 мм. Стрессовые условия поддерживали в,течение 12 суток. Измерения проводили через 2,8 и 12 дней эксперимента.

Выращивание стерильных растений-регенеравтов традесканции. Стерильные растения традесканции получали из изолированных пазушных меристем растений в стерильных условиях. Зычлененные меристемы помещали в чашки Петри на 2-J недели, а затем в пробирки с агаризованной питательной средой Мурасиге и Скуга (Грод-зинский.Гродзинский, 1973 ). Размножение регенерантов традесканции из изолированных меристем проводили черенкованием. На Ю- 12 сутки выращивания растения использовали для опытов.

Определение скорости диффузии кислорода в почве. Скорость диффузии кислорода ( Oxyden diffusion rate-ОДИ ) в почве наилучшим образом отражает, условия почвенной аэрации и характеризует потенциальную доступность Од корневой системе растений (Glinski et а1,198Д-).0ДЕ в почве определяли с помощью полярографического метода (Stepniewaki w., 1980) с применением 5 стандартных платиновых электродов в качестве катодов и одног* насыщенного каломельного электрода в качестве анода. Использованные нами для анализа метод и прибор были разработаны в лаборатории аэрации почв агрофизического Института Польской Академии Наук. В наших экспериментах платиновые электроды имели рабочую поверхность 0,65 мм . При этом рассчет скорости диффузии 0^ в почве сводился к формуле :

ОДЕ. мкг. м~^сек" = 12,75 х I , где I - сила тока, микроампер

Определение активности СОД. Активность супероксиддисмутазы определяли в грубом гомогенате корней и листьев исследуемых растений с помощью спектрофотометрического метода (Paoletti Р., 1986 ), основанного на ингибировании окисления НАДН су-

пероксидными радикалами. Измерения проводили на спектрофотометре М-40 (Германия) при длине волны 340 нм. За единицу СОД принимали 50 % ингибирование скорости окисления НАДН.

Активность каталазы, пероксидазы, глутатионредуктазы и содержание эндогенной HgOg оценивали с помощью соответствующих методов (Van Ginrel, Brown J.5., 1978; Chance В., Uachly A.C., 1953; Shaedle U., Bassham S.A., 1977; Wymann M.P. et al., 1937).

Содержание малонового диальдегида определяли с помощью теста с 2-тиобарбитуровой кислотой ( Андреева Л.И. и др., I9öt>). Поглощение регистрировали при длине волны - 535 нм против бутано-ла-I на спектрофотометре М-40 (.Германия).

Анализ пигментов проводили с помощью метода (Lichtenthaler H. 1983 )• Концентрации хлорофиллов "а" и "б" и сумму каротиноидов рассчитывали по формулам для 100 % ацетона.

Определение общего содержания белка проводили с помощью метода (Bradford Ы.М., 1976 ).

Определение величины устьичных сопротивлений листа провели с помощью автоматического порометра МК - 3, разработанного в Ноттингемском Университете ( Англия )_

Скорость ассимиляции C.0g при фотосинтезе определяли с помощью автоматизированной газометрической установки для исследований HgO - и COg газообмена листьев растений (Егоров В.П., 1985 ) и по фиксации ^COg.

Определение продуктов фиксации ^COg . Листовые высечки диаметром 9 мм помещали в затененные колбы с водой.Затем через эти колбы пропускали ток воздуха или аргона в течение часа.дальнейшая инкубация (15 час ) проходила в замкнутой системе. Перед экспонированием высечек на свету или в темноте в присутствии ^COg проводили повторную газовую продувку системы теми же газами и образцы дополнительно выдерживали в течение 10 мин на свету, после чего вводили *4C0g с удельной радиоактивностью

- 271-ГБК/моль-.-После этого материал растирали в 96 % спирте и смешивали с водой из инкубационной колбы. Полученный гомогенат использовали для определения скорости ассимиляции СО^. Состав продуктов фотосинтеза и темновой фиксации углекислоты определяли с помощью радисхроматографического метода (Биль К.Н., Медян-ников В.М., 1981 ).

Обработку результатов производили с помощью метода статистической обработки данных С Кузнецов В.К., 11?73 ).Б таблицах представлены данные при величине критерия достоверности не менее 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ДЕЙСТВИЕ И ПОСЛЕДЕЙСТВИЕ ГИПОКСИИ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛ И АКТИВНОСТЬ гЕРМЕНТОВ ЗАЩИТЫ ОТ ОПСЛИТЕЛЬНОП ДЕСТРУКЦИИ В КОРНЯХ И ЛИСТЬЯХ НЧМЕНй.

Анализ интенсивности ПОЛ в корнях 22 дневных растений ячменя, выращиваемых в течение последних 12 дней в условиях почвенной гипоксии при 120 % ППВ и скорости микродиффузии 0Р в субстрате 10 мкг м^сек^показал, что содержание МДА под влиянием гипоксии увеличивалось на 1Ь >(рис.1А,1). Активность СОД возрастала по сравнению с контролем на 40 % (рис.1А,3). При этом уровень эндогенной Н^^, отражающий главным образом интенсивность одно-электронного восстановления до увеличивался на 91 % (рисЛА,2) и положительно коррелировал с активностью СОД. Активность пероксидазы и каталазы, контролирующих содержание Н^О^, возрастала соответственно на 20 и 15 % (рисЛА; 4,5) Активность глутатионредуктазы, осуществляющей регенерации окисленных форм антиоксиданта глутатиона, увеличилась на £05 % (,рис.£А,6). При этом биомасса, отражающая изменение ростовой функции и физиологическое состояние корней, снижалась на 46,о /» (табл.!)

Содержание малонового диальдегида (рис.1Б,1) в листьях опытных растений, в отличие от корней, снижалось (на 35 %). Количество эндогенной Н20^, как и в случае корней, возрастало, хот* и'в меньшей степени ' рис. 1В,2) Активность супероксиддисму-тазы при этом оказалась выше контрольного уровня на оО % ( рис. 1Б, 3). Возрастание активности пероксидазы не превышало 10%, в то время как каталазная активность увеличилась более, чем на 30 % ^ рис.- 1ь; 4,5). Глутатионредуктазная активность в листьях

b

220

IbO 140"

ioc-60

St

I 20

%

4

If

r

к

fa

_ i

fr

опытных образцов составляла 150 % относительно контроля (рис. 1Б,6 ) По приросту биомассы

надземной части между контрольными и опытными образцами различия не обнаружены (табл.1) .

¿ажным показателем состояния функциональной активности листьев является интенсивность фотосинтеза. 3 условиях почвенной гипоксии скорость ассимиляции СО^ листьями ячменя снижалась с 107,i до 90,0 нмоль/ дм^сек. (табл.2).

Таким образом, повышение активности фер-

ментов-детоксикаторов и снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов обеспечивало поддержание рос^ товой функции надземных органов растений ячменя на уровне контроля. 3 корнях, которые являются непосредственной мишенью действия стрессового фак тора,при значительно воз росшем уровне эндогенной Н2®2 повышалась интенси! ность процессов ПОЛ и пс давлялась ростовая функция. Активация деструктивных процессов в корнях ячменя опережала их развитие в листьях. Усиление процессов перекисного окисле1 липидов может быть связано с тем, что повышенное содержание из-за низкой эффективности каталазы и пероксидазы приводит

1«

ЮГ

60

20

Hi

I

2 Э 4 5 6

Рис.1. Действие и последействие почвенной гипоксии на содержание МДА (I), ондогенной Н20^(2), активности СОД (3), пероксидазы (4), каталазы (5), глутатионредуктазы (6) в корнях (А) и листьях (Б) растений ячменя. 13 - гипоксия , О - постгипоксия

к снижению активности СОД, контролирующей количество супероксид ных радикалов, и повышает вероятность образования других, более реакционноспособных форм кислорода.

Таблица I. действие и последействие почвенной гипоксии на изменение биомассы корней и надземной части растений ячменя.

Условия _Биомасса, г сухого вещества

эксперимента Корни Надземная часть

22 ДН. , 70/ ППЗ 0,62 + 0,04 (100)* 1,28 + 0,09 (100)

10 12 дн. дн. , 70/ ППЗ+ , 120/ ПШЗ 0,33 + 0,02 (53,2) 1,29 0,06 (100,7)

29 дн. , 70/ ППЗ 1,06 + 0,06 (100) >,67 + 0,23 (100)

10 12 7 дн. дн. дн. , 70/ ППВ+ ,120/ ППЗ+ , 70/ ППЗ 1,08 + 0,07 (101,9) 3,16 + 0,24 (110,8)

Примечание: - , контроль

действие 12 дневного дефицита кислорода в почве на растения ячменя было обратимым. Нормализация условий аэрации корневой системы возвращала интенсивность процессов ПОЛ, активность фермен-тов-детоксикаторов в корнях и листьях опытных растений к значениям, обнаруженным у контрольных образцов.

Таблица 2. действие и последействие почвенной гипоксии на на скорость ассимиляции СО^ в листьях ячменя.

Условия Скорость ассимиляции С0о, нмоль

эксперимента _^_

дм'гсек растение-сек

22 дн. , 70/ ППЗ 107,1 + 10,0 (100)* 326,7 + 22,1 (100)

10 12 ДН. дн. , 70> ППВ+ ,120/ ППВ 90,0 6,0 (Г4,1) 261,0 + 11,3 (¡.0 )

ДН. , 70/ ППЗ еЗ ,0 + 6,4 и00) 337, с + ¿9,7 (100)

10 12 ДН. дн. , 70> ППЗ+ ,120% ППВ+

7 ДН. , 70/ ППВ 76,0 +■ 5,1 (.УХ, 6) 373,2 + 30,0 (110,4)

Частично восстанавливалась скорость ассимиляции СО^ , рас-

считанная на единицу площади листьев ( табл.2). При расчете ' количества СОд, ассимилированного всей фотосинтезирующей поверхностью, оказалось, что скорость ассимиляции СОд даже превышала величину этого параметра контрольных растений. Последние результаты согласуются с увеличением биомассы надземной части растений в условиях постпереувлажнения почвы.

В развитие этих экспериментов, выполненных при 2 крайних значениях скоростей диффузии Од в почве ( 120 и 10 мкг м~^сск~), ,альнейлие опыты проводили при 5 различных значениях этого параметра, что позволило более детально оценить влияние степени аэрации клеток на их систему защиты от окислительной деструкции. Основное внимание было уделено изучению закономерностей функционирования в условиях гипоксического стресса супероксиддисмутазы, снижающей концентрацию исходных форм активированного ккслорода-с^пороксидных радикалов.

влияние скорости диффузии о2 в почве на активность сод, интенсивность под и ростовую функцию растений кукурузы.

Было известно (вПпак! I., Stepn^eyíзlci ИГ.,19В4.), что снижение ОДЕ от 120 до 40 мкг м~^с~ не сказывается на всхожести семян кукурузы. При 0Д8. 30 мкг м~^с~ всхожесть падала на 50$, а при 0ДД 16 мкг м с- - подавлялась полностью. Эти предельные значения ОдЕ были обозначены как 0ДК лимитирующая - ОдКдам , ОДР 50£ эффекта - Од!^ ^ и ОДЕ критическая - 0ДЕКрИТ . Таким образом, весь диапазон значений ОДР можно разбить на 3 области :

А > °А*лим.: °^лим.>Б> Ощерит. и С<0лккрит. или соответственно области : 0Д?а> ОД^ и Од!^, где ОдЕ^ - 120-40; 0ДЕб -40-1ь и 0ДР-с- 16-0 мкг м"сс".

Активность супероксиддисмутазы в корнях 12 дневных растений

кукурузы, которые последние 2 дня выращивали при ОДЕ- 35 и 27 —2 —

мкг м с слабо возрастала. Максимальной активность фермента была при 0ДЕс~ 9 и 6 мкг м~^с~ (табл.3). Увеличение длительности гипоксического стресса до 8 дней приводило к дальнейшему возрастанию активности энзима.Так, при ОДЕ. 43,11 и 7 мкг м с~ активность СОД увеличилась на 35, 116 и 57 ^.соответственно. Выращивание растений при ОДЕ0 в течение 12 дней, в отличие от 2 и С дневного стресса, приводило не к стимуляции, а к существенному

подавлению активности СОд (.табд.З).

Таблица 3. Активность СОд в корнях и листьях кукурузы через 2,6 и 12 дней выращивания растений при разной скорости диффузии 0¿ в почве.

ОдЫ, мкг « "с

Активность СОд, ед/мг белка

Корни

Листья

2 дня

97 13,5? + 0,Ы цоо)* о7,95 + 4,0о цоо)

35 14,25 + 1,0? (104,Ь) 74,30 + 4,16 (109,3)

¿1 15,13 + 1,23 (Ш,3) о1,20 + 6,25 (119,5)

9 1с, 69 + 1.13 439,0) 63,90 + 5,201.94,0 )

6 19,54 + 1,22 СйЭ, Ь) о4,20 + 2,05 (94,5)

Ь дней

115 11,05 + 0,66 иоо) 104,10 + 7,26 (100)

90 11,75 + 0,72 (106,3) 126,01 + 6,76 (121,9)

43 14,99 + 1,03 (135,7) 162,90 + 10,75 (159,2)

11 23,90 + I ,с2 (21о,3) 304,00 ¿3,04 (¿92,0)

7 16,45 + 1,47 (167,0) 305,с4 + 11,32 (294,0)

12 дней

103 10,¿0 + 0,44 (100) '¿г, 60 + 3,70 (100)

75 10,о5 + 0,72 (.105,5) 111,00 + 4,30 (119,6)

1Ь г.. 34 0,32 (о!,1) 140,60 11,00 (160,7)

с 6,50 0, эО (^¿,6) 41'о,10 + 32,72 (,535,о)

ь с,13 + о,4а (7-,С) 469,00 + 26,99 (556,0)

¡1о результатам трех этапов эксперимента была уста .овлена зависимость интенсивности процессов перекисного окисления липидов в корнях растений кукурузы от скорости диффузии О2В почве (табл.

4). При умеренном снижении значений ОдЯ в прикорневой зоне (43-35 мкг. м'^с-) содержание ММ уменьшалось до 67,3 - 57,7 При низких значениях ОдЯ (До и 6 мкг- м~^с~) содержание )ЧдА составляло сЗ - ';9 % относительно, нормально аэрированных образцов. При этом, вплоть до 12 дней гипоксического стресса, интенсивность ПОЛ в корня кукурузы не превышала интенсивности этого процесса контрольных растений, из опытов на животных тканях известно, что содержание МдА уменьшают умереннонизкие (17-7^) концентрации О2 в окружающей среде, но повышают гипоксия и последующая аэрация ( Владимиров Ю.А.„ 1991).

Таблица Содержание МДА в корнях и листьях кукурузы через 2,6 и 12 дней выращивания растений при разной скорости диффузии кислорода в почве

0Д5,

-2 -мкг- м . с

Содержание МДА, нмоль/ мг белка

Корни

Листья

97 35 27 9 6

115 90 43 7

103 85 18 9 О

2.4 7 + Í .42 + 1,48 + 1,78 + 2,22 +

2,62 +

2,24 +

1,77 +

2,59 +

2,65 + 2,36 +

2,21 7

2,35 + 2,44 +

2 дня 0,21 (100)* 0,08 (57,7) 0,11 (59,9) 0,14 (72,1) 0,17 (90,0)

в дней 0,10 (100) 0,07 (85,2) 0,11 (67,3) 0,21 (98,5)

12 дней 0,11 (100) 0,14 (89,1) 0,11 (63,4) 0,16 (88,7) 0,08 (92,0)

3,88 + 0,40 (100)

3,77 + 0,20 (97,0)

4,20 + 0,32 (108)

3,30 + 0,26 (85,0)

3,40 + 0,25 (87,6)

4,77 + 0,20 (100)

4,39 + 0,14 (92)

3,90 + 0,28 (oí,8)

3,26 7 0,27 (68,3)

3,59 + 0,17 (100)

3,66 + 0,23 (101,7)

2,20 7 0,13 (61,3)

2,44 + 0,17 (67,9) 2,39 7 0,08 (66,6)

Таким образом, в корнях кукурузы, в зависимости от длительности выращивания растений в различных условиях аэрации почва, наблюдали две фазы в изменении активности супероксиддисмутазы-фазу стимуляции и фазу ингибирования активности фермента при снижении и последующем восстановлении содержания МДА до исходных величин.

Снижение активности СОД и содержания МДА в корнях могло быть-связано с анатомоморфологическими особенностями растений кукурузы. Известно, что по мере углубления гипоксического стресса во времени, у них возрастает доля поверхностных корней, которые располагаются в верхних слоях почвы,в лучших условиях асрации (Гринева Г.М., 1992). В основных же корнях кукурузы в условиях кислородной недостаточности могло происходить изменение в соот-

ношении ненасыщенных и насыщенных жирных кислот (Чиркова Т.З., Х5сО) 3 этом случае доля ненасыщенных жирных клслот, являвшихся субстратами перекисного окисления уменьшалась, что естественно, должно было привести к снижению количества МдА в анализируемом объекте. ;ругой причиной снижения активности СОд при гипоксии могло быть усиление деградации фермента з результате окислительной модификации. Лзвестно, что СОд инактивируется накапливающейся НдОдС^ридович И., 1979),

Ростовая функция корней кукурузы зависела от ОДЙ в почве (табл.5) и коррелировала с величиной стрессовой нагрузки.

Таблица 5. ьиомасса корней и листьев кукурузы в зависимости от условий аэрации почвы.

0¿Si¿ _ мкг м с Сухая масса, г

Корни Надземная часть

103 0,33 + 0 .02 Ц00)* 0,*5 + 0,05 (100)

65 0,31 + 0 ,05 (94,0) 0,99 + 0,07 (104,0)

Ь 0,19 + 0 ,02 (59,0) 0,с! + 0,05 (с5,3)

Биомасса корней 22 дневных растений, роса.их последние 12 дней при ОЛЯ ь мкг'м-^с~ уменьшалась по сравнению с контролем на

41 %.

Содержание белка в корнях кукурузы при дефиците кислорода в почве уменьшалось незначительно (табл.6).

Таблица 6. Содержание белка в корнях и листьях растений

кукурузы, выращенных в разных условиях аэрации почвы.

ОДК,

мкг м"2с"

Содержание белка, мг

г сухой массы корня

г сухой массы листьев

103 с4,0 + 4,0 Ц00)

с5 ЬЪ, 1 + Ц01.3)

18 68,3 + 2,9 (ol.J)

9 о2,0 + 6,3 (э7,6) Ь + 7 , J (У(,0)

323,0 + 15,5 (ЮО) 241,7 + ic.4 (74,8) 206,5 + 11,3 (63,9) ¿05,6 + 15,6 (.3,7) 171,0 + 15,8 (52,9)

3 отличие от корней, листья растений осуществляют не только поглощение, активацию, но и выделение 0->. Универсальным физиологическим регулятором фотосинтеза является устьичный аппарат растений (ЭоЗка Е., 19ВО ). 3 связи с этим, важныммна наш взгляд, являются полученные нами данные о-зависимости величины этого параметра от скорости диффузии 0^ в почве. При всех длительностях воздействия гипоксического стрессового фактора устьичные сопротивления были максимальными при низких значениях О/Л. Подавление фотосинтеза в этих условиях может лимитировать способность к акцептированию электронов конечным акцептором электронов ЭТЦ, что создает благоприятные условия для активации О^, (ЕЬ.ТЦзгн} Избыточное образование активного кислорода, связанное с нарушения- ■" ми фотосинтеза, в свою очередь, должно сказываться на активности защитных систем листа от окислительной деструкции. Важно отметить, что исходная активность СОД в листьях была более высокой, чем в корнях (табл.3). Этот факт может отражать более сложную организации листа и специфические окислительные условия в фотот-рофных клетках.

3 отличие от корней , 2 дневный стресс практически не изменял активности СОД в листьях при ОДЕ 9 и 6 мкг- Содержание МДА при этом незначительно снижалось. При 6 дневном стрессе' активность фермента резко возрастала. Максимальной она была при ОдК0 (табл.3). При этом содержание МДА было наиболее низким (табл.4). Увеличение длительности почвенного стресса до 12 дней вызывало дальнейшее повышение активности СОд и снижение содержания МдА до 556$ и 67 % соответственно (табл.3,4)

3 результате определения прироста биомассы была установлена зависимость ростовой функции от 0не только корней, но и надземной части растений кукурузы, хотя и в меньшей степени. Биомасса надземной части 22 дневных растений, росших последние 12 дней при ОдЕ0>уменьшалась по сравнению с контролем на 15 % (табл.5). Сохранение ростовой функции надземной части растений кукурузы происходило в условиях максимальной активности СОд в листьях.

Анализ содержания белка в листьях показал, что его количество зависело как от ОдК в почве, так и от длительности гипоксического стресса. 12 дневная почвенная гипоксия вызывала снижение количества белка на ч7 > (табл.6).

Таким образом, на листьях кукурузы наблюдали 2 фазы в измене-

нии активности СОд при переходах от 0Д8а к 0¿R (табл.i). Первая фаза- фаза относительной стабильности активности СОд, мало зависимой от величины Сд£, на фоне низкого содержания МДА (табл.4). вторая фаза - фаза активации СОд, сопровождающаяся ин-гибированием ПОЛ.Фазы ингибирования активности СОд в листьях, в отличие от корней, при увеличении длительности стресса, вплоть до 12 дней, не наблюдали. Возрастание активности СОд при ослаблении ПОЛ на втором и третьем этапах эксперимента, на наш взгляд, свидетельствует о том, что действие почвенного стресса на листья не выходило за рамки адаптивных возможностей организма.

ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ ДИФФУЗИИ КИСЛОРОДА В ПОЧВЕ НА АКТИВНОСТЬ СОД И ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛ В РАСТЕНИЯХ ГОРОХА.

Известно, что изменение скорости диффузии кислорода в почве отражается на физиологическом состоянии проростков ряда растений (Glinskl l.,et al.,1984). Горох относится к наибилее чувствительным культурам, по отношению к условиям аэрации корневой системы, для этого растения значения ОдЕ^ не должны быть ниже 50 мкг'м^с-, значения ОдВ^ - от 50 до 25 мкг-м~^с~, значения ОдКс от 25 мкг-м~£"с~ и ниже.

Активность СОД в корнях 22 дневных растений гороха, которые а течение последних 12 дней выращивали при 0ДКо 14 и У мкг м~ с", значительно снижалась и составляла всего 22,1 и 15,9 % относительно максимально аэрированных образцов (табл.7)

Габлица7. Активность СОд и содержание МДА в корнях и листьях гороха при разных условиях аэрации почвы

одк,

Корни

Листья

Активность СОД, ед/г сухой массы

162 83

1ч

557,3 + 31,2 (100)* 5555,0 + 299,9 (100)

593,3 + 37,А (106,4) 5764,0 + 380,4 (103,7)

123,0 + 8,9 (22,1) 4663,3 + 331,0 (83,9)

88,9 + 5,8 (15,У) 3199,0 7 220,7 (57,6)

162 83 14 9

Содержание МДА, нмоль/ г сухой массы

о32,6 +47,5 (100)* ó8i,5 + 43,6 (100)

794,6 + 46,1 (95,4) 671.2 7 54,4 (98,5)

596,6 + 48,3 (71,7) 902,7 7 47,8 (132,5)

509,9 + 21,4 (61,2) 796,4 7 56,4 (116,9)

В корнях ячменя в подобных условиях аэрации наблюдалось повышение активности фермента, а в кукурузе снижение составляло, менее 20 %.

Содержание МДА в корнях опытных растений по мере снижения ОДЕ от 162 до 9 мкг-м~^с~ уменьшалось почти на 40$ (табл.7). Эти процессы сопровождались значительным подавлением ростовой функции корней и уменьшением биомассы, которая за 12 дней гипоксии снижалась не менее чем на 70 %. Снижение активности СОД и содержания МДА в корнях гороха после 12 дневного выращивания растений в условиях кислородной недостаточности, на наш взгляд, не является адаптивной реакцией организма, а связано с необратимыми разрушениями клеточной структуры корней, которые могли происходить в результате глубокого лизиса.

Таким образом, у чувствительных к гипоксии растений гороха 8 и 12 дневная гипоксия приводила к инактивации СОД в корнях, что коррелировало с величиной стрессовой нагрузки, тестируемой по приросту биомассы.

Исходная активность СОД в листьях гороха, так же как у ячменя и кукурузы, была более высокой, чем в корнях (табл.7). 3 листьях гороха, как и в корнях, через 12 дней почвенной гипоксии наб-лвдали снижение активности СОД, хотя и в меньшей степени ( на против 64 % в корнях). Но в отличие от корней, в листьях при снижении скорости диффузии кислорода в почве содержание МДА возрастало. При этом биомасса надземных органов и содержание пигментов значительно снижались по сравнение с контролем.

Таким образом, исследования , выполненные на растениях гороха, чувствительных к дефициту кислорода, позволили выявить фазу ингибирования активности СОД под влиянием почвенной гипоксии, как на корнях, так и на листьях.

дЕйСТВЙЕ АТМОСФЕРНОЙ ГИПОКСИИ НА АКТИВНОСТЬ СОД, ИНТЕНСИВНОСТЬ И СОСТАВ ПРОДУКТОВ ФОТОСИНТЕЗА В ЛИСТЬЯХ ТРАДЕСКАНЦИИ.

3 отличие от локальной почвенной гипоксии в условиях дефицита кислорода в атмосфере листья являются тем органом, на который непосредственно направлено действие стрессового фактора. С этой точки зрения представляет интерес сопряженное исследование действия атмосферной гипоксии на активность СОД и направленность и интенсивность фотосинтеза.

Первая серия экспериментов была выполнена на стерильных растениях-ре-генерантах, выращиваемых в течение 30 суток на питательной агаризованной среде •в атмосфере аргона, обогащенной 0,05$ СОд. У контрольных растений(рис.2,кр.1) росших в течение всего эксперимента " в атмосфере воздуха, активность СОД изменялась в соответствии с известными дан ными о поведении это го энзима в онтогене зе высших растений (Мерзляк М.Н.,;

Закржевсхий Д.А. и 1935). Л 17 дне она растала на 54% относительно исходной, а затем снижалась. 3 листьях опытных растений уровень активности СОд на 14 - 17 сутки возрастал на о5 и 372 % по отношение к соответствувщим контролям (рис.2,кр.2). Затем активность энзима снижалась,превышая, однако, вплоть до 30 суток, контрольный уровень.

Таким образом, на листьях традесканции, выращиваемой в условиях атмосферной гипоксии, был подтвержден фазовый характер изменения активности СОД в листьях, обнаруженный'ранее на растениях, культивируемых в условиях локальной почвенной гипоксии. После первоначальной фазы относительной стабильности в активности фермента наблюдали фазы активации и последующего ингибирования.

действие атмосферной гипоксии было обратимым. При возвращении растений в условия обычной атмосферы активность СОд снижалась.

Параллельно данным исследованиям была проведена серия экспериментов, посвященная изучению действия дефицита кислорода на фотосинтетические характеристики. 3 опытах использовали листовые

0 10 20 30

Длительность инкубации, дни

Рис.2. Лзменение активности СО/, в листьях стерильных растений-регене-рантов традесканции при выращивании др., в атмосфере воздуха \Д) и аргона (2).

высечки, находящиеся в фазе адаптации к гипоксии ( по показателю (Ж). На рис.3 показано,что после 17 часовой предынкубации листовых высечек з атмосфере аргона и последующего их освещения в той же газовой среде, но 14

обогащенной СС^. интенсивность фотосинтеза при коротких световых окспозициях 15-30 мин была значительно ( в 5-8 раз) ниже, чем у контрольных растений. При увеличении времени освещения происходила постепенная релаксация фотосинтетической способности листьев (рис.3), и через 60 мин экспозиции разница между опытным и и контрольным вариантом составляла 25 %.

Анализ состава продуктов фотосинтеза в листьях традесканции показал, что в обычной атмосфере, наряду с интермедиатами цикла Бенсона-Кальвина присутствуют С^-дикарбоновые кислоты и аминокислоты. Анаэробные условия темновой предынкубации вызывали увеличение относительного и абсолютного ( при длительных экспозициях) количества некоторых аминокислот ( глутамат, глутамин, аланин, пролин, тирозин, лейцин, изолейцин) и появление "С в органических кислотах цикла Кребса.

Таким образом, растения, устойчивые к дефициту кислорода,характеризуются более ярко выраженной фазой активации СОД в листьях, по сравнению с менее устойчивыми видами, а также способностью быстро восстанавливать фотосинтетическую деятельность за счет активации альтернативных циклу Бенсона-Кальвина биохимических процессов. Следовательно, в отличие от корней фотосинтезирующие

Экспозиция на свету, мин. Рис.3 динамика ассимиляции ^•^СО^ листьями традесканции, предынкубированными в темноте в течение 17 час. в атмосфере воздуха (I) и аргона (2).

3 центре - поперечный срез листа традесканции

органы растений обладают дополнительными механизмами адаптации к анаэробным условиям, свлзанныммс устойчивостью фотосинтетических реакций.

Таким образом, анализ результатов, полученных в условиях почвенной и атмосферной гипоксии, позволяет придти к заключению.

При почвенной гипоксии как в корнях, так и в листьях растений наблюдается закономерное изменение в активности СОД, перок-сидазы, каталазы, глутатионредуктазы, концентрации Н^О^ и содержании МдА. Наиболее важными, на наш взгляд, являются данные, характеризующие динамику изменения активности СОД, контролирующей содержание супероксидных радикалов и тем самым снижающей вероятность образования более токсичных форм кислорода. Установлен фазовый характер изменения активности данного фермента, последовательно отражающий различные физиологические состояния клеток при развитии гипоксического стресса. Вслед за фазой относительной стабильности проявляются фазы активации, а затем - инги-бирования активности СОД. Длительность каждой фазы и амплитуда изменения активности фермента являются важной индивидуальной характеристикой устойчивости растений к действию дефицита кислорода. 3 частности, у чувствительного к гипоксии гороха фаза ингиби-рования наступает значительно быстрее, чем у кукурузы, ячменя и особенно традесканции, что свидетельствует о разных адаптационных возможностях отих видов.

Характерно, что изменение активности ферментов защитной системы от окислительной деструкции сопровождается изменением скорости роста, интенсивности и направленности фотосинтеза растений^ обнаружена положительная корреляция между устойчивостью клеток листа к окислительному повреждению и способностью фотосинтетического аппарата восстанавливать подавленный гипоксией фотосинтетический метаболизм углерода. Приведенный в работе материал и анализ литературных данных позволяют также предположить наличие функциональной взаимосвязи между гипоксическим состоянием корневой системы и антиоксидантным статусом листьев, осуществляемой через дистанционной контроль устьичного сопротивления и интенсивности фотосинтеза.

Основным выводом диссертации является универсальность характера защитных реакций растительных клеток от окислительного повреждения независимо от локализации и места действия стрессового фактора.

ВЫЗОДЫ

1. Изменение в активности ферментов защиты (СОД.пероксида-зы, каталазы.глутатионредуктазы) от окислительной деструкции в условиях гипоксии является общей универсальной способностью клеток корней и листьев и не зависит от локализации места действия стрессового фактора. При этом исходный уровень активности ключевого фермента защиты - СОД в листьях значительно превышает его активность в клетках корня. Изменения активности СОД в листьях под действием почвенной гипоксии проявляются позже, чем в корневой системе.

2. Изменение активности СОД в условиях гипоксического стресса носит фазовый характер как в автотрофных, так и в гетеротрофных органах. Выявлены фаза относительной стабильности активности СОД на фоне незначительного снижения интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), фаза активации СОД, сопровождающаяся дальнейшим снижением интенсивности ПОЛ и фаза ингибирования СОД, следствием которой является стимуляция ПОЛ. длительность каждой фазы определяется величиной стрессовой нагрузки и индивидуальной устойчивостью культуры.Устойчивые растения характеризуются более длительной фазой активации СОД.

3. При одной и той же длительности почвенной гипоксии интенсивность ПОЛ в корнях растений уменьшается в диапазоне значений ОДЕ, соответствующих умеренному снижению доступности кислорода. При дальнейшем уменьшении значений ОДЕ, т.е. в условиях глубокой гипоксии, скорость ПОЛ в клетках корня возрастает.

Изменение в активности ферментов-детоксикаторов, содержании эндогенной Н2О2 и малонового диальдегида в листьях под влиянием почвенной гипоксии, опережают видимые отклонения в ростовой функции и накоплении биомассы надземных органов, что может служить ранним диагнозом неблагополучного состояния растений.

5.Кроме ферментов защиты от окислительной деструкции в адаптации к гипоксическому стрессу растений принимают участие жизненноважные метаболические процессы, стабилизирующие скорость роста и накопление биомассы, содержание белка и пигментов и другие показатели состояния растительного организма. Основную роль при этом играет способность фотосинтетического аппарата восстанавливать подавленный гипоксией фотосинтез за счет активации альтернативных циклу Бенсона-Кальвина путей метаболизма углерода.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Закржевский д.А., Калашников D.E., Балахнина Т.Н. Зависимость устойчивости кислородвыделявщей.функции к сернистому ангидриду от возраста растений и активности супероксиддисму-тазы. Тез.докл. Международного симпозиума стран-членов СЗВ ."Элементы газообмена листа и целого растения и их изменения в онтогенезе". Москва,Пущино.1985.С. 20-21.

2. Фомина И.Р..Биль К.Л. .Закржевский д.А. .Балахнина Т.й. Фотосинтетический углеродный метаболизм традесканции после дли-"' тельной темновой инкубации листьев в атмосфере аргона и водорода В ей. "Фотосинтез и фотобиотехнология " Пущино. 1991. С. 41.

3. Калашников D.E., Вайшля О.Б., Балахнина Т.И., Астафуро-ва Т.П., Закржевский Д.А. Активация кислорода и ферменты защиты у пигментных мутантов гороха при аэрации и гипоксии. В сб. "Фотосинтез и фотобиотехнология".Пущино. 1991. С.71.

4. Балахнина Т.И..Калашников ¡O.E., Закржевский I.A. Активация кислорода и система защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях ячменя при адаптации к переувлажнении. Цитология. 1691. № 5. Т.33. С. 86 - 67.

5.Калашников Ю.Е., Вайшля 0. Б. .Балахнина Т.Н., Астафурова Т.П. .Закржевский Д.А. Фотосинтетические реакции и ферменты защиты у пигментных мутантов гороха при аэрации и гипоксии. Цитология. 1991. № 5. Т.33. С.104.

6. Фомина И.Р., Биль К.Я., Закржевский Д.А., Балахнина Т.И. Фотосинтетический метаболизм углерода в листьях традесканции

в различных газовых средах. Цитология. 1991. № 5. Т.33. С. 139,

' 7. Калашников Ю.Е., Закржевский Д.А., Балахнина Т.И., Застрижная О.М. действие почвенной засухи и переувлажнения на активации кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях ячменя. Физиология растений. 1992. Т.39.Вып.2. С. 263 - 269.

8. Фомина И.Р., Биль К.И., Закржевский Д.А., Балахнина Т.И. Фотосинтетический углеродный метаболизм Trac/tSCo/tic-Cc fiumLnCniii после длительной темновой инкубации листьев в атмосфере аргона и водорода.Физиология растений. 1993. Т.40. № I. С.27 - 34,

26.04.93 г. Заж.5602Р. Тир. 120 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ГНЦ РАН