Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие механических колебаний на биологические объекты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие механических колебаний на биологические объекты"

^ргапкэзиъ ьа чьзпнззиъ ъикшрирппзпгъ ьпьииъь ^ЬБи^иЪ чииишипиъ

ПЛ№ЬЪ ипьпьъь изьФиъзиъ

иьюиъ^ичиъ зизиъпьиъьгь иааьзш-шш-ъо ^ьъиириъшчиъ ОРЗЬ^БЪЬРЬ <4Ри

II • "

3.00.02 - ^ЬЪииЗЬЬЕЗЬЦи йшиОшцЬшпц^ииЗр ^ЬОишршОш^шО о.Ьшп1р]ПьйОЬр^ рЬЦОшбпф £}[илш1)шй шиш^бшО^ Иицдйшй Ш1лЬОш|ипитр]шС

иьаиичьп

ЬРЬ411Ъ -1998

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

СТЕПАНЯН РУБЕН СУРЕНОВИЧ

ДЕЙСТВИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ КОЛЕБАНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ

ОБЪЕКТЫ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 -"Биофизика"

ЕРЕВАН -1998

(ЭЬбшй huiumiuuiiiuiö t QUll UbQuw^fiq^^Jh MbGmpnGnLÜ

QfimujljmQ пЬЦшфир" ^Ьйишршйш1)шй qfiinnLpjruüGbpfi qnljuinp,

щрпф. U.L.^ujjpuJujbtnjujiG:

'Чшгшпйш^шй ¡ЬЬ^МшйшрЬйишф^инЗ qhuinipjnLÜQbpfi ryiliwnp,

pGrjritiüujfiinuGbp' щрпфЬипр 4.P. ипшрЬушй:

МЬйишршОшЦшО q[itnni.pjni.Gübpti rinL|innp, щрпфЬипр >4.11. UiupqujiuG:

Цпшдшшшр bpUuiGh бшршшрщЬшшгЬйшршрш^шО fiOurntiuinnfi

4mqt3ml)bpL4nLpjnLÖ" 43hcLh4LtJJh ujdpfinü:

UinbGuifununi.pjiuG mui2LnimnGni.pjnLG|] inbrifi l|nt.GbGuj « ¿А » /t—vу yi ho/с 1998p. duiün / 4 bpLuiG[i Т1Ь1лшЦшй 3iui5ui|uujpujGfiü l)hg 051 МЛиШи^нлшдЦшб hjnphpqfi Gfiuinrud (375049, ЬрЬЦшй, U[bg UiuGnLljjmG ф. 1, b^H, ^Ьйишршйш^шй фииЦтцпЬт):

UinbGiufununipjiuüQ LtujpbiJi t Йшйпршйид bpbi}uiG[i ^Ьтш^шй ^müiuiuiupuiGfi цршцшршйтй:

Ubqi5ujq|inü uunujßtliuö t «££.»

051 UiuuGiuq|iuiiijljiuG ЮпрЬргф Q|imiu^ujG ршрттдшр,

^ЬйишршйиЩшй q[iuinipjruGGbp|i рЫ^йшбги'. Q/vm U.U.InGjuiG

Тема утверждена в Центре биофизики HAH РА

Научный руководитель: доктор биологических наук, • профессор Айрапетян С.Н.

Офицапьные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Аракелян В.Б.

доктор биологических наук, профессор Саркисян B.C.

Ведущая организация: Ереванский архитектурностроительный институт,

кафедра физики.

Защита состоится "JJL" Q1998г., в ! ^ ~~ часов на заседании Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна 1, ЕрГУ, биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Ереванского государственного университета.

Автореферат разослан " И о ^ <ГМ1998г.

Ученый секретарь Специализированного Совета 051,

кандидат биологических наук, Гонян С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акпц/альыасггш-^теми. Основным физическим компонентом среды, окружающей человека, является механическое колебание -вибрация и звук. В связи с тем, что интенсивный звук, инфразвук и вибрация воздействуют на человека во всевозрастающей дозе (Романов, 1991), а так же учитывая то, что проблема биологического действия механических колебаний (МК) представляет собой часть общей очень сложной социальной проблемы взаимодействия человека с окружающей его внешней средой, как существующей независимо от деятельности человека, так и средой обуславливаемой такой деятельностью (Благонравов, 1972), представленная тема актуальна, посвящена выявлению механизмов действия МК на биологические объекты различного уровня. В работе при научном решении проблемы биологического действия МК усилия были направлены на поиски мишени (адресата действия) и изначального механизма взаимодействия МК с биологической структурой.

Цель и_зада_чл_исслеЗования. Так как вода является основной компонентой биологических систем, в которой развертываются все метаболические процессы, то вероятно, что незначительное изменение физико-химического состояния водной среды может значительным образом изменять функциональную активность клеток (Пиккарди, 1967; Волькенштейн, 1968; Классен, 1982; Аугаре1уап е1 а1., 1994; Григорян, 1995). Целью настоящей работы и являлось исследование влияния МК различных частот на воду, водные растворы и на биологические объекты различного уровня: физические свойства ДНК, жизнедеятельность микроорганизмов, сократительную активность сердечной мышцы, для того чтобы расширить наши представления о клеточных и молекулярных механизмах, лежащих в основе биологического действия различных физических факторов среды.

Научнап_ноВизна работы. Совместно с Акустическим Центром МЗ РА была собрана и впервые применена установка для обработки объектов механическими колебаниями различными частотами при контроле интенсивности, позволяющая поддерживать ее значение на одинаковом уровне для всех частот, в том числе и резонансных. В работе впервые было использовано устройство для измерения электропроводности, собраное на основе изобретения (авторское свидетельство № 2024885 РФ), отличающее высокой точностью

измерения. Полученные результаты свидетельствуют о существенном влиянии МК на физико-химические свойства воды и на оптическую плотность раствора ДНК. Использование МК синусоидальной формы позволило выявить частотно-зависимое действие механических колебаний на такую важную физическую характеристику воды как электропроводность. Показано, что обработка МК питательной среды и физиологического раствора отражается на процессах жизнедеятельности клеток микроорганизмов и на сократительной активности сердца виноградной улитки соответственно.

Лрактическаяценностьработы. Выявлено, что МК вызывают сильные изменения физиолого-биохимических свойств клеток микроорганизмов через изменения физических и химических свойств питательной среды. Можно определять эффективность целенаправленного использования МК в ряде биотехнологических процессов, установить ограничения в применении вредных для организма частот и интенсивностей МК. Полученые данные позволяют судить о клеточном механизме, ответственном за изменение сократительной активности сердца при действии физических факторов.

Апробация_работы_и_публикации. Материалы работы

обсуждались на семинарах Центра биофизики HAH РА, и доложены на первой российской конференции по проблемам электромагнитной безапасности человека (Москва, 28-29 ноября, 1996г.), а также на семинаре ЮНЕСКО по современной молекулярной и клеточной биофизики (Ереван, 17-30 августа, 1998). Основные результаты исследований отражены в четырех публикациях.

Структураиобъемработы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, заключения и списка литературы (112 ссылок). Диссертация содержит 114 страниц, 17 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена обзору существующих в литературе данных, относящихся к влиянию механических колебаний на воду и водные растворы неорганических ионов, растворы биополимеров, а также на клетки и на организм, обсуждены возможные механизмы воздействия механических колебаний на биосистемы. Приведена общая характеристика механических колебаний (звука, инфразвука и вибрации).

Во_вт0рой_глав& приведено описание материалов и методов.

1.Метод_абра6отки_воды^и...водных-раствороИ^МК Опыты проводились на установке, позволяющей передавать в воду МК с частотами от 3 до 5000Гц, интенсивностью до 90 дБ (до 75дБ для МК с частотами выше 2500Гц). Стеклянные пробирки, содержащие обрабатываемый раствор, жестко соединены с подвижной частью вибратора. Вибратор управляется генератором синусоидальных сигналов и совершает колебания в вертикальной плоскости с заданными частотой и интенсивностью. Таким образом, МК передаются в воду пробирки с незначительными потерями мощности. Частота и интенсивность МК контролировалась соответствующими приборами.

2.Измереяиеллектропроводимости^воды. Стеклянная пробирка, содержащая дистиллированную воду, обрабатываемую МК, содержит два электрода, представляющие из себя платиновые пластины. Электроды соединены с измерителем электропроводимости, способным определять удельную электропроводность (УЭП) воды при токе 10"9А (70Гц). Так как измерения электропроводимости проводятся в микромощностных режимах, применение малошумящего усилителя напряжения переменного тока повышает точность измерения за счет исключения влияния самонагрева. Повышение точности обеспечивается еще и тем, что благодаря применению фазочувствительного каскада — синхронного фильтра с детектором — на результат измерения не влияют емкостная составляющая измерительной ячейки, а также паразитная емкость соединительных проводов. Применение такого же каскада в цепи обработки сигнала приводит также к повышению помехоустойчивости (Симонян и др., 1994). Для непрерывной регистрации УЭП к выходу измерителя был подключен самописец.

Известно, что электропроводимость дистиллята, а следовательно, и его структура сильно зависят (Классен, 1982) от "возраста" воды (времени выстаивания после конденсации). Поэтому мы использовали дистиллированную воду трех "возрастов": 1)новообразованную, — дистиллят, эксперименты на котором ставились сразу же после конденсации воды и при выравнивании ее температуры с поддерживаемой в лаборатории температурой 20°С. Первоначальное значение УЭП такого дистиллята равнялась 412±4мкОм'1м"1; 2)трехдневную — дистиллят, который после обрзования содержали три дня в стеклянном цилиндре емкостью 250мл и диаметром 3,6см. Опыты ставились по истечении трех суток, при этом значение УЭП дистиллята

составляло 209±2мк0м"1м'1; 3)шестидневную — дистиллят, который содержали вышеуказанным способом б дней, и УЭП равнялась Ю4±1мкОм"1м"1. После шести дней выстаивания УЭП дистиллята практически не изменялась.

.?. Определение_оптической плотности_раствора_ДЫК.

Оптическая плотность раствора ДНК измерялась спектрофотометром СФ-46 при длине волны 260нм.

Была использована ДНК из тимуса теленка (2,5x10"sM). Водный раствор ДНК в объеме Змл обратывали МК интенсивностью 90дБ в течение 30-ти минут. Затем измерялясь оптическая плотность растворов при длине волны 260нм, на которую приходится максимум поглощения раствора ДНК. В качестве контроля исползовался раствор приготовленный таким же способом и простоявший в тоже время без воздействия МК 30 минут.

4Метод__изучения___динамики_роста__культуры_Exoli.

Бактериальные штаммы: Eco//' К-12: CA 154 th¡~, lacZ получены от Brenner MUC 154-2 thí, IacZ, Ion, слизеобразующий дериват штамма CA 154 выделен в Институте микробиологии HAH РА. Для того чтобы ■ вырабатываемая MUC 154-2 слизь не влияла на реологические свойства питательного бульона, с помощью специфического к Ion штаммам вирулентного фага М59 был отселектирован слизенеобразующий мутант NM 154-9 thí, /acZ, Ion, тис (Оганессян, 1995).

Питательные среды: обогащенный питательный бульон (ОПБ), стандарт 1 [Nutrient Broth Enriched, Standart 1] Serva; бактопептон жидкий 1,0% Difco-pepton; агаризованная среда: ОПБ + 1,5% Difco-агар.

Во избежании различий в степени аэрации образцов во время обработки МК заполненые пробирки плотно закрывались так, чтобы количество воздуха в них было минимальным. Влияние МК на бактериальные клетки изучалось двумя путями. В первом варианте опытов культура, находящаяся в экспоненциальной фазе роста (Зх108кл/мл), добавлялась к 5мл питательной среды и подвергалась действию МК различной частоты с интенсивностью 90дБ в течение 30 мин. (контролем служили необработанные клетки). Во втором варианте опытов культура добавлялась к 5мл предварительно обработанной МК питательной среды и инкубировалась стационарных условиях при 37°С (в этом случае контролем служила необработанная среда). Далее во всех вариантах изучались рост и титр клеток высевом их на

полноценную агаризованную среду через определенные промежутки времени при 37°С.

5.Метод^оценки лодвижности культуры.Е.соИ. Морфологию и поведение клеток изучали прямым наблюдением их поведения в фазово-контрастном микроскопе (Biolar, х1400, Польша). Подвижность клеток измерялась с помощью специально сконструированных двух сообщающихся между собой кювет, применяемых при измерении оптических величин спектрофотометром СФ-46. В одной из кювет содержится питательная среда с культурой, обработанной МК. В другой кювете находится питательная среда, оптическая плотность которой измеряется в течении 60 мин. при длине волны 540нм (максимум поглощения для данной культуры). Кюветы соединяются с помощью полиэтиленовой трубки диаметром 2мм, также заполненой питательной средой. С течением времени клетки проникают из первой кюветы по трубке в питательную среду второй кюветы, тем самым увеличивая ее оптическую плотность.

6. Метод регистрации сокращений изолированного внутренне

перфузируемосо_сердиа._улитки_Helix__pamatia. Опыты были

проведенны на изолированных сердцах виноградной улитки Helix Pomatia. После изоляции в сердце вставлялась канюля, через которую осуществлялась внутрисердечная перфузия растворами различных составов. Нормальный физиологический раствор имел следующий состав (шМ): NaCI-80, KCI-4, трисНС!-5, CaCI2-7, MgCI2-7, рН7,5.

Сокращения сердца регистрировались разработанным в нашей лаборатории устройством, которое позволяет регистрировать силу сокращения сердца. Устройство представляет из себя датчик колебаний, преобразующий механические сокращения мышцы в электрическими сигнал с высокой линейностью.

Добавление ацетилхолина (АХ) в перфузирующий раствор производили с помощью иньекции 1мл раствора с 1,5х10"8М АХ в перфузат. Смешиваясь с перфузатом, концентрация АХ снижалась до 5х10'9М. Иньекция длилась 4 сек.

Было проведено десять опытов. В работе представлены данные одного типичного эксперимента.

7.0бработка_данных (вычисление среднеквадратического

отклонения, тест по Стьюденту) и постройка графиков на основе полученных результатов производилась с помощью компьютерной программы Sigma Plot 1.02 (Jandel).

В^третьеи-_£лд8е приведены результаты и обсуждение исследований относящихся к действию МК на воду и водные растворы.

2? 105

ё юо -\ о

■^СОтГЮСООЮОЮООООООООО т-1-СЧ|СдЮОЮОЮОООО ■^-r-CNCMinouqo

ЧАСТОТА МК, Гц

Рис. 1. Влияние МК различных частот с интенсивностью 75дБ на УЭП дистиллированой воды (п=5).

1. Частотно-зависимое действие мк.на._УЭП^дистиллированной воды. Измерения проводились с трехдневным дистиллятом, имеющим УЭП 209±2мк0м"1м"1. Для выяснения частотной зависимости

воздействия МК на УЭП дистилята использовались следующие частоты:

3, 4, 5, б, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500 и 5000Гц. Интенсивность волн равнялась 75дБ (максимально возможная для охвата диапазона частот от 3 до 5000Гц, исходя из технических возможностей установки). Выяснилось, что максимальное снижение УЭП в среднем на 15,7%, обнаруживается в данных условиях при частоте 4Гц (рис.1). Далее с возрастанием частоты эффект уменьшается и при частоте 100Гц снижения УЭП не наблюдается.

В процессе экспериментов выяснилась зависимость эффекта воздействия МК на дистиллят от его "возраста". Частота МК выбрана

равной 4Гц, так как эта частота вызвала в предыдущем опыте наибольшее снижение УЭП. Интенсивность волн достигала 90дБ. Наибольшее снижение УЭП (рис.2) под воздействием таких МК

400

о =1

ь*300

и о

й о а о

с. С

О

^ 200

^

и с:

¡Т)

Сч

<

| 100

о

к

к

о

15

30 мин.

Рис.2. Действие МК частотой 4Гц и интенсивностью 90дБ на УЭП дистиллятов, а — новообразованного; Ь — трехдневного; с — шестидневного; К — контроль.

зафиксировано при использовании новообразованного дистиллята, в среднем на 27,4% за 30 минут. Однако при контрольном измерении УЭП такого дистиллята, т.е. без воздействия МК, также было зафиксировано небольшое падение УЭП, в среднем на 3,8% за то же время. При контрольных измерениях УЭП трехдневного и шестидневного дистиллятов такого снижения не наблюдалось. УЭП трехдневного дистиллята под воздействием МК вышеуказанных частоты и интенсивности снизилась в среднем на 19,8%, а УЭП шестидневного дистиллята, имеющая наименьшую величину, не изменилась (на рис.2 представлены кривые одного типичного эксперимента).

Л 0.220 Н

и о

X 0.215 Н

О <

с 0.210

й 0.205 5

С 0.200

О

0.000

< О

Рч

н о

4

10 20

50

ЧАСТОТА КОЛЕБАНИЙ, Гц

Рис.3. Действие МК на оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260нм (п=10). * - р<0,01.

выявления возможности влияния МК на вероятность образования или изменения структуры водородных связей, в следующей серии экспериментов было изучено влияние МК на оптическую плотность раствора ДНК (2,5х10'5М). Частоты МК были выбраны в соответствии с данными предыдущего опыта: 4, 10, 20 и 50Гц, несколько частот из

"окна", где наблюдался эффект. Обработка в течении 30 минут МК с частотами 4 и 10Гц раствора ДНК привела к снижению его оптической плотности на 4,2+1,1% и 4,8±1,2% соответственно, при длине волны 260нм (рис.3). При использовании же частот 20 и 50Гц достоверного изменения оптической плотности не наблюдается.

З.Обсуждение_полученных_результатов. В литературе

приводятся сведения о некотором временном изменении свойств воды тгистге хтгёЪых 'механических -воздействии и -перемещении. 'Ътмечено периодическое изменение УЭП и поверхностного натяжения тридистиллята при механическом перемешивании (ВогсП е1 а1., 1965). Если вода находилась под металическим экраном, то этот эффект не обнаруживался. Однако, как нам представляется, в этих экспериментах трудно было идентифицировать механические сигналы по частоте. А отсутствие эффекта при использовании экрана говорит об электромагнитной природе воздействия.

Применение в нашей работе механических колебаний синусоидальной формы позволило выявить их частотно-зависимое действие. В диапазоне исследуемых частот наибольший эффект обнаружился при частоте 4Гц. Исходя из этого, механизм воздействия МК на воду можно связать с изменениями структурной характеристики системы.

Так как структура ■ воды лабильбна, а так же учитывая происходящие в воде медленные диффузионные явления (растворение, выделение из растворов и агрегация различных ионов) и структурные перестройки воды, связанные с указанными процессами, трудно предположить механизм реализации полученных эффектов. Так как С02 имеет большую растворимость, то следует ожидать, что изменением концентрации этого газа можно объяснить действие МК на УЭП дистиллята. Предварительные результаты показывают, что полученный эффект, возможно, связан с изменением концентрации этого газа. Однако растворение С02 не может значительно увеличить УЭП низким значением своей диссоциацией при рН, свойственных дистилляту. Остается невыясненым и возможность влияния С02 на кластерную структуры и тем самым на УЭП, т. к. в результате стабилизации кластерной структуры увеличивается протонная проводимость.

Известно, что в процессе денатурации все ковалентные связи в ДНК сохраняются. За подержания двухспиральной структуры ДНК

ответствены в основном два типа взаимодействий: 1) водородные связи между основаниями в нуклеотидных парах и 2) стекинг-взаимодействия между основаниями в доль оси молекулы. Если один или оба типа взаимодействий нарушаются, то двухцепочная спираль ДНК раскручивается и происходит стурктурный переход с образованием одноцепочных неупорядочных клубков (Веденов и др., 1971; Ауа1а а1., 1980). В опытах с раствором ДНК (рис.3) уменьшение оптической плотности пр.1 260нм, по-видимому, можно оъяснить возрастанием вероятности образования водородных связей между основаниями.

Четвертая глава посвящена результатам и обсуждению исследований относящихся к действию обработанных МК физиологических растворов на биообъекты

Рис.4. Влияние предварительно обработанного МК бульона на рост и деление интактных бактериальных клеток: в^через 30 мин б^через 3 часа после инокуляции клеток. . Примечание: количество клеток необработанной культуры, имеющееся в момент их определения принималось за единицу.

ЬДейстВие._обработанной МК питательной среды на

^деятельность Е.с.оЧ После инокуляции культурой клеток и

10

культивирования в стационарных условиях при температуре 37°С действие МК проявлялось только после длительной инкубации (Зч), в то время как после 30 мин инкубации достоверных изменений не было обнаружено. Так, после трехчасовой инкубации, в питательных бульонах, обработанных МК при 4 и 10Гц наблюдалась значительная интенсификация процесса роста культур, в 2 и 1,5 раза соответственно, тогда как при 50Гц имело место сильное подавление роста более чем в 2 раза (рис.4).

Микроскопическое исследование культур, обработанных МК, выявило резкое повышение подвижности клеток, как подвергнутых непосредственному воздействию, так и инокулированных в обработанную питательную среду. Получасовая обработка культур МК с частотами 4 и 10Гц приводила к исчезновению филаментов, спонтанно образующихся в популяции клеток Ion" мутантов. С помощью соединенных между собой кювет изучалась скорость перемещения через трубку клеток из одной камеры в другую. Было обнаружено, что клетки, подвергшиеся действию МК, переходили из камеры в камеру быстрее необработанных клеток. Наибольшей подвижностью обладали клетки, обработанные 10Гц (рис.5).

„ °-12

►з н

о 0-ю i к

О 0.08 <

С

« 0.06

и 0.04

н 0.02 С

о

0.00 -V

о

ДЮГц

/

О', р-"

о

С 4Гц

5 г~50Гц

„ОК(

30 60

ВРЕМЯ (мин)

Рис.5. Рост оптической плотности среды по мере проникновения в нее культуры по системе сообщающихся кювет из кюветы с обработанной МК среды с культурой. Примечание: быстрый рост оптической плотности указывает на большую подвижность клеток.

обработки МК. Непосредственный высев культуры ММ 154-9 после получасовой обработки МК при частоте 4Гц показал, что количество клеток, способных образовать колонии, в 3 раза больше по сравнению с необработанной культурой (рис.6). Частота МК 10Гц существенного влияния на жизнеспособность клеток в процессе обработки не оказывала. Подавление жизнеспособности клеток более чем на 30% было зафиксировано при частоте 50Гц.

Изучение динамики роста культур в стационарных условиях показало, что после 3-хчасовой инкубации титры жизнеспособных клеток в контрольной и обработанных МК с частотами 4 и 10Гц были почти одинаковы. Отставание в росте более чем в 2 раза было обнаружено у культуры, обработанной при частоте 50Гц.

Рис.6. Рост и деление бактериальных клеток, после получасовой обработки МК в питательном бульоне и высева на чашки с полноценным агаром: аДгразу после обработки МК; б^после 3-х часов инкубации. Примечание: количество клеток необработанной культуры, имеющееся в момент их определения принималось за единицу.

пах

•Uax

100мг

Ux

ЗОсек

физ. раствор

физ. раствор+мк

физ. раствор (промывка)

Рис.7. Воздействие обработанного МК физиологического раствора на АХ-чувствительность сердца улитки Helix Pomatia. Примечание: (стрелкой указано место инъекции АХ).

5? 100

>£ ■ S £ ш

Ч 90 Ч

< - ж ш

0 и

1

т" <

с

<

80 -

70

■Ч

1

Рис.8. Снижение амплитуды сокращений сердца улитки Helix Pomatia под действием АХ (5х10"дМ) в нормальном и обработанном МК (4Гц) перфузатах (п=10). Заштрихованные столбцы относятся к действию перфузата, содержащего оуабаин (Ш4М). 1 — нормальный физиологический раствор; 2 — раствор, обработанный МК с частотой 4Гц, 3— нормальный физиологический раствор (промывка);

* — р<0,05 по сравнению с действием АХ в нормальном физиологическом растворе.

АХ-чу^ст^ительнпг.ть г.ердца улитки. Известно, что сердце содержит мускариноэргические ацетилхолиновые рецепторы, активация которых приводит к торможению сердечной активности. Как видно из рис. 7 и 8, инъекцирование 5хЮ"3М АХ во внутрисердечный перфузат подавляет активность сердечного сокращения на 23,3%. Время восстановления амплитуды 1=110с. Далее в качестве перфузата использовали раствор, обработанный МК частотой 4Гц и интенсивностью 90дБ. В этом случае аналогичная инъекция ацетилхолина (АХ) вызывала меньшее по величине подавление амплитуды (14,9%, 1=90с). Эффект раствора, обработанного МК, оказался обратимым (рис. 7 и 8). При использовании перфузата, обработанного МК частотой 10, 20 и 50 Гц при той же интенсивности, существенного изменения не наблюдалось.

to jjax j)ax 100мг

физ. раствор физ. раствор+оуабаин физ. раствор

(промывка)

Рис.9. Воздействие АХ на сократительную активность сердца улитки Helix Pomatia в присутсвии оуабаина (10"4М). Стрелкой указано место инъекции АХ.

В следующей серии экспериментов мы исследовали зависимость действия МК на АХ-чувствительность сокращений сердца от интенсивности работы Na+,K+-Hacoca, для чего использовался перфузат, содержащий оуабаин (Ю'^М). Инъекция АХ в присутствии в перфузате оуабаина (рис. 8 и 9) вызывала подавление (на 9,5%, t=110c) амплитуды сокращений, меньшее по величине, чем при

нормальном растворе (на 20,1%, 1=100с). Повторное использование нормального раствора показало обратимость эффекта (снижение амлитуды сокращений на 19,8%, 1=110с).

100мг

физ. раствое+оулбаин физ. раствор+оуабаин

(промывка)

физ. раствор+оуабаин+мк

Рис. 10. Воздействие обработанного физиологического раствора, содержащего оуабаин (10"4М)„ на АХ-чувствительность сердца Helix Pomada. Стрелкой указано место инъекции АХ.

Опыты с обработанным МК (4Гц) раствором, содержащий оуабаин (10"4М), показали уменьшение подавления (на 9,1%, t= 10Осек) амплитуды сокращений по сравнению с контрольным раствором, содержащим оуабаин (на 11,2%, t=110c,). Эффект оказался обратимым (рис. 8 и 10).

4.0бсцждеыае~ Полученные результаты . свидетельствуют о существенном влиянии МК на процессы жизнедеятельности микроорганизмов. Известно, что в процессе репликации ДНК непосредственный процесс деления клеток подавляется ингибитором белкового характера. Дерепрессия и далее образование клеточных перегородок происходит под действием АТФ-зависимой протеиназы, синтез которой детерминируется Ion геном (Mizusawa et al. 1983). Мутантный по Ion гену штамм отличается весьма низкой АТФ-зависимой протеиназной активностью, что является причиной образования филаментов в связи с необратимым ингибированием

процесса деления клеток. Поэтому интенсификация процессов роста клеток и раздробление филаментов изученного штамма под действием МК с частотой 4 и 10 Гц, возможно, обусловлено активацией АТФ-зависимой протеиназы.

Так как при обработке культуры МК с частотой 50Гц изучение морфологии клеток культур показало, что большинство клеток из-за утраты способности к делению начинали расти в виде филаментов, а также, что ядерный материал равномерно распределен по всей длине филамента в виде отдельных компактных образований, то это может свидетельствовать о том, что несмотря на ингибирование септообразования, репликация ДНК и сегрегация цепей в филаментных клетках происходит нормально.

Ингибирование клеточного деления бактерий воздействием внешних повреждающих факторов происходит под влиянием белковой молекулы, синтезируемой под контролем su/A (sfi) гена (Huisman et а!., 1981; Mizusawa et al., 1983; Oganriessian et al., 1973). Этот белок входит в SOS-регуляторную систему (Hill et al., 1997; Jaffe et al., 1985; Little et al., 1982), которая индуцируется в ответ на облучение или действие химических агентов, повреждающих молекулу ДНК. У диких штаммов £.со// после восстановления поврежденной ДНК Su/A-ингибитор расщепляется АТФ-зависимой протеиназой, синтезируемой под контролем Ion-гена (Mizusawa et al., 1983), и деление клеток возобновляется. У Ion мутантов из-за отсутствия АТФ-зависимой протеиназной активности ингибирование клеточного деления не востанавливается и клетки, чрезмерно удлиняясь, погибают.

Результаты данного опыта дают основание предположить, что действие МК частотй 50Гц тоже способно индуцировать SOS-систему наряду с другими физическими и химическими факторами.

В пользу влияния МК на метаболизм клетки свидетельствуют также результаты, полученные при обработке питательной среды МК. Результаты позволяют предположить, что МК вызывают определенные физико-химические изменения компонентов питательной среды (в частности воды и др.). Вышеуказанное дает основание предположить, что "медиатором" передачи воздействия МК на процессы жизнедеятельности клеток изучаемого штамма является как цитоплазматическая жидкость, так и питательная среда со своими компонентами.

Таким образом, нами впервые выявлено, что МК вызывают сильные изменения физиолого-биохимических свойств клеток микроорганизмов через изменения физических и химических свойств питательной среды.

Вышеизложенные данные показали, что изменение физико-химического состояния как внеклеточной, так и внутриклеточной воды, где разыгрываются метаболические процессы, может существенным образом менять метаболическую активность клетки.

Обработка МК дистилированной воды приводит к частотно-зависимому изменению ее электропроводимости. Оказалось, что обработка подобным образом питательной среды может оказать существенный эффект на функциональную активность микробов. Использование обработанного МК физиологического раствора вызывает изменения сократительной активности сердца улитки в результате структурных изменений перфузата. Представленные данные отчетливо показывают, что имеет место частотно-зависимое влияние МК, причем во многих случаях наиболее эффективное действие оказывает обработка водной среды МК частотой 4Гц. По видимому, эта частота вызывает наиболее выраженные структурные изменения водной среды, что подлежит более детальному исследованию.

Предварительные исследования вопроса о том, какой клеточный механизм является отретственным за указанное изменение сократительной активности сердца, показывают, что электрогенный натриевый насос (рис. 7 и 8) и механизмы, ответственные за мускаринэргическую рецепцию сердца, могут служить кандидатами в мишени механорецепции и структурного изменения перфузата в результате его обработки механическими колебаниями. Из рис. 7 и 8 видно, что блокада работы №+,К+-насоса приводит к подавлению эффекта МК, хотя тенденция этого эффекта просматривается.

Ранее нами было установлено, что Ма:Са обмен является универсальным сенсором, через который сверхслабые химические (Айрапетян и др., 1991; БадЫап а1., 1996) и физические сигналы (Аугаре1уап а1., 1994) влияют на хемочувствительность мембраны. По видимому, указанный сенсор является мишенью и для МК, который обуславливает модуляцию мускаринэргической чувствительности сердца.

Таким образом, представленные в настоящей работе экспериментальные данные о частотно-зависимом действии

механических колебаний на электропроводность воды, функциональную активность микробов и на сократительную активность сердца улитки позволяют утверждать, что водная среда клетки может служить мишенью, через которую колебания могут передаваться каскаду метаболических процессов клетки.

выводы

1. Выявлено частотно-зависимое действие МК на электропроводность воды. Максимальное понижение УЭП под действием МК (75дБ) отмечено при частоте 4Гц. Колебания с частотами выше 100Гц на УЭП не влияют.

2. Обработка водного раствора ДНК (2,5x10"5М) механическими колебаниями (4 и 10Гц; 90дБ) приводит к увеличению вероятности образования водородных связей между основаниями, при использовании же частот 20 и 50Гц изменений не наблюдается.

3. МК с частотой 4Гц увеличивают количество клеток культуры NM 154-9 (Ion" мутантный штамм E.coli К-12), способных образовать колонии, а частота 50Гц - уменьшает.

4. Обработка МК с частотами 4 и 10Гц приводит к исчезновению спонтанно образующихся филаментов клеток культуры NM 154-9 (Ion" мутантный штамм E.coli К-12).

5. Инкубация культуры клеток NM154-9 (Ion" мутантный штамм E.coli К-12) в средах, обработанных МК с частотами 4 и 10Гц приводит к увеличению способности- образовывать колонии в 2 и 1,5 раза соответственно, а с частотой 50Гц - к уменьшению более чем в 2 раза.

6. Подвижность клеток культуры (Ion" мутантный штамм E.coli К-12), как непосредственно обработанных МК, так и инокулированных в обработанную МК питательную среду повышается.

7. В физиологическом растворе, обработанном МК (4Гц, 90дБ), апликация АХ (5хЮ'эМ) вызывает обратимое уменьшение инотропного эффекта у перфузируемого сердца улитки Helix Pomatia, а МК с частотами 10, 20 и 50Гц изменений не вызывают. Инактивация Na+,K+-Hacoca эффекта не устраняет.

8. Полученные в настоящей работе данные позволяют заключить, что мишенью для МК является как внутреклеточная, так и внеклеточная водная среда, изменяя сруктуру которой, колебания осуществляют свое биологическое действие.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Степанян Р.С., Айрапетян Г.С., Айрапетян С.Н., Аракелян А.Г./ Сравнительный анализ влияния магнитного поля и акустических волн на электропроводность воды. Материалы Первой Российской конференции с международным участием "Проблемы электромагнитной безопасности человека. Фундаментальные и прикладные исследования", Москва, 28-29 ноября, 1996, с. 102-103.

2.Alaverdian Zh.R., Stepanian R.S., Ogannessian H.G., Barsegyan A.H., Markossian L.S., Ayrapetyan S.N./ Frequency-dependent effect of acoustic waves on vital bacterial functions. Proceedings Sixth Annual Meeting of the AEMS, Yerevan, September 23-26, 1997. World of Microstructure, 1998, N2 June, P. 13.

3.Stepanian R.S./ Effects of Acoustic Waves on Water and Physiological Solution Properties. In: "The 4th Pacific Ocean Remote Sensing Conference", Eds: Ming-Xia He and Ge Chen. Beijing Fortune Quick Printing Corporation Ltd., Qingdao, China, 1998., V.1, P.741-744.

4.СтеланянР.С./ О действии механических колебаний физиологического раствора на сократительную активность сердца улитки. Статья деп. в АрмНИИНТИ 12.08.98, N.116-Ap.98 (биол. науки), Юс.

ППЬРЬЪ unhntbh USb®Ub3Ub

UbfuUbhMUUUb SUSUbflhUbbPh иаОЬЗПКЭЗПЬЪО MbbUUPUbUMUb

opsbusbbph apu uua>n®L№n

^iuGqnigujj|iG pumbp. ùbfuuiG|iL|Uil|uiû LnLUimuGnLÚGbp, çph t|bl|inpujhujrinpqujL|aiGni.pjni.û, TbíB, оа|ш[1^ш1|ш0 fuinnipjniG, E.coli Ion ùnLiniuûLnGbp, ppçfi L|fiunLÚ, umiuGáGiugt|uJÓ upuifi IjöljnqnLGujlintpjniG, шдЬиффтфй, oniuipiufiG:

bijujtnti ruGbDiuiniJ, np piupâp (iGuibGuhi[nipju)ùp ôiujGbpp, fiG^piuáiujGo b фрршд^шй úiupiyu фш tuqrçniiî bG iuGQÛr].hiuin úbáiugnq qnquiGbpni{, fiQ¿tqbu GuiL ujjG, np 5nipQ huiGritiuujGni.ú t t|bGuwpuiGuil|UjG huii¡uiljujpqbp|i h[ii5GuiljiuG puiqljujgni.g|i¿ úiuup, npuibq. ^шшшрЦпиЗ bG G]rupuii{in|TJiuûuuL|iujfiG qnpópGpuigGbpti úbó úoiuq, йщшшш^й t Ьг|Ь[ ni.uniúGuiu|ipbL

iniuppbp hui6iu|rjujL)uiGnipjuu5p úbtuuiGtilfuiljujü inujinujGni.ijGbp|i (US) mqr(bgnLpjnLGp gpfi, 5>pwj|iG inLÓmjpGbpti U IjhGuuipujGujliuiG hiui5iul|ujpqbpti i|ptu: fltunnJGwuhpilbl t úbfuiuG|il)Ujl|UjG tniumujGni.t3Gbp|i luqqbgnipjnLGp Tbl3-|i $|iqiit)ujl|iuü huiwlimpjnLGGbpti, i5fil|pnopqwGfiqúGbpti l|bGumGuiljnipjUjG L lüniuGáGiugiluió upuifi liôljnLqnLGujl)ni.pjujG Црш; U;>fuujinujGgnii5 hiutnl|iuu|bu П12ШГ1ртр)тй t rjuipâilbi úb|nuiGhl-lujl|uiG шшшшйтбйЬр)! uiqqbgntp)iuG pfipuituti U CibtxiiuGfiqù|i hiujinGujpbpduiG 1|рш:

LfbfmuG|iL|UjljUjG inujinujGmi3Gbp|i iuqr¡bgnipjuii3p ppji

t|bl|inpiuhujqnpqujl|ujGnipjujG, ирт[1 L|ól|nrinLGujl)mpjujü, úfiljpnpGbph 3>ni.Gl)g|inGuiL iul)infii[nipjujG tbnifinfunipjniGGbpp pGnLpiuqpnq фпрйшпш^шй uii|jiu|Gbp[i gnijg bG ипшфи, np p22h PPLujfiG úfigiuilimPG tiiupnq t óuinuijb[ npiqbu pfipiufu, npji úfipngml intuuiujIjni.úGbp[i Ijiupnq bG huiqnpqilbl. P22h Ojnipu^nfuuiOiuljuijfiO qnpá¡]GpujgGbpti haiúiul|ujpqfiG:

^wpqtuptuütfwá t, np ¿¡Ь^ниО^ш^шй ¡лштшйтййЬрр ийтдйшй ú,h2Lu4uJJPh íhqh^LuljiuG L p[iù|iuJl)iuG huiin^nLpjnLGQbph фпфп[ш5ш0 i3fi2ngn4 innuiçujgGnitf bG lïJi^pnopqujQfiqLÎGhpfi !}>fiq|in|nq|iiu4uiG b p|inß|iCifiwljUJÜ huiuil|ni.pjni.GGbp|i фпфп^т^тй: ITbfuuiGhujllujljiuG imumuiGnu3Gbp[i hbinuiqui, uiilb|Ji funpc ntunLúGmufipnipjnLGp ртд 1цлш npnjb[ qpuiGg йщштшЦш)^ oqinuiqnpóúiuG iijpqjniGun|binnipjnLGp ф 2ШРЕ L|bGuuiinbfuGninqfiuitiujG qnpönGpiugGbpnLÜ, иш!и1шСшфш1|Ь[ opquiG|iqiîfi hiutfiup ifGuiuujíiujp hiii6ujfiniil¡U)GnLpjnLGGbp|i L fiûinbGu|ii[ni.pjni.Gûbpfi oqinuiqnpôniù[]: Uinujgtlujá uipqjnLGßGbpp hGuipu^npm.pjni.G bG шшфи GiuU quimbini tujG pggwjhG db|utuG|iqdGbp|i dujufiG, npnGg iquiuiiuiiluiuGiuinni bG upi/ф l)ôl|nqnLGl(mpjujG фпфп^п1р]шй haitfujp' $[iqfil|UjljujG qnpônGGbpfi luqqbgnipjuiG iqiujiluiGGbpnuS:

Siquiqiuluià £ fifl4-¡i щшц1фцт[

<uiQÜQiluj& t шщшодтрдшВ 23.11.98 p: "1шш1}Ьр 280: SujiupuiQuili 60:

Su[uiqp4iu& t «l-uiillip» linnuibpvumjiilti mujiupuiûmù: bpbiuifi, Sbpjuiû 72: