Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неоднородное магнитное поле и релаксационные колебания как инструмент изучения растительной клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Неоднородное магнитное поле и релаксационные колебания как инструмент изучения растительной клетки"

Р Г 6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

1 У МАГ)

I « 1..НН инепггут ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. НЛ.СЕМЕНОВА

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Олег Анатольевич

НЕОДНОРОДНОЕ МАГНИТНОЕ ПОЛЕ И РЕЛАКСАЦИОННЫЕ КОЛЕБАНИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ ИЗУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ

КЛЕТКИ.

(03.00.02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте химической физики им.Н.Н.Семенова

Российской Академии Наук. I

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Комиссаров ГХ.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Гольдфельд М.Г.

доктор биологических наук Мирошников АЛ.

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им.

М£Аомоносова, Биологический факультет, г.Москва

Защита состоится ■2Я иияЗ 1993г. в

■и.

часов на заседании

специализированного совета Л00226.07 при Институте химической физики им Л Л.Семенова РАН по адресу: Москва, 117977, улХосыпша 4, ИХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХФ РАН

Автореферат разослан К к? 1993 г.

У^кный секретарь Совета кандидат химических наук

МА. Смотряева

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: К настоящему времени достигнут значительный прогресс в изучении структуры н функционирования растительных клеток. Однако создание новых и развитие существующих физических методов изучения живых клеток остается актуальной задаче».

Например, для углубления представлений о механизмах фотосинтеза особое значение имеет поиск новых методов регистрации выделения фотосинтетического кислорода. Существующие способы регистрации наряду с большими достоинствами (высокая чуствительность, хорошие временные характеристики) имеют и значительные недостатки: регистрируется выделение кислорода, усредненное по большому ансамблю клеток или хлоропластов, имеется химическое или электрическое воздействие на объект. Поэтому представляет большой интерес регистрация выделения кислорода единичной фотосинтезирующеи клеткой, подвешенного с помощью магнитных пондеромоторных сил в своей культуральнон среде в поле магнитной системы при различных реяасмах освещения, по изменению ее магнитной восприимчивости.

К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении гравирецептирующих систем растений, однако единая точка зрения на механизмы восприятия растениями гравитационного стимула отсутсвует. В связи с этим представляет значительный интерес приложение магнитных методов к изучению физиологии растений, в частности, осуществление магнитофореза внутриклеточных частиц, находящихся в гравирецептирующих органах растений и моделирование таким образом гравитационного воздействия магнитными пондеромоторными ослами.

Еще один предложенный нами метод моделирования гравитационного стимула для растений состоит в использовании несимметричных механических колебаний растения, вызывающих смещение амилопластов относительно клетки за счет зависимости силы вязкого трения от скорости движения. Мы также предложили использовать с той же целью акустическое облучение гравичуствительных частей растений. Эти физические методы позволяют осуществлять неинвазнвным образом манипуляции с клеточными органелламн и получать информацию о механизмах гравирецепции растений и реологических свойствах клеток.

Цель работы заключалась в развитии новых подходов к исследованию растительной клетки, в частности, фотосинтезирующих и гравирецептирующих клеток. '

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Оценить экспериментально и теоретически возможности и ограниченна метола магнитного левтгационного подвеса для изучения выделения кислорода единичной фотосинтезирующей клеткой.

2. Разработать методы и средства формирования магнитомеханических сил действующих на гравирецептируюшие клетки растений, сравнимых по величине с силой земного тяготения. Провести эксперименты при локальном действии на часть апикальной зоны корня.

3. Разработать теоретическую модель и провести экспериментальные исследования по воздействию несимметричных колебании на грав1феиептируюшие органы растений.

Новизна работы.

1. Предложено использовать метод магнитного левитационного подвеса для изучения фотосинтеза. Оценены возможности метода.

2. Предложены и осуществлены устройства для создания высокогралентного магнитного поля с динамическим фактором §га<3(Н^/2)= 10^-10^з~/см в апикальных зонах корней проростков. В условиях земной гравитации без клиностатирования наблюдалась статистически достоверная реакция растения (тропный изгиб) в ответ на локальное воздействие такого магнитного стимула.

3. Исследовано воздействие несимметричных механических колебании на растения, получены статистически достоверные результаты по тропной реакции под действием этого фактора, построена модель процесса. Наблюдалась тропная реакция корней под действием ультразвука.

Научно - практическая значимость: Развитые в работе методы и подходы позволяют не только получать информацию о гравиреиептирующей системе растений, но и быть использованы для изучения гравирецегаши других организмов и для изучения механореиеггтирующих систем. Полученные результаты по действию неоднородного магнитного поля, несимметричных механических колебаний и ультразвука создают перспективы для решения проблеммы выращивания растений в космосе и управления ростом сельскохозяйственных растений. С реализацией метола магнитного левитационного подвеса связывается возможность исследования процессов медленного транспорта через мембрану клетки, кинетики биохимических процессов в ней, фагоцитоза, и исследований с использованием пара- и ферромагнитных меток. Аппробаиия работы: Материалы диссертации докладывались на Международной Школе РЕВБ "Надмолекулярная организация клетки", (Росток, Германия, 1992), на Международной конференции "Прикладная организация клетки", (Росток, Германия, 1990), на Конкурсе научных работ отдела Кинетики химических и биологических процессов ИХФ РАН, (Москва, 1992).

Публикации: По материалам дисерташш опубликовано 7 работ.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (96

наименований), трех глав, выводов и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .МЕТОД МАГНИТНОГО ЛЕВИТА1ШОННОГО ПОДВЕСА БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ВЫДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ЕДИНИЧНОЙ КЛЕТКОЙ ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ.

1.1. Метод магнитного левнтапионного подвеса биологических микрообъектов. Магнитофоретическими измерениями Ж1шых клеток занимается целый ряд групп (в ИХФ РАН, в МГУ, в ИФ Латвийской АН и др.), однако в литературе отсутствуют данные о магнитометрических методах, позволяющих длительно изучать кинетику магнитной восприимчивости единичного микрообъекта, подвешенного с помощью магнитных пондеромоторньх сил в соответствующей культуральной среде.

Пондеромоторная магнитная сила , действующая на тело объемом V, с объемной магнитной восприимчивостью е- =М(Н)/УН, где М(Н) - наведенный в поле Н магнитный момент тела как целого, находящееся в среде с магнитной восприимчивостью аеж и в неоднородном магнитном поле Н равна: Рм = (г^ - гж)У6гас1(Н2/2) = ДгУега(1(Н2/2)

Левитаиионный подвес заключается в создании таких условий, когда вес частицы уравновешивается магнитными пондеромоторными силами: = -Ррр , где Ргр =hpVg - вес тела в жидкости (за вычетом архимедовой силы). Откуда условие подвеса: gгad{H2/2) = - (др/йг^

Для большинства биологических объектов лр = 0.1-03 г/см^, Лаг =10"^-10"® едСГС, откуда необходимый динамический фактор поля О = gгad(H2/2) = 10®-10^э~/см. Получение магнитных полей с напряженностью более 2.5*10'* з является достаточно сложной технической задачей, но необходимый динамический фактор может быть создан путем уменьшения области неоднородности поля и увеличения таким образом его градиента.

Биологические объекты, как правило, более диамагнитны, чем окружающая их среда. Существует ряд магнитных систем, создающих условия для левитации диамагнетиков, но наиболее подходящей, на наш взгляд, магнитной системой для осуществления левш'ационного подвеса, является один из вариантов конструкции Броунбека, представляющая собой узкий плоский прямоугольный зазор между полюснымн наконечниками, с выемкой на их верхней грани (для стабилизации частицы в горизонтальной плоскости) (рис. 1).

Распределение динамического фактора по оси забора G(z) представлено на рис. 2. Частицы диамагнетика, попавшие на верхнюю' ветвь распределения G(z), устойчиво зависают, причем объекты с различной величиной Дге/Др левитируют на различной высоте. Процесс измерения лг?/др заключается в измерении абсолютной высоты подвеса измеряемого объекта, по которой восстанавливается величина G(z)/g, соответствующая этой точке. Так как G(z)/g = Дае/Др, то мы получаем, таким образом, величину Дг/Др. Калибровка G(z)/g осуществлялась по частицам с известной (латекс), помещенных в среды с различной геж (вода с добавлением парамагитных солей). Поскольку метод магнитного левитационного подвеса является статическим (основной измеряемой величиной является высота положения равновесия клетки), то результаты измерений не зависят от формы и размеров измеряемых частиц, от вязкости среды.

Основным физическим ограничением чусгвительносгн рассматриваемого метода является тепловое (броуновское) движение измеряемого объекта. Была проведена оценка чусгвительносгн метода Дг = (kT)/(LVgrad(H~/2)). где к-постоянная Больцмана, Т- температура, L - точность измерения смещения клетки; для ''типичной" клетки диаметром 10 мкм чусгвительносгь установки по Даг =10"^едСГС. Вообще, для объекта радиусом R чуствительность по разностной объемной магнитной восприимчивости Ls =(1/К^)*10"~^едСГС*см^.

Рис.1. Схема измерений в методе магнитного левитационого подвеса в поле магнитной системы Броунбека.

РнсЛ. Распределение динамического фактору магнитного поля grad(H~/2) по оси зазора.

фактору

Оценки времени установления левиташюнного подвеса для типичной клетки дали постоянную времени метода, которая для нашей установки составляет порядка десятков секунд.

12. Применение метода магнитного левиташюнного подвеса аая регистрации выделяющегося в процессе Фотосинтеза кислорода по изменению магшггной восприимчивости индивидуального фотосинтезируюшего объекта, вызванному выделением в нем парамагнитных молекул О?.

Чусгвительность установки по количеству молекул кислорда в клетке (сверх равновесной концентрации в среде) К0=ДСпУ = 3(кТ)~/(р~Ь £га<3(Н~/2)) =

7 1 А> "л

10'молекул/клетку, где р0 = 2д5(5*(5+1)) '~ - магнитный момент молекулы

о

кислорода (5=1), ; дд - магнетон Бора.

Кислород выделяется равномерно во всем объеме клетки радиусом Я со скоростью К (молекул/см^сек). В стационарном случае распределение избыточной концентрации кислорода в клетке, который свободно диффундирует с коэффициентом диффузии Б, описывается уравнениями:

Cq^t) = (K/6D)(R^-r^) + (KR3/3D) г < R

-C^r) = (KR3/3D)' (1/г) г > R

Опсуда находим среднюю избыточную концентрацию кислорода в клетке йС^= 0.4 KR2/D (молекул/см3). Тогда число молекул кислорода в клетке N0^= ¿CqV= 0.4 KR^V/D, откуда скорость выделения кислорода, необходимая для регистрации рассматриваемым методом К = NoD/(0.4 R-V). Таким образом, для регистрации рассматриваемым методом в клетке диаметром 10 мкм должно выделяться 5.7*10"^ мольО^/оРсек, а в клетке диаметром 20 мкм, соответственно, 1.8*Ю"Лиоль02/оАек.

Используемый в фотосинтезе световой поток, обеспечивающий требуемую скорость выделения кислорода для клетки водоросли диаметром 10 мкм ФфС~ 9'10~3 Вт/см", для клетки диаметром 20 мкм, соответственно, ФфС~ 6*10" Вт/см'-. Сравнивая эти величины с величиной светового потока, при которой наблюдается насыщение фотосистем

(- 0.1 Вт/см"), и, учитывая КПД. фотосинтеза (порядка процента) и чуствительность метода, можно сделать вывод, что надо использовать те виды зеленых водорослей, клетки которых имеют диаметр 15-25 мкм, тогда переход темнота - свет насыщающей интенсивное™ возможно зафиксировать этим методом.

В экспериментальной установке используется телевизионный микроскоп "Пармоквант-2" и оригинальная кювета для магтггофоретических исследований биологических микрообъектов. Разработанная магнитная система установки обеспечивает конфигурацию магнитного поля, необходимую для осуществления устой-

1П

чивого левиташюнного подвеса с динамическим фактором grad(H~/2)=10 э~/см

(точность установки наконечников - 10 мкм). Установка обеспечивает удобную подачу пробы в рабочую область и медленные перемещения измеряемых частиц, ' поддержание температуры в диапазоне 4-40°С с точностью 0.1°С, подавление конвективных потоков и гидродинамических пульсаций, освещение исследуемых микрообьектов разными источниками света (мощным источником видимого света (05 Вт/см^), импульсным источником света насыщающей фотосинтетические системы интенсивности). Левитация исследуемых микрообъектов осуществляется в измерительном капилляре диаметром 100 мкм, изолированном от термостатнрующего контура и обеспечивающего подавление конвективных потоков. Выбор объектов, наблюдение за ними и регистрация их перемещений осуществляется с помощью микроскопа. Поле магнитной системы изучалось путем наблюдения поведения в ней свежесуспензированных зерен крахмала йге/йр = 1,6*10"'едСГС/(г/см^)) диаметром 10-20мкм.

В рамках этой работы была проведена серия оценочных экспериментов с хлоропласгами (диаметр 3-4 мкм) и одноклеточной водорослью хлореллой (диаметр 1-5 мкм). Эксперименты показали, что хлорелла проявляет "диамагнитный характер" фореза,наблюдается ее форез вверх. В связи с малыми размерами клетки хлореллы сильно броунируют и очень медленно движутся к положению равновесия. Принимая во внимание вышеизложенные оценки и эксперименты, для изучения выделения кислорода рассматриваемым методом следует использовать зеленые водоросли с более крупными клетками (15-20 мкм).

2. ПРИМЕНЕНИЕ МАГНИТОФОРЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ГРАВИТРОПИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ РАСТЕНИЙ.

Впервые магнитомеханические силы были применены для воздействия на амилопласты (плотные крахмалсодержашие органеллы, находящиеся в гравирецептирующих клетках (статошггах) растений и смещающиеся под действием гравитации) Одусом (1960). Впоследствии эти подходы были развиты в ИХФ АН СССР (1980-1982). Однако во всех этих исследованиях величина пондеромоторной магнитной силы, действующей на амилопласты, не превышала значения, эквивалентного 10 и ее воздействию подвергалось все растение. В настоящей работе неоднородное магнитное поле создается с помощью малых (0.1 мм) ферромагнитных частиц, что позволило получить поле с динамическим

9 0 9

фактором р-ас1(Н^/2) = 10 э~/см, и, соответственно пондеромоторную магнитную силу = Дг\^га(3(Н2/2), действующую на амилопласты, порядка силы земного тяготения = Распределение магнитного поля и

динамического фактора grad(H~/2) вблизи замагниченной внешним магнитным

О

©

3 ®

® 9

О

©

7777

©

И

н

РисЗ

Рис.4, а)

Рис.4, б)

РисЗ. Распределение магнитного поля вокруг сферической намагниченной внешним магнитны^ полем ферромагнитной частицы. Стрелками показано направление grad(H"/2).

Рис.4. Постановка эксперимента и направление изгиба корня, соответсвуюшее модели, для случая "экваториальной плоскости" - магнитный стимул направлен к частице (а), и для случая "полярной области" - магнитный стимул направлен от частицы (б)

полем частицы приведено на рисЗ. Вокруг частицы существуют области с качественно различным распределением динамического фактора поля: 1) в "полярных" областях (область парамагнитного захвата) поле рядом с частицей больше внешнего и grad(H"/2) направлен к частице. Таким образом, сила, действующая на диамагнетик (Дг < 0), будет направлена от ферромагнитной частицы. 2) в "экваториальной" области (область диамагнитного захвата) поле вблизи частицы меньше внешнего и grad(H~/2) направлен от частицы. Таким образом, сила, действующая на диамагнетик, будет направлена к ферромагнитной частице. На рисунке 4 приведены схемы эксперимента и направления изгиба корня, соответсвуюшие модели, для обоих случаев.

Намагниченность частицы и величина динамического фактора поля рассчитывалась на компьютере IBM PC с помощью специально составленной программы на языке BASIC, приведенной в Приложении 1 к диссертации.

2.1. Объект н методика. Мы использовали 1,5-2 суточные проростки льна (Linum utitassimum), выращенные в темноте при комнатной температуре на вертикально расположенном субстрате. Аля опытов отбирались растения с прямым корнем длинной 1-1,5 см, у которых не был отмечен рост пшокотиля и выход семядолей из семенной оболочки.

В качестве источников неоднородного магнитного поля использовались кусочки пермендюровой проволоки диаметром 0,1 мм, длинной 0.1 - 2 мм,

помешенные в практически однородное поле магнитной системы на основе постоянных магнитов из сплава SmCoj. Напряженность магнитного поля в рабочем зазоре составляла 3'1(Р- 4_5Ч0^э. Таким образом, параметр grad(H~/2) составлял в ближайших к частице статошггах - ю'-10*"э~/см, что соответствует стимулу а - g, а в наиболее удаленных статошггах, расположенных на

противоположной стороне корня (его диаметр у льна - 0,5-0,'7мм) параметр

•> 7 О ^

grad(H-/2) - 10 э~/см, что соответствует стимулу - 10""g, т.е. пондеромоторная

сила действует в основном на блюкайшие к частице статоциты апекса корня.

Аля проведения экспериментов были изготовлены специальные кюветы из оргстекла, позволяющие корню перемешатся только в горизонтальной плоскости. В торцевой стенке кюветы имеется гнездо (углубление в форме кончика корня), куда помещался кончик корня проростка. В кювете N 1 в одну из боковых стенок этого гнезда параллельно корню был вплавлен кусочек пермендюровой проволоки диаметром 0,1 мм, длинной 1 мм. В кюветах N 2 и N 3 в непосредственной близости от этого гнезда были высверлены каналы диаметром 0,15 мм, по которым к кончику корня подводилась пермендюровая проволока диаметром 0,1 мм. В кювете N 2 с каждой стороны гнезда подходит по два канала, перпендикулярных корню. В кювете N 3 с каждой стороны гнезда проходит канал, параллельный корню.

Наблюдались изгибы коря в плоскости кюветы, за положительный результат всегда принимался изгиб корня в сторону, предсказанную теорией, за отрицательный - изгиб в противоположную сторону, за нулевой - отсутствие изгиба. Опыт длился в течение 12 часов, первый изгиб наблюдался обычно через 1 час. В опыте кювета с проростком помещалась в поле магнитной системы, в контроле та же кювета с проростком в поле не помещалась. Проверялось также действие однородного магнитного поля на изгиб корня (в отсутствие ферромагнитной частицы).

Для компенсации возможных механических влияний на изгиб корня (его повреждения, перекосы кюветы, прилипание семечка к подложке и тд.) проводились следующие эксперименты: после появления небольшого изгиба корня проросток переворачивался в кювете так, чтобы магнитный стимул действовал в противоположную сторону (в кювете N 1), либо (в кюветах N 2 и N 3) проволока перемещалась в канал с противоположной стороны кюветы. Если первоначальный изгиб был небольшой, то наблюдался изгиб в противоположную сторону, в результате корень приобретал S-образную форму. 22. Результаты и их обсуждение. В экспериментах, в которых апикальная зона корня со статошгтами находится в "экваториальной области" ферромагнитной частицы (см.рис.5-7) были отмечены ^ушественные отличия опыта от контроля в

полож.

нулевои отриц.

Рис.5. Распределение направлении изгиба корней проростков в кювете N 1 (положительный -изгиб в сответствии с моделью, нулевой - отсутствие изгиба; отрицательный - изгиб е противоположную сторону),

амилопласты в "экваториальной области" частицы

контроль

опыт

Рис.6. Распределение направлений изгиба корней проростков в кювете N 2; амилопласты в "экваториальной области" частицы

контроль опыт

полож.

нулевои отриц.

—- (_ - :

I' Ю*

Г ы.

I

I. = 1' I.

"'-ЙЙлВл

нулевой отр1ш.

' I МО | I «мм

С I»—.

С I' ■

и»| ■

"I. Ььд

-ЙУ&ВОП-^отрПСГ

Рис.7. Распределение направлений . изгиба корней проростков в кювете N 3; амилопласты в "экваториальной области" частицы

контроль опыт"

Рис.8. Распределение направлений изгиба корней проростков в кювете N 1; амилопласты в "полярной области" частицы

контроль опыт

кюветах N 1 и N 3. В контроле наблюдалась тенденцня к отсутствию изгиба корня (70-80% случаев) к практически равная вероятность изгиба корня в ту или другую сторону (от или к частице), если таковой происходил. В опыте же на этих двух кюветах 70-80% корней проростков изгибалось к частице, т.е. в сторону, предсказанную моделью, что значительно отличается от равновероятного распределения направлений изгиба в контроле и доказывает, что наблюдаемый изгиб вызывается воздействием магнитного поля на систем)' гравирецегшии корня, а не механическими артефактами.

Вариабельность результатов может быть связана со следующими факторами: 1) Влияние взаимного расположения ферромагнитной частицы и статошггов, вследствие малого объема области неоднордносги поля (этим фактором, по-видимому, объясняется меньший процент положительных результатов в кювете N 2); 2)Механическое воздействие кюветы; 3) Влияние начального изгиба корня; 4) Ошибки системы гравирецепции растения.

Несколько меньший процент положительных результатов в случае "полярной области" (магнитный стимул напрален от частицы) (см.рис.8), чем в первой конфигурации поля объясняется, по-видимому, тем, что для диамагнитных частиц "экваториальная область" частицы является потенциальной ямой (область "диамагнитного захвата"), в "полярной" же области положение диамагнитной часпшы существенно неустойчиво, поэтому система еще более чусгвительна к взаимному расположению статошггов апекса корня и часпшы.

В однородном поле (без ферромагнитной часпшы) не было отмечено отличия опыта от контроля. В экспериментах с изменением направления действия магнитного стимула результат сильно зависел от степени выраженности первоначального изгиба: если изгиб был сильно выражен, он обычно продолжал развиваться в том же направлении, а если изгиб только начался (обычно это отмечалось через 05-15 часа после начала опыта), то при смене направления магнитного стимула наблюдался изгиб в обратную сторону, что приводило к характерной Б-обраэной форме корня.

3. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГРАВИТАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЛЯ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ НЕЛИНЕЙНЫХ МЕХАНИЧЕСКИХ КОЛЕБАНИЙ И УЛЬТРАЗВУКА.

Осуществлялось моделирование гравитационного стимула на растения с помощью несимметричных механических колебаний и ультразвука. Такое расширение диапазона физических факторов, как мы полагаем, позволит получить больше информации о функционировании гравирецептируюших систем растений и создает предпосылки для практических применений.

о

У

о4

У

а v

Fhm f Ft

x'

X

Рис.9. Рис.10

Модель статоцита, Схема экспериментов с несимметричным

пояснения в тексте. колебаниямилзтб корня согласно модели

3.1. Модель. Смешение статоцитов при несимметричных колебаниях происходит за счет зависимости силы вязкого трения от скорости движения. Сложность механической структуры клетки (наличие наружных стенок и внутреннюю мембран, шггоскелета, нелинейность вяэкоупругих свойств цитоплазмы) делает затруднительным точное описание растительной клетки как механической системы. Мы использовали упрошенную модель растительтной клетки - статоиита (см.рис.9): Статошгг - контейнер, лишенный внутренних структур, заполненный вязкой жидкостью (вязкость ф, плотность р-ж ), в нем помешен амнлопласт - шарик объемом VT, плотностью pp. При движешш амилопласт испытыает только вязкое трение, не касается стенок и не вращается. Линейное приближение. Клетка совершает периодические колебания, причем закон движения (скорость v(t), ускорение a(t)) различен при движении в ту и в другую сторону, что вызывает движение амилопласта относительно клетки со скоростью u(t). Рассматривается эффективное смешение амилопласта ¿s относительно клетки под действием таких колебаний и деисгвуюшая на него эффективная сила F^.

В неинерциальной системе отсчета X'O'Y', связанной с клеткой, на амилопласт действует (поступательная) сила инерции FHH = m авнеш, где m =(рг-РжУ^'т п а1ла вязкого трения F-ф. Так как сила инершш является внешней силой, то сила взаимодействия амилопласта и клетки равна силе вязкого трения.

Так как число Рейнольдса очень мало: Re = pRu/rj = -107 << 1, то можно пользоваться Сгоксовым приближением: F-ф = 6irrjR u(t).

Строго говоря, Сгоксово приближение справедливо только для установившегося равномерного прямолинейного движения под действием постоянной силы. В нашем случае сила переменна и движение шара (амилопласта) сложное, но,

как показанно в диссертации, из-за малости числа Рейнольдса время

установления постоянной скорости (-Ю'^сек) очень мало по сравнению с 7 "Я

периодом колебании (10 -10 сек), и можно пренебречь переходными процессами.

Найдем смешение амилопласта относительно клетки при разных режимах колебаний. Уравнение движения:

ш du/dt = FHH- F^p = ma(t) - 6-nijR u(t)

a(t) = (ôn-jR/m) u(t) + du/dt (1)

В диссертации получены решения данного уравнения методом операционного исчисления при различных a(t) для следующих простейших случаев: 1) постоянная скорость, 2) постоянное ускорение, 3) постоянная вторая производная скорости. Наличие таких решений позволяет оценивать эффективную силу и эффективное смещение амилопласгов для колебаний произвольной формы.

32. Экспериментая установка (рис. И). I - источник пилообразного напряжения (напряжение развертки осциллографа С1-68), II - усилитель мощности У7-5, III - генератор механических колебаний ГМК-1, IV - кювета с проростками. Ускорения кюветы измерялись с помощью пьезоэлектрического датчика

Профиль колебаний а(1), обеспечиваемых установкой приведен на рис.12. Он достаточно сложен, поэтому точное решение уравнения (1) затруднительно. Аля оценки эффективной силы, действующей на амилопласты в эксперимен-

тальной установке, и их эффективного смещения относительнб клетки профиль колебаний был разделен на 6 участков ([0-1], [1-2]„., [5-0]), где 'движение кюветы можно считать либо равноускоренным, либо с постоянной первой производной ускорения, т.е. задача сводится к рассмотренным в диссертации случаям.

Рис. 12.

Согласно оценке смещение амилопластов в статошгтах корней растении на нашей установке: « = Ш'-'см = 0.1мкм > 0; следовательно, амилопласты будуг смещаться в ту сторону, где ускорение меньше, а расстояние, равное размеру клетки (- 20 мкм), будет пройдено ими за время порядка секунд. Т.е.

амилопласт за времена порядка секунд доспгает одной из клеточных стенок и совершает около нее колебательные движения с амплитудой порядка 0,5 мкм.

Оценим эффертшную силу, дейсгвуюшюю на амилопласты на нашей установке: Рэф = (1 /Х)|Р-гр(1) с!г = 0.8 т£, где Т - период колебаний. Т.е. эффектив-о

ное ускорение, действующее на амилопласты на нашей установке, равно 0.8 g.

Использовались проростки льна, полученные по методике, описанной выше. Проростки помещались вертикально в кювету, после чего она помещалась в вертикальное положение без вибраций примерно на 10 часов для того, чтобы произошло фиксирование проростков к подложке кюветы за счет слизи на семенной оболочке и корневых волосков, и только после закрепления проростков на подложке кюветы проростки подвергались вибрашш.. Конструкция кювет обеспечивала также необходимую аэрацию и водоснабжение проростков и удобство наблюдения за перемещениями корней. Кюветы позволяют корням проростков перемещатся только в вертикальной плоскости, совпадающей с плоскостью колебаний активного элемента генератора механических колебатш; таким образом, эффективная сила действует на амилопласты в горизонтальном направлении, а сила земной тяжести - вертикально (рис. 10). Так как величина эффективной силы сравнима с силой земного тяготения, наблюдался изгиб корней проростков на некоторой угол а от вертикали в плоскости кюветы. Эксперимент длился 30 - 80 часов.

33. Результаты и обсуждение. Распределения величин углов изгиба корней проростков при разных направлениях эффективной силы представлены на рисунке 13. Стрелка показывает направление изгиба в соответствии с моделью. Из гистограмм видно, что подавляющее большинство проростков изгибались в направлении, предсказанном моделью, но величина угла изгиба заметно варьировала. Статистическая обрабатка полученных экспериментальных результатов производилась на компьютере 1ВМ РС с помощью пакета "БТАТОКАРН". В предположении нормального закона распределения величин углов изгиба вокруг их среднего арифметического, были рассчитаны доверительные интервалы (по Стьюденту) при доверительной вероятности 0.9: соответственно для каждого случая: 252°± 6.1°; а = 225°± 6.8°. Важно отметить близость средних значений величин изгиба (в пределах доверительного интервала) при одинаковой величине, но разных направлениях эффективной силы. Проводились эксперименты со сменой направления действия эффективной силы на одно и то же растение: поел« появления изгиба корня в одну сторону колебания прекращались на 5-7 часов, затем, после возвращения направления роста корня к вертикали, вибрашш возобновлялась со сменой направленния

"У

-О-

-я -60 -У -ЭД -20 -20 -Ю

0 10 20 30 но $и 60 ?0

<Г

1 Г"] 5

-?С -Ф -Я? -30 -20 -Ю 0 ю 20 30 40 $0 60 70 '

Р,,с 13 Угол изгиба корней пол действием обозначено направление действия

ем эффективной силы Рэф. Стрелкой чего наблюдался изгиб в

действия эффективной силы, в результате

угла — ^-Гв1=

помощью ультразвука, паи. л г интенсивностью менее

действием ультразвуков потока с -^кт с ^йГГ ра^.ашшиного 01 Вт/см2 Мы связываем этот этот эффект с действием рхм

„по на статошпы т.к. ах^ческшЧ импеданс (рс) крахмальных зерен давления на статошпы, . возникновением

значительно отличается от импеданса шгтоплазмы, а также

аку

сшческих течений внутри клетки.

ВЫВОДЫ

1) Рассмотрены возможности метода левиташонного подвеса в неоднородном магнитном поле для исследования магнитных свойств единичных биологических микрообъектов, оценены принципиальные ограничения метода, его чуствительносп» по объемной магнитной восприимчивости, время установления левитационного подвеса (г - 10^-10~сек). Создана установка, реализующая левитационный подвес биологических микрообьектов в неоднородном магнитном поле микрозазора. Чуствительность установки по разности объемной восприимчивости изучаемого объекта и среды, в которой он находится, для типичного биообъекта составляет 10"8едСГС. Предложено использовать для магнитного подвеса поле малого отверстия в тонкой намагниченной пластине. Даны рекомендации по совершенствованию магнитной системы установки для осуществлению длительного (часы и дни) устойчивого магнитного левитационного подвеса биологических микрообъектов.

2) Показана принципиальная возможность зарегистрировать рассматриваемым методом ... изменение статической магнитной - восприимчивости фотосинтезируюшей клетки диаметром 15-25 мкм, вызванное- выделением в ней молекулярного кислорода при переходе темнота - свет насыщающей интенсивности. Проведены предварительные эксперименты с зелеными водорослями и хлоропластами на пределе чусгвительности установки.

3) Предложен и осуществлен метод силового воздействия на гравирецептирующие клетки растений, позволяющий формировать стимул, эквивалентный нескольким g, с помощью высокоградиентного магнитного поля (динамический фактор grad(H^/2)= 10» -10 э /см). Впервые показана возможность осуществления in vivo магнитофореза внутриклеточных частиц (амилопластов) в гравирецептируюших клетках растений и наблюдения соответствующей физиологической реакции на это воздействие (тропического изгиба) в условиях земного тяготения без клиностатирования.

4) Проведены эксперименты по воздействию высокоградиентного магнитного поля на апикальные зоны корней проростков льна. Действию магнитного стимула подвергалась небольшая доля (10-30%) сгатоцитов корня. Впервые показано, что на такое локальное воздействие растение отвечает полноценным тропным изгибом. Показано, что направление тропной реакции растения зависит от того, где расположены гравичуствительные клетки: в зоне диамагнитного или парамагнитного захвата. Полученные результаты могут быть использованы для создания методов выращивания растений в условиях микрогравитации.

5) Проведен анализ внутриклеточного движения амилопласгов при нелинейных колебанях растения. Показана возможность моделирования гравиташюнного стимула для растений с помощью такого воздействия. Создана оригинальная экспериментальная установка, обеспечивающая воздействие на растение, эквивалентное ускорению несколько g. Проведены эксперименты на проростках льна. Экспериментальные результаты удовлетворительно совпадают с полученными другими методами.

6) Предложено использовать для моделирования гравиташюнного воздействия на растения ультразвук. Проведены эксперименты, показавшие обоснованность модели. По параметрам полученного тропного изгиба можно получить информацию о величине акустического импеданса (рс) внутриклеточных структур.

7) Моделирование гравитационного воздействия на гравирецептируюшие органы растения тремя различными физическими факторами позволяет получить новую информацию о строении живой клетки и происходящих в ней процессах.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Кузнецов АА, Чиков В.М, Теренгьев AJH, Кузнецов OA, Савичев АА. Клеточный магнитофорез - основа получения физиологически значимой информации. //В Сб. 'Электрофорез клетки". - Уфа. - 1989. - С. 16 - 19.

2. Кузнецов А А, Кузнецов OA. Модел1фование гравиташюнного воздействия на

растения сильно неоднородным-магнитным полем. // Биофизика. - 1990. Т35, Вып. 5. - С. 835-840.----------•

3. Kuznetsov OA, Komissarov G.G. On the Possibility of the Magnetic Levitational

Suspension Method Application for Registration of Photosynthetic Oxygen Production by a Single Chloroplast or a Single-cell Alga. // Photosynthesis Research, supplemental issue. - 1992. V34, No 1. - P. 146

4. Кузнецов OA, Комиссаров Г .Г. Метод магнитного левитационного подвеса биологических микробъектов и его применение для регистрации выделения кислорода единичным фотосинтезирующим объектом. // Биофизика.- 1993. Т. 38, Вып.3.

5. Kuznetsov OA, Kuznetsov АА. Gravity simulation for plants by high gradient magnetic field, by vibrations and by ultrasound. // Abstract to the 11th International Congress of Biophysics. - Budapest, Hungary. - 1993.

6. Kuznetsov OA, Komissarov G.G. Registration of photosynthetic oxygen evolution

by a single-cell alga by the magnetic levitational suspension method. // Abstract to the 11th International Congress of Biophysics. -Budapest. Hungary. -1993.

7. Кузнецов OA, Комиссаров Г.Г. Применение метода магнитного левитационного подвеса биологических микрообъектов для регистрации выделения кислорода единичной клеткой при фотосинтезе. // Тезисы докладов "Путинских чтений по фотосинтезу". - 1993.