Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro"



На правах рукописи

Клещенко Юлия Евгеньевна

Действие дефензина а-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma

cruzi in vitro

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

1 7 (!ЮН 2010

004605228

Работа выполнена на базовой кафедре микробиологии и вирусологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» и на кафедре микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США)

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Карпенко Людмила Петровна,

Ph.D., профессор Виллалта Фернандо

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Токмалаев Анатолий Карпович

Лауреат Государственной премии СССР,

доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова»

Защита диссертации состоится « » 1и-€ Н X_2010 г. в /5 -££часов

на заседании диссертационного совета Д212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу:, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Trypanosoma cruzi - паразитический жгутиковый одноклеточный организм рода Trypanosoma, семейства Trypanosomatidae, отряда Kinetoplastida, класса Zooflagellata, типа Sarcomastigophora. Т. cruzi является возбудителем американского трипаносомоза (болезнь Шагаса), распространенного преимущественно в Южной и Центральной Америке, где в некоторых очагах может поражать до 70-90% населения. Заражение человека происходит в основном трансмиссивно с участием клопов семейства Reduviidae (70 видов), но возможно также при гемотрансфузии, трансплацентарно или с молоком матери. В природе резервуарами Т. cruzi выступают до 200 видов диких и домашних млекопитающих, поддерживающих естественные, в том числе, и синантропные очаги инфекции.

Местом паразитирования и размножения Т. cruzi в организме позвоночного хозяина служат клетки мононуклеарных фагоцитов, мигрирующие в ткани различных органов. Наиболее часто и тяжело поражаются сердце, гладкая и скелетная мускулатура, а также нервная система.

Внутриклеточное размножение Т. cruzi обеспечивает паразиту неуязвимость для циркулирующих в крови факторов защиты хозяина. Применяемые при болезни Шагаса в настоящее время лекарственные препараты - бензнидазол и нифуртимокс, эффективны лишь в острой фазе заболевания и не могут быть использованы при хронической его форме, обладая высокой токсичностью и приводя к ряду побочных эффектов. Названные терапевтические средства далеки от совершенства, чем и объясняется необходимость поиска новых подходов к созданию средств борьбы с данной протозойной инфекцией.

Одним из перспективных направлений исследований в этой области является изучение иммунитета и путей стимулирования иммунного ответа организма хозяина при болезни Шагаса. Особую группу эффекторных молекул системы врожденного иммунитета представляют дефензины - пептиды, которые характеризуются широким спектром антимикробной и антивирусной активности (Madison M.N., Kleshchenko Y.Y. et al., 2008). До настоящего времени действие дсфензинов на Т. cruzi не изучалось. Цель исследования

Целью настоящего диссертационного исследования является изучение действия дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro. Задачи исследования

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Изучить действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность трипомастигот и амастигот Т. cruzi при вариациях дозы и времени инкубации двухкомпонентных систем в опытах in vitro.

2. Изучить инвазивную активность трипомастигот, предварительно подвергнутых действию дефензина а-1 в опытах in vitro.

3. Установить ультраструктурные изменения, возникающие у Т. cruzi под действием дефензина а-1 человека.

Научная новизна работы

Впервые показано, что дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью по отношению к Т. cruzi в опытах in vitro. Определены концентрационные и временные характеристики действия препарата.

Описаны поэтапные изменения клеточных структур, приводящие к гибели паразита. Охарактеризован механизм взаимодействия дефензина а-1 и клеточной мембраны трипаносом с образованием пор и последующей перестройкой всех внутриклеточных мембран, сопровождающейся разрушением клеточных органелл, а также фрагментацией ДНК паразита. Практическая значимость работы

Дефензины представляют собой биополимеры животного происхождения. В результате исследований установлена токсичность дефензина а-1 против Т. cruzi, а также охарактеризован механизм токсичного действия. Получены оригинальные данные, раскрывающие физиологические механизмы резистентности макроорганизма к инфекции Т. cruzi. Факт микробицидного действия дефензина а-1 открывает возможности для поиска более эффективных терапевтических агентов при лечении болезни Шагаса.

Существует также проблема безопасности банков донорской крови, в которой могут оказаться патогенные трипомастиготы Т. cruzi. Использование дефензина а-1 в пределах физиологических концентраций может позволить элиминировать Т. cruzi и устранить риск заражения этими паразитами при переливании донорской крови. Основные положения, выносимые на защиту

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью против трипомастиготных и амастиготных форм Т. cruzi. Степень микробицидного действия природного биополимера предопределена дозой и временем инкубации компонентов в двухмодульной системе.

2. Установлен молекулярный механизм трипаноцидного эффекта. Электронно-микроскопические исследования показали характерную морфологию трипомастигот при воздействии дефензина а-1 человека, а также позволили

определить встраивание последнего в клеточную мембрану паразитического простейшего и образование мембранных пор. Ультраструктурные изменения и фрагментация ДНК, вызванные действием дефензина а-1 человека, имеют общие черты с клеточным апоптозом. Апробация работы

Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением базовой кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и кафедры микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США). Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии и вирусологии РУДН (2009, 20 ноября), на международной конференции «55th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Atlanta, GA., 12-16 ноября 2006 г.), на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (Washington, DC, с 28 апреля по 2 мая 2007 г.), на научной конференции « 94th Annual Meeting of the American Association of Immunologists» (Miami Beach, Florida, 18-22 мая, 2007 г.), на международной конференции «56th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Philadelphia, Pennsylvania, 4-8 ноября 2007 г.), и на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (San Diego, California, 5-9 апреля 2008 г.) Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, 1 из них - в издании, входящем в рекомендованный ВАК список. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы/^источников). Работа изложена на^странице^содержит К. рисунков и f. таблиц. Список литературы содержит работал. .^российских, зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Во всех экспериментах использовали трипомастиготные и амастиготные формы Т. cruzi клона ММС 20А, полученного из штамма Tulahuen (Lima M.F., et al., 1989). Чистую культуру трипомастигот выделяли из супернатанта культуры трансформированных миобластов крысы (Lima M.F. et al., 1989). Амастиготы были выделены по Villalta F. et al., 1998. Кровяные трипомастиготы получали из крови инфицированных мышей линии C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME).

В работе использовали дефензин а-1 человека с аминокислотной последовательностью ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC, полученный синтетическим путем и очищенный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Valore E.V., et al., 1992). Масспектрометрический анализ пептида показал единственный пик с отношением массы к заряду 3445,07 (m/z). Контрольный образец со случайной последовательностью аминокислот дефензина (CACRPGCRIQYECRARLTAICIGYFAWYCG) был синтезирован с помощью программы RJE-SEQ, которая позволяет сформировать последовательности, не встречающиеся во всех известных белках (http://bioinfoninatics.vKd.ie/shields/'TedwardsA.

Синтетические пептиды были получены в Genemed Synthesis (San Francisco, CA).

Для исследования действия от 3,7 цМ до 35 цМ дефензина а-1 человека на жизнеспособность Т. cruzi трипомастиготы или амастиготы (2х106/мл) инкубировали в культуральной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с различными дозами пептида, а также дополнительно с ослиными антителами к дефензину а-1 или контрольной неспецифической сывороткой (MBL International Corp., Woburn, MA) в течение 1 часа при 37 "С. В контрольных экспериментах паразитов инкубировали или с контрольным образцом или только в культуральной среде в таких же условиях. Количество убитых трипомастигот или амастигот определяли под микроскопом (Villalta F. et al., 1998), используя следующую формулу: % убитых трипаносом = [1 - (число живых паразитов после инкубации/число живых паразитов в культуральной среде)]х100. Каждый эксперимент был выполнен в трипликате, а также воспроизведен три раза.

Для изучения действия дефензина а-1 на трипомастиготы, выделенные из крови инфицированных мышей (3 х 106/мл в цитрате натрия - 1,5% ), инкубировали с 25 |iM дефензина а-1 или без него в течение 24 час. при 4 "С. Эксперименты были выполнены 3 раза в трипликате для каждого условия.

Для исследований взаимодействия дефензина а-1 человека с клеточной мембраной трипомастигот последние предварительно инкубировали с карбонил-цианид-от-хлор-фенилгидразоном (КЦ) (Shafet W.M., et al., 1998), вызывающим деполяризацию мембран. Трипомастиготы обрабатывали 10 цМ КЦ (Sigma, St. Louis, МО) в течение 15 мин., отмывали в культуральной среде, а затем инкубировали с 20 рМ дефензина а-1 в течение 1 часа при 37 °С. Контрольную культуру подвергали действию дефензина а-1 без обработки КЦ. Дополнительные контрольные эксперименты включали в себя инкубацию трипомастигот с 20 цМ контрольного пептида или дефензина а-1, который предварительно обработали либо сывороткой к дефензину, либо неспецифической сывороткой. Трипомастиготы также инкубировали только с 10 цМ КЦ или в культуральной среде в течение 1 час. при .37 °С. Эксперименты были выполнены 3 раза в трипликате для каждого условия.

Ультраструктурные изменения трипомастигот под действием дефензина а-1, a также мембранные поры, образуемые последним у трипомастигот, T. cruzi (107/мл) исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi-2700 (СЭМ), негативного контраста (нкСЭМ), негативного контраста с использованием антител с коллоидным золотом (н-иммуноголд-ЭМ) и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на установке Philips СМ-12. Кроме того, иммуноголд-ЭМ метод применяли для анализа локализации дефензина а-1 внутри трипаносомной клетки.

Для сканирующей электронной микроскопии трипомастиготы (107/мл) инкубировали в течение 1 часа с дефензином а-1 в различных концентрациях (3,7; 5 и 20 рМ), 20 цМ контрольного пептида или 20 цМ дефензина а-1, обработанного специфичными к нему антителами (IgG) или неспецифической сывороткой в течение 1 час. Материал обрабатывали по стандартной методике (Villalta F., et al., 1984) с постфиксацией в OsOî, золото-палладиевым раствором и исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi 2700.

Для негативной контрастной-ЭМ-окраски трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 3,7 |Ш дефензина а-1 или 3,7 цМ контрольного пептида в течение 1 часа, образцы окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой (Home R.W., Bangham A.D., et al., 1963) и анализировали под электронным микроскопом Philips СМ-12.

Для нк-иммуноголд-ЭМ трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 3,7 цМ дефензина а-1 и обрабатывали, как для нк-ЭМ. Образцы также инкубировали с антителами к дефензину а-1 или неспецифической сывороткой, разведенными в солевом растворе с 1 % эмбриональной телячьей сывороткой, антителами обезьян против козлиных IgG, конъюгированными с 12-нм частицами коллоидного золота (Amersham

7

Biosciences, NJ), которые также растворили в солевом растворе с 1 % эмбриональной телячьей сывороткой. Далее образцы докрашивали фосфорновольфрамовой кислотой и исследовали под электронным микроскопом Philips СМ-12.

Для анализа мембранных пор, образуемых под действием дефензина а-1 в мембранах трипомастигот, измеряли диаметр 320 пор в 3 независимых экспериментах.

Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 15 цМ дефензина а-1, а также 15 ¡Ш контрольного пептида, 15 цМ дефензина а-1, предварительно обработанного антителами к дефензину а-1 или неспецифической сывороткой, либо только в культуральной среде в течение разных промежутков времени: от 15 мин. до 1 часа при 37°С. Образцы были зафиксированы в 2,5% глутаровом альдегиде с постфиксацией в оксиде осмия OsÜ4 и заключены в смолу Спаррса. Ультратонкие срезы изучали под микроскопом Philips СМ-12 как описано ранее (Villalta F., et al., 1984).

В случае иммуноголд-ТЭМ трипомастиготы (107/мл) инкубировали с 10 цМ дефензина а-1 в течение 15 мин. и 1 часа, затем образцы были заключены в акриловую смолу (Villaita F., et al., 1984). Ультратонкие срезы трипомастигот, обработанных дефензином а-1, инкубировали с антителами к последнему или неспецифической сывороткой, после чего места связывания визуализировали вторыми антителами, конъюгированными с частицами коллоидного золота (Villalta F., et al., 1984). Срезы докрашивали 0,25% фосфоровольфрамовой кислотой и анализировали, как описано для трансмиссионной электронной микроскопии.

Для мониторинга фрагментации ДНК Т. cruzi был использован метод, основанный на специфичном встраивании биотинилированных нуклетидов dUTP в концевые участки фрагментов ДНК (TUNEL-анализ). Данный прием широко используется для определения клеточной смерти in situ (Roche Diagnostics Inc., Indianapolis, IN) (Madison M.N., et al., 2007). Трипомастиготы Т. cruzi (106/мл) инкубировали с 10 цМ дефензина а-1 в течение 5 мин. при 37°С в культуральной среде DMEM без фенола красного (Invitrogen Inc., CA). В качестве контроля использовали Т. cruzi, которые инкубировали либо с дефензином а-1, обработанным антителами к последнему (IgG), либо только в культуральной среде. Для позитивного контроля клетки обрабатывали экзонуклеазой (ДНКазой), очищенной из бычьей поджелудочной железы (Promega, Madison, WI). TUNEL-анализ проводили под флюоресцентным микроскопом Nikon (Kleshchenko Y.Y., et al., 2004), а также с помощью FACS-цитометрии (Heibein J.А. et al., 1999).

Определяли также изменения электрического потенциала цитоплазматической мембраны (ДЧ'р) трипомастигот под действием дефензина а-1 с помощью 5 nM DiBAC4

(бис-(1,3 дибутилбарбитуровая кислота)-триметин-оксонол, Molecular Probes, США) в соответствии с ранее описанными рекомендациями производителя (Piacenza L., 2007; Piacenza L., 2001). Для контроля использовали уже описанный выше набор экспериментов. Позитивным контролем служила 20%-ная сыворотка человека. Деполяризацию анализировали проточной цитометрией.

Для изучения способности дефензина а-1 ингибировать инвазию трипомастигот Т. cruzi в клетки использовали клеточную культуру HeLa, являющуюся хорошей моделью для изучения инфекции T. cruzi in vitro (Schenkman S. et al., 1992). Трипомастиготы инкубировали с 3,7 ¡дМ дефензина а-1, что эквивалентно его концентрации в крови человека, с 3,7 дМ контрольного пептида и только в культуральной среде с 3,7 цМ дефензина а-1, предварительно инкубированного с антителами к нему или же с неспецифической сывороткой. Клетки паразитов отмывали в культуральной среде DMEM, добавляли к монослойным клеткам HeLa в пропорции 10 паразитов на 1 клетку и инкубировали 2 часа (Nde P.N., et al., 2006). Несвязавшиеся с клетками HeLa паразиты были отмыты DMEM, зафиксированы в метаноле и окрашены по Гимза и с помощью ДНК-специфичного красителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Madison M.N., et al., 2007). Число паразитов на каждые 200 клеток HeLa подсчитывали под люминесцентным микроскопом. Число паразитов внутри клеток получали вычитанием количества окрашенных DAPI трипомастигот из общего количества связанных паразитов для 200 клеток HeLa. Увеличение числа паразитов внутри клеток через 24, 48 и 72 часа после инфекции определяли под микроскопом на препаратах, окрашенных по Гимза (Nde P.N., et al., 2006, Simmons K.J., 2006).

Для нейтрализации активности дефензина а-1 были использованы козьи антитела (0,1 - 1 мг/мл), выделенные аффинной хроматографией (дефензин-а-1-агароза) из сыворотки крови иммунизированного животного (каталожный номер #LS-C54238, Life Span Biosciences, США). Неспецифичные антитела были получены фракционированием иммуноглобулинов из сыворотки нормального животного того же вида (каталожный номер IN1G-IG, Innovative Research, США).

Результаты представляют собой среднее из трех независимых экспериментов, выполненных в трипликате с использованием одинаковых методик.

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью компьютерной программы Graphpad Prism. Отличия считались значимыми при Р <0,05 по критерию Стьюдента. Результаты выражены как средние + стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность трипомастиготных и амастиготных форм Т. cruzi in vitro

1.1. Действие дефензина а-1 человека на трипомастиготные и амастиготные формы Т. cruzi in vitro в культуралыюй среде

Показано, что дефензин а-1 человека обладает трипаноцидным действием на трипомастиготные формы Т. cruzi, полученные из супернатанта культуры трансформированных миобластов крыс. Эффект является дозозависимым и подчиняется кинетике насыщения. Минимальная концентрация пептида, при которой наблюдалось разрушительное действие препарата, составляла 3,7 - 5,0 цМ. Максимальную летальную дозу для трипомастигот в зоне насыщения составляли 30,0 цМ (рис. 1, а). Антитела, специфичные к дефензину а-1 человека, инактивировали его после предварительной инкубации, неспецифическая сыворотка не влияла на активность дефензина а-1. Инкубация трипомастигот с контрольным пептидом не влияла на жизнеспособность трипаносом (рис. 1, а).

Дефензин а-1 (цМ) Дефензин а-1 (цМ)

Дефензин а-1 □ Дефензин а-1 + антитела к нему (lgG)

А Дефензин а-1 + несиецифнческне антитела (lgG) C3Z) Контрольный пептид И Только культуральная среда

Рис.1. Действие дефензина а-1 в разных концентрациях на жизнеспособность трипомастигот (а) и амастигот (б)

Дефензин а-1 человека вызывал также гибель амастигот Т. cruzi, причем его действие зависело от дозы препарата, а специфическая сыворотка против дефензина а-1 нейтрализовала этот эффект. Амастиготы оказались более чувствительными к действию дефензина в концентрациях от 3,7 до 10 |дМ. Контрольный пептид не оказывал влияния на выживаемость амастигот (рис. 1, б).

1.2. Действие дефензина а-1 человека на трипомастигот Т. cruzi in vitro в крови мыши

Дефензин а-1 человека в концентрации 25 (iM и инкубации в течение 24 час. при 4 "С также губительно действует на трипомастиготы в крови мышей in vitro. Установлено, что в этих условиях (они соответствуют условиям хранения донорских образцов в банках крови) под действием а-1 дефензина а-1 погибает 35%±1,8% паразитов. Контрольный пептид не действовал на трипаносомы.

2. Действие дефензина а-1 человека на ультра структуру Т. cruzi

2.1. Ультраструктурные изменения мембран трипомастигот Т. cruzi под действием дефензина а-1

Экспериментально установлено, что КЦ, реагент, деполяризующий клеточную мембрану, исключал трипаноцидное действие дефензина а-1 человека на трипомастиготы Т. cruzi (рис. 2). Это можно объяснить тем, что деполяризованные мембраны одноклеточного паразита не могут взаимодействовать с дефензином а-1, что позволяет предполагать прямое летальное действие этого препарата на клеточные мембраны Т. cruzi. Соответственно, предварительная инкубация трипомастигот с 10 дМ КЦ, после которой следовала инкубация с дефензином а-1, ингибировала действие последнего. Инкубация трипомастигот только с деполяризующим агентом КЦ не влияла на их жизнеспособность -100 % клеток оставались живыми (рис. 2). Как и в предыдущих экспериментах специфичные антитела нейтрализовали эффект дефензина а-1, неспецифическая сыворотка не обладала такой способностью. Эти экспериментальные данные стали основой для дальнейшего исследования механизма действия дефензина а-1 на ультраструктурном уровне.

Как показали сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), нк-электронная микроскопия, нк-иммуноголд-электронная микроскопия и трансмиссионная электронная

микроскопия (ТЭМ) Т. спш, в контроле клеточные мембраны трипомастигот имели типичную структуру. Мембраны оставались интактными также при инкубации клеток с контрольным пептидом. При действии на Т. спш 3,7 цМ и 5 цМ дефензина а-1 в течение 1 часа наблюдалась дезорганизация клеточных мембран трипомастигот - выпячивания, прерывистость, разрывы. Эти эффекты были нивелированы в образцах, обработанных дефензином а-1, который предварительно инкубировали со специфичными к нему антителами.

К Д Д+КЦ КЦ Д+АД Д+К Ср

К - контрольный пептид Д - дефензин а-1 человека

Д+КЦ - дефензин а-1 человека + карбонил цианид т хлор-фенилгидразон (КЦ)

КЦ - карбонил цианид т хлор-фенилгидразон (КЦ)

Д+АД - дефензин а-1 человека + антитела (IgG) к нему

Д+К - дефензин а-1 + неспецифические антитела (IgG)

Ср - культуральная среда

Рис. 2. Чувствительность трипомастигот Т. спш к летальным дозам дефензина а-1 в присутствии или отсутствии карбонил-цианид-т-хлор-фенилгидразон (КЦ), контрольного пептида, специфичных и неспецифических антител.

Использование более высоких концентраций дефензина а-1 (20 цМ) для инкубации с трипомастиготами в течение 1 час. приводило к полному разрушению клетки паразита и отслоению жгутика от тела клетки.

Установили также, что дефензив а-1 вызывает деполяризацию цитоплазматической мембраны грипомастигот.

Факт изменения клеточной мембраны трипаносом под действием дефензина а-1 и его способность формировать поры в мембранах послужили основанием для дальнейшего изучения состояния ультраструктур трипаносомной клетки, обработанной дефензином а-1, для чего использовали нк-ЭМ - стандартной методики исследования мембранных пор (Bouley R., Breton S., et al., 2000).

2.2. Формирование мембранных пор под действием дефензина а-1 у грипомастигот T. cruzi

Рис. 3. Образование пор у грипомастигот Т. спи под действием дефензина а-1. А -формирование поп вдоль меморапы жгутика: МЖ - мембрана ж.угнка; Т - тело клетки паразита. Бар = 100 „м: Б - две поры дааметром 46 нм в ундулирующей мембране; В - слияние пор; Г - пора диаметром 92 нм. Бары рисунков Б,

Нк-ЭМ - анализ грипомастигот Т. спи, обработанных дефензином а-1, выявил образование мембранных пор (рис. 3). Дефензин а-1 образует поры преимущественно в области жгутика и прилегающих участков мембраны, как показано на рис. 3 А. На более светлом участке электронограммы хорошо видны поры разного размера. На рис. 3 Б

показаны поры при большем увеличении, способные сливаться друг с другом (рис. 3 В) и формировать поры еще большего диаметра (рис. 3 В, Г).

Характер встраивания дефензина а-1 в клеточную мембрану трипомастигот изучили методом нк-иммуноголд ЭМ. Результаты экспериментов представлены на рисунке 4. Показано, что дефензин а-1 встроен в мембрану трипомастигот в виде концентрических паттернов, приводящих в конечном счете к образованию пор или каналов.

А Г 50

40 30 20 10 0

1 23456789 10 Диаметр пор (им)

Рис. 4. Встраивание дефензина а-1 в мембрану трипомастигот с образованием концентрических фигур (А): А'- встраивание дефензина а-1 в мембрану через 15 мин. взаимодействия с клеткой; А"- мембрана трипомастиготы после действия к дефензина а-1, обработанного антителами к нему; Б - связывание дефензина се-1 с мембранами трипаносом после взаимодействия пептида, обработанного неспецифической сывороткой: Б', Б", Б'" - участки связывания различного диаметра через 15 мин взаимодействия; Б -мембранные норы через 30 мин. взаимодействия; Д - через 1 час взаимодействия. Бары = 0,1 мкм. Г - частота встречаемости пор различного диаметра под действием дефензина а-1 в дозе 3,7 цМ в течение 1 часа: 1-3.0 мкм, 2 - 6.0 мкм, 3 - 10-19 мкм, 4 - 20-29 мкм, 5 - 30-39 мкм; 6 - 40-49 мкм, 7 - 50-59 мкм, 8 - 60-69 мкм. 9 -70-79 мкм; 10-90-190 мкм.

Статистически значимые отличия обнаружены между группами, маркированными двумя звездочками, а также между группами с 2 и 1 звездочкой (Р<0,05).

Негативное контрастирование трипомастигот, обработанных козьими антителами к дефензину а-1 с последующей инкубацией с антикозьими антителами, конъюгированными с коллоидным золотом, позволило обнаружить концентрические паттерны дефензина а-1, встроенного в клеточную мембрану. Отсутствие окрашивания в

контроле свидетельствует о его специфичности (рис. 4 А"). Данные, представленные на рис. 4 Б, показывают концентрический или круговой характер взаимного расположения дефензина а-1 в мембране. Эти круги, образующиеся уже через 15 мин. после начала инкубации, могут иметь различный диаметр в зависимости от времени действия дефензина (панели Б", Б" Б'")- Соответственно, поры на панели Б' имеют диаметр 56,2 нм, на панели Б" - 142,0 нм, на панели Б'" 126,0 нм. На рис. 4 В показаны промежуточные поры после 30 мин. инкубации с дефензпном а-1. Рис. 4 Д иллюстрирует более поздние поры, образующиеся после 1 часа инкубации. На рис. 4 Г суммировано распределение частот встречаемости пор различного диаметра после 1 часа экспозиции с дефензином а-1. Самые высокие частоты встречаемости определены для пор с диаметром 10-39 нм (75%), более низкая встречаемость у пор с диаметром 3-6, 40-190 нм (25%).

2.3. Изменения внутриклеточной ультраструктуры трипомастигот Т. спш под действием дефензина а-1

Изучение трипомастигот с помощью ТЭМ показало, что при обработке трипомастигот 15 цМ дефензина а-1 наблюдались изменения ультраструктур пропорционально с увеличением времени инкубации.

Как видно на рис. 5 В, после 15 мин. инкубации с дефензином наряду с изменениями плазматической мембраны (прерывистость, потеря участков - обозначены стрелками) происходило разрушение подмембранных микротрубочек (обозначено концами стрелок), набухание митохондрии и изменения митохондриальных мембран (показаны звездочкой) в сравнении с нормальными трипомастиготами, которые инкубировали в клеточной среде (рис. 5 В'). В жгутиковой мембране появлялось больше электронно-плотных участков (показаны концами стрелок на рис. 5 Г) в сравнении с контролем (рис. 5 Г').

Инкубация трипомастигот с 15 цМ контрольным пептидом не оказывала никакого действия на паразита (рис. 5 А). Антитела к дефензину а-1 полностью нейтрализовали разрушительный эффект (рис. 5 Б). На рис. 5 Д видны цитоплазматические вакуоли, образовавшиеся после 30 мин. инкубации с 15 дМ дефензином а-1, отсутствующие при инкубации трипаносом без последнего (рис. 5 Д'). Некоторые вакуоли располагались очень близко друг к другу (показаны звездочками на рис. 5 Д). Через 45 мин. экспозиции с дефензнном а-1 все вакуоли сливались и формировали одну большую вакуоль (рис. 5 Е), таких вакуолей в контроле не было (рис. 5 Е'). После 1 часа инкубации трипакосомные клетки разрушались и не содержали различимых клеточных органелл (рис. 5 Ж) в отличие от нормальной клеточной структуры (рис. 5 Ж').

15

Рис. 5. Улътраструктурные изменения трипомастигот Т. спш под действием дефензина а-1. А -трипомастигота после инкубации с 15 цМ контрольного пептида в течение 1 часа; Б - трипомастигота после инкубации с 15 цМ дефензина а-1, предварительно обработанного специфичными антителами в течение 1 часа; В - трипомастигота после инкубации с 15 цМ дефензина а-1 в течение 15 мин. (клеточная мембрана деструктурирована, набухшая митохондрия -#). Стрелки указывают на участки с отсутствующей клеточной мембраной, концами стрелок обозначены мембранные микротрубочки. В' - митохондрия и микротрубочки трипомастиготы в культуральной среде (контроль): концами стрелок обозначены мембранные микротрубочки, * - нормальные митохондриальные мембраны; Г - нарушение жгутиковой мембраны (концы стрелок указывают на деструктурированные участки мембраны). Г' - жгутик трииомастигот в культуральной среде. Д - цитоплазматические вакуоли после 30 мин. инкубации с дефензином а-1 (указаны звездочками). Д' - цитоплазма трипомастиготы в контроле (в культуральной среде). Е -декомпартментализация внутриклеточных мембран после 45 мин. инкубации с дефензином а-1. Е1 -трипомастигота в контроле. Ж - разрушение трипомастиготы через 1 час после инкубации с дефензином а-1 (Е - жгутик). Ж'- трипомастиготы в нормальных условиях. Бары в панелях А, Б, Е, Е', Ж, Ж' = 0,5 мкм; бары в панелях В, В', Г, Г', Д, Д' = 0,1 мкм.

2.4. Распределение дефензина а-1 в клетках трипомастигот Т. спш

Для изучения распределения дефензина а-1 в трипаносомной клетке использовали иммуноголд ТЭМ.

Результаты, представленные на рис. 6 показали, что дефензин а-1 появляется в цитоплазме паразитарной клетки и в ее органеллах на ранних стадиях экспозиции и обнаруживается там уже через 15 мин. воздействия, когда разрушительный эффект еще мало различим, но появляются поры в цитоплазматических мембранах трипомастигот.

Внутри клеток дефензин а-1 обнаруживался в цитоплазме, ядре, и кинетопласте через 30 и 60 мин. инкубации (рис. 6 А, Б, В, Г), что соответствовало степени его трипаноцидного эффекта.

Рис. 6. Распределение дефензина а-! в клетках трипомастигот Т. cruzi: А - диффузное распределение 10 цМ дефензина а-1 по всей цитоплазме через 15 мин. воздействия (стрелкой указана кДНК, Я - ядро; бар = 500нм). Б - локализации дефензина а-1 в местах деструктивных изменений цитоплазмы через 30 мин. воздействия (бар = 1 ООнм). Г - дефензин а-1 в кинетопласте через 30 мин. экспозиции (К - кинетопласт; бар = 250нм). В - дефензин а-1 в клетке через 1 час экспозиции, клетка значительно повреждена (стрелкой указан кинетопласт, Я - ядро; бар = 500нм).

3. Действие дефензина а-1 на ДНК трипомастигот Т. cruzi

Как показал TUNEL-анализ, дефензин а-1 человека в концентрации 10 цМ индуцирует разрушение ДНК трипомастигот Т. cruzi. Через 5 мин. экспозиции ДНК подвергается фрагментации, что видно из графика проточной цитометрии (FACS) на рис. 7 А. В качестве позитивного контроля использовали экзогенную ДНКазу, которая также фрагментировала ДНК (рис. 7 А).

->.

Интенсивность флюоресценции

ДНКаза Дефензин Культуральная среда Дефензин + антитела

Рис. 7. ТИЫЕЬ-анализ. Фрагментация ДНК тршюмастигот Т. спга, обработанных дефензином а-1. А -анализ позитивных клеток проточной цитометрией (НЛСЗ); Б - флюоресцентная микроскопия трипомастигот.

а - триномастиготы после обработки ДНКазой (контроль); Ь - трипомастиготы после инкубации с дефензином а-1; с - трипомастиготы при инкубации в культуральной среде; £1 - трипомастиготы после инкубации с дефензином а-1, обработанным нейтрализующими антителами.

Дефензин а-1, обработанный специфичными антителами, не вызывал фрагментации ДНК, а нсспецифические антитела также не влияли на его активность. В культуральной среде, содержащиеся сами по себе трипомастиготы также не образовывали фрагментированной ДНК (рис. 7 А). Под люминесцентным микроскопом флуоресцирующие фрагменты ДНК были обнаружены как в ядре, так и в кинетопласте (рис. 7 Б, панель б). Обработка трипомастигот ДНКазой (позитивный контроль), вызывала сходную фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта паразитов (рис. 7 Б, панель а). При просмотре трипомастигот в клеточной среде без дефензина (рис. 7 Б, панель с) или с дефензином а-1, обработанным нейтрализующими специфичными антителами (рис. 7 Б, панель д) флюоресценции не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии фрагментации ДНК или неспецифичности эффекта.

Приведенные результаты показали, что дефензин а-1 индуцирует фрагментацию ДНК у 94% + 2% трипонасом, что соответствует эффекту экзогенной ДНКазы. Данные демонстрируют, способность дефензина а-1 выступать индуктором фрагментации ДНК ядра и кинетопласта Т. спга.

4. Действие дефензина а-1 на инвазнвную активность Т. спт

А Б

Время (ч)

Время (ч)

• о Культ, среда Контрольный пептид д О Дефензин + антитела Дефензин + неспецифич.

ш Дефензнн

Рис, 8, Влияние иреинкубации трипомастигот Т. спг/: на их инвазивную способность: А - снижение числа трииомастигот на 200 культивируемых опухолевых клеток НеЬа при преинкубации паразитов с 3,7 рМ дефензина а-1 по сравнению с кош ролями; Б - Снижение доли инфицированных культивируемых опухолевых клеток НеЬа после преинкубации трипомастигот с 3,7 рМ дефензина а-1 по сравнению с контролями.

Поскольку в предыдущих экспериментах было обнаружено, что сублетальные дозы дефензина а-1 вызывают изменения клеточной мембраны трипаносом, мы исследовали влияние дефензина а-1 на способность трипомастигот проникать в культивируемые эукариотические клетки варианта Не1л.

Для изучения свойства ингибировать инфекцию трипомастиготы Т. спш преинкубнровались с сублетальными дозами дефензина а-1 (3,7 цМ), после чего паразиты добавлялись к монослою культуры клеток НеЬа.

Было установлено, что обработка трипомастигот дефензином а-1 значительно снижает связывание паразитов с клеткой-хозяином и проникновение в нее через 2, 24,48 и

72 часа после заражения клеточной культуры, о чем свидетельствует снижение доли инфицированных клеток по сравнению с контролями с 60% до 10%. Это также подтверждается достоверно меньшим количеством трипаносом в трансформированных клетках и их замедленным размножением в те же промежутки эксперимента (рис. 8 А, Б). Данный эффект нивелировался только антителами к дефензину а-1.

В работе впервые исследована активность дефензина а-1 человека против трипомастиготной и амастиготной форм Т. cruzi. Установлено, что механизм этого действия связан с образованием мембранных пор и фрагментацией геномной ДНК паразита, что приводит к его гибели. Были обнаружены нарушения внутриклеточных органелл. Сублетальная доза дефензина а-1 человека вызывала снижение инвазивной способности трипомастигот. Таким образом, показано, что дефензин а-1 человека обладает трипаноцидными свойствами и является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения Т. cruzi.

Рядом авторов показано, что дефензины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов - вирусов, бактерий, грибов (Lehrer R.I., 1993). Относительно трипаносом, выявлено действие дефензина а-1 мышей на проциклические формы Trypanosoma brucei и против кровяных форм возбудителей африканского трипаносомоза (McGwire B.S., 2003). Чувствительность к дефензину а-1 была описана также для Giardia lamblia (Aley S.B., Zimmerman M., et al., 1994). Однако механизмы этого действия не исследовались.

Современные модели механизма взаимодействия дефензинов с мембранами основаны на использовании липидных бислоев как модели изучения электростатических отношений между катионными группами дефензинов и анионными фосфолииидными группами (Ganz Т., 2003, Lourenzoni M.R., 2007). Эти исследования позволяют предполагать, что дефензины абсорбируются на поверхности мембраны и пересекают синтетическую мембрану как мономеры или димеры в зависимости от заряда и электростатического потенциала, а разрушение целостности мембраны может происходить в результате образования пор.

Результаты данной работы показали, что трипаноцидная активность дефензина а-1 полностью ингибирована цианид - т- хлор-фенилгидразоном (КЦ), что поддерживает эту гипотезу. Эффект деполяризации мембраны КЦ и инактивации дефензина а-1 говорит о том, что активность последнего инициируется на плазматической мембране трипомастигот.

Нарушения мембран, а также фрагментация ДНК (Deschesnes R.G., Huot J., et al., 2001), а в более современных публикациях - образование пор, являются признаками апоптоза (Sugiyama Т., Kobayashi М., et al., 2004, Zhang С., Xu Y., et al., 1998).

Показанные факты образования пор, нарушений мембран и фрагментации ядерной ДНК и ДНК кинетопласта в трипаносомах под воздействием дефензина а-1 дают основание предположить, что он индуцирует апоптоз в трипомастиготах Т. cruzi, приводя тем самым к их клеточной смерти. Наши наблюдения за появлением дефензина а-1 в кинетопласте и в ядре подтверждают гипотезу об индукции фрагментации ДНК в ядре и кинетопласте при проникновении в них дефензина а-1 человека.

Чувствительность трипомастиготных форм Т. cruzi, характерных для кровяного русла, к дефензину а-1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения болезни Шагаса. Трипаноцидный эффект дефензина а-1 in vitro предполагает возможность использования его также для нейтрализации Т. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.

ВЫВОДЫ

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидными свойствами против трипомастиготных и амастиготных форм Т. cruzi in vitro.

2. Дефензин а-1 вызывает образование пор и нарушения в клеточных мембранах Т. cruzi.

3. Действие дефензина а-1 приводит к нарушениям внутриклеточных ультраструктур и гибели трипомастигот Т. cruzi.

4. Дефензин а-1 вызывает фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта трипомастигот Т. cruzi.

5. Дефензин а-1 ограничивает инвазивные свойства Т. cruzi.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Kleshchenko Y.Y., Madison M.N., Simmons K.N., Nde P.N., Lima M.F., and Villalta F. 2006. Trypanosoma cmzi regulates TLR9 to mediate an increase of defensin a-i expression and secretion to kill invasive trypanosomes. Journal of Immunology 176: S67.

Kleshchenko Y.Y., Madison M.N., Nde P.N., Simmons K.N., Lima M.F., and Villalta F. 2006. Defensin a-1 expression is up-regulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as a trypocidal mechanism to decrease cellular infection. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 75: A689.

Madison M.N. *, Kleshchenko Y.Y. *, Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2007. Human defensin a-1 causes Tiypanosoma cruzi membrane pore formation and induces

DNA fragmentation, which leads to trypanosome destruction. Infection and Immunity. 75: 4780-4791. (*equal contributors).

Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2007. Defensin a-1 is upregulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as an apoptotic trypanocidal mechanism. FASEB Journal. 21:250.10.

Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2007. Defensin a-1 expression is up-regulated in human cells in response to early Trypanosoma cruzi infection as an innate immune mechanism to decrease cellular infection via membrane pore formation leading to apoptosis. Journal of Immunology. Vol.178: S51.6.

Madison M.N., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., Lima M.F., and Villalta F. 2008. Human defensin a-1 causes Trypanosoma cruzi membrane pore formation and induces DNA fragmentation, which leads to trypanosome destruction. FASEB Journal. 22: 674.1.

Клещенко Ю.Е., Карпенко Л.П., Виллалта Ф.В. 2010. Действие дефензина а-1 человека на трипомастиготы Trypanosoma cruzi in vitro. БЭБМ, 6:

Kleshchenko Yulia Yevgenievna

The action of Human Defensin a-1 on Trypanosoma cruzi trypomastigotes and amastigotes in vitro

Here we show that human defensin a-1 displays a trypanocidal role against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas' disease. The mechanism of human defensin a-1 toxicity on T. cruzi is mediated by membrane pore formation leading to apoptosis. Exposure of defensin a-1 to infective trypomastigote forms of T. cruzi significantly reduced parasite viability. Electron microscopic analysis of ttypomastigotes upon short exposure to defensin a-1 revealed pore formation in the cellular and flagellar membranes, membrane disorganization, cytoplasmic vacuolization and membrane blebbing, a hallmark of apoptosis. Defensin a-1 rapidly induced DNA degradation in the trypanosome. Thus, human defensin a -1 is an innate immune molecule that causes severe toxicity to T. cruzi and plays an important role in reducing cellular infection.

Клещенко Юлия Евгеньевна

Действие дефензина а-1 человека на трипомастиготы и амастиготы

Trypanosoma cruzi in vitro

В работе представлены исследования по действию дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro. Показано, что трипаноцидный эффект пептида связан с образованием мембранных пор, нарушениями цитоплазматической мембраны и внутриклеточных органелл, а также фрагментацией геномной ДНК паразита. В экспериментах на клетках HeLa показано, что дефензин а-1 ограничивает инвазивную способность трипомастигот. Таким образом, установлено, что дефензин а-1 человека является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения Т. cruzi. Чувствительность кровяных трипомастиготных форм Т. cruzi к дефензину а-1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения американского трипаносомоза и предполагает возможность использования его также для нейтрализации Т. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.

Подписано в печать 22.04.10. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,25. Заказ 339

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д.З

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клещенко, Юлия Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология и жизненный цикл Trypanosoma cruzi.

1.2. Т. cruzi и болезнь Шагаса.

1.3. Защитные реакции человека на инфицирование Т. cruzi и противодействие возбудителя иммунному ответу.

1.4. Дефензины млекопитающих как один из факторов врожденного иммунитета.

1.5. Активность а-дефензинов против микроорганизмов (антибактериальная, антивирусная, антипротозойная).

1.6. Структура и механизмы действия а - дефензинов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Штаммы Т. cruzi, линии перевиваемых и культивируемых клеток млекопитающих, сыворотки.

2.2. Пептиды.

2.3. Изучение действия дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro.

2.4. Деполяризация цитоплазматических мембран Т. cruzi для изучения взаимодействия с ними дефензина а-1.

2.5. Электронная микроскопия.

2.6. Анализ фрагментации ДНК Т. cruzi, вызванной действием дефензина а-1.

2.7. Анализ деполяризации плазматических мембран Т. cruzi, вызванной действием дефензина а-1.

2.8. Анализ инвазивности Т. cruzi для клеток HeLa.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность.

Т. cruzi in vitro

3.1.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro в культуральной среде.

3.1.2. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro в крови мыши.

3.2. Действие дефензина а-1 на ультраструктуру Т. cruzi.

3.2.1. Ультраструктурные изменения мембран трппомастигот Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.2.2. Формирование мембранных нор под действием дефензина ау триномастигот Т. cruzi.

3.2.3. Изменения внутриклеточных ультраструктур трипомастигот

Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.2.4. Распределение дефензина а-1 в клетках трипомастигот

Т. cruzi.

3.3. Фрагментация ДНК трипомастигот Т. cruzi, вызванная действием дефензина а-1.

3.4. Действие дефензина а-1 на инвазивную активность трипомастигот Т. cruzi для клеток HeLa.

3.5. Деполяризация плазматических мембран трипомастигот

Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.6. Обсуждение результатов исследований.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro"

Актуальность проблемы

Trypanosoma cruzi — паразитический жгутиковый одноклеточный организм рода Trypanosoma, семейства Trypanosomatidae, отряда Kinetoplastida, класса Zooflagellata, типа Sarcomastigophora. Т. cruzi является возбудителем американского трипаносомоза (болезнь Шагаса), распространенного преимущественно в Южной и Центральной Америке, где в некоторых очагах может поражать до 70-90% населения. Заражение человека происходит в основном трансмиссивно с участием клопов семейства Rediiviidae (70 видов), но возможно также при гемотрансфузии, трансплацентарно или с молоком матери (Nickerson Р., et al., 1989). В последнем случае эта проблема актуальна для США, поскольку большое количество иммигрантов из Латинской Америки проживают в США и могут стать источником инфекции (Kirchhoff L.V., 1989). Американский Красный Крест недавно начал проверять банки крови на присутствие Trypanosoma cruzi (McCarthy М., 2003; Tobler L.H., et al., 2007). На сегодня описано несколько клинически выраженных случаев болезни Шагаса местного происхождения в Техасе и Калифорнии. В природе резервуарами Т. cruzi выступают до 200 видов диких и домашних млекопитающих, поддерживающих естественные, в том числе и синантропные очаги инфекции.

Местом паразитирования и размножения Т. cruzi в организме позвоночного хозяина служат клетки мононуклеарных фагоцитов, мигрирующие в ткани различных органов. Наиболее часто и тяжело поражаются сердце, гладкая и скелетная мускулатура, а также нервная система и другие органы.

Внутриклеточное размножение Т. cruzi обеспечивает паразиту неуязвимость для циркулирующих в крови факторов защиты хозяина. Применяемые при болезни Шагаса в настоящее время лекарственные препараты - бензнидазол и нифуртимокс, эффективны лишь в острой фазе заболевания и не могут быть использованы при хронической его форме, обладая высокой токсичностью и приводя к ряду побочных эффектов. Названные терапевтические средства далеки от совершенства, чем и объясняется необходимость поиска новых подходов к созданию средств борьбы с данной протозойной инфекцией.

Одним из перспективных направлений исследований в этой области является изучение иммунитета и путей стимулирования иммунного ответа организма хозяина при болезни Шагаса. Особую группу эффекторных молекул системы врожденного иммунитета представляют дефензины — пептиды, которые характеризуются широким спектром антимикробной и антивирусной активности (Madison M.N., Kleshchenko Y.Y. et al., 2007). До настоящего времени действие дефензинов на Т. cruzi не изучалось.

Цель исследования

Целью настоящего диссертационного исследования является изучение действия дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro.

Задачи исследования

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Изучить действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность трипомастигот и амастигот Т. cruzi при вариациях дозы и времени инкубации двухкомпонентных систем в опытах in vitro.

2. Изучить инвазивную активность трипомастигот, предварительно подвергнутых действию дефензина а-1 в опытах ш vitro.

3. Установить ультраструктурные изменения, возникающие у Т. cruzi под действием дефензина а-1 человека.

Научная новизна работы

Впервые показано, что дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью по отношению к Т. cruzi в опытах in vitro. Определены концентрационные и временные характеристики действия препарата.

Описаны поэтапные изменения клеточных структур, приводящие к гибели паразита. Охарактеризован механизм взаимодействия дефензина а-1 и клеточной мембраны трипаносом с образованием пор и последующей перестройкой всех внутриклеточных мембран, сопровождающейся разрушением клеточных органелл, а также фрагментацией ДНК паразита.

Практическая значимость работы

Дефензины представляют собой биополимеры животного происхождения. В результате исследований установлена токсичность дефензина а-1 против Т. спт, а также охарактеризован механизм токсичного действия. Получены оригинальные данные, раскрывающие физиологические механизмы резистентности макроорганизма к инфекции Т. сгигг. Факт микробицидного действия дефензина а-1 открывает возможности для поиска более эффективных терапевтических агентов при лечении болезни Шагаса.

Существует также проблема безопасности банков донорской крови, в которой могут оказаться патогенные трипомастиготы Т. сгт1. Использование дефензина а-1 в пределах физиологических концентраций может позволить элиминировать Т. спш и устранить риск заражения этими паразитами при переливании донорской крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью против трипомастиготных и амастиготных форм Т. спш. Степень микробицидного действия природного биополимера предопределена дозой и временем инкубации компонентов в двухмодульной системе.

2. Установлен молекулярный механизм трипаноцидного эффекта. Электронно-микроскопические исследования показали характерную морфологию трипомастигот при воздействии дефензина а-1 человека, а также позволили определить встраивание последнего в клеточную мембрану паразитического простейшего и образование мембранных пор. Ультраструктурные изменения и фрагментация ДНК, вызванные действием дефензина а-1 человека, имеют общие черты с клеточным апоптозом.

Апробация работы

Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением базовой кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и кафедры микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США). Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии и вирусологии РУДН (20 ноября 2009 г.), на международной конференции «55th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Atlanta, GA, 12-16 ноября 2006 г.), на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (Washington, DC, с 28 апреля по 2 мая 2007 г.), на научной конференции «94th Annual Meeting of the American Association of Immunologists» (Miami Beach, Florida, 18-22 мая, 2007 г.), на международной конференции «56th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Philadelphia, Pennsylvania, 4-8 ноября 2007 г.), и на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (San Diego, California, 5-9 апреля 2008 г.)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, 1 из них - в издании, входящем в рекомендованный ВАК список.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы (183 источника). Работа изложена на 97 страницах, содержит 16 рисунков и 0 таблиц. Список литературы содержит 183 работы: 4 российских, 179 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Клещенко, Юлия Евгеньевна

выводы

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидными свойствами против трипомастиготных и амастиготных форм Т. cruzi in vitro.

2. Дефензин а-1 вызывает образование пор и нарушения в клеточных мембранах Т. cruzi.

3. Действие дефензина а-1 приводит к нарушениям внутриклеточных ультраструктур и гибели трипомастигот Т. cruzi.

4. Дефензин а-1 вызывает фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта трипомастигот

Т. cruzi.

5. Дефензин а-1 ограничивает инвазивные свойства Т. cruzi.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлены исследования по действию дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro. Показано, что трипаноцидный эффект пептида связан с образованием мембранных пор, нарушениями цитоплазматической мембраны и внутриклеточных органелл, а также фрагментацией геномной ДНК паразита. Таким образом, установлено, что дефензин а-1 человека является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения Т. cruzi. Чувствительность кровяных трипомастиготных форм Т. cruzi к дефензину а-1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения американского трипаносомоза и предполагает возможность использования его также для нейтрализации Т. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клещенко, Юлия Евгеньевна, Москва

1. Каллиникова В.Д. 2004. Тула: Гриф и К. Противоопухолевые свойства жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi. 280 с.

2. Каллиникова В. Д., Соколова Н.М. Противораковые свойства паразитического жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi Chagas, 1909. //Вестн. Моск. Ун-та.- Сер. 16. Биология. - 1966 - № 2.- С.28-34.

3. Карпенко Л.П., Яшина Н.В. Методические указания к лабораторным занятиям по теме «Микробиологическая диагностика протозойных инфекций», 2004. //М., РУДН. 47 С.

4. Клюева Н.Г., Роскин Г.И. Биотерапия злокачественных опухолей. // М.: Изд-во Институтата вакцин и сывороток, 1957.-247 с.

5. Aarbiou J., Rabe K.F., and Hiemstra P.S. Role of defensins in inflammatory lung disease. // Ann. Med. 2002. - Vol. 34. - P. 96-101.

6. Abrahamsohn I.A., and Coffman R.L. Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN-gamma, and IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. // Exp. Parasitol. 1996. - Vol. 84. - P. 231-244.

7. Aley S.B., Zimmerman M., Hetsko M., Selsted M.E., and Gillin F.D. Killing of Giardia lamblia by cryptdins and cationic neutrophil peptides. // Infect. Immun.1994. Vol. 62. - P. 5397-5403.

8. Ashitani J., Mukae H., Nakazato M., Ihi T., Mashimoto H., Kadota J., Kohno S., and Matsukura S. Elevated concentrations of defensins in bronchoalveolar lavage fluid in diffuse panbronchiolitis. // Eur. Respir. J. 1998. - Vol. 11. - P. 104-111.

9. Bastos K.R., Barboza R., Sardinha L., Russo M., Alvarez J.M., and Lima M.R. Role of endogenous IFN-gamma in macrophage programming induced by IL-12 and IL-18. // J. Interferon Cytokine Res. 2007. - Vol. 27. - P. 399-410.

10. Bergeron M., and Olivier M. Trypanosoma cruzi-mediated IFN-gamma-inducible nitric oxide output in macrophages is regulated by iNOS mRNA stability. // J. Immunol. 2006. - Vol. 177. - P. 6271-6280.

11. Bhatia V. and Nisha Jain Garg. Previously Unrecognized Vaccine Candidates Control Trypanosoma cruzi Infection and Immunopathlogy in Mice. // Clin. Vaccine Immunol.-2008.-Vol.15. 8.-P. 1158-1164.

12. Bogdan C., and Rôllinghoff M. How do protozoan parasites survive inside macrophages? // Parasitai. Today 1999. - Vol. 15. - P. 22-28.

13. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3. - P. 238-250.

14. Bronner C., and Landry Y. The use of the potential-sensitive fluorescent probe bisoxonol in mast cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1070. - P. 321331.

15. Castro J.A., de Mecca M.M., and Bartel L.C. Toxic side effects of drugs used to treat Chagas' disease (American trypanosomiasis). // Hum. Exp. Toxicol. 2006. -Vol. 225.-P. 471-479.

16. Chang T.L. Vargas J.Jr., DelPortillo A., and Klotman M.E. Dual role of alpha-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity. // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115.-P. 765-773.

17. Chen K., Huang J., Gong W., Iribarren P., Dunlop N.M., and Wang J.M. Toll-like receptors in inflammation, infection and cancer. // Int. Immunopharmacol. 2007. -Vol. 7.-P. 1271-1285.

18. Coutinho C.M., Cavalcanti G.H., van Leuven F., and Araújo-Jorge T.C. Alpha-2-macroglobulin binds to the surface of Trypanosoma cruzi. // Parasitol Res. -1997.-Vol. 83.-P. 144-150.

19. Cunha-Neto E., Bilate A.M., Hyland K.V., Fonseca S.G., Kalil J., Engman D.M. Induction of cardiac autoimmunity in Chagas heart disease: a case for molecular mimicry. // Autoimmunity. 2006. - Vol. 39. - P. 41-54.

20. Daher K.A., Selsted M.E., Lehrer R.I. Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins. // J. Virol. 1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.// J. Virol. -1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.

21. De Miranda-Santos I.K., and Campos-Neto A. Receptor for immunoglobulin Fc on pathogenic but not on nonpathogenic protozoa of the Trypanosomatidae. // J. Exp. Med.-1981.-Vol. 154.-P. 1732-1742.

22. De Sousa M.A. Morphobiological characterization of Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 and its distinction from other trypanosomes. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -1999. Vol. 94. - Suppl. 1. - P. 205-210.

23. De Souza E.M., Menna-Barreto R., Araujo-Jorge T.C., Kumar A., Hu Q., Boykin D.W., and Soeiro M.N. Antiparasitic activity of aromatic diamidines is related to apoptosis-like death in Trypanosoma cruzi. II Parasitology. 2006. - Vol. 133. -P. 75-79.

24. De Souza W. A short review on the morphology of Trypanosoma cruzi: from 1909-1999. // Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 1999. - Vol. 94. - Suppl. 1. - P. 1736.

25. Debrabant A., Lee N., Bertholet S., Duncan R., and Nakhasi H.L. Programmed cell death in trypanosomatids and other unicellular organisms. // Int. J. Parasitol. -2003.-Vol. 33.-P. 257-267.

26. Deschesnes R.G., Huot J., Valerie K., and Landry J. Involvement of p38 in apoptosis-associated membrane blebbing and nuclear condensation. // Mol. Biol. Cell.-2001.-Vol. 12.-P. 1569-1582.

27. Duszenko M., Figarella K., Macleod E.T., and Welburn S.C. Death of a trypanosome: a selfish altruism. // Trends Parasitol. 2006. - Vol. 22. - P. 536542.

28. Eisenhauer P.B., Harwig S.S.L., and Lehrer R.I. Cryptdins: antimicrobial defensins of the murine small intestine. // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 3556-3565.

29. Freedman J.C., and Novak T.S. Optical measurement of membrane potencial in cells, organelles, and vesicles. // Metods Enzymol. — 1989. Vol. 172. - P. 102122.

30. Freire-de-Lima C.G., Nunes M.P., Corte-Real S., Soares M.P., Previato J.O., Mendonca-Previato LZ., and DosReis G.A. Proapoptotic activity of a

31. Trypanosoma cruzi ceramides-containing glycolipid turned on in host macrophages by IFN-gamma. // J. Immunol. 1998. - Vol. 161. - P. 4909-4916.

32. Ganz T. Extracellular release of antimicrobial defensins by human polymorphonuclear leukocytes. // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55. - P. 568-571.

33. Ganz T. Biosynthesis of defensins and other antimicrobial peptides. // Ciba Found. Symp.- 1994. Vol. 186.-P. 62-71.

34. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. // Nat. Rev. Immunol. -2003. Vol. 3. - P. 710-720.

35. Ganz T., and Lehrer R.I. Defensins. // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6. - P. 584-589.

36. Ganz T., Selsted M.E., Szklarek D., Harwig S.S.L., Daher K., Bainton D.F., and Lehrer R.I. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils. // J. Clin. Investig. -1985. Vol. 76. - P. 1427-1435.

37. Garg N., and Bhatia V. Current status and future prospects for a vaccine against American trypanosomiasis. // Exp. Rev. Vaccines 2005. - Vol. 4. - P. 867-880.

38. Ghosh D., Porter E., Shen B., Lee S.K., Wilk D., Drazba J., Yadav S.P., Crabb J.W., Ganz T., Bevins C.L. Paneth cell trypsin is the processing enzyme or human defensin-5. // Nat. Immunol. 2002. - Vol. 3. - P. 583-590.

39. Hashimoto M., Nakajima-Shimada J., Ishidoh K., and Aoki T. Gene expression profiles in response to Fas stimulation in Trypanosoma cruzi-infected host cells. // Int. J. Parasitol. 2005. - Vol. 35. - P. 1587-1594.

40. Hehl A.B., Regos A., Schraner E., and Schneider A. Bax function in the absence of mitochondria in the primitive protozoan Giardia lamblia. II PLoS ONE. 2007. -Vol. 2.-P. e488.

41. Heibein J.A., Barry M., Motyka B., and Bleackley R.C. Granzyme B-induced loss of mitochondrial inner membrane potential (Delta Psi m) and cytochrome c release are caspase independent. // J. Immunol. — 1999. Vol. 163. - P. 46834693.

42. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimmer: mechanisms of membrane permeabilization. // Science. -1991.-Vol. 251.-P. 1481-1485.

43. Hoare C.A. The trypanosomes of mammals. A Zoological Monograph. // Blackwell Scientific Publications Oxford, U.K. 1972. P. 1-749.

44. Hoff R., Teixeira R.S., Carvalho J.S., and Mott K.E. Trypanosoma cruzi in the cerebrospinal fluid during the acute stage of Chagas' disease. // N. Engl. J. Med. -1978. Vol. 298. -P. 604-606.

45. Hörne R.W., Bangham A.D., and Whittaker V.P. Negatively stained lipoprotein membranes. // Nature. 1963. - Vol. 200. - P. 1340.

46. Huttner K.M., Bevins C.L. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense. // Pediatr. Res. 1999. - Vol. 45. - P. 785-794.

47. Ihi T., Nakazato M., Mukae H., and Matsukura S. Elevated concentrations of human neutrophil peptides in plasma, blood, and body fluids from patients with infections. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 25. - P. 1134-1140.

48. Jacobs T., Bruhn H., Gaworski L., Fleischer B., and Leippe M. NK-lysin and its shortened analog NK-2 exhibit potent activities against Trypanosoma cruzi. II Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - Vol. 47. - P. 607-613.

49. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., and Lehrer R.I. Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 210-214.

50. Kierszenbaum F. Chagas' disease and the autoimmunity hypothesis. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 12. - P. 210-223.

51. Kierszenbaum F. Where do we stand on the autoimmunity hypothesis of Chagas disease?//Trends Parasitol.-2005. Vol. 21.-P. 513-516.

52. Kleshchenko Y.Y., Moody T.N., Furtak V.A., Ochieng J., Lima M.F., and Villalta F. Human galectin-3 promotes Trypanosoma cruzi adhesion to human coronary artery smooth muscle cells. // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6717-6721.

53. Kirchhoff L.V. Is Trypanosoma cruzi a new threat to our blood supply? // Ann. Intern. Med. 1989. - Vol. 111. - P. 773-775.

54. Klotman M.E., and Chang T.L. Defensins in innate antiviral immunity. // Nat. Rev. Immunol. 2006. - Vol. 6. - P. 447-456.

55. Kumar S., and Tarleton R.L. The relative contribution of antibody production and CD8+ T cell function to immune control of Trypanosoma cruzi. II Parasite Immunol. 1998. - Vol. 20. - P. 207-216.

56. La Flamme A.C., Kahn S.J., Rudensky A.Y., and Van Voorhis W.C. Trypanosoma cruzi- infected macrophages are defective in major histocompatibility complex class II antigen presentation. // Eur. J. Immunol. -1997. Vol. 27. - P. 3085-3094.

57. Lam D., Levraud J.P., Luciani M.F., and Golstein P. Autophagic or necrotic cell death in the absence of caspase and bcl-2 family members. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - Vol. 363. - P. 536-541.

58. Leguizamon M.S., Campetella O.E., González Cappa S.M., and Frasch A.C. Mice infected with Trypanosoma cruzi produce antibodies against the enzymatic domain of trans-sialidase that inhibit its activity. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62.-P. 3441-3446.

59. Lehrer R.I. Multispecific myeloid defensins. // Curr. Opin. Hematol. 2007. -Vol. 14.-P. 16-21.

60. Lehrer R.L, Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz T., and Selsted M.E. Interaction of human defensins with Escherichia coli: Mechanism of bactericidal activity. // J. Clin Invest. 1989. - Vol. 84. - P. 553-561.

61. Lehrer R.I., and Ganz T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. // Ciba Found Symp. 1992. - Vol. 171. - P. 276-290.

62. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., and Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells. // Annu. Rev. Immunol. 1993. - Vol. 11. -P. 105-128.

63. Lieke T., Graefe S.E., Klauenberg U., Fleischer B., and Jacobs T. NK cells contribute to the control of Trypanosoma cruzi infection by killing free parasites by perforin-independent mechanisms. // Infec. Immune. 2004. - Vol. 72. - P. 6817-6825.

64. Lieke T., Steeg C., Graefe S.E., Fleischer B., and Jacobs T. Interaction of natural killer cells with Trypanosoma cruzi-infected fibroblasts. // Clin. Exp. Immunol. — 2006. Vol. 145. - P. 357-364.

65. Lima M.F., and Kierszenbaum F. Lactoferrin effects on phagocytic cell function. I. Increased uptake and killing of an intracellular parasite by murine macrophages and human monocytes.//J. Immunol. 1985.-Vol. 134.-P. 4176-4183.

66. Lima M.F., Beltz L.A., and Kierszenbaum F. Trypanosoma cruzi: a specific surface marker for the amastigote form. // J. Protozool. 1988. - Vol. 35. - P. 108-110.

67. Lima M.F., and Villalta F. Trypanosoma cruzi trypomastigote clones differentially express a cell adhesion molecule. // Mol. Biochem. Parasitol. -1989.-Vol. 33.-P. 159-170.

68. Madison M.N., Lima M.F., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., and

69. Villalta F. Mechanism of toxicity of human defensin a-1 against Trypanosomathcruzi. II Proceedings of the 13 International Congress of Immunology. 2007. -P. 447-451.

70. Mallow E.B., Harris A., Salzman N., Russell J.P., DeBerardinis R.J., Ruchelli E., Bevins C.L. Human enteric defensins. Gene structure and developmental expression. Hi. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. - P. 4038-4045.

71. Mauel J. Intracellular survival of protozoan parasites with special reference to Leishmania spp., Toxoplasma gondii, and Trypanosoma cruzi. II Adv. Parasitol. -1996,-Vol. 38.-P. 1-51.

72. McCabe R., Meagher S., and Mullins B. Gamma interferon suppresses acute and chronic Trypanosoma cruzi infection in cyclosporine-treated mice. // 1991. Vol. 59.-P. 1633-1638.

73. McCabe R.E., Remington J.S., and Araujo F.G. Enhancement of resistance to Trypanosoma cruzi infection by recombinant interferon gamma. // In G. Byrne and J. Turco (ed). Interferon and nonviral pathogens. Marcel Dekker Inc., New York, 1988.-P. 203-216.

74. McCarthy M. American Red Cross to screen blood for Chagas' disease. // Lancet -2003.-Vol. 362.-P. 1988.

75. McGwire B.S., Olson C.L., Tack B.F., and Engman D.M. Killing of African trypanosomes by antimicrobial peptides. // J. infrct. Dis. 2003. - Vol. 188. - P. 146-152.

76. Ming M., Ewen M.E., and Pereira M.E. Trypanosome invasion of mammalian cells requires activation of TGF-beta signaling pathway. // Cell. 1995. - Vol. 82. - P. 287-296.

77. Nde P.N., Simmons K.J., Kleshchenko Y.Y., Pratap S., Lima M.F., and Villalta F. Silencing of the laminin gamma-1 gene blocks Trypanosoma cruzi infection. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 1643-1648.

78. Nicholls D.G. Simultaneous monitoring of ionophore- and inhibitor-mediated plasma and mitochondrial membrane potential changes in cultured neurons. // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281. - P. 14864-14874.

79. Nickerson P., Orr P., Schroeder M.L., Sekla L., and Johnston J.B. Transfusion-associated Trypanosoma cruzi infection in a non-endemic area. // Ann. Intern. Med.- 1989.-Vol. 111.-P. 851-853.

80. Norris K.A. Stable transfection of Trypanosoma cruzi epimastigotes with the trypomastigote-specific complement regulatory protein cDNA confers complement resistance. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2460-2465.

81. Nunes M.P., Andrade R.M., Lopes M.F., and Dos Reis G.A. Activation-induced T cell death exacerbates T. cruzi replication in macrophages cocultured with CD4+ T lymphocytes from infected hosts. // J. Immunol. 1998. - Vol. 160. - P. 13131319.

82. Panyutich A.V., Panyutich E.A., Krapivin V.A., Baturevich E.A., and Ganz T. Plasma defensin concentrations are elevated in patients with septicemia or bacterial meningitis. // J. Lab. Clin. Med. 1993. - Vol. 122. - P. 202-207.

83. Panyutich A.V., and Ganz T. Activated alpha 2-macroglobulin is a principal defensin-binding protein. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991. - Vol. 5. - P. 101-106.

84. Panyutich A.V., Szold O., Poon P.H., Tseng Y., and Ganz T. Identification of defensin binding to CI complement. // FEBS Lett. 1994. -Vol. 356. - P. 169173.

85. Pardi A., Zhang X.L., Selsted M.E., Skalicky J.J., Yip P.F. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 2. Three dimensional structures of rabbit NP-2 and human HNP-1. // Biochem. 1992. - Vol. 31. - P. 11357-11364.

86. Pazgier M., Li X., Lu W., Lubkowski J. Human defensins: synthesis and structural properties. // Curr. Pharm. Des. 2007. - Vol. 13. - P. 3096-3118.

87. Petersen C.A., Krumholz K.A., Carmen J., Sinai A.P., and Burleigh B.A. Trypanosoma cruzi infection and nuclear factor kappa B activation prevent apoptosis in cardiac cells. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 1580-1587.

88. Piacenza L., Peluffo G., and Radi R. L-Arginine-dependent suppression of apoptosis in Trypanosoma cruzi: Contribution of the nitric oxide and polyamine pathways. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - Vol. 93. - P. 7301-7306.

89. Quayle A.J., Porter E., Nussbaum A.A., Wang Y.M., Brabec C., Yip K.P., and Mok S.C. Gene expression, immunolocalization, and secretion of human defensin-5 in human female reproductive tract. // Am. J. Pathol. 1998. - Vol. 152.-P. 1247-1258.

90. Ramos E., Olivos-García A., Nequiz M., Saavedra E., Tello E., Saralegui A., Montfort I., and Pérez Tamayo R. Entamoeba histolytica: apoptosis induced in vitro by nitric oxide species. // Exp. Parasitol. 2007. - Vol. 116. - P. 257-265.

91. Reed S.G. In vivo administration of recombinant IFN-gamma induces macrophages activation, and prevents acute disease, immune suppression, and death in experimental Trypanosoma cruzi infections. // J. Immunol. 1988. - Vol. 140.-P. 4342-4347.

92. Reed S.G., Grabstein K.H., Pihl D.L., and Morrissey P.J. Recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor restores deficient immune responses in mice with chronic Trypanosoma cruzi infections. // Immunol. -1990.-Vol. 145.-P. 1564-1570.

93. Rebeiro-Gomes F.L., Silva M.T., and Dosreis G.A. Neutrophils, apoptosis and phagocytic clearance: an innate sequence of cellular responces regulating intramacrophagic parasite infections. // Parasitology — 2006. Vol. 132. - P. 6168.

94. Rosemberg S., Chaves C.J., Higuchi M.L., Lopes M.B., Castro H.L., and MachadoL.R. Fatal meningoencephalitis caused by reactivation of Trypanosoma cruzi infection in a patient with AIDS. // Neurology 1992. - Vol. 42. - P. 640642.

95. Salzman N.H., Ghosh D., Huttner K.M., Paterson Y., Bevins C.L. Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin. //Nature. 2003. - Vol. 422. - P. 522-526.

96. Samejima K., and Earnshaw W.C. Trashing the genome: the roles of nucleases during apoptosis. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 6. - P. 677-688.

97. Schenkman S., and Mortara R. HeLa cells extend and internalize pseudopodia during active invasion by Trypanosoma cruzi trypomastigote. // J. Cell Sci. -1992,-Vol. 101.-P. 895-905.

98. Schroder J.M., and Harder J. Human beta-defensin-2. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. - Vol. 31. - P. 645-651.

99. Selsted M. E., and Ouellette A.J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. //Nat. Immunol. 2005. - Vol. 6. - P. 551-557.

100. Selsted M.E., Miller S.I., Henschen A.H., and Ouellette A.J. Enteric defensins: antibiotic peptide components of intestinal host defense. // J. Cell Biol. 1992. -Vol. 118.-P. 929-936.

101. Selsted M.E., and Harwig S.S. Determination of the disulfide array in the human defensin HNP-2: a covalenty cyclized peptide. // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264.-P. 4003-4007.

102. Severa M., and Fitzgerald K.A. TLR-mediated activation of type I IFN during antiviral immune responses: fighting the battle to win the war. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2007.-Vol. 316.-P. 167-192.

103. Simmons K.J., Nde P.N., Kleshchenko Y.Y., Lima M.F., and Villalta F. Stable RNA interference of host thrombospondin-1 blocks Trypanosoma cruzi infection. // FEBS Lett. 2006. - Vol. 580. - P. 2365-2370.

104. Skalicky J.J., Selsted M.E., and Pardi A. Structure and dynamics of the neutrophil defensins NP-2, NP-5, and HNP-1: NMR studies of amide hydrogen exchange kinetics. // Proteins. -1994. Vol. 20. - P. 52-67.

105. Souto-Padron T. The surface charge of trypanosomatids. // An. Acad. Bras. Cienc.- 2002. Vol. 74. - P. 649-675.

106. Stempin C., Giordanengo L., Gea S., and Cerban F. Alternative activation and increase of Trypanosoma cruzi survival in murine macrophages stimulated by cruzipain, a parasite antigen. // J. Leukoc. Biol. — 2002. Vol. 72. - P. 727-734.

107. Sugiama T., Kobayashi M., Kawamura H., Li Q., and Puro D.G. Enhancement of P2X(7)-induced pore formation and apoptosis: an early effect of diabetes on the retinal microvasculature. // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. - Vol. 45. - P. 1026-1032.

108. Szyk A., Wu Z., Tucker K., Yang D., Lu W., and Lubkowski J. Crystal structures of human alpha-defensins HNP4, HD5, and HD6. // Protein Sci. 2006. - Vol. 15.- P. 2749-2760.

109. Tanaka S., Edberg C.J., Winn C., Fassina G., and Kimberley R. FcIIIb allele-sensitive release of a-defensins: anti-neutrophil cytoplasmic antibody-induced release of chemotaxins.//J. Immunol.-2003.-Vol. 171.-P. 6090-6096.

110. Tang Y.Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., and Selsted M.E. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated defensins. // Science 1999 - Vol. 286. - P. 498502.

111. Tanowitz H.B., Kirchhoff L.V., Simon D., Morris S.A., Weiss L.M, and Wittner M. Chagas' disease. // Clin. Microbiol. 1992. - Rev. 5. - P. 400-419.

112. Tarleton R.L., Grusby M.J., and Zhang L. Increased susceptibility of Stat4-deficient and enhanced resistance in Stat6-deficient mice to infection with Trypanosoma cruzi.// J. Immunol. 2000. - Vol. 165.-P. 1520-1525.

113. Tomlinson S., Pontes de Carvalho L.C., Vandekerckhove F., and Nussensweig V. Role of sialic acid in the resistance of Trypanosoma cruzi trypomastigotes to complement. // J. Immunol. 1994. - Vol. 153. - P. 3141-3147.

114. Une C., Andersson J., and Orn A. Role of IFN-alpha/beta and IL-12 in the activation of natural killer cells and interferon-gamma production during experimental infection with Trypanosoma cruzi. II Clin. Exp. Immunol. 2003. — Vol. 134.-P. 195-201.

115. Valore E.V., Ganz T. Posttranslational processing of defensins in immture human myeloid cells. // Blood. 1992. - Vol. 79. - P. 1538-1544.

116. Van Wetering S., Mannesse-Lazeroms S.P., van Sterkenburg M.A., Daha M.R., Dijkman J.H., and Hiemstra P.S. Effect of defensins on interleukin-8 synthesis in airway epithelial cells. // Am. J. Physiol. 1997. - Vol. 272. - P. L888-L896.

117. Van Wetering S., Sterk P.J., Rabe K.F., and Hiemstra P.S. Defensins: key players or bystanders in infection, injury, and repair in the lung? // J. Allergy Cli. Immunol. 1999. - Vol. 104. - P. 1131-1138.

118. Van Zandbergen G., Solbach W., and Laskay T. Apoptosis driven infection. // Autoimmunity. 2007. - Vol. 40. - P. 349-352.

119. Vaux D.L., and Strasser A. The molecular biology of apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - Vol. 93. - P. 2239-2244.

120. Villalta F., and Kierszenbaum F. Role of inflammatory cells in Chagas' disease. I. Uptake and mechanism of destruction of intracellular (amastigote) forms of Trypanosoma cruzi by human eosinophils. // J. Immunol. 1984. - Vol. 132. - P. 2053-2058.

121. Villalta F., and Kierszenbaum F. Effects of human colony-stimulating factor on the uptake and destruction of a pathogenic parasite (Trypanosoma cruzi) by human neutrophils. // J. Immunol. 1986. -Vol. 137. - P. 1703-1707.

122. Villalta F., Pankratz H.S., and Kierszenbaum F. Extracellular killing of Trypanosoma cruzi amastigotes by human eosinophils. // J. Protozool. 1987. -Vol. 34. - P. 285-290.

123. Weinberg A., Krisanaprakornkit S., and Dale B.A. Epithelial antimicrobial peptides: review and significance for oral applications. // Crit Rev. Oral Biol. Med. 1998. - Vol. 9. - P. 399-414.

124. Welburn S.C., Macleod E., Figarella K., and Duzensko M. Programmed cell death in African trypanosomes. // Parasitology. 2006. - Vol. 132. - P. S7-S18.

125. Wetering S.V., Mannesse-Lazeroms S.P.G., Dikjman J.H., and Hiemstra P.S. Effect of neutrophil serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: modulation of cytotoxicity and 1L-8 production. // J. Leukoc. Biol. 1997. - Vol. 62.-P. 217-226.

126. Wilde C.G., Griffith J.E., Marra M.N., Snable J.L., Scott R.W. Purification and characterization of human neutrophil peptide 4, a novel member of the defensin family. // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 11200-11203.

127. Wimley W.C., Selsted M.E., and White S.H. Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multemeric pores. // Protein Sci. 1994. - Vol. 3. - P. 1362-1373.

128. Xie C., Prahl A., Ericksen B., Wu Z., Zeng P., Li X., Lu W.Y., Lubkowski J., and Lu W. Reconstruction of the conserved beta-bulge in mammalian defensins using D-amino acids. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 32921-32929.

129. Yang D., Biragyn A., Kwak L.W., and Oppenheim J.J. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. // Trends Immunol. 2002. - Vol. 23. - P. 291-296.

130. Yu J.J., Gaffen S.L. Interleukin-17: a novel inflammatory cytokine that bridges innate and adaptive immunity. // Front. Biosci. 2008. - Vol. 13. - P. 170-177.

131. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. 2002. -Vol. 415.-P. 389-395.

132. Zhang C., Xu Y., Gu J., and Schlossman S.F. A cell surface receptor defined by a mAb mediates a unique type of cell death similar to oncosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 6290-6295.

133. Zhao C., Wang I., and Lehrer R.I. Widespread expression of beta-defensin hBD-1 in human secretory glands and epithelial cells. // FEBS Lett. 1996. -Vol. 396. -P.319-322.

134. Zimmermann G.R., Legault P., Selsted M.E., Pardi A. Solution structure of bovine neutrophil beta-defensin-2: the peptide fold of the beta-defesins is identical to that of the classical defensins. // Biochem. 1995. - Vol. 34. - P. 13663-13671.