Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Противораковая активность in vivo лизированных эпимастигот Trypanosoma cruzi различных генетических линий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Противораковая активность in vivo лизированных эпимастигот Trypanosoma cruzi различных генетических линий"

На правах рукописи

ЦЭЦЭГСАЙХАН Батмонх

ПРОТИВОРАКОВАЯ АКТИВНОСТЬ IN VIVO ЛИЗИРОВАННЫХ ЭПИМАСТИГОТ TRYPANOSOMA CRUZI РАЗЛИЧНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учен*>й степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и кафедре беспозвоночных биологического факультета Московского Государственного Университета

Научные руководители:

докюр биологических наук, профессор

кандидат биологических наук, доцент

Каллиникова Валерия Дмитриевна Карпенко Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Токмалаев Анатолий Карпович Чебышев Николай Васильевич

Ведущая организация:

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Защита состоится « /5~» 2005 года в часов

на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 г. Москва, ул. Миклухо - Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198 г. Москва, ул. Миклухо - Маклая, д.6.

Автореферат разослан «_т2_» Ж2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

S Ъ ^ Общая характеристика работы

Актуальность работы. Жгутиковое простейшее Trypanosoma cruzi -возбудитель болезни Чагаса, остающейся серьёзной проблемой Южной и Центральной Америки.

Интересная особенность этого паразита - открытый в 1931 году Г.И. Роскиным и Е.В.Экземплярской антагонизм между T.cruzi и процессом злокачественного роста, что легло в основу нового направления современной онкотерапии - биотерапии злокачественных заболеваний (Клюева, Роскин, 1946, 1957). Трипаносома оказалась способной предпочтительно перед нормальными клетками размножаться и развиваться в раковых клетках хозяина и таким образом подавлять опухолевый рост или приводить к полной регрессии новообразований. Эта противораковая активность T.cruzi распространяется и на злокачественные заболевания человека.

Противораковое начало сохраняется в культуральных (эпимастиготных) формах и убитых клетках T.cruzi, на основе чего из них производились два противоопухолевых препарата: круцин в России и трипаноза во Франции.

Механизм противоракового действия T.cruzi до сих пор нельзя считать выясненным. Уже в первых работах Г.И. Роскин высказал предположение об участии в этом феномене нескольких факторов. И в настоящее время появились данные, свидетельствующие о том, что эффект T.cruzi не сводится только к прямому воздействию на раковые клетки и что в противораковом феномене участвуют иммунологические механизмы.

Известно, что в патогенезе болезни Чагаса значительное место занимают аутоиммунные процессы, развивающиеся в результате общности антигенов паразита и тканей хозяина. Такая общность достаточно хорошо описана в отношении антигенов миокарда и нервной ткани. В последние годы появились данные об экспрессии на поверхностных структурах T.cruzi муцинов, сходных по строению с муцинами малигнизированных клеток.

В настоящее время показано, что вид T.cruzi в высокой степени структурирован генетически, а степень противораковой активности различна у штаммов данного вида, неодинаковых по биологическим свойствам.

Возможность исследования противоопухолевых свойств T.cruzi не на штаммах, а на клонах, т.е. генетически чистых линиях этого высоко дифференцированного вида, появилась только теперь. Первые исследования показали, что клоновые культуры могут быть продуцентами активного начала и степень эффекта соответствующих лизатов in. vitro зависит от дринад лежности клона к определенной генетической группе (Шеклакова, §003),

РОС. НАЦИОНАЛ ЬИАН . БИБЛИОТЕКА J СПетср О»

1ИОТЕКА 1

332У

Цель работы: Изучение противораковой активности in vivo лизированных эпимастигот T.cruzi различных генетических линий и участия иммунологических механизмов в этом эффекте. В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Изучить противораковую активность in vivo лизатов из различных клонов T.cruzi;

2. Исследовать общность антигенов T.cruzi и аденокарциномы Эрлиха;

3. Провести анализ гуморального иммунологического ответа на прививку опухоли и введение лизатов;

4. Оценить влияние антител против T.cruzi на рост опухоли;

5. Сравнить рост клонов T.cruzi на различных искусственных питательных средах.

Научная новизна.

В настоящей работе получило продолжение использование в биотерапии опухоли генетически чистых линий (клонов) T.cruzi. Их обнаруженный ранее эффект на раковых клетках in vitro (Шеклакова, 2003), в данной работе впервые подтвержден в отношении аденокарциномы Эрлиха мышей in vivo. Показано, что эффект зависит от дозы вводимого препарата.

Впервые выявлена общность антигенов T.cruzi и аденокарциномы Эрлиха.

Выявлено, что противораковое действие препарата из T.cruzi осуществляется in vivo на фоне значительного пула антител (AT) к трипаносоме: фоновых, индуцированных опухолью и возникших после введения лизатов.

Установлено, что все указанные AT оказывают ингибиторное влияние на рост прививной опухоли мышей.

При культивировании на искусственных питательных средах (среды LIT, NNN, махачкалинская) выявлены различия клонов по динамике роста, накоплению клеток и способности к длительному культивированию в этих условиях.

Практическая значимость работы.

1. Полученные данные вносят определенный вклад в изучение феномена противораковой активности T.cruzi и его связи с генетической гетерогенностью этого вида. Показана возможность использования клоновых культур T.cruzi в качестве продуцента противоопухолевого начала.

2. Выяснено, что даже у интактных мышей имеются фоновые антитела к T.cruzi, что заставляет более строго относиться к контролю в опытах по исследованию противоопухолевой активности трипаносомы.

3. Для выбора сред и клонов продуцента, способных культивироваться в достаточных для производства количествах, важны найденные клоновые

различия T.cruzi при культивировании на искусственных питательных средах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Лизаты клонов T.cruzi обладают противораковой активностью in vivo, но ' различаются по её степени в зависимости от клоновой принадлежности определенным генетическим группам

2. T.cruzi имеет общие антигены с аденокарциномой Эрлиха.

3. Лизаты T.cruzi обладают иммуногенностью и вызывают in vivo гуморальный ответ.

4. In vivo противоопухолевый эффект препаратов из T.cruzi осуществляется на фоне различных антител к трипаносоме, которые важны для противоракового эффекта.

5. Клоны различных генетических групп T.cruzi различаются по характеру роста на искусственных питательных средах.

Апробация работы. Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов и программой совместных исследований с Московским Государственным Университетом. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии РУДН (2003, 2004), международной конференции и III съезде Паразитологического общества при РАН (Петрозаводск, 2003), форуме монгольских студентов, обучающихся в Вузах РФ (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 24 рисунками. Список литературы содержит 169 работ: 32 российских и 137 зарубежных авторов.

Общая характеристика работы

Материалы и методы исследования.

В настоящей работе использовали эпимастиготные формы 9 клонов различных генетических групп T.cruzi из лаборатории UVR CNRS/IRD9996 "Генетика инфекционных заболеваний" (Монпелье, Франция): Р209-ь Gambab Spi¿.i, MASb Y7b MN12, CL-Brener, 86/29зб, Y7/2.,.

Использованные в работе клоны принадлежат основным генетическим труппам и подгруппам Т.спш ("ПЬаугепс ег а1., 1993).

Таблица 1.

Клоны Т.спш, источник их выделения и географическое __происхождение__

Клоны Группа DTU Источник выделения Страна

Р 209 ell DTU 1 Человек, хроническая фаза Боливия

Gamba ell 01с1е1рЫз агагае Бразилия

SP 104 ell Тпа1оша вртоЫ Чили

MAS1 ell DTU 2b Человек, хроническая фаза Бразилия

Y7 ell Человек Бразилия

MN cl2 DTU 2d Человек, хроническая фаза Чили

CL-Brener DTU 2e Triatoma тГе51апз Бразилия

86/2036 ТпаЮта ^евШв Боливия

Y7/2 ell Человек Бразилия

Эпимастиготные формы клонов культивировали in vitro на трех искусственных питательных средах: NNN, LIT (Liver Infusion Tryptose) и на специально разработанной среде совместно МГУ и НПО «Питательные среды» (Махачкала) - 45А (Каллиникова и др., 2000). Результаты культивирования оценивались по накоплению клеток (млн/мл) на разных пассажах и разных сроках культивирования в течение 2 лет.

Для получения элементарных препаратов - лизатов, на высоте роста культур, примерно на 14-20 дни после посева, клетки эпимастиготных форм трипаносомы подсчитывали в камере Горяева, выражая накопление в ке (миллион клеток в 1 мл), отделяли от среды центрифугированием, промывали физиологическим раствором, дистиллированной водой и лиофилизировали.

В опытах in vivo лизаты использовали в двух дозах: низкой -5 ке/мышь, высокой - 15 ке/мышь. Работа выполнена на самцах и самках беспородных мышей весом 20-25 г. Проведено 9 опытов с использованием 350 белых беспородных мышей. Опыты состояли из следующих этапов:

1. Прививка аденокарциномы Эрлиха, приводившая к образованию солидной опухоли.

2. Начиная с 6 дня после прививки опухоли, в течение 12 дней ежедневное введение лизатов эпимастигот T.cruzi подкожно в дозе по 5 или 15 ке/мышь и наблюдение за ростом аденокарциномы путем измерения площади опухоли через каждые 4-6 дней на протяжении 50-60 дней опыта. В качестве показателя подавления опухоли использовали индекс, который выражали

отношением средней площади опухоли в контроле к средней площади опухоли в опыте.

3. В ходе опытов определяли титр антител к T.cruzi у опытных и контрольных мышей с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (по Кунсу). Контроль сывороток осуществляли на следующих этапах экспериментов:

- до прививки опухоли, т.е. у интактных мышей;

- через 6 дней после прививки опухоли;

- через 6-7 дней после окончания введения лизатов T.cruzi, (примерно на

30-ый день от прививки опухоли);

- через 22 дня после окончания введения лизатов T.cruzi, (примерно на 50-

ый день от прививки опухоли);

Результаты реакции антиген-антитело просматривали 100 полях зрения под люминисцентным микроскопом, учитывали яркость флюоресценции трипаносом, «окрашенных» флуоресцирующими иммуноглобулинами, и оценивали по 4-х крестовой системе.

Для исследования общности антигенов T.cruzi и аденокарциномы Эрлиха использовали эпимастиготы T.cruzi штамма G, асцитные клетки перевивной мышиной аденокарциномы Эрлиха и кроличью гипериммунную сыворотку к T.cruzi с титром 1:1200 в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Противотрипаносомная сыворотка была декомплементирована, после чего её добавляли в предварительно отмытые взвеси трипаносом и опухолевых клеток. Такой контакт продолжали в течение 20 мин. при комнатной температуре, затем клетки отмывали от иммунной сыворотки физиологическим раствором и добавляли к ним флюоресцирующую антикроличью сыворотку. После 20- минутной инкубации её отмывали и обработанный таким образом материал микроскопировали под люминисцентным микроскопом.

Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 с применением критерия Стьюдента и регрессионного анализа. За уровень статистической значимости принимали р < 0,05 и ниже.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Действие лизатов эпимастигот T.cruzi на рост аденокарциномы Эрлиха мышей in vivo

1.1. Доза 5 ке/мышь. Проведено 4 опыта на 169 мышах с использованием лизатов 9 клонов T.cruzi.

Оценка результатов с помощью стандартного метода показала, что в целом 12 ежедневных введений лизатов в дозе 5 ке/мышь оказалось недостаточным для получения выраженного противоопухолевого эффекта (рис.1, а): опухолевый рост в опыте и контроле не различались достоверно.

Следует отметить, что при отсутствии достоверных различий в динамике роста опухолей в среднем, у отдельных животных в опыте наблюдалась достоверная задержка роста опухоли или даже полное освобождение от неё. В некоторых опытах этот эффект нивелировался за счет крупных размеров опухоли у отдельных мышей.

Для оценки полученного результата был применен новый прием математической обработки - определение безразмерного коэффициента корреляции, который позволил обнаружить положительный противораковый эффект от введения животным этой низкой дозы.

В контрольной группе была выражена зависимость размера опухоли от времени. Коэффициент корреляции ( Г\ ) при этом приближался к 1, в то время как в двух опытных группах этот показатель был значительно снижен и Г2= 0,686 ± 0,128, г3 = 0,699 ± 0,109. Таким образом, введение препарата даже в этой низкой дозе привело к нарушению линейной зависимости роста опухоли от времени. В этом эффекте клоновые различия были выражены слабо.

1.2. Доза 15 ке/мышь. Проведено 5 опытов на 181 мыши с использованием лизатов 9 клонов Т.спш.

Ингибирующее действие на опухолевый рост оказывали лизаты всех клонов Т.спш, за исключением клона У7. В целом подавление опухоли было достоверным на 20-50 дни (р < 0,01), а наибольший эффект наблюдался на 3040 дни после прививки (рис.1, б).

а) 5 млн клУмышь

б) 15 млн.кл/мышь

Рис.1. Влияние лизатов Т.спш нарост аденокарциномы Эрлиха по оси абсцисс - дни после прививки опухоли по оси ординат - средний размер опухоли, см2

В экспериментах с лизатами в дозе 15 ке наглядно проявилась зависимость противоопухолевого эффекта от клона Т.спш - продуцента

лизата

В динамике проведенных опытов имели место два неодинаковых периода: период введения лизата и после него. Препараты, полученные из разных клонов, различались как по общему противораковому эффекту, так и по ei о степени в период введения препарата, а также на последующем этапе.

В период введения препаратов наибольшим противоопухолевым эффектом (средние индексы 1,26 - 1,57 ) отличались лизаты клонов Р, G, Sp, MAS (Рис 2,6) Наименее активными (индексы 1,02 - 1,12) были лизаты клонов Y7/2, 86 и М\, CL, a Y7 вызывал некоторую стимуляцию опухолевого роста (индекс 0,68).

Эти клоновые различия хорошо совпадают с активностью тех же препаратов в их прямом действии на раковые клетки человека in vitro (Шеклакова, 2003) В культурах тканей в дозе 250 млн.кл./мл наиболее активными (гибель 78-94 % клеток рака молочной железы человека) были лизаты тех же клонов Р, G, Sp и MAS, а наименьшей активностью обладали лизаты клонов CL, Y7 ( гибель 44-52 % клеток) (рис.2,а).

Рис.2. Противоопухолевая активность лизатов различных клонов T.cruzi m

vitro и in \ivo

250 ке/мл

a. In vitro

% гибели клеток рака молочной железы человека в культурах злокачественных под влиянием

дозы 250 ке/мл (Шеклакова, 2003)

б. In vivo

Степень подавления роста опухоли под влиянием лизатов в дозе 15 ке/мышь (средний индекс в период введения лизатов)

Р G Sp 86 CL Y7/2 »1 MAS Y7

Таким образом, способность лизатов к прямому избирательному действию на раковые клетки в непосредственном с ними контакте in vitro проявляла и in vivo, несмотря на то, что в этой модели на прямой эффект накладывается многогранное взаимодействие с организмом хозяина.

Иные клоновые различия проявлялись в период после введения лизатов. В этот период при использовании обеих доз эффект был более значителен. И в нем наиболее активными нередко выступали лизаты иных клонов: Y7/2, 86, MAS. Однако в этот период в противораковом могут быть задействованы помимо прямого действия, опосредованные механизмы.

2. Антитела против T.cruzi, сопровождающие действие лизатов in vivo

Действие лизатов эпимастигот T.cruzi in vivo осуществляется на фоне целого набора антител против T.cruzi. Обнаружено по крайней мере три их источника, связанные с разными процессами.

2.1. Фоновые антитела

При исследовании индивидуальных сывороток мышей перед прививкой опухоли у 62 из 433 интактных животных были обнаружены не индуцированные целенаправленно, «спонтанные», или фоновые, антитела к Т. cruzi. Их экстенсивность в общей популяции составляла 14,3 ±1,7 %, а титр 1:10 (в логарифме 1,0 ± 0). Этот уровень оставался достаточно постоянным на протяжении опыта, как по титру, так и по распространению среди мышей (рис.3,а, б).

Обнаруженные фоновые антитела интактных мышей положительно реагировали с эпимастиготами тех или иных клонов T.cruzi, чаще с Р, Y7/2, MN и MAS.

2.2. Антитела, индуцированные прививкой опухоли

Известное из литературы сходство антигенов T.cruzi с клетками хозяина явилось основанием для поиска антигенных детерминант общих и с опухолевыми клетками организма (рис.4).

Гомологичная реакция гипериммунной противотрипаносомной кроличьей сыворотки с самими трипаносомами была положительной и выглядела как выраженное свечение поверхности (рис.4,а), а в отдельных случаях и кинетопласта эпимастигот. Данная реакция была специфичной. Однако иммунная противотрипаносомная сыворотка взаимодействовала не только с трипаносомами, но и в гетерологичной реакции с раковыми клетками. При этом асцитные клетки аденокарциномы Эрлиха давали поверхностное свечение, образуя хорошо визуализируемый комплекс не только на поверхности клеток, но и на ядре (рис.4,б). Это взаимодействие было специфичным. После сорбции иммунной сыворотки гомологичным штаммом T.cruzi на опухолевых клетках свечение отсутствовало (рис. 4,в).

P G Sp 86 CL Y7/2 MN MAS Y7

Рис.3. Антитела против T.cruzi, сопровождающие действие препаратов

in vivo

a, фоновые антитела

в, #^'а6титела, индуцированные прививкой опухоли д,4- антитела, индуцированные введением лизатов T.cruzi

а, динамика экстенсивности антител (% мышей)

б, гомология антител клонам T.cruzi (% мышей)

noJraS абсцисс - дни после прививки опухоли, по оси ординат - % мышей Р - Y7 - клоны T.cruzi

Рис. 4. Общность антигенов Т.спш и клеток аденокарциномы Эрлиха

Сыворотки Тгураповота спш Опухолевые клетки

Нативная иммунная + а + б

кроличья

противотрипаносомная сыворотка

| Сыворотка, I сорбированная Т 01x121

Сыворотка, сорбированная тканями мыши и средой

культивирования

Сыворотка | сорбированная | тканями мыши и

средой I культивирования

20 мин +

20 мин + д

72 часа + е

72 часа + ж

Сыворотка,

сорбированная

опухолевыми

клетками

При сорбировании иммунной сыворотки гомогенатами тканей интактных мышей или питательной средой культивирования сыворотка оставалась активной в отношении опухолевых клеток и трипаносом (рис. 4,г-ж). В то же время при предварительном сорбировании сыворотки опухолевыми клетками флюоресценция раковых клеток гасилась (рис.4,и), а на трипаносомах сохранялось слабое свечение, и на этом фоне весьма ярким становилось ядро и отчасти цитоплазма вокруг него (рис.4,з). Это может свидетельствовать о том, что общими с клетками аденокарциномы являются главным образом поверхностные и отчасти цитоплазматические компоненты Т.спш.

Прямое воздействие антител с такими детерминантами не являлись фатальным для паразита и опухолевой клетки. Эпимастиготы с выраженным свечением поверхности активно передвигались.

Из этого следует, что клетки аденокарциномы Эрлиха имеют общие антигенные детерминанты с теми антигенами трипаносом, которые не могут быть отнесены к тканевым, а по всей видимости являются опухоле-специфичными.

Подтверждением общности антигенов Т.спга и аденокарциномы Эрлиха явились появление антител к Т.спга в результате прививки опухоли. Среди 226 мышей, исходно лишенных фоновых антител к трипаносоме, уже через 6-8 дней после прививки аденокарциномы их приобрели 87 животных (38,5% ± 3,2). Экстенсивность этих антител, в зависимости от их гомологии разным клонам Т.спш, составляла от 7,7 до 71 %. (рис.3,в) а титр 1: 21 (в логарифме 1,23).

В дальнейшей динамике опытов экстенсивность антител, поднявшаяся в результате прививки опухоли с 0 до 38,5%, падала очень постепенно, сохраняясь на примерно одинаковом уровне 31-39 % (рис. 3, г).

Подобно фоновым, среди привнесенных опухолью антител к Т.спш были гомологичные тем или иным из 9 использованных клонов, однако этот репертуар антигенной специфичности был несколько иным (рис. 3,в).

2.3. Антитела к Т.спш. индуцированные введением лизатовТ.спш

Таким образом, в контроле мыши обладали весьма значительным арсеналом антител к Т.спш (фоновым и привнесенным прививкой опухоли). Этот фон становился ещё более сложным в результате введения опухолевым мышам лизатов Т.спш.

Использованные в качестве противоракового препарата лиофилизированные лизаты Т.спш оказались иммуногенными. Появление именно этих антител, индуцированных введением препарата, в чистом виде можно было обнаружить у той категории животных, которые до лечения не имели антител к Т.спга, ни фоновых, ни вызванных прививкой опухоли. Среди 41 таких мышей через 6 дней после окончания курса

введения препарата эти антитела приобрели 18, т.е. 43,9 ± 7,7 %, а титр колебался от 1:12 до 1:65 (в логарифме от 1,06 до 1,6), составляя в среднем 1:33 (в логарифме 1,35).

Такая связанная с введением препарата иммунизация против T.cruzi носила клоново-направленный характер. В соответствии с этим результаты положительной реакции сывороток с вызвавшим образование антител антигенным вариантом можно рассматривать как меру иммуногенности клонов T.cruzi.

Высоко иммунногенными были лизаты клонов хруппы DTU1 (Р, G, Sp) и особенно клона MAS (подгруппа DTU2b). Экстенсивность антител к ним составляла 52,9 - 75 %. Наименее иммуногенными были лизаты клонов CL и Y7/2 (подгруппа DTU2d) - 20-25 % мышей (рис. 3, е).

Экстенсивность антител, вызванных только действием лизатов трипаносом, достигнув 43,9 ± 7,7 % через неделю после введения препарата, оставалась столь же высокой и через 3 недели (46,9 ± 8,8 %) (рис.3,д). Титр этих антител в динамике в эти же сроки сохранялся на уровне 1:33 - 1:25 (в логарифме 1,35 и 1,32).

Несмотря на различный противораковый эффект, использованные дозы лизатов индуцировали уровни антител к T.cruzi, которые достоверно не различался.

Найденные три источника обеспечивают весьма значительный пул антител к T.cruzi, на фоне которого in vivo осуществляется действие лизатов трипаносомы. Даже в контроле он высок, слагается из антител двух разных источников (фоновые и индуцированные прививкой опухоли) и порождает вопрос о чистом контроле, т.е. привносит определенные трудности в учете результатов.

Тем не менее, уровень антител к T.cruzi выше у опытных мышей в результате введения лизатов. Разница экстенсивности АТ между контрольной и опытной группами становилась особенно ощутимой через 3 недели после окончания введения препарата (~50 дней после прививки опухоли), когда уровень антител, привнесенных опухолью, начинал снижаться, а у получивших лизат оставался равным 60,75 % (рис.5).

80

Рис. 5. Сравнительная динамика экстенсивности антител к Т.сгап в опытной и контрольной группе

дни

о

10 20 30 40 50

3. Роль антител к Т.спш в противоопухолевом эффекте

Независимо от происхождения, все описанные антитела к Т.спш оказались связанными с противоопухолевым эффектом.

3.1. Несмотря на низкие титры, обнаруженные у 14,3 ± 1,7 % мышей, фоновые антитела оказались важными для дальнейшего злокачественного роста.

В шести опытах, на 62 мышах было выяснено, что присутствие у контрольных мышей фоновых антител к Т.спш оказывает ингибирующее влияние на рост привитой аденокарциномы (рис.6,а): опухоль уменьшалась в 1,5-2,5 раза и максимум этого эффекта достигается на 30-40 дни после прививки опухоли.

3.2. Подобно фоновым антителам, антитела к Т.сгигЪ индуцированные прививкой аденокарциномы, также были важны для

опухолевого роста.

Мыши, не имеющие фоновых антител, но приобретшие их после прививки опухоли, имели меньшие размеры аденокарциномы, чем животные не ответившие на прививку опухоли образованием антител к Т.спш (рис.6, б). При этом максимальная разница с контролем достигалась к 30-40 дню роста опухоли и индекс подавления опухоли составлял 4,4.

3.3. Противоопухолевая активность антител, возникших в результате введения лизатов Т.спш, выяснялась в каждом опыте сравнением размеров опухоли у 2 групп мышей: контрольных мышей, изначально лишенных фоновых и приобретенных после прививки опухоли антител к клону-продуценту лизата Т.спш и опытных мышей, изначально лишенных этих АТ, но подвергшихся введению лизата и ответивших на него продукцией АТ к данному клону

Это сравнение показало, что приобретение антител к вводимому клону лизата в большинстве случаев приводит к торможению опухолевого роста. Достоверная (р < 0,01) и максимальная разница с контролем достигалась после окончания введения препарата, на 30-40 дни роста опухоли (рис.6,в) и индекс подавления опухоли составлял 3,8.

Однако зависимость опухолевого роста от антител, привносимых лизатами, не была такой прямой, как в случае антител фоновых или индуцированных прививкой опухоли. Во-первых, еще больший эффект под влиянием лизатов наблюдался у мышей, у которых введение препарата не сопровождалось появлением антител к Т.спш. Они достоверно отставали в росте от мышей, у которых появились антитела к лизатам (р =0,01 на 30-50 дни) и от контроля (р <0,001). Во-вторых, регрессионный анализ не обнаружил положительной корреляции этого эффекта с титром антител (скорее наоборот: индекс Ье1а= - 0,15).

опухоли

а) влияние фоновых антител на рост опухоли

б) влияние антител к T.cruzi, индуцированных прививкой опухоли

в) влияние антител к T.cruzi, индуцированных введением лизатов T.cruzi

_ мыши, лишенные антител к T.cruzi (контроль)

— мыши, обладающие антителами к T.cruzi (опыт)

мыши, не приобретшие антител к T.cruzi в результате введения лизатов (опыт) по оси ординат-размер опухоли, см 2 по оси абсцисс - дни после имплантации опухоли

4. Различия клонов T.cruzi при культивировании на искусственных питательных средах

Во всех изученных свойствах: способности лизированных эпимастигот быть продуцентами противоопухолевого начала, индуцировать гуморальный ответ, проявлять антигенную общность с аденокарциномой и гомологию с фоновыми и индуцированными прививкой опухоли антителами - клоны T.cruzi проявляли некоторые различия, ещё требующие уточнения.

Наиболее достоверно и подробно нами изучены клоновые различия при культивировании. Культивирование 9 клонов T.cruzi на трех средах выявило их различия по динамике роста, накоплению клеток (млн/мл), способности к длительному росту на трех искусственных питательных средах: LIT, NNN и махачкалинская.

Наблюдения в течении 2 лет на разных пассажах и при разных сроках культивирования показало что, то на среде LIT хорошо росли клоны генетической группы DTUI и подгруппы DTU2b; на махачкалинской

среде NNN - клоны генетической группы DTU 1, DTU 2е, а на среде 45 А -клоны генетической группы DTU 1, DTU 2е.

В целом на всех трех средах хорошо культивировались клоны группы DTU 1, а также подгруппы DTU2e.

Иная картина наблюдалась по длительности сохранения клонов в культурах. Устойчивостью роста отличались клоны генетических подгрупп группы DTU 2: 2d (MN), 2е (Y7/2, 86, CL) и 2b (Y7). Заметим, что две первые подгруппы представлены комбинаторными генотипами (Barnabe et al., 2000).

Найденные различия клонов важны для характеристики их как возможных продуцентов препарата. Эта оценка, помимо противоопухолевых свойств, обязательно включает их способность легко культивироваться в достаточных для производства количествах.

ВЫВОДЫ

1. Способность продуцировать противоопухолевое начало является видовым свойством T.cruzi. Как штаммы паразита, так и клонированные, генетически разные линии трипаносомы в виде лизата эпимастигот вызывают подавление роста аденокарциномы Эрлиха.

2. В пределах испытанных доз (5 и 15 млн.кл./мышь) степень противоопухолевого эффекта пропорциональна им и зависит от клона T.cruzi.

3. Противораковое действие препарата из T.cruzi осуществляется in vivo на фоне значительного пула антител к T.cruzi разного происхождения:

а) фоновых антител к T.cruzi, обнаруженных у 14 % интактных мышей;

б) антител к T.cruzi, индуцированных прививкой аденокарциномы Эрлиха, имеющей общие антигены с трипаносомой;

в) антител к T.cruzi, образовавшихся в результате введения лиофилизированного лизата эпимастигот паразита.

4. Все типы антител к T.cruzi влияют на противораковый эффект трипаносомы:

а) фоновые антитела к T.cruzi достоверно сдерживают рост опухоли;

б) антитела к T.cruzi, индуцированные прививкой аденокарциномы Эрлиха, также ингибируют её рост;

в) опухолевый рост находится в сложной зависимости от антител, индуцированных лизатами паразита.

5. Выявлены различия клонов T.cruzi по степени ингибиции развития опухоли, по иммунногенности, по антигенной общности с аденокарциномой, а также по способности расти в различных культуральных средах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.Д. Каллиникова, Э.Г. Кравцов, Е.Н. Борисова, Т.А. Оглоблина, Л.В.Пахорукова, Цэцэгсайхаи Батмонх, Л.П. Карпенко, М.В. Далин. Развитие перевивных опухолей в мышах, иммунизированных против Trypanosoma cruzi. Проблемы современной паразитологии.//Материалы международной конференции и Ш съезда Паразитологического общества при РАН. -Т. 1.- Тезисы докладов. - Петрозаводск.- 2003 г. - С. 190.

2. Батмонх Цэцэгсайхан, Каллиникова В.Д., Карпенко Л.П. Противоопухолевые свойства Trypanosoma cruzi./УСборник трудов московской научной, теоретико-практической конференции монгольских студентов, магистрантов, аспирантов и докторантов, обучающихся в Вузах Российской Федерации. Москва 2004 г.-вып.1.- С. 15-17.

3. Цэцэгсайхан Батмонх, Кравцов Э.Г., Каллиникова В.Д., Карпенко Л.П. Исследование общности антигенов T.cruzi и опухоли.//Сборник трудов московской научной, теоретико-практической конференции монгольских студентов, магистрантов, аспирантов и докторантов, обучающихся в Вузах Российской Федерации. Москва 2004 г.- вып.1.- С. 18-20.

4. Ю.С. Коршунов, И.А. Османов, В.Д. Каллиникова, Э.Г. Кравцов, Л.П. Карпенко, Батмонх Цэцэгсайхан. Некоторые качественные закономерности, отмеченные при статистической обработке экспериментальных данных по действию лизированных Trypanosoma cruzi на опухолевый рост. // Вестник РУДН. Сер. Медицина.- 2005 г.- № 1 (29). -

5. В.Д. Каллиникова, Е.Н. Борисова, Э.Г. Кравцов, Батмонх Цэцэгсайхан, Л.П. Карпенко. К иммунологическим механизмам противоракового феномена Trypanosoma cruzi. //Вестник РУДН. Сер. Медицина,- 2005 г. -№ 1 (29). - С. 60-64.

С. 77-80.

Цэцэгсайхан Батмоих (Монголия) «Противораковая активность in vivo лизированных эпимастнгот T.cruzi различных

генетических линий»

Показано, что способность продуцировать противоопухолевое начало является видовым свойством Т cruzi Как штаммы паразита, так и клонированные, генетически разные линии трипаносомы в виде лизата эпимастигот вызывают подавление роста аденокарциномы Эрлиха. В пределах испытанных доз степень противоопухолевого эффекта пропорциональна им и зависит от клона T.cruzi. Выявлено, что T.cruzi имеет общие антигены с аденокарциномой Эрлиха. Показано, что противораковое действие препарата из T.cruzi осуществляется in vivo на фоне значительного пула антител к T.cruzi разного происхождения: фоновых антител; антител, индуцированных клетками аденокарциномы Эрлиха; а также антител, индуцированных введением лиофилизированного лизата эпимастигот. Фоновые и индуцированные прививкой аденокарциномы Эрлиха антитела достоверно сдерживают рост опухоли; опухолевый рост находится в сложной зависимости от антител, индуцированных лизатами. Выявлены различия клонов Т cruzi по степени ингибиции развития опухоли, иммуногенности, антигенной общности с аденокарциномой, а также по способности расти в различных культуральных средах.

Tsetsegsaikhan Batmunkh (Mongolia) "Anticarcinogenic activity in vivo lysed epimastigotes of different genetic strains of Trypanosoma

cruzi"

It is shown, that ability to produce the anticancer beginning is specific property of T.cruzi. Both strains of the parasite, and clones, genetically different lines of trypanosoma as lysed epimastigotes cause suppression of growth Ehrlich's adenocarcinoma. Within the limits of the tested dozes the degree of anticancer effect is proportional to them and depends on clone of T.cruzi. It is revealed, that T.cruzi has the common antigens with Ehrlich's adenocarcinoma. It is shown, that anticancer action of a preparation from T cruzi is earned out in vivo on a background of a significant pool of antibodies to T.cruzi of a different origin- spontaneous antibodies; antibodies, induced by inoculation Ehrlich's adenocarcinoma cells, and also antibodies, induced by introduction lyophilized epimastigotes. Spontaneous and induced by an inoculation Ehrlich's adenocarcinoma antibodies authentically constrain growth of a tumour; tumoral growth is in complex dependence on the antibodies induced by lisates. Distinctions of с lones T.cruzi on a degree of inhibition of tumor growth, immunogenecity, an antigenic generality with adenocarcinoma, and also on ability to grow in various cultural mediums are revealed.

РНБ Русский фонд

2006-4 5953

Принято к исполнению 11/05/2005 Заказ № 845

Исполнено 12/05/2005 Тираж- 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Цэцэгсайхан, Батмонх

ВВЕДЕНИЕ. 3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Trypanosoma cruzi и болезнь Чагаса. 6

1.2. Противоопухолевая активность препаратов из Trypanosoma cruzi in vivo.12

1.3. Возможное участие иммунологических механизмов в противоопухолевом эффекте Trypanosoma cruzi.24

1.4. Генотипическая неоднородность вида Trypanosoma cruzi.35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Штаммы Trypanosoma cruzi коллекции лаборатории «Генетика инфекционных заболеваний».

2.2. Культивирование трипаносом. 41

2.3. Приготовление лизатов T.cruzi.

2.4. Исследование противоопухолевой активности лизатов T.cruzi in vivo.43

2.5. Определение антител к T.cruzi методом непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). 45

2.6. Исследование общности антигенов T.cruzi и клеток аденокарциномы Эрлиха.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Действие лизатов эпимастигот Trypanosoma cruzi на рост аденокарциномы Эрлиха мышей in vivo.

3.1.1. Действие лизатов в дозе 5 ке/мышь. 47

3.1.2. Действие лизатов в дозе 15 ке/мышь.50

3.1.3. Степень противоопухолевой активности лизатов, полученных из разных клонов Т. cruzi. 53

3.2. Влияние антител против Trypanosoma cruzi на опухолевый рост

3.2.1. Фоновые антитела к Т. cruzi у интактных мышей.58

3.2.2. Общность антигенов Т. cruzi и клеток аденокарциномы Эрлиха и антитела, индуцированные прививкой опухоли. 61

3.2.3. Иммуногенность препаратов из Т. cruzi. 67

3.2.4. Антитела к Т. cruzi и противоопухолевый эффект.80

3.3. Различия клонов Т. cruzi в противоопухолевом эффекте in vivo.91

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Противораковая активность in vivo лизированных эпимастигот Trypanosoma cruzi различных генетических линий"

Жгутиковое простейшее Trypanosoma cruzi - возбудитель болезни Чагаса, остающейся серьёзной проблемой Южной и Центральной Америки.

Интересная особенность этого паразита - открытый в 1931 году Г.И. Роскиным и Е.В.Экземплярской антагонизм между T.cruzi и процессом злокачественного роста, что легло в основу нового направления современной онкотерапии - биотерапии злокачественных заболеваний (Клюева, Роскин, 1946, 1957). Трипаносома оказалась способной предпочтительно перед нормальными клетками размножаться и развиваться в раковых клетках хозяина и таким образом подавлять опухолевый рост или приводить к полной регрессии новообразований. Эта противораковая активность T.cruzi распространяется и на злокачественные заболевания человека.

Противораковое начало сохраняется в культуральных (эпимастиготных) формах и убитых клетках T.cruzi, на основе чего из них производились два противоопухолевых препарата: круцин в России и трипаноза во Франции.

Механизм противоракового действия T.cruzi до сих пор нельзя считать выясненным. Уже в первых работах Г.И. Роскин высказал предположение об участии в этом феномене нескольких факторов. И в настоящее время появились данные, свидетельствующие о том, что эффект T.cruzi не сводится только к прямому воздействию на раковые клетки и что в противораковом феномене участвуют иммунологические механизмы.

Известно, что в патогенезе болезни Чагаса значительное место занимают аутоиммунные процессы, развивающиеся в результате общности антигенов паразита и тканей хозяина. Такая общность достаточно хорошо описана в отношении антигенов миокарда и нервной ткани. В последние годы появились данные об экспрессии на поверхностных структурах T.cruzi муцинов, сходных по строению с муцинами малигнизированных клеток.

В настоящее время показано, что вид T.cruzi в высокой степени структурирован генетически, а степень противораковой активности различна у штаммов данного вида, неодинаковых по биологическим свойствам.

Возможность исследования противоопухолевых свойств T.cruzi не на штаммах, а на клонах, т.е. генетически чистых линиях этого высоко дифференцированного вида появилась только теперь. Первые исследования показали, что клоповые культуры могут быть продуцентами активного начала и степень эффекта соответствующих лизатов in vitro зависит от принадлежности клона к определенной генетической группе (Шеклакова, 2003).

Цель работы: Изучение противораковой активности in vivo лизированных эпимастигот T.cruzi различных генетических линий и участия иммунологических механизмов в этом эффекте.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Изучить противораковую активность in vivo лизатов из различных клонов T.cruzi;

2. Исследовать общность антигенов T.cruzi и аденокарциномы Эрлиха;

3. Провести анализ гуморального иммунологического ответа на прививку опухоли и введение лизатов;

4. Оценить влияние антител против T.cruzi на рост опухоли;

5. Сравнить рост клонов T.cruzi на различных искусственных питательных средах.

Научная новизна.

В настоящей работе получило продолжение использование в биотерапии опухоли генетически чистых линий (клонов) T.cruzi. Их обнаруженный ранее эффект на раковых клетках in vitro (Шеклакова, 2003), в данной работе впервые подтвержден в отношении аденокарциномы Эрлиха мышей in vivo. Показано, что эффект зависит от дозы вводимого препарата.

Впервые выявлена общность антигенов T.cruzi и аденокарциномы Эрлиха.

Выявлено, что противораковое действие препарата из T.cruzi осуществляется, in vivo на фоне значительного пула антител (AT) к трипаносоме: фоновых, индуцированных опухолью и возникших после введения лизатов.

Установлено, что все указанные AT оказывают ингибиторное влияние на рост прививной опухоли мышей.

При культивировании на искусственных питательных средах (среды LIT, NNN, махачкалинская) выявлены различия клонов по динамике роста, накоплению клеток и способности к длительному культивированию в этих условиях.

Практическая значимость работы.

1. Полученные данные вносят определенный вклад в изучение феномена противораковой активности T.cruzi и его связи с генетической гетерогенностью этого вида. Показана возможность использования клоновых культур T.cruzi в качестве продуцента противоопухолевого начала.

2. Выяснено, что даже у интактных мышей имеются фоновые антитела к T.cruzi, что заставляет более строго относиться к контролю в опытах по исследованию противоопухолевой активности трипаносомы.

3. Для выбора сред и клонов продуцента, способных культивироваться в достаточных для производства количествах, важны найденные клоновые различия T.cruzi при культивировании на искусственных питательных средах. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Лизаты клонов T.cruzi обладают противораковой активностью in vivo, но различаются по её степени в зависимости от клоновой принадлежности определенным генетическим группам

2. T.cruzi имеет общие антигены с аденокарциномой Эрлиха.

3. Лизаты T.cruzi обладают иммуногенностью и вызывают in vivo гуморальный ответ.

4. In vivo противоопухолевый эффект препаратов из T.cruzi осуществляется на фоне различных антител к трипаносоме, которые важны для противоракового эффекта.

5. Клоны различных генетических групп T.cruzi различаются по характеру роста на искусственных питательных средах.

Апробация работы. Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов и программой совместных исследований с Московским Государственным Университетом. Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии РУДН (2003, 2004), международной конференции и III съезде Паразитологического общества при РАН (Петрозаводск, 2003), форуме монгольских студентов, обучающихся в Вузах РФ (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 24 рисунками. Список литературы содержит 169 работ: 32 российских и 137 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Цэцэгсайхан, Батмонх

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ

1. Способность продуцировать противоопухолевое начало является видовым свойством T.cruzi. Как штаммы паразита, так и клонированные, генетически разные линии трипаносомы в виде лизата эпимастигот вызывают подавление роста аденокарциномы Эрлиха.

2. В пределах испытанных доз (5 и 15 млн.кл./мышь) степень противоопухолевого эффекта пропорциональна им и зависит от клона T.cruzi.

3. Противораковое действие препарата из T.cruzi осуществляется in vivo на фоне значительного пула антител к T.cruzi разного происхождения: а) фоновых антител к T.cruzi, обнаруженных у 14 % интактных мышей; б) антител к T.cruzi, индуцированных прививкой аденокарциномы Эрлиха, имеющей общие с антигены с трипаносомой; в) антител к T.cruzi, образовавшихся в результате введения лиофилизированного лизата эпимастигот паразита.

4. Все типы антител к T.cruzi влияют на противораковый эффект трипаносомы: а) фоновые антитела к T.cruzi достоверно сдерживают рост опухоли; б) антитела к T.cruzi, индуцированные прививкой аденокарциномы Эрлиха, также ингибируют её рост; в) опухолевый рост находится в сложной зависимости от антител, индуцированных лизатами паразита.

5. Выявлены различия клонов T.cruzi по степени ингибиции развития опухоли, по иммунногенности, по антигенной общности с аденокарциномой, а также по способности расти в различных культуральных средах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Цэцэгсайхан, Батмонх, Москва

1. Воробьева Н.В., Калинникова В.Д., Оглоблина Т.А., Гусев М.В.Влияние лизатов эпимастиготных форм Trypanosoma cruzi на пролиферацию лимфоцитов человека in vitro. //Вестн. Моск. Ун.-та. Сер. 16. - Биология,- 1998.-№ 2.- С. 16-21.

2. Каллиникова В.Д. Биология трипанозомы шизотрипанум круци и её туморотропизм как биологическая предпосылка биотерапии рака антибиотиком круцином. // Круцин в терапии рака. М.: МГУ. -1963.- С. 19-23

3. Каллиникова В.Д. Биология трипаносомы Schizotrypanum cruzi и ее туморотропизм как биологическая предпосылка биотерапии рака круцином. //Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. -Биология. -1964а,- №1. С. 39-42.

4. Каллиникова В.Д. Противоопухолевые свойства жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi.// Тула: Гриф и К, 2004. 280 с.

5. Каллиникова В.Д., Кац Г.И. Жизненный цикл Trypanosoma cruzi и антибластомная активность на его разных этапах. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ.-1968.- С. 9-19.

6. Вестн. Моск. Ун-та. Сер.16. - Биология.- 1994 б.- № 3.- С.25-33.

7. Карпенко Л.П., Яшина Н.В. Методические указания к лабораторным занятиям по теме «Микробиологическая диагностика протозойных инфекций».// М., 2004. —46 с.

8. Клюева Н.Г. Пути биотерапии рака. // Вест. АМН СССР.-1946.- № 2-3. С. 44-53.

9. Клюева Н.Г., Роскин Г.И. Биотерапия злокачественных опухолей. // М.: Изд-во АМН СССР, 1946.-224 с.

10. Клюева Н.Г., Роскин Г.И. Проблема противораковых антибиотиков. // М.:Изд-во Ин-та вакцин и сывор, 1957,- 247 с.

11. Клюева Н.Г. Круцин как противораковый антибиотик. // Круцин в терапии рака. М.: МГУ.- 1963 б.-С. 12-18.

12. Лейкина М.И. О методе определения антибластомной активности круцина на культуре злокачественных клеток человека. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ. -1968,- С. 267-271.

13. Лейкина М. И., Смирнова H.A. Действие инфекции Trypanosoma cruzi и круцина на перевивную меланому мышей. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ. 1968.- С. 165-169.

14. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. // Пер. с англ.- М.: Мир, 2000.- С. 380-382.

15. Розендал Я.А. Борьба с переносчиками болезней: методы, предназначенный для отдельных лиц и общин. // Издательство «Медицина». Всемирная организация здравоохранения. - 1998.

16. Роскин Г.И., Каллиникова В.Д. Связь активности круцина с содержанием рибонуклеиновой кислоты в клетках исходных культур продуцента.// Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ.-1968,- С. 77-83.

17. Роскин Г.И., Коломина С.М. Чувствительность саркомы-180 и карциномы Эрлиха к круцину. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ.- 1968.- С. 154159.

18. Роскин Г.И., Оглоблина Т.А. Лечение круцином мышей высокораковой линии С3Н. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ. -1968.- С. 170-172.

19. Роскин Г.И., Романова К.Г. Исследование действия протозойных токсинов на клетки злокачественных опухолей.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1936.- Вып. 17.- № 4. С. 595-603.

20. Роскин Г.И., Романова К.Г. Исследование терапевтического действия протозойных эндотоксинов на экспериментальный рак. // Бюл. экспер. биологии и медицины.-1938.- Т. 6,-Вып. 1.- С. 119-121.

21. Роскин Г.И., Соколова Г.А. Влияние круцина и инфекции Trypanosoma cruzi на экспериментальные лейкозы мышей. // Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ. 1968,- С. 160-164.

22. Роскин Г.И., Экземплярская Е. Протозойная инфекция и экспериментальный рак. // Журн. микробиол. и иммунол. 1932.- Т.9.- № 3,- С. 339-349.

23. Скорикова А.С. Действие круцина на процессы, вызываемые вирусом саркомы Рауса. //Противораковый антибиотик круцин. М.: Изд-во МГУ,- 1968.- С.184-199.

24. Шеклакова Л.А., Карпенко Л.П., Кравцов Е.Г. Сравнительная характеристика распределения антигенов в клетках различных штаммов эпимастигот Trypanosoma cruzi. // Биомед. техпол. -2000.- Вып. 13.- С. 37-42

25. Шеклакова Л. А., Каллиникова В.Д., Карпенко Л.П. Тибайренк М. Действие лизированных Trypanosoma cruzi различных генетических групп на культуры раковых клеток человека. // Биомед. Технол. 2001. - вып. 16. - С. 224-230.

26. Alcina A., Fresno M. A tubulin-related 55 kilodalton surface antigen recognized by different Trypanosoma cruzi stage-specific monoclonal antibodies from infected mice. // Mol. Biochem. Parasitol. -1988. Vol. 29. - P. 181-190.

27. Almeida I.C., Gazzinelli R., Ferguson M.A.J., Travassos L.R. Trypanosoma cruzi Mucins: Potential Functions of a complex structure. // Mem. Do Inst. Oswaldo Cruz. — 1999.-Vol. l.-P. 173-176.

28. Alves M.J.M. Members of the Tc-85 protein family from Trypanosoma cruzi are adhesion proteins. //Braz. J. Med. Biol. Res. -1996,-Vol. 29. P. 831-833.

29. Andersson J. Experimental Chagas disease. // Stockholm, Microbiology and tumorbiology center. Karolinska Institutet, 2003.

30. Andrade S.G. Trypanosoma cruzi: Clonal Structure of Parasite Strains and the importance of principal clones.// Mem. Inst. Oswaldo Cruz.-1999. Vol. 94. -Suppl. 1. -P. 185-187.

31. Arciniegas D., Ortegon M., Rodrigues A., Mercado M., Rosas T., Velasco V., Puerta C. Determinación de la perencia de anticuerpos contra colágeno tipo 1 y IV en pacientas chagasicos. // Acta Med. Columb. -2000. Vol. 25.- No. 3.- P. 1117- 1121.

32. Avila J.L., Rojas M., Galili U. Immunogenic Gal a 1-3 Gal carbohydrate epitopes are present on pathogenic American Trypanosoma and Leishmania. // J. Immunol. -1989.-Vol. 142.-P. 2828-2834.

33. Barnabe C., Brisse S., Tibayrenc M. Population structure and genetic typing of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease: a multilocus enzyme electrophoresis approach.// Parasitology. -2000. Vol. 120. - P. 513-526.

34. Barr S.C. Anti-heart tissue antibodies during experimental infection with pathological and non-pathologenic T.cruzi isolates in dogs. // Intern. J. For Parasitol. -1993.- Vol. 23.-No.7.-P. 961-967.

35. Berzovfsky J.A., Terabe M., Oh S., Belyakov I.M., Jeffrey D.A., Janik J.E., Morris J.C. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer. // J. Clin. Invest.-2004.- Vol. 113.-P. 1515-1525.

36. Blanco L. Accion des Schizotrypanum cruzi sobre el desarollo del sarcoma-180 en ratones albinos C3H . // Tesis de Caracas.- 1961.

37. Bogliolo A. R., Lauriapires L., Gibson W.C. Polymorphisms in Trypanosoma cruzi: Evidence of genetic recombination.// Acta Tropica. -1996. Vol. 61.- P. 31 -40.

38. Bonfa E., Viana V.S.T., Barreto A.C.P., Joshinari N.IL, Cassermelli W. Autoantibodies in Chagas disease. An antibody cross-reactive with human and T.cruzi ribosomal proteins. // J. Immunol. -1993.- Vol. 150. -No.9.- P. 3917-3923.

39. Brisse S., Barnabe C., Tibayrenc M. J. Identification of six Trypanosoma cruzi phylogenetic lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. // Parasitol. 2000.- Vol. 30,- P. 35-44.

40. Cabrai H.R.A. The tumorocidal effect of Trypanosoma cruzi: its intracellular cycle and the immune response of the host. // Medical Hypotheses. -2000. Vol. 54. - No.l- P. 1-6.

41. Cardoso D.F., Takehara H.A., Mota J. Autoantibodies induced by immunization with dead bloodstream trypomastigotes of T.cruzi. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -1990. Vol. 85.- Suppl.l.- P.77.

42. Coudert J., Juttin P. Note sur Taction d'un lysat de Trypanosoma cruzi vis-a vis d'un cancer greffe du rat.// Compt.rend. Soc. Biol. -1950. Vol.144.- № 11-12. P. 847-849.

43. Coudert J. Recherches, expérimentales et cliniques sur Faction d'un extrait lyophilise de Trypanosoma cruzi vis-à-vis de quelques neoplasies. // Sem. Hôpitaux Le Paris.- 1956. -No. 74/9.-P. 419-427.

44. Coudert J. Que peut-on attendre de Futilization des extraits de Trypanosoma cruzi dans le traitement des neoplasmes. // Sem. Hôpitaux. -1958.- J.34. No.44.- P. 1290-1294.

45. Coudert J. Que peut-on attendre de lutilisation des extraits de Trypanosoma cruzi dauc le treatment des neoplasmes. Sem. Flopitaux. Sem. Therap. -1959. Vol. 35.- No. 1,-P.47-51.

46. Coudert J. Клинические и экспериментальные исследования действия лиофилизированного экстракта Trypanosoma cruzi на некоторые формы рака. // Антибиотики. -1961.- Т. 6. № 2. - С.99-105.

47. Davis C.D., Kuhn R.E. Detection of antigens with affinity for host-cell membrane polypeptides in culture supernatants of Trypanosoma cruzi. // Infcc. Immunol. -1990.-Vol. 58.-P. 1-6.

48. Eckhardt A.E., Goldshtein I.J. Isolation and characterization of a family of a —D-galactosyl-containing glycopeptides from Erlich ascites tumor cells.// Biochem. 1983. -Vol.22.- P. 5290-5297.

49. Elbhoudidi A., Riverd M.T., Basin H., Goldmann M., Carlier J. Kinetics of immunoglobulin in isotypes during murine Trypanosoma cruzi infection. // Bull. Soc. Fr. parasitol. -1990. Vol.8. - Suppl. 1. - P. 522.

50. Ferguson M.A.J. The surface glycoconjugates of trypanosomatid parasites. // Philos. Trans.R. Soc. Lond. Biol. Sci. -1991.- Vol. 352.- P. 1295-1305.

51. Freire Т., Medeiros A., Reis C.A., Real F.X., Osinaga E. Biochemical characterization of soluble Tn glycoproteins from malignant effusions of patients with carcinomas.- // Oncol. Rep.-2003. Vol.10.-P. 1577-1585.

52. Frosch S., Swantje K., Bernhard F. Trypanosoma cruzi is a potent inducer of interleukin-12 production in macrophages. // Med. Microbiol. Immunol. -1996,- Vol. 185.- No. 3. -P. 189-193.

53. Fausto G. Characterisation of stages and strains of Trypanosoma cruzi by analysis of cell membrane components.// J. Immunol. 1981. - Vol. 127.- No.3.

54. Galili U., Mandrell R.E., Hamedeh R.M., Shohet S.B., Griffiss J.M. Interaction between netural anti-a-galactosyl immunoglobulin G and bacteria of the human flora. // Infec. Immun. -1988,- Vol. 56. P. 1730-1737.

55. Galili U., Anaraki F., Thall A., Hill-black C., Radie M. One percent of human circulating B-lymphocytes are capable of producing the natural anti-Gal antibody. // Blood. -1993. -Vol.82. No.8. - P. 2485-2493.

56. Gea S., Ordonez P., Carban F., Josa D., Chizzolini C., Vottero-Cima E. Chagas disease cardioneuropathy. Association of anti-T.cruzi and anti-sialic nerve antibodies. // Amer. J. Trop. Med. Hyg. -1993.- Vol.495.- P. 581-588.

57. Gruzhit O., Fisken R. Failure of Trypanoma lysate in treatment of Brown-Pearce czrcinomic in rabbit. // Fed. Proc. -1948. Vol. 7. - P. 271.

58. Guiterrez L.S., Burgos M.H., Brengio S.D.R. Antibodies from Chagas patient's serum bind to the gut epithelial cell surface of Triatoma infestans. // Microscopio electrónica y Biología Celular. -1991,- Vol. 15.-No.2.-P. 145-157.

59. Hauschka T.S., Saxe L.H.Jr., Blair M. Trypanosoma cruzi in the treatment of mouse tumors.//J. Nat. Cancer Inst. -1947.- Vol. 7,-No. 4.- P. 189-197.

60. Hauschka T.S., Goodwin M.B. Trypanosoma cruzi endotoxin (KR) in the treatment of malignant mouse tumors. // Science. -1948. Vol. 107.-P. 600-602.

61. Henriksson J., Aslund L., Macina R.A. Chromosomal localization of seven cloned antigen genes provides evidence of diploidy and further demonstration of karyotype variability in Trypanosoma cruzi. // Mol. Biochem. Parasitol. -1990. Vol. 42. -P. 213214.

62. Henriksson J., Petrsson U., Solari A. Trypanosoma cruzi: Correlation between karyotype variability and isoenzyme classification. // Exp. Parasitol. -1993. Vol.77.- P. 334-348.

63. Hernandes-Munian C., Alcina A., Fresno M.A. Trypanosoma cruzi specific monoclonal antibody crossreactive with activated mouse B lymphocytes. // Bull. Soc. Fr. parasitol. — 1990.-Vol. 8. Suppl. l.-P. 610.90. Hoare 1960

64. Hontebeyric-Jaskowicz M. Murine Trypanosoma cruzi infection: a role for Th2 cells in the immunopathology of chronic infection. // Res. Immunol. -1991.-Vol. 142. No. 2. -P. 141-143.

65. Hudson L., Britten V. Immune response to South American trypanosomiasis and its relationship to Chagas disease. // British Med. Bull. -1985,-Vol. 41. No. 2.- P. 175-180.

66. Jazin E.E., Bontempi E.J., Sanchez D.O., Aslund L., Henriksson J., Frasch A.C.C., Petersson U. T.cruzi exoantigen is a member of a 160 kDa gene family. // Parasitology. -1995.-Vol. llO.-No.l.-P. 61-69.

67. Jedeloo G.C., Lignac G.O.E., Ligtenberg M.A.J., Van Thiel P.H. The biotherapeutic action of Trypanosoma cruzi on tar carcinoma in mice.// J. Nat. Cancer Inst.- 1950.- Vol. 10.-No. 4.-P. 809-813.

68. Kierzenbaum F., Lopez H.M , Sztein M.B. Inhibiton of specific immune responses by a protein produced by Trypanosoma cruzi in the course of Chagas disease.// Immunology. -1994.- Vol. 81.- No. 3,- P. 462-467.

69. Kierzenbaum F., Chagas disease and the Autoimmunity hypothesis. //-1999. Vol.12. -No.2. - P. 210-223.

70. Kinnamon K.E., Poon B.T., Hanson W.L., Waits V.B. //Activity of anticancer compounds against Trypanosoma cruzi infected mice.//Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. -Vol. 58(6). P. 804-806.

71. Laguens R.P., Meckert P.C., Chambo Y. Origin and significance of anti-heart and anti-skeletal muscle autoantibodies in Chagas disease. //Res. Immunol. -1991.-Vol. 142.-No. 2.-P. 160-163.

72. Lana M.D., Pinto A.S., Basrenta B., Barnabe C., Noel S., Tibayrenc M. // Trypanosoma cruzi: Infectivity of clonal genotype infections in acute and chronic phases in mice. //Exp.Parasitol.-2000.- Vol. 96. P. 61-66.

73. La Temple D.C., Abrams J.T., Zhang S.J., Galili U. Increased immunogenecity of tumor vaccines complexed with anti-Gal: Studies in knockout mice for a-1, 3 galactosyltransferase. // Cancer Res. 1999. - Vol. 59. - P. 3417-3423.

74. Lederkremer R.M., Alves M.J.M., Fonseca G.C., Colli W. A lipopeptidophosphoglycan from Trypanosoma cruzi (epimastigota):isolation, purification and carbohydrate composition. // Biochem. Biophys. -1976. - Vol. 444,- P. 85-96.

75. Leon J.S., Daniels M.D., Toriello K.M., Wan K., Engman D.M. A cardiac myosin-specific autoimmune response is induced by immunization with T.cruzi proteins. //Infect. Immun. -2004. Vol.72.- No.6.- P. 3410-3417.

76. Levin M.I. Molecular mimicry and Chagas heart disease: high anti-R-13 autoantibody levels are markers of severe Chagas heart complaint. // Res. Immunol. — 1991. Vol. 142,- No. 2.- P. 157-159.

77. Lob G. L"action du Schizotrypanum cruzi sur Tadenocarcinom provoque de la mamelle chez la souris. // Schwez. Zeschr. Allgem. Pathol, und Bakter. -1950. Bd. 13.-No. 3.- P. 279-296.

78. Lo-Man R., Bay S., Vichier-Guerre S., Deriaud E., Cantacuzene D., Leclerc C.

79. A fully synthetic immunogen carrying a carcinoma-associted carbohydrate for active specific immunotherapy.//Cancer Res. 1999. - Vol.59. - P. 1520-1524.

80. Lo Man R., Vichier-Guerre S., Bay S., Deriaud E., Cantacuzene D., Leclerc C. Anti-tumor immunity provided by a synthetic multiple antigenic glycopeptide displaying a tri-Tn glycotope.// The J. Immun. -2001. - Vol. 166. - P. 2849-2854.

81. Lopes M.F., DosReis G.F. Apoptosis as a cause of T-cell unresponsiveness in experimental Chagas disease. // Braz.J.Med. a. Biol. Res. -1995. Vol. 28.-P. 913-918.

82. Macedo A.M., Machado C.R., Oliveira R.P., Pena S.D.J. Trypanosoma cruzi: genetic structure of populations and relevance of genetic variability to the Chagas disease. // Mem. Do Inst. Oswaldo Cruz. 2004.- Vol. 99,- No. 1,- P. 1-12.

83. Majumder S., Kierzenbaum F. Mechanisms of Trypanosoma cruzi down-regulation of lymphocyte function. // J. Immmunol. 1996,- Vol. 156.-P. 3866-3874.

84. Malisoff W.M. The action of the endotoxin of Trypanosoma cruzi (KR) on malignant mouse tumors.// Science. 1947. - Vol. 106. - P. 591-594.

85. Maneesh J., Karan D., Batra S.K. Mucins in protozoan parasites.// Frontiers in Вести. Моск. Ун-та. Сер.16. -Биология.-1995.- № 1 .Bioscience. -2001.- Vol. 6. - P. 1276-1283.

86. McConville M.J., Mullin K.A., Ilgoutz S.C., Teasdale R.D. Secretory pathway of Trypanosomatid parasites. // Microbiol. Mol. Biol. Rew. -2002. Vol.66. - No.l. - P. 122-154.

87. McCormick T.S., Rowland E.C. Trypanosoma cruzi: recognition of a 43-kDa muscle glycoprotein by autoantibodies present during murine infection.// Exp. Parasitol. -1993.-Vol. 77.- P. 273-281.

88. Melo C.C.M.J., Cavalcanti J.H., Bonaldo M.C., Mortensen R.F., Aranjo-Jorge T.C. T.cruzi: Detection of surface antigen cross-reactive to human C-reactive protein. // Exptl. Parasitol.-1998. Vol. 90.-No.2.- P. 143-153.

89. Miatello C.C., Katzin A.M., Umezawa E.E., Solana M.E. T.cruzi ribosomal antigens are recognized by sera from patients with Chagas infection and/or Chagasic disease. //Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -1990. Vol. 85. Suppl.l. - P.69.

90. Miles M.A., Souza A., Povoa M., Shaw J.J., Lainson R., Toye P.J. Isozymic heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first auchtonous patients with Chagas disease in Amazonian Brazil. //Nature, London. -1978. Vol. 272. -P. 819-821.

91. Millar A.E., Kahn S.J. Trypanosoma cruzi: the effect of nitric oxide synthesis inhibition on the CD4 T ce;; response to the trans-silaidase superfamily.// Exp. Parasitol. -2000. Vol. 94. - No.2.- P. 84-91.

92. Minoprio P. Chagas disease: CD-5B-cell-dependent Th2 pathology. // Res. Immunol.-1991.-Vol.142.-No.2.-P.137-140.

93. Minoprio P. Parasite polyclonal activators: new target for vaccination approacges. // Intern. J. Parasitol. -2001,- Vol. 31.- No. 5-6,- P. 587-590.

94. Mirkin G.A. // Clin. Exp. Immunol. -1997. Vol. 107,- P. 328-334.

95. Moretti E.A., Basso B., Voltero-Cima E. Exoantigen of T.cruzi. 1. Conditions for their detection and immunogenic properties in experimental infections. // J. Protozoology.-1985.-Vol. 32. -No.l.-P. 150-153.

96. Petry K., Van Voorhis W. C. Antigens of Trypanosoma cruzi that mimic mammalian nervous tissues: investigations of their role in the autoiimune pathophysiology of chronic Chagas disease. // Res. Immunol. 1991. - Vol. 142.-No.2.-P. 151-156.

97. Piuvezam M.R., Russo D.M., Burns Y.M., Skeiky Y.A.W., Grabstein K.H., Reed S.G. Characterization of response of normal human T-cells to Trypanosoma cruzi antigens. // J.Immunol. -1993. Vol. I50.-No. 3.- P. 916-924.

98. Pollevick G.D., Di Noia J.M., Salto M.L., Lima C., Leguizamon M.S., Lederkremer R.M., Frasch A.C. Trypanosoma cruzi surface mucins with exposed variant epitopes. // J. Biol. Chem. -2000. Vol.275. - P. 27671-27680.

99. Previato J.O., Andrade A.F., Pessolani M.C., Mendonca-Previato L. Incorporation of cialic acid into Trypanosoma cruzi macromolecules. A proposal for a new metabolic route. // Mol. Biochem. Parasitol. -1985.- Vol.16.- P. 85-96.

100. Previato J.O., Jones C., Goncalves L.B.P., Wait R., Travassos L.R., Mendonca-Previato L. O-glycosidically linked N-acetylglucosamine-bound oligosaccharides from glycoproteins of Trypanosoma cruzi. // Biochem. J. -1994. Vol. 301. - P. 151-159.

101. Revollo S., Oury B., Laurent J.P., Barnabe C., Quesney V., Carriere V., Noel S., Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: Impact of clonal evolution of the parasite on its biological and medical properties. // Exp. Parasitol. 1998. - Vol. 89. - P. 30-39.

102. Ribeiro dos Santos R., Pirmez C., Savino W. Role of autoreactive immunological mechanisms in Cahgasic carditis. // Res. Immunol. 1991. - Vol. 142.- No. 2.- P. 134137.

103. Rosenberg H. Cancer chemo (toxino) therapy revisited and alternative ways of healing,// Thesis Doctor of Naturopathy. Inst. Of Drugless Therapy. -1990.

104. Ruiz R., Rigoni V.L., Gonzalez J., Yoshida N. The 35/50 kDa surface antigen of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes, an adhesion molecule involved in host cell invasion. // Parasite immunol. -1993. Vol. 15.- P. 121-125.

105. Sanchez G., Wallace A., Munoz S., Venegas J., Ortiz S., Asolari A.characterization of Trypanosoma cruzi populations by several molecular markers supports a clonal mode of reproduction. -1984

106. Schenkman S., Diaz C., Nussenzweig V. Attachment of Trypanosoma cruzi trypomastigotes to receptors at restricted cell surface domains. // Exp. Parasitol. —1991. -Vol. 72.- P. 76-86.

107. Skeyky J.A.W., Benson D.R., Juderian J.A., Sleath P.R., Parsons M., Reed J. Trypanosoma cruzi acidic ribosomal P protein gene family: Novel P proteins encoding unusual cros-reactive epitopes. //J. Immunol. -1993. Vol.151. - No.10.- P.5504-5515.

108. Spain D.M., Molomut N., Warshaw L.J. Preparation of lysates from cultures of Trypanosoma cruzi and their effects on normal and tumor-bearing mice. // Proc. Soc. Exper. Biol. Med. -1948. Vol. 69.-P. 134-136.

109. Springer G.F. T and Tn, general carcinoma autoantigens. // Science. 1984. -Vol. 224. - No. 4654. - P. 1198-1206.

110. Sztein M.B., Cuna W.R., Kierzenbaum F. Trypanosoma cruzi inhibits the expression of CD3, CD4, CD8, and IL-2R by mitogen-activated helper and cytotoxic human lymphocytes. //J. Immunol. 1991. - Vol. 144,- No. 9.- P. 3558-3562.

111. Tarleton R.I. The role of T-cell subpopulations in experimental Chagas disease. // Res. Immunol. -1991,-Vol. 142. No. 2.- P. 130-133.

112. Ternynk Th., Bleux Ch., Gregoire Y., Avrameas S., Kanellopoulos-Langevin C. Comparison between antibodies arising during Trypanosoma cruzi infection in mice and natural autoantibodies. // J.Immunol. 1990. -Vol. 144.-No. 4.-P. 1504-1511.

113. Tibayrenc M., Ward P., Moya A., Ayala F.J. // Natural populations of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal structure. // Proc. Natl. Acad.Sci.USA. -1986. Vol. 83.- P. 115-119.

114. Tibayrenc M., Ayala F. V. Towards a population genetics of microorganisms: the clonal theory of parasitic protozoa. // Parasitol. Today. 1991. - Vol.7. - P. 228-232.

115. Tibayrenc M. Integrated genetic epidemiology of infectious diseases: the Chagas model. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -1998. Vol. 93,- No.5.- P.577-580.

116. Tibayrenc M., Ayala F.V. Isoenzyme variability in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease: genetical, taxonomical, and epidemiological significance. // Evolution. 1988. - Vol. 42. - No.2. - P. 277-292.

117. Tibbetts R.S., McCormick T.S., Rowland E.C., Miller S.D., Engman D.M. Cardiac antigen-specific autoantibody production is associated with cardiomyopathy in T.cruzi- infected mice.// J. Immunol. -1994. Vol.152.- No.3.- P. 1493-1499.

118. Tiralongo von E. Trans-sialidase from Trypanosoma congolense isolation, characterization and molecular biology. // Dissertation zur erlangung des doktorgrades der naturwissenschaften. -Dr. rer. Nat. - Universität Bremen. — 2002.

119. Torrealba L.F., Roys D.S., Ramos J. Otra nota sobre extractos de protozoarios y cancer. // Gazeta medica de Caracas. 1962. -Vol.70. No 3-6. - P. 291-297.

120. Travassos L.R., Almeida I.C. Carbohydrate immunity in American trypanosomiasis.// Springer Semin. Immun. -1993. Vol. 15.- P. 183-204.

121. Unfer R.C., Hellrung D., Link C.J. Immunity to the a (1, 3) Galactosyl epitope provides protection in mice challenged with colon cancer cells expressing a (1, 3) Galactosyl-transferase.// Cancer Res. 2003. - Vol.63. - P. 987-993.

122. Van Voorhis W.C., Eisen H. A surface antigen of Trypanosoma cruzi that mimics mammalian nervous tissue. // J. Exptl. Med. -1989. Vol. 169,- P. 641-652.

123. Van Voorhis W.C. Coculture of human peripheral blood mononuclear cells with Trypanosoma cruzi leads to proliferation. // J. Immunol. 1992. - Vol. 148.-No.1.- P. 239-248.

124. Vermelho A.B., Meirelles M.N.L., Pereira M.C., Pohlentz G., Barreto-Bergter E. Heart muscle cells share common neutral glycosphingolipids with Trypanosoma cruzi. // Acta Tropica.-1997. Vol. 64., Issues 3-4. - P. 131-143.

125. Villas Boas M.H., Barretto-Bergter E. Reactivity of Chagas sera with crude and highly purified glycosphingolipid fraction from T.cruzi epimastigotes as detected by ELISA. //Abstract IX Int. Congress Prozool. Berlin. 1993. -No.516. - P.131.

126. Wang, Bao-Le., Harwick, Larissa C., Bligh H.M. Characterization of T/Tn antigen-pulsed dendritic cells and subsequently activated T lymphocytes. // Suppl. To Clin. Cancer Res. 1999. - Vol.5.

127. Yabsley M.J., Noblet G.P., Pung O.J. Use of indirect immunoiluorescent antibody test (IFAT) and blood culture to detect Trypanosoma cruzi infections in raccoons from

128. Georgia. // -2003.- The second International virtual conference in veterinary medicine: diseases of exotic animals and wildlife.

129. Zhang Q., Tiabyrenc M., Ayala F.Y. Linkage disequilibrium in natural populations of T.cruzi, the agent of Chagas disease. // J. Prozool. -1988. Vol. 35.- No. l.-P. 81-85.