Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ"

На правах рукописи

Рязанцева Анастасия Александровна

Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярнои карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ.

Специальность - ОЗ.ОО.ОЗ - «Молекулярная биология»

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Маныкин Анатолий Анатольевич Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Франк Георгий Авраамович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Урываев Леонид Викторович

доктор биологических наук,

профессор Иткес Александр Веньяминович

Ведущее учереждение:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится 17 января 2005 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123089, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16, в конференц-зале. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан_декабря 2004 года.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.020.01.

доктор медицинских наук Косякова Наталья Павловна

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Вирус гепатита С (ВГС), как предполагается, проник в человеческую популяцию довольно давно и в настоящее время получил широкое распространение, в том числе из-за парентеральных манипуляций. Число инфицированных вирусом - около 500 млн. человек, большинство из которых является скрытыми носителями. У 5085% заболевших острым гепатитом С развивается хроническая (персистирующая) ВГС-инфекция, при которой вирус сохраняется и размножается в организме в течение десятков лет [http://www.ibmc.msk.ru/hepatitis/default.html.

Данные о частоте встречаемости гепатита С неоднородны и колеблются от 0,1% от общей численности населения в таких странах, как Исландия, или Норвегия и до 18,1% - в Египте [Hepatitis С: Global prevalence, 1997].

Можно считать установленным, что около 15% опухолей человека этиологически связаны с наличием в них вирусного генетического материала. Среди таких опухолей 30% приходится на рак печени, ассоциированный с вирусами гепатита В и С, что составляет 4,5% от всех известных опухолей [Киселев Ф. Л., 2004], причем в некоторых регионах мира, например в Японии, доля ВГС-инфекции в этом отношении является ведущей, достигая 75%. [Colombo М., 1999].

ВГС является единственным представителем рода Hepacivirus семейства Flaviviridae [Houghton М., 1995], а его геном ВГС представляет собой однонитевую положительно-полярную молекулу РНК, протяжённостью 9500 нуклеотидов [Choo Q.L. и др., 1991]. Вирионы имеют диаметр около 55-60 нм и обладают липопротеиновой оболочкой примерно 6 нм толщиной, которая окружает нуклеокапсид диаметром 30-35 нм, предположительно икосаэдрической симметрии [Shimizu Y.K. и др., 1996]. Следует отметить, что до настоящего времени нет ультраструктурных работ, которые бы убедительно показывали наличие вирионов ВГС в инфицированных клетках, а о наличии ВГС-инфекции судят по специфическим клеточным изменениям, которые представлены в табл. 1.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ j БИБЛИОТЕКА [

Таблица 1. Ультраструктурные признаки наличия ВГС-инфекции

в клетке.

Ультраструктурные признаки наличия ВГС-инфекции в клетке Автор

«конфронтирующие» цистерны Jackson D.(1979), Shimizu Y. (1979) Tsiquae (1980)

изогнутые мембраны Jackson D.(1979), Shimizu Y.(1979) Tsiquae (1980)

губкоподобные включения Jackson D.(1979), Shimizu Y.(1979) Tsiquae (1980)

тубулярные агрегаты Pfeifer(1980), De Vos R. (2002)

увеличение размеров гепатоцита Z. Shaft(1990), V. Falcon (1993)

большое количество цитолизосом K.Lapis (1979), V.Falcon (2003)

паракристаллические включения в ядре V. Falcon(1993)

расширение шероховатого ЭР V. Falcon (2003)

увеличение размеров митохондрий V. Falcon (2003)

увеличение размеров перинуклеарного пространства V. Falcon (2003)

появление округлых ламеллярных телец K. Lapis (1979), V. Falcon (2003)

присутствие больших жировых капель V. Falcon (2003)

гипертрофия и гиперплазия ГлЭС А.Ф. Блюгер и др. (1989)

Однако в отдельных работах были обнаружены вирусоподобные частицы (ВПЧ), которые авторы трактовали как зрелые вирионы ВГС. Так De Vos и др.визуализиролвали ВПЧ в цитоплазме гепатоцита, причём на микрофотографиях были чётко различимы шипики на поверхности ВПЧ.

На основании анализа существующих эпидемиологических данных рабочая группа МАИР (Международное Агентство по Изучению Рака) по оценке канцерогенного риска пришла к выводу, что хроническое носительство ВГС является канцерогенным для человека,

а сам вирус отнесен к группе 1 доказанных канцерогенов [Заридзе Д.Т., 2004].

Несмотря на всё вышеперечисленное, до сих пор остаются неизученными молекулярно-биологические аспекты репродукции вируса. Также однозначно не выяснена его внутриклеточная локализация. Хотя факт участия ВГС в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГК) доказан, молекулярные механизмы ВГС-ассоциированного канцерогенеза не изучены до настоящего времени. [Киселев Ф. Л., 2004]. В связи с этим возникает вопрос о методе, который:

• позволил бы выявить генетический материал (РНК) вируса непосредственно в инфицированной ткани (in situ)

• позволил бы сохранить тканевые срезы достаточно цельными для того, чтобы можно было установить внутриклеточную локализацию вирусной РНК

Таким методом, по сути, является гибридизация in situ. Однако, этот метод в применении к ВГС имеет низкую чувствительность и не дает достоверные результаты из-за того, что во-первых, количество вирионов ВГС в ткани невелико, а во-вторых, в процессе выполнения процедур его РНК часто подвергается разрушению.

Метод обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции in situ (ОТ-ПЦР in situ) был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ . Таким образом, он сочетает в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Однако, несмотря на преимущества, ОТ-ПЦР in situ обладает и некоторым недостатком. Более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады, имеющие место на этапе амплификации, приводят к более сильному, чем при гибридизации in situ, разрушению срезов. Также к сложностям ОТ-ПЦР in situ можно отнести его многоэтапность, трудоёмкость и высокую стоимость реактивов. Всё это вместе и привело к тому, что в нашей стране этот метод практически не применяется, в то время как за рубежом появляются исследования с применением ОТ-ПЦР in situ для идентификации различных вирусов. Схема метода RT-PCR in situ представлена на рис. 1.

О первых результатах, полученных с использованием этого метода сообщалось в работе A. T.Haase и др. в 1990 г.

Рис. 1. Схема метода ПЦР /n srft/ (no Long A, Komminoth P, 1997)

В дальнейшем, количество работ с применением метода обнаружения РНК ВГС в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и изучение с ее помощью ВГС внес G. Nuovo [G. Nuovo и др. 1991, G. Nuovo 1992, G. Nuovo и др. 1994, G. Nuovo 1996].

Применение метода детекции РНК ВГС in situ позволило обнаружить ВГС не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках [Bettinger D. и др., 1999]. Кроме того, было показано, что РНК ВГС обнаруживается не только в печени, но и, например, в лимфоцитах [Kato N., и др. 1998], и в эритротроцитах [Lotz G. и др., 2002]. Предполагают, что эти клетки могут принимать участие в транспорте ВГС от места проникновения в организм до клеток печени, где, в основном, происходит его размножение.

До сих пор остаётся спорным вопрос о внутриклеточной локализации РНК ВГС. Некоторые исследователи сообщают о нахождении РНК ВГС только в цитоплазме гепатоцитов [Chang M. и др., 2000, OhishiМ. и др., 1999, Sansonno D. и др., 1995, Sansonno D. и др., 1997], другие указывают на исключительно ядерную локализацию

[BiaginiP. и др., 2001], третьи обнаруживают РНК ВГС как в цитоплазме, так и в ядрах клеток [BettingerD. и др., 1999, Cho S. W. и др., 1996, Нагипа Y. и др. 1993, Komminoth Р. и др., 1994, Nuovo G. и др., 1993, Тапака Y. И др., 1993].

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - модификация метода ОТ-ПЦР in situ для рутинного гистологического материала, выявление РНК ВГС в клетках печени больных с хроническим гепатитом Сиу больных с диагнозом гепатоцеллюлярный рак на биопсийном и операционном материале, также изучение тропизма вируса гепатита С в клетках и ткани печени методом ОТ-ПЦР in situ.

Основные задачи исследования:

1. Модификация и оптимизация и использование морфологического метода ОТ-ПЦР in situ для исследования РНК ВГС на парафиновых срезах.

2. Детекция и внутриклеточная локализация геномной РНК ВГС у больных с хроническим гепатитом С (ХГС).

3. Детекция и внутриклеточная локализация геномной РНК ВГС у больных с ПС.

4. Сравнение данных, полученных с помощью ОТ-ПЦР in situ, данных, полученных с использованием классического ОТ-ПЦР-анализа, а также с гистологичекой картиной и оценкой степени поражения печени по Knodelle и результатами ультраструктурного исследования.

Научная новизна работы.

В работе впервые в практике отечественных исследований применён и модифицирован метод ОТ-ПЦР in situ для вирусологических и патологоанатомических исследований и, в частности, для детекции ВГС.

В ходе работы с операционным материалом от больных с диагнозом «гепатоцеллюлярный рак» впервые показана локализация РНК ВГС в перинуклеарном пространстве раковых клеток, что

дополняет представление о внутриклеточной локализации компонентов вируса в опухолевых клетках. Учитывая трудности в получении такого материала для анализа, а также невысокую частоту встречаемости гепатоцеллюлярного рака в России, эти результаты имеют важное значение, т.к. они способствуют выявлению одного из главных факторов опухолевого роста в печени.

Научно-практическая ценность.

Показано, что ОТ-ПЦР in situ имеет ряд преимуществ перед уже известными диагностическими методами, такими как рутинное гистологическое исследование, гибридизация in situ, электронная микроскопия и классический метод ОТ-ПЦР.

Рутинное гистологическое исследование дает представление о степени выраженности воспалительного или опухолевого процесса в печени, но не даёт представления о причине заболевания, а классический метод ОТ-ПЦР показывает наличие генетического материала ВГС в крови или тканевом лизате, но не показывает наличие вируса в отдельных клетках. В силу того, что обычно выявляемое количество вируса невелико, такие диагностические методы, как гибридизация in situ и электронная микроскопия - малоэффективны. ОТ-ПЦР in situ, являясь морфологическим методом, обладает более высокой чувствительностью, чем гибридизация in situ, за счёт многократной амплификациии молекул-мишеней, и, следовательно, более перспективна для детекции вируса.

В работе впервые показано наличие РНК ВГС в операционном материале от больных с гепатоцеллюлярным раком, что даёт возможность выбора адекватного метода лечения этих больных.

Успешное применение метода для анализа материала от больных с ХГС и ГК, позволяет надеяться на эффективное применение такого подхода не только для научных исследований, но и для существующей медицинской практики.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оптимизация и модификация метода ОТ-ПЦР in situ для исследований в вирусологии и патологической анатомии, и в

частности, для детекции РНК ВГС в материале от больных ХГС и ГК

2. Сравнение методов ОТ-ПЦР in situ и электронной микроскопии как морфологических методов для практической идентификации ВГС в биоптатах печени от больных сХГС.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: заседании отдела молекулярной вирусологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (октябрь 2004), 11 (октябрь 2003г), 12 (май 2004 г) конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург), на XX Российской Конференции по Электронной Микроскопии (РКЭМ - 2004, п. Черноголовка, май-июнь 2004)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 79 страницах, иллюстрирована 7 схемами, 18 рисунками и 8 фотографиями. Список цитированных источников насчитывает 134 источника.

Список сокращений:

ВГС - вирус гепатита С

ВПЧ - вирусоподобная частица

ПС - гепатоцеллюлярная карцинома

ИФА - иммуноферментный анализ

ОТ (RT) - обратная транскрипция

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

ХГС - хронический гепатит С

ЭР -эндоплазматический ретикулум

Материалы и методы.

Клинический материал для детекции РНК ВГС

Клинический материал для исследования был любезно предоставлен отделением патологической анатомии МНИОИ им. ПА Герцена и клиническим отделением ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Материалом для исследования послужили биоптаты печени больных ХГС и операционный материал от больных с диагнозом ГК. Биопсийный и операционный материал фиксировали 10% нейтральным формалином в течении 18 часов и заключали в парафин. В работе использовались парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Биопсийный и операционный материал от 22 пациентов был разделен нами на 3 группы:

Первая группа - 15 больных ХГС - как правило, это молодые люди от 18 до 20 лет, диагноз которых подтвержден с помощью ИФА (иммуноферментного анализа), клиническими данными и рутинным морфологическим исследованием биоптатов с оценкой процесса по Knodelle.

Вторая группа - 3 больных с диагнозом ГК, (причём, в одном случае, по результатам гистологического исследования, был поставлен диагноз ГК на фоне хронического гепатита, а в двух других клинических и гистологических признаков ХГ обнаружено не было).

Третья группа (контрольная) - 4 пациента с нормальной печенью, у которых подозревали метастазы опухоли в печени, брали биопсию, но метастазов не обнаруживали.

Рутинное гистологическое исследование каждого из исследуемых образцов также было проведено отделением патологической анатомии МНИОИ им. ПА Герцена.

Метод ОТ-ПЦР. В работе использовали классический вариант ОТ-ПЦР (модификация «горячий старт») с применением коммерческого набора производства НПФ «ДНК-Технология». 15 биоптатов печени от больных ХГС (первая группа) были исследованы с помощью

классической ОТ-ПЦР и по результатам разделены на две подгруппы: ОТ-ГЩР - положительные (11 образцов) и ОТ-ПЦР -отрицательные (4 образца).

ОТ-ПЦР in situ. В работе использовали прямую разновидность метода. Предварительная подготовка срезов. Фиксированный 10% нейтральным формалином в течении 18 часов биопсийный и операционный материал, заключали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм наносили на сиалинизированные стёкла фирмы Dako. Прикрепление срезов к предметному стеклу осуществляли путём прогревания стекла сначала при 54°С в течении 3 часов, а затем при 37°С -18 часов.

После этого проводили депарафинирование срезов по стандартной схеме.

После депарафинирования срезов проводили их очистку от белков:

1. Инкубировали стёкла в 0,02М НС1 в течение 10 мин при комнатной температуре.

2. Промывали в 0,05М Трис-HCl буфере

3. Наносили на стёкла 0,01%-ный буферный раствор Тритон X-100 на 90 сек, затем снова промывали в буфере в течение 2 мин

4. В течение 30 мин срезы обрабатывали пепсином при 37°С (20 мг пепсина растворяли в 9,5 мл DEPC-воды и 0,5 мл 2М НС1)

5. Срезы промывали в DEPC-воде 2 раза по 1 мин Очистку от клеточной ДНК проводили с использованием

ДНКазы (RQ1 RNase-free DNase Promega, USA, 1и/ц1). Разведение 1:10 согласно инструкции производителя, инкубировали 30-60 мин при 37°С. Затем срезы промывали в DEPC-воде 2 раза по 1 мин, после чего стекла опускали в 100°этанол и высушивали их на воздухе.

Обратную транскрипцию и амплификацию in situ проводили в один этап с применением фермента ST-pol ("single tube") производства «Силекс М» в термоциклере PCR Express ("HybaicF) со сменными модулями для пробирок и предметных стекол. Праймеры, которые

использовались для обратной транскрипции и амплификации были комплементарны 5' -некодирующему участку генома ВГС (5' - UTR).

Амплификационная смесь рассчитывалась из объема 50 мкл на 1 стекло, состав и пример расчёта амплификационной смеси представлен в табл.2

Таблица 2. Состав амплификационной смеси.

Реагент на 50 мкл (1 стекло)

Реакционный буфер (Силекс М) х 10 5

Смесь Bio-11-dUTP 14(150 mkM dA, dC, dG, 100 mkM dT, 50 mkM bio-dU, Силекс M) 10

2% БСА 2

RNAasin (Promega, USA) 2

Праймеры 32,33,194,299 (10 ОЕ/мл, Литех): 5x4 = 20

DEPC-вода 8

ST-pol (1мкл на 25 мкл реакционной смеси, Силекс М) 3

Режим обратной транскрипции/амплификации: 65°С - 30 мин 94°С - 3 мин 60°С- 1,5 мин 94°С - 45 сек

После проведения амплификации препараты извлекали из амплификатора, погружали их в ёмкость с буфером (0,05М Трис-HCl) и, не вышимая, аккуратно снимали покровные стекла со среза, а затем препараты использовали для проведения других этапов.

Детекцию продуктов амплификации проводили с использованием комплекса биотин - стрептавидин - щелочная фосфатаза и красителем NBT/BCIP, проявляемой в течение 30 мин при 37°С в темноте во влажной камере по стандартной схеме.

Срезы заключали в водорастворимую среду «Permount»

Визуализация метки. Световую микроскопию проводили при помощи микроскопа «Leica» DMRB; изображение препаратов подвергали компьютерной регистрации и обработке с использованием системы

} 5 циклов

Рис 2 Срез биоптата печени больного ХГС, окрашивание 3 балла (в баллах по Р. В'щШ, 2001), ув 200 Стрелками показана метка

Рис.3. Срез биоптата печени больного ХГС, окрашивание 1 балл (в баллах по Р. Biagini, 2001), ув.400. В нижней части фотографии четко заметно окрашенное ядро.

Рис 4 Срез печени больного ГК, ув 400 Стрелкой показано окрашенное ядро

Рис 5. Срез печени больного ГК, ув.ЮОО. Четко заметно окрашенное перинуклеарное пространство (показано стрелкой).

анализа изображения «LeicaQWIN 550 IW» и видеокамеры высокого разрешения «ProgRes 3012». Усиление насыщенности цветов производилось при помощи программы «Adobe Photoshop 4.01»

Оценка результатов.

Положительную реакцию оценивали полуколичественным методом в баллах по схеме, предложенной Р. Biaginiи др., 2001 г:

1 - от 1 до 10 меченых клеток /на 100 клеток в 2 - 3 полях зрения

2 - от 10 до 30 меченых клеток/на 100 клеток в 2 - 3 полях

зрения

3 - более 30 меченых клеток/на 100 клеток в 2 - 3 полях зрения Также оценивали соотношение между количеством меченых

клеток и клиническими данными (баллами по Knodelle).

Электронная МИКРОСКОПИЯ.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Фиксация.

Небольшие кусочки биоптатов печени от больных с ХГС заливали избытком холодного 2,5% раствора глютарового альдегида и выдерживали в холодильнике в течение часа при температуре 4°С.

Через час после фиксации во второй порции глютаральдегида кусочки биоптатов промывали холодным 0,15 М фосфатным буфером, заливали 1% раствором OsO4 и выдерживали в холодильнике при температуре 4°С в течение 2 ч. Обезвоживание.

После фиксации кусочки биоптатов промывали холодным 0,15 М фосфатным буфером и проводили через серию спиртов возрастающих концентраций и пропиленоксида.

Пропитывание, заливка и полимеризация. Обезвоженные кусочки биоптатов печени последовательно пропитывали в двух смесях при комнатной температуре.

Смесь№1 содержала 1 часть смеси аралдитовых смол и одну часть пропиленоксида. Пропитывали в течение 10 - 12 ч при комнатной температуре.

Смесь№2 состояла из чистых аралдитов. Пропитывали в течение 4 -6 ч при комнатной температуре.

Пропитанные кусочки биоптатов печени переносили в желатиновые или пластиковые капсулы; ориентировали кусочки длинной осью перпендикулярно плоскости предполагаемого среза и заливали смесью№2.

Полимеризацию проводили в течение 48 ч при температуре

60°С.

Ультратонкие срезы толщиной 500 - 350 А получали на ультратоме III - 8800. Срезы наносили на сетки. С каждого кусочка получали несколько серий срезов на различных уровнях, чтобы иметь возможность наиболее объективно оценить результаты исследования.

Контрастирование срезов проводили с применением 5% раствора уранил-ацетата.

Исследования контрастированных препаратов проводили в электронном микроскопе JEM-100-B при ускоряющем напряжении 80 кВ и различных увеличениях.

Фотографирование проводили на фотопластинки размером 6x9 для ядерных исследований, покрытых эмульсией типов МК или МР, с толщиной эмульсионного слоя 10 - 15 ц.

Результаты и обсуждение.

Метод ОТ-ПЦР in situ.

Впервые в России адаптирован метод ОТ-ПЦР in situ для детекции РНК ВГС в материале от больных с ХГС и с ГК. Для достижения наилучшего результата в методику, описанную G.Nuovo (1996) мы внесли ряд изменений, самыми существенными из которых были:

1. подбор оптимального времени обработки срезов ДНКазой для удаления клеточной ДНК (для того, чтобы уменьшить повреждение срезов и минимизировать деградацию РНК время инкубации с ДНКазой сократили с 7-8 часов до 30-60 мин),

2. для того, чтобы уменьшить повреждение срезов, этапы обратной транскрипции и амплификации проводились одним ферментом без промежуточной промывки срезов

3. подобран режим амплификации, позволяющий уменьшить повреждение срезов

Обнаружение РНК ВГС in situ.

Из каждого парафинового блока получали около 10 срезов. Всего было исследовано 194 среза материала от 18 больных с ХГС и с ГК. РНК ВГС была обнаружена на 151 срезе (78 %). Метка обнаруживалась во всех образцах, положительных по классической ОТ-ПЦР. В 1 из 4 отрицательных образцов по классической ОТ-ПЦР также была найдена метка, что, по нашему мнению, свидетельствует о незначительном количестве РНК ВГС в данном образце и, вероятно, её неравномерному распределению в ткани печени, и , соответственно, в толще исследуемых биоптатов . У двух из трёх больных с ГК также была обнаружена РНК ВГС. Результаты представлены в табл. 3,4,5

Табл.3 ОТ-ПЦР in situ

Ч Группы ХГС Гелатокарцинома (ГК) Контрольные группы

\ Иа фоне ХГС Без ХГС Нормальная печень Образцы, положительные по «классической» ОТ-ПЦР in situ амллифицированиые с ВИЧ-праймерами (ES7, ES8.ED5, ED12).

Количество \

Положительная эеакция 12 1 1 - -

Отрицательная реакция 3 - 1 4 4

Табл. 4. Обнаружение ВГС v больных из группы (ХГС)

Реакция Метод обнаружения " -__ Положительная (+) Отрицательная (-)

«класическая» ОТ-ПЦР 11 4

ОТ-ПЦР in situ 12 3

ИФА 15 -

Табл. 5. Полуколичественная оценка результатов (в баллах по

. Количество ^\образцов Баллы «класическая» ОТ-ПЦР + «класическая» ОТ-ПЦР- ГК

1 5 1 1

2 3 - -

3 3 - 1 (на фоне ХГС)

Локализация in situ.

На рис. 2 представлен срез биоптата печени больного ХГС после проведения ОТ-ПЦР in situ: положительная реакция, окрашивание 3 балла (интенсивность окраски в баллах по Р . Biagini, 2001 ). На рис. хорошо заметны окрашенные ядра в центре среза. На рис. 3 также представлен срез биоптата печени больного ХГС после проведения ОТ-ПЦР in situ: положительная реакция, окрашивание 1 балл (интенсивность окраски в баллах по Р. Biagini, 2001).

На рис. 4 представлен срез операционного материала из печени больного с ГК после проведения ОТ-ПЦР in situ. На рис. в центре среза хорошо заметна клетка у которой окрашено перинуклеарное пространство (ув.400). На рис. 5 представлена эта же клетка (ув.ЮОО).

Метка выявлялась в отдельных гепатоцитах без какой-либо закономерности распределения по срезу ткани. Во всех образцах из обеих контрольных групп метка не выявлялась. Локализация метки отмечена как в цитоплазме, так и в ядрах гепатоцитов, что не противоречит результатам, полученным другими авторами [Biagini P. и др., 2001, Тапака Y. и др., 1993]. Поскольку ни в купферовских клетках, ни в эритроцитах (которые также присутствуют на срезах) РНК ВГС не была обнаружена, наши результаты не подтверждают данные других авторов о тропизме ВГС к этим клеткам.

У больных с ХГС корреляции между оценкой степени поражения печени по Knodelle, результатами ОТ-ПЦР, проведенной в пробирках и ОТ-ПЦР in situ выявлено не было.

Ультраструкгурные исследования.

Для ультраструктурных исследований были отобраны 5 биоптатов печени больных с ХГС. Следует отметить, что поскольку биоптаты для ультраструктурных исследований фиксировали по Ito уже после того, как они уже были зафиксированы в 10% формалине для клинических гистологических исследований, качество ультраструктуры клетки ухудшилось.

Мы наблюдали характерное изменение цитоплазмы гепатоцита, появление липидных включений, типичные изменения ЭР, как то расширение цистерн ЭР, и появление пузырчатых структур в местах локализации ЭР. Аналогичную изменения ультраструктуры цитоплазмы . инфицированных ВГС гепатоцитов наблюдали и другие исследователи [Falcon V. и др., 2003, Блюгер А. Ф. и др., 1989]. Такие изменения обычно сопровождались изменениями размеров перинуклеарного пространства [Falcon V. и др., 2003]. Одним из наиболее часто встречающихся клеточных изменений являются тубулярные структуры, располагающиеся обычно вблизи вакуолей, при этом мы наблюдали как продольные срезы, так и поперечные срезы таких структур, диаметр которых 20 - 30 нм. Такие тубулярные структуры в инфицированных вирусом гепатита ни-А, ни-В гепатоцитах наблюдали многие исследователи, начиная с 80-х гг [Pfeifer U. и др., 1980, Блюгер А. Ф. и др., 1989]. Позднее было показано, что тубулярные структуры представляют собой вирусные белки Е1 и Е2 ВГС [De Vos К и др., 2002, Falcon V. и др., 2003].

Тщательный анализ большого количества гепатоцитов в исследуемом материале не позволил нам однозначно обнаружить вирионы ВГС на ультраструктурном уровне. Однако, в некоторых сильно разрушенных гепатоцитах в цитоплазме можно было визуализировать структуры круглой формы, напоминающие вирусоподобные частицы, размер которых варьирует от 50 до 70 нм. При более тщательном анализе поверхностного слоя таких частиц мы наблюдали выступы, напоминающие шипики вирусных оболочек. В некоторых других случаях мы наблюдали единичные ВПЧ на цитоплазматических мембранах, которые также имели размер 50-70 нм. Как правило, шипики на них видны не были. Кроме того, иногда в

цитоплазме сильно разрушенных гепатоцитов мы наблюдали скопление круглых электронно-плотных структур кучно сидящих на мембранах. Следует отметить, что до настоящего времени нет ультраструктурных работ, которые бы убедительно показывали наличие вирионов ВГС, однако в отдельных работах были обнаружены ВПЧ, которые авторы трактовали как вирионы ВГС. Так De Vos и др.визуализиролвали ВПЧ в цитоплазме гепатоцита, причём на микрофотографиях были чётко различимы шипики на поверхности ВПЧ. С другой стороны, Falcone и др. нашли ВПЧ, напоминающие вирионы ВГС не только в цитоплазме клетки, но и внутри вакуолей, что, возможно, что авторы трактуют как результат почкования вируса. Кроме того, эти авторы показывают наличие зон в цитоплазме, заполненных структурами круглой формы, которые они трактуют как предшественники нуклеокапсида ВГС диаметром 35 - 50 нм. Мы наблюдали подобные структуры в сильно разрушенных гепатоцитах.

Итак, ультраструктурные исследования, проведённые на биоптатах печени больных с ХГС показали, что в настоящее время мы можем дифференцировать по структуре инфицированный гепатоцит от нормального генпатоцита по ряду косвенных признаков, в то же время такой стандартный метод как идентификация вирионов ВГС, как показывают наши результаты не является достаточно надёжным.

Общее заключение по обсуждению

Принято считать, что причиной ПС является несколько важнейших этиологических факторов, одним из которых является ВГС, причём на его долю приходится по разным данным и в разных странах от 6 до 48% [Colombo M., 1999]. Но несмотря на то, что при ГК было показано наличие репликации РНК ВГС и экспрессии вирусспецифических протеинов в раковых клетках, молекулярные механизмы ВГС-ассоциированного канцерогенеза до сих пор недостаточно изучены. Сведения о локализации геномной РНК остаются пока противоречивыми. По данным Y. H. Su и др., изучавших распространение разных генотипов ВГС у больных с ГК с помощью ОТ-ПЦР от situ , положительный сигнал наблюдался в основном в ядрах раковых клеток, но иногда в цитоплазме. Мы же наблюдали

положительный сигнал в цитоплазме раковых клеток и в перинуклеарном пространстве. Однако, в ряде работ по изучению внутриклеточной локализации РНК ВГС была показана только цитоплазматическая [Ohishi M. и др., 1999], или только ядерная локализация [Biagini P. и др., 2001]. Анализ большого количества срезов после проведения нами ОТ-ПЦР in situ не подтверждает эти данные.

Данные о локализации РНК ВГС в ядре гепатоцитов не единичные; они также подтверждаются исследованиями, выполненными с помощью метода in situ гибридизации [Blight К., и др. 1992]. Кроме того, считается, что представители семейства Flaviviridae могут иметь короткую ядерную репликативную фазу, и, следовательно, РНК ВГС может быть локализована в ядре.

Таким образом, исследование ВГС с помощью метода ОТ-ПЦР in situ идет по пути обнаружения геномной (+ цепи) РНК. До сих пор почти нет данных о наличии и локализации в каких-либо клетках репликативной формы ( - )РНК ВГС, хотя эти данные могли бы прояснить многие вопросы касающиеся репликации вируса.

Полученные нами результаты показывают эффективность применения данного метода для исследования тканей, пораженных ВГС. Тем не менее, требуется дальнейшее накопление материала и стандартизация метода для уточнения локализации ВГС в гепатоцитах, распределения вируса в клетках печени, а также прояснения механизмов и роли ВГС в злокачественной трансформации клеток.

Выводы

1. Впервые в практике отечественных исследований применён и модифицирован метод ОТ-ПЦР in situ для детекции вирусного генома в парафиновых срезах. Подобраны оптимальные условия для снижения деградации РНК, установлено оптимальное время инкубации срезов с ДНКазой, подобраны реагенты для проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одну стадию, а также режим амплификации.

2. При исследовании биопсийного и операционного материала от больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой показана эффективность модифицированного нами метода для выявления РНК ВГС в ядрах и цитоплазме гепатоцитов и раковых клеток.

3. В образцах печени от больных с хроническим гепатитом С, положительных по ОТ-ПЦР in situ методом электронной микроскопии установлено наличие в цитоплазме гепатоцитов вирусоподобных частиц и тубулярных образований, представляющих собой структурные белки ВГС, характерных для клеток, инфицированных вирусом гепатита С. Сочетание указанных подходов повышает достоверность полученных результатов.

4. Не выявлено прямой корреляции между гистологической картиной поражения печени при хроническом гепатите С с числом инфицированных гепатоцитов, детектируемых с помощью ОТ-ПЦР in situ.

5. В результате проведения ОТ-ПЦР in situ впервые показана перинуклеарная локализация РНК ВГС в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.

6. Показана возможность использования ОТ-ПЦР in situ в качестве одного из методов ранней диагностики вирусных и онкологических заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Северова А.А, Маныкин А.А. Применение методов гибридизации in situ и обратно - транскриптазной полимеразной цепной реакции in situ для изучения инфекции, вызванной вирусом гепатита О//Вопросы Вирусологии 2000, 6:7-12.

2. Рязанцева А.А., Завалишина Н.Э., Маныкин А.А., Петров А.Н., Кучерова Т.Е., Франк Г.А., Клименко СМ. Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) в образцах биоптатов печени больных хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода RT-PCR in situ.// Вопросы Вирусологии 2005, в печати.

3. А.А.Северова, А.А.Маныкин, Н.Б.Мацко, П.Г.Богуш Выявление геномной рнк вируса гепатита с в сыворотке больных гепатитом с методом пцр с использованием риболайзера.//Тезисы доклада 3-ей Всероссийской Научно-Практической Конференции "Генодиагностика в современной медицине", Москва, 2000г.

4. Северова А.А., Завалишина Н.Э., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Кучерова Т.Е. Обнаружение ВГС в образцах биоптатов печени больных гепатитом С с помощью метода RT-PCR in situJ/Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2003:т.7,№1,с.83

5. Рязанцева А А., Завалишина Н.Э., Маныкин А.А., Франк Г.А., Петров А.Н., Кучерова ТЕ Детекция РНК ВГС при гепатоцеллюлярном раке с помощью метода RT-PCR in situ.ll Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2004: т.8, №1, с.87-88

6. МаныкинА.А., РязанцеваА.А., Завалишина Л.Э., Гущина Е.А., Лисицын Ф.В., Кучерова Т.Е. Исследование печени больных людей с диагнозом гепатит С методами просвечивающей электронной микроскопии и молекулярной гистологии//Тезисы доклада XX Российской Конференции по Электронной Микроскопии г. Черноголовка, 2004 г.

7. Маныкин А.А., Рязанцева А.А., Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Кучерова Т.Е., Франк Г.А. Детекция РНК вируса гепатита С при хроническом гепатите С и гепатоцеллюлярном раке методом RT-PCR in situy/Тезисы доклада конференции «Актальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты», С-Пб., 2004

Принято к исполнению 16/12/2004 Исполнено 17/12/2004

Заказ № 522 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

»2735 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рязанцева, Анастасия Александровна

I. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные задачи исследования.

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Научно-практическая ценность.

1.6. Основные положения, выносимые на защиту.

1.7. Апробация работы.

II. Обзор литературы.

2.1. Общие сведения о вирусе гепатита С (ВГС).

2.2. Структура и организация генома. Краткая характеристика некоторых продуктов его экспрессии:

• 5'-нетранслируемый участок (5-UTR)

• З'-нетранслируемый участок (З'-UTR)

• вирусные протеины. Структурные белки. Белок Core

• гликопротеины оболочки

• неструктурные белки. NS

2.3. Тканевой тропизм ВГС.

2.4. Роль ВГС в канцерогенезе.

2.5. Метод ОТ-ПЦР in situ.

2.6. Морфогенез ВГС.

III. Материалы и методы.

3.1. Клинический материал для детекции РНК ВГС.

3.2. Метод ПЦР. З.З.ОТ-ПЦР in situ.

3.4. Электронная микроскопия.

IV. Результаты и обсуждение.

4.1. Метод ОТ-ПЦР in situ.

4.2. Обнаружение РНК ВГС in situ.

4.3. Локализация in situ.

4.4. Ультраструктурные исследования.

4.5. Общее заключение по обсуждению.

V. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ"

1.1.Актуальность проблемы.

Вирус гепатита С (ВГС), как предполагается, проник в человеческую популяцию довольно давно и в настоящее время получил широкое распространение, в том числе из-за парентеральных манипуляций. Число инфицированных вирусом - около 500 млн. человек, большинство из которых является скрытыми носителями. У 50-85% заболевших острым гепатитом С развивается хроническая (персистирующая) ВГС-инфекция, при которой вирус сохраняется и размножается в организме в течение десятков лет [125].

Данные о частоте встречаемости гепатита С неоднородны и колеблются от 0,1% от общей численности населения в таких странах, как Исландия, или Норвегия и до 18,1% - в Египте [44].

Кроме того, на фоне хронического вирусного гепатита может развиваться первичный рак печени (гепатоцеллюлярная карцинома). Как известно, гепатоцеллюлярная карцинома является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека. Среди злокачественных новообразований печени на её долю приходится 80-90%, а ВГС, наряду с ВГВ (вирусом гепатита В), являются важнейшими 4 этиологическими агентами. Причем в некоторых регионах мира, например в

Японии, доля ВГС-инфекции в этом отношении является ведущей, достигая 75% [20].

Несмотря на всё вышеперечисленное, до сих пор остаются неизученными молекулярно-биологические аспекты репродукции вируса. Также однозначно не выяснена его внутриклеточная локализация. Хотя факт участия ВГС в развитии гепатоцеллюлярной карциномы доказан, молекулярные механизмы ВГС-ассоциированного канцерогенеза не изучены до настоящего времени. [132]. В. В связи с этим возникает вопрос о методе, который позволил бы :

• выявить генетический материал (РНК) вируса непосредственно в инфицированной ткани (in situ).

• сохранить тканевые срезы достаточно цельными для того, чтобы можно было установить внутриклеточную локализацию вирусной РНК.

Таким методом, по сути, является гибридизация in situ. Однако, этот метод в применении к вирусу гепатита С имеет низкую чувствительность и дает не очень достоверные результаты из-за того, что во-первых, количество вирионов ВГС в ткани невелико, а во-вторых, в процессе выполнения процедур его РНК часто подвергается разрушению.

Метод ОТ-ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ. Таким образом, он сочетает в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Однако, несмотря на преимущества, ОТ-ПЦР in situ обладает и некоторым недостатком. Более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады, имеющие место на этапе амплификации, приводят к более сильному, чем при гибридизации in situ, разрушению срезов. Также к сложностям ОТ-ПЦР in situ можно отнести его многоэтапность, трудоёмкость и высокую стоимость реактивов. Всё это вместе и привело к тому, что в нашей стране этот метод практически не применяется, в то время как за рубежом появляются исследования с применением ОТ-ПЦР in situ для идентификации различных вирусов.

О первых результатах, полученных с использованием этого метода сообщалось в работе А.Т .Haase и др. в 1990 г. [39]. В дальнейшем, количество работ с применением метода обнаружения РНК ВГС в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и изучение с ее помощью ВГС внес G. Nuovo [81 - 90].

Применение метода детекции РНК ВГС in situ позволило обнаружить ВГС не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках [6]. Кроме того, было показано, что РНК вируса гепатита С обнаруживается не только в печени, но и, например, в лимфоцитах [54], и в эритротроцитах [73]. Предполагают, что эти клетки могут принимать участие в транспорте ВГС от места проникновения в организм до клеток печени, где, в основном, происходит его размножение.

До сих пор остаётся спорным вопрос о внутриклеточной локализации РНК ВГС. Некоторые исследователи сообщают о нахождении РНК ВГС только в цитоплазме гепатоцитов [15, 93, 103, 104], другие указывают на исключительно ядерную локализацию [7], третьи обнаруживают РНК ВГС как в цитоплазме, так и в ядрах клеток [6, 16, 41, 60, 89, 118].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рязанцева, Анастасия Александровна

Выводы:

1. Впервые в практике отечественных исследований применён и модифицирован метод ОТ-ПЦР in situ для детекции вирусного генома в парафиновых срезах. Подобраны оптимальные условия для снижения деградации РНК, установлено оптимальное время инкубации срезов с ДНКазой, подобраны реагенты для проведения этапов обратной транскрипции и амплификации в одну стадию, а также режим амплификации.

2. При исследовании биопсийного и операционного материала от больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой показана эффективность модифицированного нами метода для выявления РНК ВГС в ядрах и цитоплазме гепатоцитов и раковых клеток.

3. В образцах печени от больных с хроническим гепатитом С, положительных по ОТ-ПЦР in situ методом электронной микроскопии установлено наличие в цитоплазме гепатоцитов вирусоподобных частиц и тубулярных образований, представляющих собой структурные белки ВГС, характерных для клеток, инфицированных вирусом гепатита С. Сочетание указанных подходов повышает достоверность полученных результатов.

4. Не выявлено прямой корреляции между гистологической картиной поражения печени при хроническом гепатите С с числом инфицированных гепатоцитов, детектируемых с помощью ОТ-ПЦР in situ.

5. В результате проведения ОТ-ПЦР in situ впервые показана перинуклеарная локализация РНК ВГС в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.

6. Показана возможность использования ОТ-ПЦР in situ в качестве одного из методов ранней диагностики вирусных и онкологических заболеваний.

Глава VI.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рязанцева, Анастасия Александровна, Москва

1. Agnello V, Abel G., Knight G. The role of hepatitis С virus (HCV) in the pathogenesis of type II cryoglobulinemia (MC). //Arthritis Rheum. 1993;. 36: S241.

2. Ali N., Siddiqui A. Interaction of polypirimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis С virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation. U J. Virol 1995; 69:6367-6375.

3. Barba G., Harper F., Harada Т., et al. Hepatitis С virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. // Proc. Natl. AcadSci. USA, 1997; 94: 1200-1205.

4. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobs en H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. // J. Virol, 1993; 67: 3835 3844.

5. Behrens, S. E., Tomei, L., De Francesco, R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus. // EMBO J, 1996; 15: 12-22.

6. Bettinger D., Mougin C., Fouque В., et al Direct in situ reverse transcriptase-linked polymerase chain reaction with biothinylated primers for the detection of hepatitis С RNA in liver biopsies. //J Clin Virol 1999; 12:233 — 241.

7. Biagini P., Bencoel L., Dodero F., et.al. Hepatitis С virus by in situ RT- PCR in formalin-fixed paraffin-embedded liver tissue. Comparison with serum and tissue results. //Cel. Mol Biol 2001;47, № 23: OL 167-ОЫ71.

8. Blanchard E., Brand D., et al Hepatitis С virus-like particles morphogenesis. // J. Virol, 2002;76: 4073 4079.

9. Blight K.J., Trowbridge R., Rowland R., Gowans E.J. Detection of hepatitis С virus RNA by in situ hybridization. // Liver 1992; 12: 286 — 289.

10. Blight K. J., Rowland R., de la Hall P.M., et al. Immunohistochemical detection of the NS4 antigen of hepatitis С virus and its relation to histopathology. //Am J Pathol. 1993; 143:1568—1573.

11. Bosman C., Valli M.B., et al. Detection of virus-like particles in liver biopsies from HCV-infected patients. II Res. Virol., 1998; 149: 311 314.

12. Bouffard P., Hayashi P.H., Acovedo R. et al. Hepatitis С virus is detected in monocyte/macrophage subpopulation of peripheral blood mononuclear cells of infected patients. //J. Infect. Dis., 1992; 166:1276-1280.

13. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the 5' non-coding region of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1992;89: 4942 -4946.

14. Buratti E., Tisminetzky Zotte M., Baralle F. E. Functional analysis of interaction between HCV 5'UTR and putative subunits of eukaryotic translation initiation factor eIF3. //Nucleic Acid Res., 1998; 26: 3179 3187.

15. Chang M., Marquardt A.P., Wood B. L., et al. In situ distribution of hepatitis С virus replicative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease. //J Virol 2000; 74: 944 955.

16. Cho S. W., Hwang S. G., Han D. C., et al. In situ detection of hepatitis С virus RNA in the liver tissue using a digoxigenin-labelled probe created during a polymerase chain reaction. // J Med Virol. 1996; 48: 227 — 233.

17. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:2451 -2455.

18. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. Involvement of endoplasmatic reticulum chaperones in the folding of hepatitis С virus glycoproteins. // J. Virol. 1998; 72:3851- 3858.

19. Clarke B. Molecular virology of hepatitis С virus. // J. Gen. Virol., 1997; 78: 2397-2410.

20. Colombo M. Hepatitis С virus and hepatocellular carcinoma. // Seminars in liver disease 1999; vol.19; №3 : 263 269.

21. De Vita S., Sansonno D., Dolcetti R., et al. Hepatitis С virus within a malignant lymphoma lesion in the course of type II mixed cryoglobulinemia. // Blood 1995; 86:1887—1892.

22. De Vos R., Verslype C., et al. Ultrastructural visualization of hepatitis С virus components in human and primate liver biopsies. // J.Hepatol., 2002; 37: 370-379.

23. Deleersnyder V, Pillez A., Wychowski C., et al. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes. //J. Virol., 1997; 71: 697-704.

24. Dubuisson J. Folding, assembly and subcellular localization of hepatitis С virus glycoproteins. // Cur. Top. Microbiol. Immunol., 2000; 242: 135 — 148.

25. Dubuisson J., Hsu H.H., Cheung R.S., et al. Formation and intracellular localization of hepatitis С virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccina and Sindbis viruses. //J.Virol., 1994; 68: 6147 6160.

26. Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y., et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis С virus lb infection. II N.Engl. J.Med, 1996; 334: 77-81.

27. Failla C.M., Tomei L., De Francesco R. Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of the hepatitis С virus nonstructural proteins //J. Virol. 1994; 68:3753-3760.

28. Falcon V., Acosta-Rivero N., et al. Ultrastructural evidences of HCV infection in hepatocytes of chronically HCV-infected patients. // Biochem. Biophys. Res. Com., 2003; 305: 1085 1090.

29. Falcon V., Baranosky N., et al. Ultrastructural and immunocytochemical characteristics of hepatocytes from hepatitis В virus infected shimpanzees. // Tissue Cell, 1993; 25: 865 873.

30. Farci P., Bukh J., Purcell R. The quasispecies of hepatitis С virus and the host immune response. // Springer Semin. ImmunopatoL, 1997; 19: 5-26.

31. Feinstone S., Mihalik K.B., Kamimura Т., et al. Inactivation of hepatitis В virus and non-A, non-B hepatitis by chlorophorm. // Infect. Immun. 1983;41:816-821.

32. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Classification and nomenclature of viruses: Fifhtreport of the International Committee on Tacsonomy of Viruses. I I Arch. Virol. 1991; 2: 223.

33. Fukushi S., Katayama K., Kurlhara C., et al. Complete 5' noncoding region is necessary for efficient internal initiation of hepatitis С virus RNA. //Biochem.Biophys.Res Commun., 1994; 199: 425 432.

34. Gale M. J., Jr., Korth M. J., Tang N. M., et al. Evidence that hepatitis С virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein. // Virology, 1997; 230: 217-227.

35. Gonzalez-Peralta R.P., Fang J.W.S., Davis G.L., et al. Optimization for the detection of hepatitis С virus antigens in the liver. // J Hepatol. 1994; 20: 143 —147.

36. Gracoui A., McCourt D. W., Wychowski C., et al. A second hepatitis С virus-encoded proteinase. HProc. Natl. Acad.Sci. USA, 1993; 90:10583-10587.

37. Gracoui A., Wychowski C., Lin.C., et al. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products. II J. Virol. 1993; 67:1385-1395.

38. Gwak V., Kim D. W., Han J. H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis С virus nonstructural protein 3. IIEur. J. Biochem. 1997; 251: 47 54.

39. Haase A.T., Retzel E.F., Staskus K.A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990,87; 4971-4975.

40. Haruna Y, Hayashi N. Hiramatsu N., et al. Detection of hepatitis С virus RNA in liver tissues by an in situ hybridization technique. // J Hepatoll993;. 18: 96— 100.

41. He L.F., Ailing D., Popkin Т., et al. Determining the size of non-A, non-B hepatitis virus by filtration. И J.Infect.Dis. 1987; 156: 636 640.

42. He X.S., Rehermann В., Lopez-Labrador F. X., et al. Quantitative analysis of hepatitis С virus-specific CD8(+) T-cells in peripheral blood and liver using peptide-МНС tetramers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:5692 5697.

43. Hepatitis C: Global prevalence, 1997.

44. Hijikata M., Mizushima H., Akagi Т., et al. Two distinctproteinase aktivities required for the processing of a putative nonstructural precursor protein of hepatitis С virus. II J. Virol., 1993; 67:4665 4675.

45. Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y, et al. Gene mapping of the putative structural region of hepatitis С virus by in vitro processing analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1991; 88: 5547-5551.

46. Honda M., Beard M.R., Ping L.H., Lemon S.M. A phylogenetically conserved stem-loop structure at the 5'border fo the internal ribosome entry site of hepatitis С virus is required for cap-independent viral translation. // J.Virol. 1999;73: 1165-1174.

47. Honda M., Brown E. A., Lemon S.M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis С virus RNA. // RNA, 1996; 2: 955-968.

48. Houghton M. Hepatitis С viruses. // Virology, Ed. B.N. Fields, third ed.,ch.32, p. 1037, "Lippincott-Raven Publishers ", 1995.

49. Ito Т., Lai M. M. An internal polypirimidine tract-binding protein-binding site in the hepatitis С virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence. // Virology, 1999; 254: 288 296.

50. Jackson D., Tabor E., Gerety R. Acute non-A, non-B hepatitis: specific ultrastructural alterations in endoplasmatic reticulum of infected hepatocytes. // Lancet 1979; 1:1249 1250.

51. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K. et al. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study. // J Gen. Virol., 1994; 75:. 1755-1760.

52. Kato N., Ikeda M., et al. Hepatitis С virus population dynamics in human hepatocytes infcted in vitro. //J Gen Virol. 1998; 79 (Pt 8): 1859 — 1869.

53. Kato N., Lan К. H., Ono-Nita S. К Shiratori Y, Omata, M. Hepatitis С virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator. // J. Virol, 1997; 71: 8856-8859.

54. Kato N., Lan K.H., Ono-Nita S. K, et al Hepatitis С virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator. // J. Virol, 1997; 71: 8856-8859.

55. Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S. K, et al Activation of intracellular signaling by hepatitis В and С viruses: C-viral Core is the most potent signal inducer. // Hepatology 2000;32: 405 412.

56. Kim D. W., Gwak Y, Han J. H., Choe J. С terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protein contains an RNA helicase activity. // Biochem.Biophys.Res Commun., 1995; 215: 160-166.

57. Kolykhalov A. A., Feinstone S. M., Rice C.M. Identification of a highly conseved sequence element at the 3' terminus of hepatitis С virus genome RNA. // J. Virol 1996; 70:3363- 3371.

58. Komminoth P., Adams V, Long A., et al Evaluation of methods for hepatitis С virus detection in archival liver biopsies. //Path Res Pract. 1994; 190: 1017—1025.

59. Komoda Y., Hijikata M., Sato S., et al. Substrate requirements of hepatitis С virus serine proteinase for intermolecular polypeptide cleavage in Escherichia coli. // J. Virol. 1994; 68: 7351-7357.

60. Krawczinski K., Beach M.J., Bradley D.W., et al. Hepatitis С virus antigen in hepatocytes: immunomorphologic detection and identification. //Gastroenterology 1992; 103: 622 — 629.

61. Lapis K, Shaff Z Acute viral hepatitis. // Electron Microsc.Hum. Med.: The Liver, 1979; 8:124 136.

62. Leary K., Brair C. Segmental events in morphogenesis of Japanese encephalitis virus. // J.Ultrastruct.Res. 1980; 72: 123 129.

63. Lin C., Lindenbach B. D., Pragai В. M., et al. Processing in the hepatitis С virus E2/NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different C-termini. // J. Virol. 1994; 68:5063 5073.

64. Lin C., Pragai В. M., et al. Hepatitis С virus NS3 serine proteinase: trans cleavage requirements and processing kinetics. // J. Virol. 1994; 68:8147 — 8157.

65. Lin C., Wu J.W., Hsiao K., Su M.S. The hepatitis С virus NS4A protein: interactions with the NS4B and NS5A proteins. // J. Virol. 1997; 71:6465 -6471.

66. Lo S. Y., Masiarz F., Hwang S. В., Lai M. M., and Ou J. H. Differential subcellular localization of hepatitis С virus core gene products. // Virology, 1995; 213: 455-461.

67. Lo S. Y., Selby M., Tong M., and Ou J. H. Comparative studies of the core gene products of two different hepatitis С virus isolates: two alternative forms determined by a single amino acid substitution. // Virology, 1994;199: 124-13.1

68. Lo S. Y., SelbyM. J., and Ou J. H. Interaction between hepatitis С virus core protein and El envelope protein. II J.Virol., 1996; 70: 5177-5182.

69. Lohmann V, Korner F., Herian U., Bartenschlager, R. Biochemical properties of hepatitis С virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase andidentification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity. // J.Virol, 1997; 71: 8416-8428.

70. Long A., Komminoth P. In situ PCR. //Gosden J. (Ed) PRINS and PCR protocols. Methods in molecular biology. Humana Press, Totowa 1997: 141 — 161.

71. Lotz G., Szalay F., Firneisz G., et al. Localization of hepatitis С virus RNA of human erythrocytes by RT in situ PCR technique. // Scand.J. Gastroenterol. 2002; 37 (5): 578-584.

72. Major M.E., Rehermann В., Feinstone S. Hepatitis С viruses. // Virology, Ed. B.N. Fields, fourth ed.,ch.34, p. 1128, "Lippincott-Raven Publishers ",2000.

73. Matsumoto M., Hwang S. В., Jeng K. S., Zhu N., and Lai M. M. Homotipic interaction and multimerization of hepatitis С virus core protein. // Virololgy, 1996; 218: 43-51.

74. Michalak J. P., Dubuisson, J., Rice, С. M. Characterization of truncated forms of hepatitis С virus glycoproteins. // J.Gen.Virol., 1997; 78: 22992306

75. Mizushima, H., Hijikata, M., Asabe, S., et al. Two hepatitis С virus glycoprotein E2 products with different С termini. // J Virol., 1994; 68: 62156222.

76. Muller H.M., PfajfE., Goeser T. et al. Peripheral blood leukocytes as a possible extrahepatic site for hepatitis С replication. // J. Gen. Virol., 1993; 74: 669-676.

77. Neddermann P., Clementi A., De F.R. Hyperphosphorylation of the hepatitis С virus NS5A protein requires an active NS3 protease NS4A, NS4B, and NS5A encoded of the same polyprotein. // J. Virol. 1999;73:9984-9991.

78. Nouri-Aria К. Т., Sallie R., Sangar D., et al. Detection of genomic and intermediate replicative strands of hepatitis С virus RNA in liver tissue by in situ hybridization. IIJ Clin Invest. 1993; 91: 2226 — 2234.

79. Nuovo G. PCR in situ hybridization. // NY, Raven Press, 1992.

80. Nuovo G. Preparation of samples for polymerase chain reaction in situ. H Scan Microsc Suppl. 1996; 10: 49 — 55.

81. Nuovo G., Forde A. An improved system for reverse transcriptase in situ PCR. // J. Histotech. 1995; 18 : 295 299.

82. Nuovo G., Gallery F., McConnell P. Analysis of non-specific DNA synthesis during in situ PCR. // PCR Method Applic. 1994; 4: 342 349.

83. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Becker J., Bloch W. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification. // Am J Pathol. 1991; 139: 1239—1244.

84. Nuovo G., Gallery F., McConnell P.,Horn R.„ J., Bloch W. Importance of different variables for enchansing in situ detection of PCR-amplified DNA. // PCR Methods Appl. 1993; 2: 305 — 312.

85. Nuovo G., Gorgone G., McConnell P., Margiotta M.,Gorevic P. In situ localization of PCR-amplified human and viral cDNAs. //PCR Methods Appl. 1992; 2: 117 — 123.

86. Nuovo G., Hohman R., Nardone G., Nazarenko I. In situ amplification using universal energy transfer-labelled primers. // J Histochem Cytochem. 1999; 47: 273 — 280.

87. Nuovo G., Lidonnici K., McConnell P., Lane B. Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis С cDNA. // Am J Surg Pathol. 1993; 17: 683 — 690.

88. Nuovo G., McConnell P., et al. Correlation of the in situ detection of polymerase chain reaction-amplified metalloproteinase complimentary DNAs and their inhibitors with prognosis in cervical carcinoma. // Cancer Res. 1995; Jan. 15; 55 (2): 267-275.

89. Nuovo G., McConnell P., Forde A., Delvenne P. Detection of human papilloma virus DNA in formalin-fixed tissues by in situ hybridization after amplification by polymerase chain reaction. //Am J Pathol. 1991; 139: 847 — 854.

90. Oh J. W., Ito Т., Lai M.M. A recombinant hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase capable of copying the full-length viral RNA. // J.Virol. 1999; 73:7694-7702.

91. Ohishi M., Sakisaka S., Harada M., et a/.Detection of hepatitis С virus and hepatitis С virus replication in hepatocellular carcinoma by in situ hybridization. // Scand.J. Gastroenterol. 1999;4: 432-438.

92. Pfeifer U., Thomssen R., et al. Experimental non-A, non-B hepatitis: four types of cytoplasmic alteration in hepatocytes of infected shimpanzees. // Virchows Arch. В Cell Pathol. 1980; 33: 233 243.

93. Prince, A. M., Huima-Byron, Т., Parker, T. S., and Levine, D. M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins. //J.ViralHepat., 1996; 3: 11-17.

94. Ralston R., Thudium K., Berger K., et al. Characterization of hepatitis С virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccina viruses. И J. Virol., 1993; 67: 6753 6761.

95. Ray R., Lagging L. M., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis С virus core protein. // Virus Res., 1995; 37: 209-220.

96. Ray R., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional repression of p53 promotor by hepatitis С virus core protein. //J. Biol. Chem., 1997; 272: 1098310986.

97. Ray R.B., Lagging L. M., Meyer K., Ray R. Hepatitis С virus core protein cooperates with ras and transforms primary rat embryo fibroblasts to tumorigenic phenotype. //J. Virol, 1996; 70: 4438-4443.

98. Reed К. E., Gracoui A., Rice C.M. Hepatitis С virus-encoded NS2-3 proteinase: cleavage-site mutagenesis and requirements for bimolecular cleavage. II J. Virol 1995; 69:4127-4136.

99. Reynolds J.E., Kaminski A., Carrol A.R., et al. Internal initiation of translation of hepatitis С virus RNA: the ribosome entry site is at the authentic initiation codon. // RNA, 1996; 2: 867 878.

100. Sansonno D., Cornacchiulo V., Iacobelli A.R., et al. Localization of hepatitis С virus antigens in liver and skin tissues of chronic hepatitis С virus-infected patients with mixed cryoglobulinemia. // Hepatology 1995; .21:305 — 312.

101. Sansonno D., Cornacchiulo V, Racanelli V, Dammacco F. In situ simultaneous detection of hepatitis С virus RNA and hepatitis С virus-related antigens in hepatocellular carcinoma. // Cancer, 1997; 80 (1): 22- 33.

102. Santolini E., Migliaccio G., and La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. // J. Virol., 1994; 68: 3631-3641.

103. Santolini E., Pacini L., Fipaldini C., Migliaccio G., and Monica N. The NS2 protein of hepatitis С virus is a transmembrane polypeptide. IIJ. Virol., 1995; 69: 7461-7471.

104. ShaffZ., Lapis K. Fine structure of hepatocytes during the etiology of several common pathologies IIJ. Electron Microsc. Technol: 1990; 14: 179 207.

105. Shih C.M., Chen C.M., Chen S.Y., Wu Lee Y.H. Modulation of the transsupression activity of hepatitis С virus core protein by phosphorilation. // J. Virol. 1995; 69:1160-1171.

106. Shimizu Y.K., Feinstone S. M., Kohara M., et al. Hepatitis С virus: Detection of intracellular virus particles by electron microscopy. // Hepatology 1996;23: 205-209.

107. Shimizu Y.K., Feinstone S. M., Purcell R. L., et al. Non-A, non-B hepatitis: ultrastructural evidence of two agents in experimentally infected shimpanzees. // Science 1979; 205: 197- 200.

108. Smith D.B., Mellor J., Jarvis L.M., et al. Variation of the hepatitis С virus 5' non-coding region: implications for secondary structure, virus detection and typing. II J. Gen. Virol, 1995;76: 1749-1761.

109. Speel E. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors. //Histochemistry and Cell Biology 1999; 112: 89 — 113.

110. Su Y.H., Lu S.L., Gu Y.H., Zhu T.F., Zhu S.N. In situ RT-PCR detection of hepatitis С virus genotypes in Chinese patients with hepatocellular carcinoma. II J. Exp. Clin. Cancer Res. 2002; Dec. 21 (4): 591 598.

111. Suzich J.A., Tamura J.K., Palmer-Hill F., et al. Hepatitis С virus NS3 protein polynucleotide-stimulated nucleoside triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes. // J.Virol, 1993; 67: 6152—6158.

112. Tai C.L., Chi W.K., Chen D.S., and Hwan, L.H. The helicase activity associated with hepatitis С virus nonstructural protein 3 (NS3). // J.Virol., 1996; 70:8477-8484.

113. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., et al Structure of the З'-terminus of hepatitis С virus genome. II J.Virol. 1996; 70:3307- 3312.

114. Tanaka Y., Enomoto N., Kojima S., et al Detection of hepatitis С virus RNA in the liver by in situ hybridization. // Liver 1993; 13: 203 — 208.

115. Tanji Y., Kaneco Т., Satoh S., Shimotohno К Phosphorilation of hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS5A. // J. Virol 1995; 69:39803986.

116. Tomei L., Failla C., Santolini E., De Francesco R., and La Monica N. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein. IIJ. Virol, 1993; 67: 4017-4026.

117. Tsiquae K.N., Bird R. J., et al. Further evidence of cellular changes associated with non-A, non-B hepatitis. IIJ. Med. Virol. 1980; 5: 63 71.

118. Vizmanos J.L., Gonzalez-Navarro C.J., Novo F.J. et al. Degree and distribution of variability in the 5'untranslated, El, E2/NS1 and NS5 regions of the hepatitis С virus (HCV). IIJ. Viral. Hepat., 1998; 5: 227-240.

119. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis С virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism. II J. Virol. 1993; 67: 3338-3344.

120. Westaway E.G. Flaviviruses replication strategy. // Adv. Vir. Res. 1987; 33: 45 90.125. http://www. ibmc. msk. ru/hepatitis/default. htm

121. Yamada K., Mori A., Seki M., et al. Critical point mutations for the hepatitis С virus NS3 proteinase. // Virology, 1998; 246: 104-112.

122. Zignego A.L., Macchia D., Monti M. et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C. J. //Hepatol., 1992; 15: 382-386.

123. Алътштейн А. Д. Вирусный канцерогенез и роль вирусов в возникновении опухолей человека. //Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 5, с.251.

124. Блюгер А. Ф., Зальцмане В. К, Картагиова О. Я. Ультраструктурная патология печени. Электронно-микроскопический атлас. II Рига: Зинатне, 1989; с. 157.

125. Заридзе Д.Г. Введение. //Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, с.27.

126. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований. II Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 1, с.29.

127. Киселев Ф. Л. Роль вируса гепатита в развитии рака печени. // Канцерогенез, под ред. Д.Г. Заридзе, М.: Медицина, 2004, гл. 5, с.297.

128. Клименко С.М. Структура вириона вирусов животных. //Общая и частная вирусология, под. ред. В. М. Жданова, С. Я. Гайдамович, М: Медицина, 1982, т.1, гл. 3, с.71.

129. Оленина Л.В., Соболев Б.Н. Тканевой тропизм вируса гепатита С. // с сайта http://www.ibmc.msk.ru.

130. Злокачественные образования в России и СНГ. //М., 2004.

131. Dominguez-Malagon Н. Hepatocellular carcinoma: an update. // Ultrastructural pathology, 2001; 25: 497-516.

132. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

133. Северова А.А (Рязанцева А.А.), Маныкин А.А. Применение методов гибридизации in situ и обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции in situ для изучения инфекции, вызванной вирусом гепатита С. IIВопросы Вирусологии 2000, 6: 7 — 12.

134. А.А.Северова, А.А.Маныкин, Н.Б.Мацко, П.Г.Богуги Выявление геномной РНК вируса гепатита С в сыворотке больных гепатитом с методом ПЦР с использованием риболайзера. //Тезисы доклада 3-ей Всероссийской

135. Научно-Практической Конференции "Генодиагностика в современной медицине ", Москва, 2000г.

136. Северова А.А., Завалишина Л.Э., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Кучерова Т.Е. Обнаружение ВГС в образцах биоптатов печени больных гепатитом С с помощью метода RT-PCR in situ. //Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2003: т.7, №1, с. 83.

137. Рязанцева А.А., Завалишина Л.Э., Маныкин А.А., Франк Г.А., Петров А.Н., Кучерова Т.Е Детекция РНК ВГС при гепатоцеллюлярном раке с помощью метода RT-PCR in situ. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2004: т. 8, №1, с.87-88.

138. Хронический гепатит печени. Хорошо различимы Ф фиброз, МК - многоядерные клетки. ОН - очаговый некроз клеток и ЗД - зернистая дистрофия. У в. 200. Окраска гематоксилином-эозином.1. Рис. 10.

139. Хронический гепатит печени. Хорошо различимы Ф-фиброз, МК многоядерныеклетки и 5Д зернистая дистрофия.

140. Ув. 200. Окраска гематоксилином-эозином.1. Рис. 11.

141. Гепатоцеллюлярная карцинома. Хорошо различимы многоядерные клетки и клетки сочень крупными ядрами.

142. Ув. 400. Окраска гематоксилином-эозином.•I •ggapfflp a• •••л & •1.| 1Я1• g -V ■ 1: < ■" 9 m1. Щ/ Щ tto . dfe ' Г SS>. *1. C* • £4 ® A1. Щ Щ®9 ® » £1. Mill• №■ Ii: ЩрЩш «у' -W if Ч * wN1. Щ) ;< ГА»1. К сзК111. Рис. 12.