Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генодиагностика и генотипирование вируса гепатита С

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генодиагностика и генотипирование вируса гепатита С"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

п

I . и

на правах рукописи

ГБ ОД

2 2 ИЮ1

ТАРАСОВ Кирилл Викторович

ГЕНОДИАГНОСТИКА И ГЕНОТИ ПИРОВ АН И Е ВИРУСА ГЕПАТИТА С

(03.00.06 — вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии и генн< инженерии Нау.чно-Исследовательского Института гриппа РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Киселев О.И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиолог] и микробиологии им. Пастера

Официальные оппоненты: д.м.н., профессор, Аксенов O.A.

к.м.н., Сосунов A.B.

Защита диссертации состоится...........1998г. в1Ь..ч.о.О.. мин.

заседании Диссертационного совета Д.001.46.01. при НИИ гриппа РАМН адресу: ул. проф. Попова, д. 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа РАМН. Автореферат разослан ..W. .4.2........1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.001.46.01

к-б.н. Покровская Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вирусные гепатиты занимают лидирующее место в группе заболеваний вирусной пологий. В 1989 г. был открыт вирус гепатита С (ВГС) (Chou et.al.1989). Оказалось, что I 80 % постгрансфузионных гепатитов вызывается ВГС. Интерес к вирусному гепати-С (ГС) объясняется еще и тем, что заболевание, часто протекающее бессимптомно, ансформируется в хронические формы почти у 50 % больных, а исходом хроничес->го ГС в 20 % случаев могут быть цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) Isteban, 1989). В Европе и Азии ВГС является причинным агентом ГЦК в 50—75 % слу-ев. По оценке экспертов CDC (Alter et al., 1992), в США ежегодно ожидается около 0 тыс. новых случаев заболевания ВГС, из них у 30 тыс. больных разовьется цирроз :чени, а около 10 тыс. погибнут от этой инфекции. Нельзя исключить вероятность того, о в нашей стране эти цифры могут быть аналогичными или еще выше.

К настоящему времени разработаны четыре поколения тест-систем для серодиаг->стики ВГС. Однако, особенностью ВГС-инфекщш является позднее появление спе-1фических антител в сыворотке крови — от 3-4 месяцев до 2 лет и более от момента кэширования, — что значительно затрудняет серодиагностику ВГС. Кроме того, ши-iKo применяемые в России отечественные тест-системы II поколения уступают зару-жным аналогам. В результате риск передачи ВГС с переливаемой кровью, а также ме-щинскиыи работниками остается высоким. Так, среди доноров С.-Петербурга анти-ла к ВГС были обнаружены в 2,4 % случаев, у медработников — в 1,2 %, у работаю-их с кровью лаборантов — в 6,3 % случаев (Мукомолов ,1992).

Представляется очевидным, что в диагностической практике целесообразно нсполъ • вать методы прямой детекции ВГС в сыворотке крови, к которым относится и ПЦР-текция. По принятой классификации Симмондса ( Simmonds et al. 1994) ВГС, геном дорого представляет собой однонитевую РНК, можно подразделить на б основных нотипов и большое число субтипов, причем отмечена связь между генотипом вируса, жестью течения и исходоами заболевания (Nousbaum et al., 1995). Поэтому своевре-;нная диагностика ГС, а также определение генотипа возбудителя, является важной »едпосылкой эффективного лечения заболевания.

За рубежом созданы коммерческие диагностические наборы для обнаружения РНК "Сс помощью РТ-ПЦР ("Amplicor", "Inno-Lipa", и т.п.), которые широко использу-гся в зарубежной диагностической практике, однако слишком дороги для активного шменения в России. В нашей стране РТ-ПЦР для выявления РНК ВГС только начнет использоваться. Остается открытым и вопрос о генотипах циркулирующего у нас "С и его нукяеотидных последовательностях. Имеются лишь единичные публикащш по ому вопросу (Васильев, Вязов с соавт., 1994). Данные о нуклеотидных последователь-1стях и генотипах циркулирующих в С.-Петербурге штаммов ВГС отсутствуют.

Таким образом, необходимость разработки оригинальных подходов к прямой лекции и определению генотипов ВГС не вызызает сомнения. Использование современ-IX молекулярно-диагностических методов является особенно актуальным для нашей раны в связи с ограниченным количеством данных по циркуляции ВГС на террито-и России.

Целью настоящей работы явилась разработка высокочувствительного и высокоспе-фичного метода РТ-ПЦР для генодиагностики ВГС, и использование данного мето-для разработки подходов к определению генотипов штаммов ВГС, циркулирующих 3. -Петербурге.

Задачи настоящего исследования

1. Разработка методов амплификации фрагментов геноШ ВГС.

2. Приложение метода амплификации к диагностике ВГС.

3. Определение нуклеотадной последовательности фрагментов генома изолятов BI циркулирующих в С.-Петербурге.

4. Разработка метода генсгагаирования на основе анализа полиморфизма длин р тренированных фрагментов амплификатов и определение генотипов штаммов ВГС, щ кулнрующих в С.-Петербурге.

Научная новизна работы

Создана система РТ-ПЦР, позволяющая детектировать ВГС и осуществлять ni винное генотипирование. Получены данные о распространении генотипов ВГС в Сам Петербурге. Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей tj изолятов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге. Показано, что полученные изо; ты относятся к генотипу lb и родственны "индийским" изолятам.

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования разработана и внедрена в клиническ практику специализированной клиники вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН те< система д ля генодиагностики ВГС и его генотип ирования на основе полиморфизма дл рестрицированных фрагментов. Данные о распределении генотипов ВГС, циркулиру щих в С.-Петербурге, могут учитываться при назначении комплексной противовир; ной терапии. Внедрение РТ-ПЦР позволяет выявлять этиологию заболевания у пацш тов с ^верифицированными гепатитами.

Основные положения, выносимые да защиту

1. Разработан метод генодиагностики ВГС в клиническом материале с использо] нием оригинальных универсальных и высокоспецифичных праймеров.

2. Разработанный метод РТ-ПЦР, основанный на применении праймеров, фле кируюхцих консервативную и вариабельную области генома вируса гепатита С, поз! ляет, благодаря оригинальной структуре праймеров, проводить не только диагностш но и генотипирование этого вируса.

3. Разработанная система РТ-ПЦР диагностики, позволяет выявлять этиолошч« кую причину заболевания у серонегативных больных вирусным ГС.

4. Определены нулеогидные последовательности фрагмента гена core ВГС.

5. РТ-ПЦР является эффективным методом контроля проводимой терапии в щ цессе лечения больных гепатитом С.

Адробапия работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференц: "Progress in Clinical Virology", Стокгольм, 1994; международном симпозиуме "IX Trienn International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease", Рим, 1996; X междунарс ном вирусологическом конгрессе "International Congress of Virology", Иерусалим, 195 II Всеросийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и koi роле лечения инфекционных заболеваний", Москва, 199S.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура, п объем днссерташш

Диссертация состоит из введения; обзора литературы, включающего 3 главы; р зультатов собственных исследований, включающих "Материалы и методы" и "Резулы ты и обсуждение", изложенные в 5 главах; выводов и списка литературы. Работа изл жена на1о5страницах машинописного текста, содержит 12. таблиц,25 рисунков; спио литературы содержит ^^наименований на русском и английском языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Пациенты

В работе использовались сыворотки крови пациентов Специализированной Клиники русных инфекций НИИ гриппа РАМН, а также городской инфекционной больницы 30 им. С.П. Боткина. Для клинико-лабораторной характеристики острой и хроничес-й форм ВГС использовались данные анамнеза заболевания, результаты клинического следования. Наряду с серологическим исследованием, у больных проводилось опре-ление в динамике стандартных биохимических показателей крови: уровня общего лирубина, активности аланинаминотрансферазы (АлТ), тимоловой пробы, общего лка крови, альбуминов и гаммаглобулинов, протромбинового индекса.

Определение антител к вирусам гепатитов А, В, С, Д, Е, а так же цитомегалови-су проводилось с помощью иммуноферментных тест-систем следующих фирм: НПО дагностические системы" (Н. Новгород), "Labsystems" (Финляндия), "Orgenics" (Фран-га-Израиль), и НПО "Аквапаст" (С. Петербург). Серологические исследования прово-лись в серологической лаборатории НИИ гриппа РАМН. Определение антител к ядер-гму белку ВГС (анти-HCV core IgM) проводилось с использованием тест-системы, зработашюй в лаборатории вирусных гепатитов НИИЭМ им. Пастера совместно с бораторией химии пептидов ГНИИ ОЧБ, на основе синтетических пептидов, соот-тствуюШих антигенным детерминантам ядерного белка ВГС.

Определение ДНК ВГВ и РНК ВГД проводилось в лаборатории молекулярной ви-сологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН.

Забор крови у больных стационара осуществлялся при поступлении. У детей, рож-нных от матерей, инфицированных ВГС, кровь для исследования забиралась из пу-вины сразу после родов.

Штаммы

В работе использовались штаммы E.coli XLl-Blue, BL21 из коллекции лаборатории шекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН.

Выделение РНК из сыворотки крови инфицированных пациентов методом

экстракции в растворе гуанидин тиоционата

Кровь от пациентов брали в стерильные стеклянные конические пробирки и цен-ифугирорали при 2000 об/мин в течение 15 мин. Сыворотку отбирали в стерильные листирольные пробирки. Тотальный препарат РНК выделяли из сыворотки крови тодом фенол/хлороформной экстракции в растворе гуанидин тиоционата (ГТЦ-ме-ц) (P.Chomczynski, N.Sacchi., 1987). Осадок РНК собирали центрифугированием в гении 30 мин 12000 об/мин при 4"С, дважды промывали 70% охлажденным этаном и высушивали.

Выделение РНК из биоптатов печеночной ткани пациентов метолом экстракции

в растворе гуанидин тиоционата

Нами был модифицирован ГТЦ-метод для выделения РНК из биоптатов печеноч-й ткани. Печеночная ткань сразу после биопсии помещалась в пробирку с 500 мкл грильного физиологического раствора, приготовленного на воде, обработанной диэ-лпирокарбонатом, на 30 минут. Фрагмент ткани, составляющий около 5 мг помещав 100 мкл физиологического раствора. Затем, добавляли 400 мкл буфера для выделе-

ния, содержащего 4M гуанидин тиоционат, 25 мМ цитрат натрия pH 7.0, 0,5% сарко-зил, к полученному раствору добавляли р-меркаптозтанол до конечной концентрации 100 мМ и 50 мкг тРНК E.coli (Sigma) в качестве соосадителя. После перемешивания пробирку оставляли на ночь при +4*С. Дальнейшее выделение проводилось аналогично стандартному ГТЦ-методу.

Амплификапия последовательностей генома ВГС

Получение кДНК на матрице РНК

Полученную РНК растворяли в 30 мкл деионизованной воды, обработанной диэ-тшширокарбонатом. 10 мкл РНК использовали в реакции обратной транскрипции. Реакционная смесь содержала 50 мМ Tris-HCl, pH 8.3, 40 мМ KCl, lOmM MgCl2, 10 мМ DIT, 10 ед. HPRI (ингибитора РНКаз), 10 ея. AMV обратной транскриптазы (Promega), 200 мМ каждого dNTP, 100 нг случайных гсксануклеотидов в конечном объеме 20 мкл. В варианте получения кДНК от специфического праймера вместо случайных гсксануклеотидов использовались праймеры, впервые предложенные Окамото (Okamoto, 1992), Е и #32 (Таблица 1, раздел 1.1). Реакцию проводили при 37°С в течении 60 мин.

Постановка двухступенчатой поламеразной цепной реакции (ПНР»

По окончании реакщш 4 мкл реакционной смеси использовали в первой стации ПЦР. Во второй стадии ПЦР использовали 2 мкл продуктов реакции первой стадии. Такой вариант постановки ПЦР (называемый в зарубежной литературе "nested"-PCR) обусловлен малыми количествами вирусной РНК в исследуемых пробах (101—102 вирионов на 100 мкл сыворотки). Второй раунд ПЦР проводился для повышения чувствительности и контроля специфичности с праймерами, внутренними по отношению к используемым в первой стадии. Обе стадии ПЦР проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 30 мМ Трис HCl pH 8.8, 16,3 мМ сульфата аммония, 0,01% Nonidet Р-40— Tween 20,2 мМ MgCl2,2 ед. Taq-полимеразы ("Биотех", Москва) и 200 нг каждого праймера. В работе использовались два набора праймеров (см. раздел 1.1): 1) универсальные праймеры Is, 8N/S, 4s, 10 N/S в ПЦР с термальным профилем 93°С 1мин., 65'С 1мин, 72°С 1мин; 2) праймеры для генотипирования А, Б, С, D в ПЦР с термальным профилем 93'С 1мин., 60'С 1мин, 72'С 1,2 мин.

Амплифицированные фрагменты идентифицировали в 1,5% агарозном геле (Sigma), обработанном бромистым этидием (Sambrook et al, 1989).

Генотипирование с помощью метода, основанного на полиморфизме длин рест-рицированных фрагментов амплифицированных последовательностей ВГС.

Выбранные праймеры А, В, С, D позволили амплифицировать фрагмент из 2 смежных областей генома вируса: фрагмент 5'-нетранслируемой области и фрагмент гена core. Схема расположения праймеров для ПЦР приведена в Таблице 1.

Рестрикция амплификатов выполнялась в соответствии с рутинной методикой (Sambrook et al., 1989). Ферменты рестрикции: Нра II, Sma I, Xho I. Анализ рестрициро-ванных фрагментов проводили в 3,5% агарозном геле (агароза фирмы "Carl Roth GMBH + Со Karlsruhe", ФРГ).

Клонирование фрагментов геиома ВГС.

В работе была получена серия векторов, несущих фрагмент генома ВГС с координатами 411—625"н.о. Для создания векторов тотальная РНК была выделена ГТЦ-мето-дом из сывороток крови четырех независимо инфицированных ВГС пациентов. Полу-

:нная РНК использовалась в РТ-ПЦР, которую проводили по приведенным выше эотоколам. Синтез заданного фрагмента в ПЦР направлялся праймерами С и D. Нук-ютидные последовательности и координаты праймеров приведены в Таблице I, раз-:л 1. Амплифицированные фрагменты длиной 215 п.о. были элюированы из геля мето-)м замораживания в жидком азоте и встроены в Smal сайт вектора pBluescript II SK+. 1тамм E.coli XLl-Blue трансформировали лигазной смесью; рекомбинантные колонии бирали в бело-голубом тесте и использовали для получения однонитевой плазмидной НК и последующего определения нуклеотидной последовательности вставки.

Все этапы клонирования проводили стандартными методами генной инженерии rambrook et al, 1989).

Получение однонитевой копии рекомбинантной ДНК

К 200 мкл ночной культуры рекомбинантного штамма XLl-Blue, трансформиро-iHHoro вектором, несущим геномный фрагмент ВГС с координатами 411—626 н.о. , >бавляли равный объем суспензии хелперного бактериофага М13К07 с титром 10|г видных частиц в мл. Смесь инкубировали 15 мин. при комнатной температуре и добавля-1 к 20 мл питательного бульона 2xYT. После инкубации в течении 3 часов при 37°С к гльтуре добавляли канамицин до концентрации 70 мкг/мл и растили 18 часов при •ггенсивном перемешивании. Культуру осаждали центрифугированием, к надосадоч-зй жидкости (20 мл) добавляли 6 мл раствора, содержащего 2,5М NaCl и 20% ПЭГ 000, и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре. Фаговые частицы осаждали :нтрифугированием 12 000 об/мин в течении 20 мин. при +4°С. Осадок растворйли в Ю мкл буфера ТЕ, рН 7.5. ДНК экстрагировали фенол/хлороформом и осаждали эта-элом. Осадок растворяли в воде; 1 мкл раствора ДНК использовали в реакции секве-фования.

Определение нуклеотидной последовательности

Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов определяли методом энгера (Sambrook et al, 1989) с модификациями, которые заключались в использова-т термостабильной ДНК полимеразы и проведении реакции в 5 циклов при термаль->м профиле: 92°С 1 мин., 50°С 1 мин., 72°С 3 мин. Модификации были введены для умень-ения интерферирующего влияния GC-богатых участков, характерных для секвенируе-эго фрагмента. Определение последовательности проводили от меченых праймеров: [иверсального праймера к последовательности фага М13 серии шр и праймера D.

Статистическая обработка результатов исследования проведена на персональном >мпьютере IBM PC 486DX4-100 с использованием программного пакета для статис-иеского анализа MICROSOFT EXCEL 6.0 и включала в себя определение средних ве-гчин показателей (М); расчет стандартных ошибок средних величин этих показателей i); выявление достоверности различий показателей в сравниваемых группах с исполь--ванием t-критерия Стьюдента (различия считались достоверными при вероятности 95% <0.05 и выше) (Лакин, 1980).

Выбор праймеров для амплификации проводился с использованием компьютерной юграммы "Primer-Master 1.1", разработанной в лаборатории молекулярной вирусолога и генной инженерии НИИ гриппа РАМН (Proutsky et al., 1994).

Моделирование третичной структуры фрагмента пептидной последовательности продалось с использованием программ "DNA-SUN", "HAMOG", "Nukleo" (последняя раз-ботана в лаборатории молекулярной вирусолоши и генной инженерии НИИ гриппа VMH).

s

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методов амплификации и генотшшрованпя фрагментов генома ВГС из сыворотки крови инфицированных пациентов

1.1. Стратегия выбора праймеров для РТ-ПЦР детекшга ВГС

Эффективная амплификация фрагментов генома РНК-содержащих вирусов возм на в том случае, когда подобраны оптимальные условия для проведения трех после нательных этапов: выделения РНК, синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реаю обратной транскрипции (РТ) и собственно завершающего этапа анализа — амшш кации кДНК в ПЦР. Поэтому, эффективное проведение ПЦР зависит от ряда клк вых параметров и условий, важнейшими из которых являются: во-первых, оптимал подобранные праймеры, обеспечивающие специфическую амплификащт фрагмен генома; во-вторых, подбор условий самой реакции, таких как состав буфера, врем! и температуры отжига праймеров, количества проводимых циклов.

Выбранные для тестирования инфекционного агента праймеры должны соотп ствовать критериям, впервые сформулированным Эрлихом (ЕгНсЬ, 1989). Кроме -л мы ввели следующие критерии: I) отсутствие образования возможных вторичных стр тур праймерами; 2) выбранные праймеры должны обладать максимальной энерг взаимодействия (дО) в сайте связывания праймера с матрицей; 3) лучшим, при вы ре, считается праймер, имеющий возможно большую разницу дй в специфичеа месте посадки по сравнению с неспецифическим. Последний пункт обеспечивает от наиболее специфичных праймеров из числа возможных. Для автоматизации поиска пр меров в лаборатории генной инженерии и молекулярной вирусологии НИИ гри: РАМН была создана компьютерная программа "Рпшег-Майег 1.0".

Поиск праймеров проводился по нуклеотидным последовательностям ВГС, по ченнньгм из банка данных ЕМВЬ.

Поиск универсальных праймеров проводили в наиболее консервативном реги генома ВГС — 5'-нетранслируемой области. Для проведения двухступенчатой ПЦР б! подобраны две пары праймеров. Пара праймеров, используемых в первой стадии, 61 внешней по отношению ко второй паре праймеров. Из области поиска праймеров 61 исключены регионы, участвующие в формировании вторичной структуры 5'-нетра лируемой области (БШууег е1 а1., 1993). Универсальные праймеры, подобранные , амплификации 5'- нетранслируемой области генома ВГС, представлены в Таблице

Таблица 1. Используемые праймеры. Позиции приводятся по последовательно ВК 146, опубликованной Такамизавой (Такатката й.а!., 1991).

Праймеры Последовательность Ген Позиция

ls, прямой 5 'gEgasagccaraglggtctg 3' 5'-UTR 131-150

8 N/S ,обратный 54cccggggcactcgcaagca3' 5'-UTR 321-302

4 sпрямой 5'ggiclgcggaaccggtgagt 3' S'-UTR 145-164

10 N/S, обратный 5'ggcactcgcaagcaccciat 3' 5'-UTR 315-296

А, прямой 5' tagaccgtgcaccatgagc^' S'-UTR/ cor 315-334

В, обратный 5' ggtaicgatgaccaaccca3' cor 705 -696

С, прямой 5' ggtcagatcgttggtggagl 3' cor 411-430

■ D, обратный 5' gacaggagccatcctgccca3' cor 626—607

Е, обратный 5' atgtaccccatgaggtcggc 3' El 740 - 721

#32s, прямой 5' ctgtgaggaactactgtctlc 31 5'UTR 34-54

Для детекции ВГС достаточно подобрать универсальные праймеры, обеспечиваю-гае амплификацию всех последовательностей ВГС вне зависимости от генотипа. Но для енотипирования необходимо подобрать специфические праймеры, обеспечивающие мплификащло только одного генотипа ВГС. Нам не удалось подобрать специфические раймеры, обеспечивающие надежную детерминацию ВГС до субтипа.

Наиболее выраженные различия между штаммами возможно определить в гипер-ариабельной области генома ВГС (HVR1). Но эти различия настолько высоки даже у гтаммов, относящихся к одному субтипу, что проводить дифференциацию генотипов о данному фрагменту нуклеотидной последовательности представляется весьма затруд-ительным (van Doom, 1993). В то же время, ген core представляет собой более консер-ативную область генома, чем районы El и Е2, где расположена последовательность IVR.1, и позволяет более четко различать генотипы вируса, чем это возможно в 5'-не-ранслируемом районе (Okamoto, 1992). Поэтому, в качестве мишени для генотипиро-ания, нами был выбран ген core. Из предложенных программой "Primer Master" прай-[еров отобрали праймеры А, В, С, D (Табл. 1) для проведения двухступенчатой РТ-1ЦР, которые позволяют амплифицировать фрагмент гена core, в пределах которого аблюдаются различия сайтов рестрикции между субтипами ВГС.

1.2. Подбор условий амплификаипи Фрагментов генома ВГС из сыворотки крова

инфицированных папиептов

Подбор условий для проведения ПЦР отрабатывали на контрольной ДНК-матри-;е, содержащей фрагмент генома ВГС с координатами 30—1300 п.о. на основе вектора 'UC19 (матрица любезно предоставлена Ноландт, Национальный Раковый Центр, ФРГ), la этом этапе работы были использованы пары праймеров: А—В и С—D (см Табли-у 1). Температура отжига в эксперименте соответствовала расчетной (60'С), а оптималь-:ая концентрация ионов Mg++ , при которой происходит эффективная специфическая мплификация, была равна 4 мМоль, и существенно влияла на эффективность ампли-шкации. Увеличение или уменьшение концентрации магния на 1 мМоль приводило к отере эффективности амплификации, а при 2 и 6 мМоль продукты амплификации на лекгрофореграмме не определялись.

Отработка условий амплификации фрагментов генома ВГС из сыворотки крови

инфицированных пациентов в варианте двухступенчатой ППР.

Были отобраны 3 сыворотки от больных с диагнозом острый вирусный гепатит С, которых серологические маркеры других возбудителей вирусных гепатитов отсутство-али, а биохимически имелись яркие признаки холестатического и цитолитического индромов, указывающие на активную репликацию вируса. РНК из сывороток выделя-ась ГТЦ-методом. Экстракция РНК проводилась из двух объемов: из 400 мкл и из 100 мкт. 1ри этом мы полагали, что при низком уровне виремии целесообразно выделение из ак можно большего объема сыворотки.

Для проведения обратной транскрипции брали всю РНК после выделения и алик-оты, составляющие '/2 и '/3 части объема препаратов РНК Реакция обратной транс-рипции проводилась в двух параллельных сериях: в одном случае в качестве затравки интеза кДНК использовались специфические к РНК ВГС праймеры Е и #32 (см. Таб-ицу ,1), а в другом — случайные гексануклеотиды. Выбирая два праймера для синтеза ДНК, мы учитывали возможность обнаружения как плюс- так и минус- цепей РНК. В [ЦР брали аликвоты кДНК-смеси, равные 1/10, 1/5 и 1/2 частям объема.

При экстракции РНК из 400 мкл сыворотки ни в одном из вариантов амплифика-ы не определялись. При экстракции РНК из 100 мкл сыворотки наиболее эффектив-ая амплификация достигалась при использовании 1/3 части объема выделенной РНК 1/5 части объема кДНК-смеси. Не отмечено заметных различий в эффективности ре-

акции обратной транскрипции при использовании случайных гексануклеотидов и. специфического праймера.

Аналогичные результаты были получены при использовании универсальных пра меров для амплификации фрагмента 5'-нетранслируемой области #ls — #8N/S и #4s #10N/S.

Чувствительность РТ-ПЦР детекции была определена с использованием РНК ВГ синтезированной in vitro. Ряд десятикратных разведений РНК с концентрацией, равно в пересчете на вирусные частицы, 2 • 104—2 • 101 частиц в образце объемом 10 мкл, бы использованы в РТ-ПЦР реакциях. Специфический фрагмент обнаруживался в проба содержащих вплоть до 2 • 101 частиц. Предельная концентрация вирусных частиц, выя ляемая в данном анализе, составляет примерно 2 • 103 частиц в 1 мл сыворотки.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно сделать несколь: заключений, касающихся оптимизации условий проведения амплификации РНК ВГ

1. Экстракцию РНК ВГС ГТЦ-методом следует проводить из 100 мкл сыворотки

2. В реакции обратной транскрипции следует использовать не всю РНК, получе: ную из 100 мкл сыворотки, а 1 /3 часть ее.

3. Наилучшая амплификация в варианте двухступенчатой ПЦР достигается п] использовании 1/5 части кДНК-смеси.

В дальнейшем РТ-ПЦР проводилась в соответствии с подобранными условиям которые приводятся в соответствующем разделе главы "Материалы и методы".

Отработка условий амплификации фрагментов генома ВГС из сыворотки крови

инФинированных пациентов в одноступенчатой ППР.

После того, как были подобраны условия для проведения двухступенчатой Ш для амплификации фрагментов из сыворотки больных вирусным ГС, нами была пре, принята попытка проведения амплификации с использованием только одной пары пра; меров с максимально возможным количеством циклов реакции (45 циклов), при кот ром еще обеспечивается синтез амплификата. Последнее условие мы пытались обесп чить используя 2-3 кратное количество праймеров и термостабильной ДНК-полимер зы. Для этой цели были отобраны две сыворотки, в которых в варианте двухступенч той ПЦР были выявлены фрагменты генома ВГС. Для использования в реакции обра ной транскрипции были выбраны аликвоты, равные 1/5, 1/7 и 1/8 частям объема пр паратов РНК. В дальнейшем, в ПЦР реакцию бралась половина объема получение кДНК-смеси и весь ее объем. Амплификация проводилась с праймерами С — D. Бы; проведено 45 циклов ПЦР. Наилучшая амплификация достигалась при использоваш 1/5 части объема РНК и 1/2 части объема кДНК-смеси.

Затем нами было проведено тестирование 10 образцов, положительных в двухст пенчатой ПЦР. Только 7 проб из 10 оказались положительными при проведении одн< ступенчатой ПЦР. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод том, что использование одноступенчатой ПЦР для определения ВГС приводит в ря, случаев к ложноотрицательным результатам.

1.3. Разработка системы генотипирования на основе анализа полиморфизма длин

рестрипярованкых фрагментов.

Праймеры А, В, С, D, описанные в разделе 1.1, позволили амплифицирова' фрагмент гена core, в пределах которого наблюдаются различия между субтипами ВГ< Проведенный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей (програми DNA-SUN) не позволил выявить уникальные сайты рестрикции, однако оказалось, ч' показать генотипические отличия возможно при использовании определенного набо) рестриктаз (Таблица 2).

Таблица 2. Соответствие размеров рестрицированных фрагментов амплифицирован-ых последовательностей гена core генотипам ВГС, согласно классификации Окамото )kamoto et al., 1992)

-^Генотип I (П. О.) II (п. О.) Ill (П. О.) IV (п. о.) V (п. о.)

Hpail 60, 155 60, 155 29, 60, 127 --- 81, 134 77, 138

Smal 61, 154 61, 154 61, 154 --- --- ----

Xho I 92, 123 --- --- --- --- ---

На Рисунке 1 приведен пример генотипирования амплификата с использованием сработанной системы анализа полиморфизма длин ресгримированных фрагментов Restriction Fragment Length Polymorphism — RFLP). На электрофореграмме представ-:на проба с генотипом lb.

16 II. О. 50 п. о.

94 п. о.

1 2 3 4 5

-> ->

J i

t ; ' t

I

Рисунок 1. Генотипирование ВГС методом JRFLP. Амплифицированный фрагмент ВГС генотипа II (1Ь) был рестри-цирован следующими эндонуклеазами: ХЬо I (дорожка 2), Нра II (дорожка 3), Б та I (дорожка 5). Дорожка 4 — иерест-рицированный фрагмент, дорожка 1 — маркер молекулярного веса.

Предложенный метод может быть использован как первичный, позволяющий пробить генотипирование па этапе скрининга клинических проб.

2. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома ВГС, циркулирующего в С.-Петербурге. Компьютерный анализ полученных последовательностей, определение их генотшшческой принадлежности

Ранее отмечалось, что в настоящее время имеется единственная публикация, л священная выделению российского изолята ВГС и расшифровке фрагментов нуклеотк ной последовательности его генома (Вязов с соавт., 1994). В С.-Петербурге такие раЕ ты не проводились. Кроме этого, следует отметить, что работы по определению nocí довательности генома проводятся у нас в стране в небольших объемах и до сих пор б£ данных по нуклеогидным последовательностям ВГС, циркулирующих в России, вес ма ограничена и насчитывает единичные и фрагментарные последовательности.

Определение нуклеотидной последовательности изолятов ВГС было предприня также с целью подтверждения полученных результатов по генотипированию изолят ВГС методом RFLP.

Препараты РНК ВГС были получены от трех независимо инфицированных паи ентов. Для каждого изолята стандартным методом амплификации в варианте двухсл пенчатой ПЦР был получен фрагмент гена core, фланкированный праймерами С-(см.Табл. 1, раздел 1.1). Клонирование полученных амплификатов описано в разде "Материалы и методы". Для каждого амплификата были секвенированы по 4 клона д уменьшения вероятности ложного прочтения вследствие возможных ошибок на этап амплификации. С помощью RFLP-метода было проведено генотипирование данных и; лятов. Во всех трех случаях был определен генотип II (lb).

На Рис. 2 представлены результаты сравнения фрагментов нуклеотидных последо1 тельносгей полученных изолятов с фрагментами известных штаммов ВГС генотипа I (1 US-PT (Choo et al,1991), ВГС-Р (Вязов с соавт., 1994) и II (lb): китайского изол? HPCCGENOM (EMBL, L02836, Bi, 1992), японского изолята HPCHUMR (HCV-B Takamizawa et al.,1991) и двух индийских изолятов 1BI054,1В1192 (EMBLX91297, Х912! Panda, 1995). Последние два изолята были отобраны, как наиболее схожие с получе ными нами нуклсотвдными последовательностями, при поиске гомологий с помощ пакета программ "DNA-SUN". Как видно из Рисунка 2, полученные нами нуклеотс ные последовательности могут быть однозначно отнесены к генотипу II (lb). Они ик ют 88,2% гомологии со штаммами US-PT и ВГС-Р, что так же подтверждает принг лежность наших и сравниваемых изолятов к разным субтипам генотипа 1 (гомолог <90%) (Stuyver et al., 1993). С остальными штаммами наблюдается гомология >90%, ч свидетельствует о принадлежности всех штаммов к одному субтипу генотипа 1. Так, i мология со штаммом HPCCGENOM сотавила 94,0%, HPCHUMR — 96,9%, а со шта мами 1BI054 и 1В1192 от 98,2% до 96,9%. Между собой полученные изолята имеют i мологию от 98,2% до 99,4%, т.е. имеют высокий уровень гомологии.

С помощью пакета программ "DNA-SUN" нами была проведена трансляция noj ченной нуклеотидной последовательности. Гомология аминокислотных последовать ностей штаммов одного субтипа составила от 94,2% у HPCHUMR до 96,1% у IBI0: На Рисунке 3 приводится аминокислотная последовательность белка CORE, кодир] мая секвенированным в данной работе фрагментом нуклеотидной последовательное ВГС. Приведенная аминокислотная последовательность с 39 по 89 а.к. содержит ию нодоминантный участок, локализованный с 45 по 58 а.к. (Семилетов, 1995). На Рис иммунодоминантный фрагмент помечен выделением и подчеркиванием. Проводило сравнение аминокислотных последовательностей этого фрагмента изолятов 1ВЮ: HPCHUMR, HPCCGENOM с полученными нами. На Рис. 3 видно, что изол HPCHUMR отличается от "индийского" изолята 1BI054 в этой области 3 аминокислс ными заменами. Все проанализированные нами российские изоляты в 39 положен имеют замену Arg —> Pro.

82 ПРАЙМЕР С

GGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGrTGCCGCGCAGG

US-PT ВГС-Р

HPCCGENOM .......................................

HPCHUMR .......................................

1BI054 .......................................

1B1192 .......................................

SEQ106 -----------------------------------С....

SQ101T -----------------------------------е....

SEQFHC ----------------------------------С. . . .

121

GGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGT

г

.G.......

г . G....... •G....

. . G. г . G....... ........А.Т. • G. . . . .......................А

.. G. г .G.......

. .G. г ■ G.......

-81 Smal, Hpall AGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTCGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCGGG

.......G____

. . G. А .А....... .......Т..С. ....С .. .А.................

. .G. л

. .G. А .А.......

>. .G. и .А....... .......т..С. ....Т...G.................

SEQFHC. .G. .A. .A..............T.

,c.■..

Kpa-U

.T...G.

241

ПРАЙККР D

US-PT

ВГС-Р

HPCCGEN

HPCHUMR

1BI054

1B1192

SEQ106

SQ101T

SEQFHC

TACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTC

. . .T . .C. . . .C..

. .c..

. .c..

• TC. .

...Tt. ..Та.. ..Tg..

.CTg..

Рисунок 2. Сравнение фрагментов нуклеотидлых последовательностей некоторых штаммов ВГС генотипов I и И. Генотипы изолятов даиы в тексте. Нумерация дана от начала гена core. Выделением и подчеркиванием показаны сайты рестрикции для генотшшровання._

1BI054 38PRRGPRLSV№TRKTSBRSQERSRRQPIPKACRPEGRAWAQPGYPWPLYGNEGC 89

HPCHUMR ..........Р...................R.....Т...........

HPCCGENOM ..............................R.....Т...........

SEQ106 Р.............................R.................

SQ101T Р..............................................F

SEQFHC Р.............................R..................

Рисунок 3 Сравнение фрагментов аминокислотной последовательности некоторых изолятов ВГС генотипа 1Ь. Выделением и подчеркиванием обозначен иммунодомниантиый домен.__

В 69 положении Arg встречается во всех приведенных штаммах, кроме нашего из лята SQ101T, где находится Cys. Возможно, что Cys 69 этого изолята участвует в образ вании внутримолекулярных Cys-Cys сульфгидрильных связей (например с Cys90), и, ее. это так, то экспонирование этой области должно быть усилено, т.к. образуется петл содержащая кластеры положительно заряженных аминокислот. Наряду с этим, следу обратить внимание также на то обстоятельство, что остаток Cys 69 фланкирован осте ком лизина в 67 положении и аргинина в 70 положении у нашего изолята SQ101T и и дийского 1BIQ54. Наличие у остальных сравниваемых штаммов в 69 положении аргин на приводит к усилению положительного заряда в данном участке, что изменяет локал ную гидрофобность и повышает вероятность экспонирования данного участка на пове хности белка CORE. Наличие же цистеина в этом положении у SQ101T и 1BI054 осла ляет положительный заряд этого участка, что может повлечь за собой изменение ант генных свойств домена. В отношении других мутаций, в частности, тирозин -> фенил ланин (81), можно отметить, что они вряд ли имеют серьезные последствия для осно ных свойств белка CORE этих изолятов, т.к. гидрофобность домена остается неизменно Таким образом, впервые в С.-Петербурге определены фрагменты нуклеотидн] последовательностей трех изолятов ВГС, полученных от лиц российской популяци Установлено, что: 1) все три изолята относятся к генотипу II (lb), 2) характеризуют высокой генетической однородностью, 3) близки к индийским изолятам генотипа (lb), 4) подтверждена специфичность полученных в ПЦР фрагментов ВГС и дальне шего генотипирования полученных амплификатов методом RFLP.

3. Определение генотипов циркулирующих в С.-Петербурге штаммов ВГ с помощью метода полиморфизма длин рестрпкциоиных фрагментов амплификатов, и коммерческой тест-системы "INNO-LIPA HCV-H"

Нами было проведено изучение циркулирующих в С.-Петербурге генотипов BI во взаимосвязи с тяжестью течения болезни.

Методом RFLP был определен генотип ВГС у 22 больных. Распределение генот пов, согласно классификации Окамото (Okamoto et.al., 1992), имело следующую ка тину: у 6 больных был определен генотип I, у 15 — генотип' II, у 1 — генотип III, тог как генотип IV и V в этой группе больных обнаружен не был.

С помощью коммерческого набора "INNO-LIPA HCV II" ( Innogenetics Ю Belgium) генотип ВГС был определен также у 22 больных. В данном случае распредел ние генотипов имело следующую картину: генотип lb был тестирован у 11 пациенте генотип 2 — у 5 пациентов (в соответствии с инструкцией к набору, при наличии пер крестных реакций идентификация до субтипа не проводилась), генотип За — у 5 пац ентов, кроме того у одного больного была выявлена циркуляция одновременно дв генотипов, а именно: lb и За.

Для удобства анализа, полученные результаты сведены к классификации генот пов ВГС по Стайверу (Stuyver L., et al., 1993), одному из разработчиков коммерческо набора "INNO-LIPA HCV И" (Innogenetics N.V., Belgium). Распределение генотипов В1 среди обследованных больных представлено в Таблице 3.

Таблица 3. Распределение генотипов ВГС среди обследованных больных.

Генотип абс.число %

1а 6 13,6%

lb 26 59,1

2 6 13,6%

За 5 ■ 11,4%

1Ь+За 1 2,3%

всего 44 100,0%

4. Применение РТ-ПЦР в комплексной диагностике вирусных

гепатитов.

С октября 1994 г. по декабрь 1996 г. нами было проведено 1464 определения РНК ВГС юмощью РТ-ПЦР в сыворотке крови больных вирусными гепатитами. 495 проб (34%) азались положительными, в 969 (66%) фрагменты генома РНК ВГС выявлены не были. 51 исследование было первичным, 413 образцов исследовались повторно. Для характе-стики группы РНК ВГС позитивных больных была создана компьютерная база данных, ца заносились клинико-анамнестические, биохимические и серологические данные.

Для характеристики серологического профиля больных нами были отобраны 518 циентов, у которых в сыворотке крови отсутствовали ДНК ВГВ и РНК ВГД на мо-нт определения РНК ВГС. У 35 из них был определен гепатит неустановленной эгио-гии, но РНК ВГС была обнаружена у 20 пациентов, т.е. пациенты с гепатитами неус-говленной этиологии более чем в половине случаев оказались РНК ВГС позитивны.

Из 518 больных 214 (41,3 %) были РНК ВГС позитивны. Полученные результаты ли систематизированы для анализа в следующие группы: а) пациенты, у которых зутствовали серологические маркеры вирусных гепатитов, но определялась РНК ВГС 5Т-ПЦР; б) пациенты, у которых отсутствовали серологические маркеры ВГС-ин-кции, но определялись серологические маркеры гепатитов В, Д, и/или А при обнажении в сыворотке только РНК ВГС; в) пациенты с наличием серологических мартов как ГС, так и других вирусных гепатитов, при наличии РНК ВГС в сыворотке ови; г) пациенты с наличием серологических маркеров только ГС при наличии РНК С в сыворотке крови.

а) У пациентов с клиникой вирусного гепатита и наличием РНК ВГС в сыворотке ови отсутствовали серологические маркеры вирусных гепатитов А, В, С, Д и Е в 9,3% »чаев. Детекция РНК ВГС в сыворотке крови этих больных позволила выявить зтио-гию вирусного гепатита. У 6 из 8 пациентов в этой группе были выявлены антитела к С в срок от 14 дней до 10 месяцев после выявления РНК ВГС, что подтвердило зти-эгию вирусного гепатита, установленную методом РТ-ПЦР.

б) У 26 пациентов с наличием антител к вирусам гепатитов В и А, детекция РНК С позволила выявить коинфекцию вирусом гепатита С. У 5 пациентов с вирусным гагатом А и наличием РНК ВГС антитела к ВГС были выявлены в срок от 7 до 32 ей после РТ-ПЦР обследования, на второй волне заболевания.

в, г) У РНК-ВГС позитивных больных серологические маркеры одновременно к В и ВГС определялись в 50,9% случаев, в то время как антитела только к ВГС определись в 21,1% случаев. У больных с наличием РНК ВГС в сыворотке крови и антитела-только к ВГС не было выявлено статистически достоверных отличий клинико-лабо-горных показателей при сравнении с группой больных вирусным гепатитом В. При ногепатите С с наличием РНК ВГС преобладают хронические формы вирусного ГС )% случаев), причем первично-хронические формы выявлялись в 44,4% случаев.

Проведено выделение РНК ВГС из биоптата печеночной ткани. В дальнейшем, дан-;й метод может быть применен при уточнении диагноза и для решения вопроса о реп-кативной активности ВГС.

Среди 6 обследованных новорожденных и их матерей РНК ВГС в сыворотке крови ределена у одного, мать которого к моменту исследования была РНК ВГС негатив, что подтверждает возможность вертикальной передачи ВГС.

5. РТ-ПЦР, как один из методов оценки эффективности

противовирусной терапии.

РТ-ПЦР-мониторинг проводился за группой из 56 больных с диагнозом острый эусный гепатит С. Из них 42 больных получали на фоне базисной терапии азидоти-

мидин (основная группа) и 14 были включены в группу сравнения, с аналогичной те рапией, но без азвдотимидина.

Лечение азидотимидином было начато в разгар заболевания и продолжалось в тече нии 21 дня. У всех больных РТ-ПЦР мониторинг осуществлялся в динамике: фон, на 1 день приема препарата, 22 день, через 1,3 и 6 месяцев после окончания лечения. Рутинны биохимические и серологические исследования проводились как в момент пребывани в стационаре, так и в период амбулаторного наблюдения. В серологическое исследование кроме общепринятых, было включено исследование анти-HCV core IgM в ИФА.

После окончания курса лечения (¡22 день) статистически значимые различия в срав ниваемых группах обнаружены только в,активности АлТ: 3,4±1,6 и 8,8±1,6 ммоль/ч.х Вместе с тем, в группе пациентов, получавших препарат, РНК ВГС выявлялась в 425 случаев, а в контрольной группе — в 86%.

Через один месяц после окончания курса терапии у 66% больных основной ipyn пы сохранялись повышенные значения уровня билирубина и активности АлТ и досто верно не отличались от таковых в контрольной группе. В то же время, через 1 месяц поел окончания терапии РНК ВГС в РТ-ПЦР в основной группе выявлялась только в 39 случаев. В контрольной группе в этот же период РНК ВГС выявлялась в 57% случаев ( пациентов). Этот факт позволяет сделать вывод об эффективном подавлении реплика ции ВГС азидотимидином у больных острым гепатитом через один месяц после окон чания курса терапии. Антитела класса IgM к белку CORE, как маркер текущей инфек ции, определялись в течении первых 2 месяцев у 19 из 42 больных (45,2%), а у осталь ных они не выявлялись. Суммарные антитела к структурным и неструктурным белка! вируса сохранялись во все сроки обследования.

Через 3 и 6 месяцев после окончания противовирусной терапии в группе получав ших азидотимидин больных наблюдалась нормализация уровня билирубина крови. РН1 ВГС выявлялась у одного больного (3% случаев).

Через 6 месяцев у 41 больного основной группы по клиническим и биохимичес ким данным отмечено выздоровление. В контрольной группе формирование хроничес кого вирусного ГС наблюдалось в 29% случаев (4 пациента). У этих пациентов стой» выявлялась РНК ВГС.

Таким образом, окончательный' вывод об эффективности проведенной терапи: больных с острым вирусным ГС по результатам клинико-биохимического обследовани можно было сделать только по прошествии 6 месяцев после окончания курса, в то вре мя как РТ-ПЦР мониторинг уже к моменту окончания приема препарата позволи выявить тенденцию на успех терапии-

РТ-ПЦР мониторинг также осуществлялся за группой из 27 человек с диагнозо) хронический вирусный гепатит С, получавших азидотимидин. У всех больных определя лась РНК ВГС в РТ-ПЦР. Из исследования были исключены больные с микст-гепатита ми, у которых выявлялись маркеры ВГВ, ВГД или В ГА Больным хроническим гепати том азидотимидин назначался 2 курсами по 21 дню каждый с интервалом в 2-3 недели У 18 больных хроническим вирусным ГС через 6 месяцев РНК ВГС не выявлялась и была отмечена положительная динамика с нормализацией клннико-биохимически показателей, а у 9 больных спустя 3 и 6 месяцев продолжала выявляться РНК ВГС npi гиперферментемии на фоне нормализации уровня билирубина. У этих же 9 больных дли тельно выявлялись анти HCV core IgM. „

Можно сделать вывод, что метод РТ-ПЦР позволяет осуществлять контроль з эффективностью проводимой терапии. Учитывая это, мы рекомендуем включать дан ное исследование в комплекс проводимых тестов при проведении противовирусной те рапии - г— ГС. При хроническом вирусном ГС РТ-ПЦР мониторинг подтвердил мень шую эффективность терапии азидотимидином.

ВЫВОДЫ

1. Разработана система РТ-ПЦР-диагностики ВГС, а так же геноти-пирования та основе анализа полиморфизма длин рестрицированных фрагментов амплификатов. Показано, что определение РНК ВГС в клинических эбразцах следует проводить в двухступенчатой ПЦР.

2. Впервые в С.Петербурге определены фрагменты нуклеотидных пос-тедовательностей трех изолятов ВГС, полученных от лиц российской по-гулящга. Установлено, что все три изолята относятся к генотипу II (1Ь), ¡арактеризуются высокой генетической однородностью, близки к индийс-«ш изолятам генотипа II (1Ь).

3. В результате проведенного генотшгарования установлено, что в Занкг-Петербурге частота выявления генотипов ВГС составила: 1а -13,6%, Ь — 59.1%, 2 — 13,6% и За — 11,4%. Показана возможность инфицирова-шя ВГС сразу двух генотипов.

4. Применение РТ-ПЦР в ряде случаев является единственным методам, позволяющим выявить этиологию заболевания при неверифицирован-[ых гепатитах.

5. Применение РТ-ПЦР подтвердило возможность вертикальной передачи ВГС.

6. Метод РТ-ПЦР позволяет осуществлять контроль за эффективнос-ыо проводимой терапии. Использование этого метода позволило показать спешность лечения азидотимидином больных с острым гепатитом С. При ровическом вирусном гепатите С РТ-ПЦР-мониторинг подтвердил мень-хую эффективность такой терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. T.Bekhtereva, K.Tarasov, E.Yinogradova, LPiskarev, A.Yakovlev, O.Kiselev. Detectioi of hepatitis С viral sequences in serum of the patients with acute hepatitis by PCR. Abstr. Progres in Clinical Virology, 1994 Joint Meeting, Stockholm, Swceden, August 1994.

2. KTarasov, T.Bekhtereva, M.Pisareva, E.Vinogradova.The Distribution of Hepatitis С Viral Genotypes in St.Petersburg Area: Approaches and Prospects. Thesis of IX Triennia International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, B220, Rome, Italy, April 1996

3. K.Tarasov, T.Bekhtereva, M.Pisareva, E.Vinogradova, O.Kiselev. Detection and stud of HCV by PCR. Abstracts Xth International Congress of Virology, PW31-7, Jerusalem, Israel August, 1996

4. Грудинин М.П. Виноградова E.H., Писарева M.M.,Тарасов К.В., Иванюшина В.А Решетникова О.Ю., Рыжова Е.В., Бехтерева ТА, Романова С.Ю., Семенов С.Н, Шелухина В.Р., Пискарев И.Г., Каторгина Л.Г., Яковлев А.А., Киселев О.И. Полиме разная цепная реакция как один из компонентов комплексной диагностики вирусны гепатитов. — В сб.: Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции., Ст.-Петербург "ССЗ",т.1, 22-32, 1997

5. Грудинин М.П. Виноградова Е.Н., Романова С.Ю., Иванюшина В.А., Рыжов Е.В., Писарева М.М.,Тарасов К.В., Решетникова О.Ю., Пискарев И.Г., Комарова А.Я Алексеева М.Н.,Семенов С.Н., Яковлев А.А., Киселев О.И. ПЦР в диагностике re патита Дельта.- В сб.: Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции., Ст.-Петер бург, "ССЗ",т.1, 32-40, 1997

6. Киселев О.И., Яковлев А.А., Виноградова Е.Н., Грудинин М.П., Бехтерева Т.А Тарасов К.В., Писарева М.М. Распространение генотипов вируса гепатита С в Санкт Петербурге и их клиническая характеристика. — В сб.; Вирусные гепатиты и друга актуальные инфекции., Ст.-Петербург, "ССЗ",т.1, 53-61, 1997.

7. C.JL Мукомолов, А.А. Яковлев, А.А. Колобов, В.А. Плотникова, Е.Н. Винограде ва, Е.А. Кампе-Немм, В.М. Шпень, КВ. Тарасов, Л.Г. Ермолаева. Диагностическое зна чение определения антител класса IgM к ядерному белку вируса гепатита С. . — В сб Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции., Ст.-Петербург, "ССЗ",т.1, 61 70, 1997.

8. Мусатов В.Б., Фирсов С.Л., Грудинин М.П., Тарасов К.В. Опыт использовали полимеразной цепной реакции в практике работы городской инфекционной больниць — В сб. материалов II Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний", Москва, январь, 199i с.81.