Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты"

На правах рукописи

МАТЫС СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

ДЕ1 РАДАЦИЯ МЕТИЛФОСФОНАТА Е. COLI: ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ACIIEK IЫ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

Пущино - 2003

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор М. А. Несмеянова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. А. Головлева

доктор биологических наук, профессор Г. А. Жариков

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Защита состоится

2003 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан »ьМ/Н £ 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного

совета, доктор биологических наук В. М. Вагабов

2 oo?-f\ tS cog

Актуальность проблемы. Фосфорорганические соединения, имеющие углерод-фосфорную связь (С-Р) - фосфонаты, широко распространены среди природных соединений во всех царствах живых существ, а так же среди химических веществ антропогенного происхождения - ксенобиотиков, бесконтрольно поступающих в окружающую среду и становящихся ее токсикогенным фактором. Углерод-фосфорная связь, особенно неактивированная С-Р связь алкилфосфонатов, очень устойчива к химическому гидролизу, термальному разрушению и фотолизу и расщепляется только прокариотическими микроорганизмами за счет функционирования фермента С-Р лиазы. Однако в отличие от ферментов, разлагающих фосфонаты с активированной С-Р связью (такие как фосфоноацетат и аминоэтил фосфонат), которые выделены и хорошо охарактеризованы, С-Р лиаза функционирует только в интактных клетках. Обнаружить ее в бесклеточных экстрактах пока достоверно не удалось, фермент до сих пор не выделен и не изучен, а механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути не известен. Понимание механизма биодеградации алкилфосфонатов является, таким образом, актуальной задачей современной биохимии и биотехнологии. Не смотря на то, что способность бактерий использовать алкилфосфонаты в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно (Zeleznick et a I., 1963; Harkness, 1966; Cook et al., 1978; Wackett et al., 1987; Lee et al., 1992), особенно большой интерес к их деградации бактериями возник лишь в последние годы, в связи с экологическими проблемами, особенно, в связи с всемирной программой уничтожения химического оружия, в состав которого входят соединения с С-Р связью.

В настоящее время достаточно интенсивно проводится скрининг микроорганизмов, способных к деградации Pn (Hidaka et al., 1990; Kamigiri et al., 1992; Nakashita et a/.,2000). Большое внимание уделяется генетической характеристике системы. Гак, у Е. coli проведено картирование и молекулярное клонирование phn(psiD) генов, ответственных за С-Р лиазную активность, а также их мутационный анализ (Wanner and Boline, 1990; Metcalf and Wanner, 1993). Показано, что за использование фосфонатов клетками Е. coli отвечает кластер из 14 генов - одна из наиболее крупных транскрипционных единиц Е. coli, а экспрессия некоторых из них контролируется РЬо-регулоном (Wackett et al., 1987). Между тем, понять механизм разложения апкилфосфонаюв по С-Р лиазному пути и иденитифицировать С-Р лиазную активность in vitro невозможно без знания физиологической и биохимической регуляции этого процесса в клетках бактерий. Однако систематических исследований в этом направлении практически не проводилось.

Цель настоящего исследования - выявить физиологические и биохимические особенности разложения алкилфосфонатов бактериями на примере грамотрицагельной бактерии Escherichia coli. У этой бактерии впервые была выявлена способность разлагать алкилфосфонаты и хорошо изучена 1енетическая система, контролирующая этот процесс. В качестве

модельного субстрата использовали метилфосфонат (Рп), как типичный алкилфосфонат.

В задачи исследования входили:

1) сравнительный анализ разложения Рп различными штаммами Е. coli-,

2) изучение особенностей адаптации клеток Е. coli к Рп;

3) селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп;

4) поиск физиологических и биохимических факторов, влияющих на разложение Рп различными штаммами Е. coli;

5) изучение разложения Рп рекомбинантными штаммами Е. coli, содержащими клонированные гены С-Р лиазного комплекса, кодирующие этот процесс;

6) выявление белков С-Р лиазного комплекса и изучение их локализации.

Научная новизна работы. В данной работе впервые показано, что

длительный латентный период при выращивании клеток на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора, связан с адаптацией клеток к Рп, которая подробно изучена. Показано, что адаптация происходит эффективнее при 30° С, чем при 37° С, но не зависит от его концентрации и сопровождается изменением физиологических и морфологических характеристик клеточной популяции. Впервые проведена селекция адаптированных клеток, что на порядок повышает скорость разложения Рп и рост клеток на этом субстрате. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli: возраст культуры, температура культивирования, аэрация, pH среды и УФ-лучи. Определены оптимальные условия для разложения Рп: низкое парциальное давление кислорода, 30°С, рН=8 и логарифмическая стадия роста культуры.

Путем анализа белкового состава рекомбинантных штаммов с клонированными в плазмидах генами С-Р лиазного комплекса впервые выявлены белки этого комплекса и их распределение между субклеточными фракциями. Впервые установлено, что повышенный синтез белков С-Р лиазного комплекса в условиях индукции кодирующих генов не приводит к увеличению активности С-Р лиазы и разложения Рп, что свидетельствует о существовании факторов неизвестной природы, лимитирующих этот процесс и не связанных с количеством белков С-Р лиазного комплекса.

Поиск этих факторов позволит не только повысить его эффективность, но и понять его механизм.

Научно-практическое значение работы. Полученные в работе новые данные расширяют представление о физиологической и биохимической регуляции процесса разложения алкилфософнатов клетками бактерий, что послужит основой для оптимизации биосинтеза С-Р лиазы и ее дальнейшего исследования in vitro с целью понимания механизма разложения алкилфосфонатов. Результаты могут быть полезны при разработке биотехнологии для биоремедиации почв.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103

страницах, содержит 17 таблиц и 11 рисунков. Библиографический указатель содержит 141 источник литературы.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмов" (Москва, 1993), конференция "Биотехнология защиты окружающей среды" (Пущино,1994), Российская конференция "Новые направления биотехнологии" (11ущино,1994), конференция «Ферменты микроорганизмов. XI Всероссийская конференция» (Казань, 1998), International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (Pushchino, 2000), Seminar-presentation of scientific and technical innovation projects "Biotechnology-2000" (Pushchino, 2000), III съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), FEMS Congress of European Microbiologists (Slovenia, 2003). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 7 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных конференций.

Обзор литературы посвящен фосфонатам и их деградации микроорганизмами.

ПОДХОДЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная стратегия для решения задач, поставленных в настоящей работе, включала изучение разложения Рп различными штаммами Е. coli, которое оценивали по образованию метана - конечного продукта разложения Рп по С-Р лиазному пути, в газовой фазе культуры, выращиваемой на среде с Рп в качестве единственного источника фосфора. Содержание метана определяли с помощью газового хроматографа GCD (фирма «Pay Unicam»). В работе использовали штаммы Escherichia coli: Е. coli К12 и Е. coli К10 с диким типом Pho-регулона; мутанты по регуляторным генам Pho-регулона: Е. coli С4, Е. coli С90, Е. coli LEP1 и мутанты с делецией в структурном гене щелочной фосфа1азы: Е. coli Е15, Е. coli K.S272 и Е. coli K.S303; Для повышенного синтеза белков С-Р лиазного комплекса использовали рекомбинантные штаммы, содержащие плазмиды с клонированными генами С-Р лиазного комплекса: Е. coli BW11733 (Wanner and Boline, 1990), E. coli BW20736/pGYl (Yakovleva et al., 1998), E. coli BW20736/pGY3 (Yakovleva et al., 1998) и E. coli El5/ pGYl. Плазмиды и рекомбинантные штаммы были любезно предоствлены проф. Б. Ваннсром (Пурду Университет, США), штамм Е. coli Е15/ pGYl - был получен в ходе настоящей рабош.

Штаммы выращивали на минеральной среде (Torriani, 1966) и на среде LB (Sambrook, 1989). Для поддержания шшмид pBW120, pGYl и pGY3 использовали ампициллин (100 мкг/мл). Для индукции С-Р лиазы, находящейся под конфолем Pho-регулона, клетки Е. coli переносили на минеральную среду с Рп в качестве единственного источника фосфора, а для

индукции С-Р лиазы, находящейся под контролем lacTl промотора - в среду роста добавляли IPTG (1 мМ).

Выделение плазмидной ДНК и трансформацию клеток Е. coli проводили по протоколам, приведенным в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989).

Субклеточное фракционирование проводили по методу Миуры и Мицушимы (Miura, Mizushima, 1968), солюбилизацию мембранных белков проводили по методу Шнайтмана (Scnaitman, 1971).

Облучение клеток ультрафиолетом при длине волны 254 нм, поглощаемой Е. coli, проводили с помощью аппарата «Изолда» МФ-73М.

Электронную микроскопию тонких срезов проводили по стандартной методике.

Липиды экстрагировали по методу Эймса (Ames, 1968) и разделяли с помощью тонкослойной хроматографии в системе хлороформ : метанол : вода : гидроксид аммония (60:37,5:3,38:0,62 (v/v)) (Fine, Sprecker, 1982).

Электрофорез белков проводили в присутствии ДДС-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Активность щелочной фосфатазы определяли по скорости гидролиза ¿»-нитрофенилфосфата (Torriani, 1960).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Различные штаммы Е. coli разлагают метилфосфонат с образованием метана

Известно, что разложение Pn Е. coli по С-Р лиазному пути с образованием метана осуществляется С-Р лиазой, биосинтез которой контролируется экзогенным ортофосфатом и РЬо-регулоном (Wackett et al., 1987b). Мы подтвердили это, изучив разложение Рп в отсутствие других источников фосфора различными штаммами Е. coli с диким типом Pho-регулона, а также мутантами по его рсгуляторным генам в условиях фосфорного голодания.

Как видно из таблицы 1, все исследуемые штаммы за исключением одного способны использовать Рп для роста и образуют метан. Только штамм Е. coli LEP 1, имеющий мутацию в гене phoB, которая предотвращает индукцию белков РЬо-регулона при фосфорном голодании за счет утраты транскрипционного активатора (Makino et al., 1994), не разлагал Рп. Рост этого штамма на Рп также не обнаружен. Наоборот, штаммы с конститутивным РЬо-регулоном, Е. coli С90 и Е. coli С4 разлагают Рп даже более интенсивно, чем другие штаммы. Результаты подтверждают, что разложение Рп контролируется Pho-peryлоном.

Таблица 1. Рост и разложение Рп различными штаммами Е. coli

Штамм Е. coli On54„ Разложение Рп (метан,нмоль/ОП)

К 12 (wt) 0,570 175

К 10 (wt) 0,530 180

Е 15 (phoA") 0,350 270

KS 272 (phoA", Lp+) 0,260 245

С 4 (phoT+) 0,640 230

С 90 (phoT) 0,600 280

LEP 1 (phoB") 0,050 0

Примечание. Анализировали клетки через 72 часа инкубации в присутствие 0,5 мМ Рп, как единственного источника фосфора. В таблице представлены средние результаты пяти опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.

Мутанты Е. coli El5 и Е. coli KS272 с делецией в гене щелочной фосфатазы разлагают Рп даже с несколько большей скоростью, чем их изогенные родительские штаммы — Е. coli К10 и Е. coli К12. В то же время разложение Рп этими штаммами не сопровождается появлением активности щелочной фосфатазы. Таким образом, щелочная фосфа1аза не ответственна за разложение Рп, а С-Р лиаза не обладает активностью щелочной фосфатазы. Эти данные находятся в соответствие с данными, полученными ранее (Wackett et al., 1987а). Таким образом, тестируемое в наших экспериментах образование метана является следствием разложения Рп по С-Р лиазному пути.

2. В процессе инкубации клеток Е. coli с Рп происходит их адаптация к этому субстрату

В настоящей работе показано, что разложение Рп различными штаммами Е. coli начинается лишь после длшельного латентного периода (48-72 часа), что наблюдали и в более ранних работах (Quinn et al., 1989). Одной из наиболее вероятных причин этого может быть необходимость адаптации клеток к данному субстрату и образование адаптивных мутантов. Известно, что такие мушнты могут образовываться в условиях дефицита тех или иных питательных веществ и, особенно, в присутствии альтернативных исючников питания (Radiceila et al., 1995). Наличие в культуральпой среде Е. coli Рп с грудногидролизуемой С-Р связью в качестве единственного источника фосфора соответствуеi гаким условиям. Мы изучили динамику адаптации к Рп клеток Е. coli, анализируя образование метана через каждые сутки. Так, клетки Е. coli К12, неадаптированные к Рп, начинают pací и и разлагать этот субстрат только

через 48-72 часа инкубации. Однако, если клетки, преинкубированные на Рп затем перенести на свежую среду, они начинают расти и разлагают такое же количество Рп уже через 24 часа инкубации (рис.1). Результаты свидетельствуют, что в процессе преинкубации клеток на Рп происходит их адаптация к этому субстрату.

Нам представлялось важным выяснить, достаточно ли для появления адаптивных мутантов и индукции С-Р лиазы только фосфорного голодания, как для других белков РИо-рсгулопа, или для этого необходимо присутствие субстрата (Рп).

Время, час

100

Метан, нмоль/мл

Исходные клетки

Клетки после преинкубации на Рп

24 48 Время, час

Рис. 1. Динамика роста (А) и разложения Рп (Б) исходными и преинкубированными на Рп клетками Е. соИ К12

Клетки засевали с одинаковой плотностью (ОП=0,05).

Клетки Е. coli инкубировали в течение 72 часов на жидкой среде в условиях полного фосфорного голодания и на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора. После такой преинкубации клетки с одинаковой оптической плотностью и разведением переносили на агаризоваппую среду, содержащую Рп, и выращивали до получения

отдельных колоний в верхнем агаре. Предполагалось, что адаптированные клетки будут расти на твердой среде с Рп в отличие от неадаптированных клеток. Оказалось, что клетки, преинкубированные с Рп дают в 6 раз больше колоний, чем клетки преинкубированные в отсутствие этого источника фосфора (табл. 2). При этом клетки, инкубированные при полном фосфорном голодании, будучи перенесенными на жидкую среду с Рп, не росли и не разлагали Рп, в отличие от клеток, проинкубированных с Рп.

Таблица 2. Влияние условий фосфорного питаная на адаптацию клеток Е. coli Kl 2 к Рп

Условия фосфорного питания -Pi -Pi+Pn

Количество колоний на твердой среде с Рп 30 190

Разложение Рп на жидкой среде* (метан, нмоль/ОП) 0 230

ОП 0,03 0,35

Примечание. "Клетки инкубировали на жидкой среде с Рп в течение 6 часов. В таблице представлены средние результаты семи опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.

Таким образом, в присутствии Рп происходит адаптация клеток к этому субстрату, по-видимому, за счет селективного давления на клеточную популяцию, что и приводит к образованию адаптивных мутаций.

2.2. Концентрация Рп не влияет на адаптацию клеток к этому субстрату, а температура 30°С является оптимальной для процесса

Можно предположить, что концентрация Рп може! быть фактором, влияющим на скорость адаптации клеток к Рп. Например, при увеличении концентрации субстрата можно ожидать большего селекгивного давления на клеточную популяцию в условиях отсутствия других источников фосфора и таким образом, увеличению доли адаптированных клеток в общей клеточной популяции и, как следе [вие, увеличению разложения Рп этой популяцией. Чтобы проверить такое предположение, клетки Е. coli Е15 выращивали в течение 72 часов в присутствии различных концентраций Рп в качестве единственного источника фосфора и наблюдали динамику роста клеток и разложения ими Рп. Несмотря на то, чю концентрация Рп не оказывает существенного влияния на адаптацию в целом, при увеличении концентрации этого субстрата его слабое разложение начинается уже в первые 24 часа (рис.2).

Рост клеток

Разложение Рп

0.5-, 300 Г —

с0'3" / gilSO- I

o-l-,-,-,-■ ■ -У-1

■ 0,5 мМ Pn

□ 5 мМ Pn

□ 10 мМ Pn

0 24 48 72

0 24 48 72 Время, час

Время, час

Рис.2. Влияние концентрации Рп на рост клеток Е. coli Е15 и разложение ими Рп

Клетки засевали с начальной 0п=0,05.

Большинство бактерий-деструкторов алкилфосфонатов являются представителями грамотрицательных бактерий (Schowanek and Verstraete, 1990). Многие из них являются почвенными бактериями, растущими при 30°С (Parker et al., 1999). Не исключено, что эта температура является наиболее оптимальной для адаптации к этому субстрату в почве и для разложения Рп. Действительно, сравнение динамики разложения Рп клетками Е. coli El 5 и их роста при 30°С и 37°С показало (рис. 3), что при температуре 30°С клетки росли более интенсивно и разлагали этот субстрат уже через 24 часа инкубации. Удельное разложение Рп при 30°С в 2 раза выше, чем при 37°С, характерной для Е. coli.

0.6 -| 0.5 -

Рост клеток

350-, л 300 •--ВС 250---

1 * 20°- ■ I

g §150 ИтИ'

2 § 100---(- Л-

1 50+-г!" г

и зо° с оЛЛлЛг

□ 37° С 48 72

Разложение Рп

ОП 0.4 -

0.3 -

0.2 -

0.1 -

0 -

Время, час

Время, час

Рис. 3. Влияние температуры на рост клеток Е. coli Е15 и разложение ими Рп

Клетки засевали с начальной 0п=0,05.

2.3. Выявлена гетерогенность популяции клеток в процессе их адаптации к Рп

Анализ клеточной популяции в процессе адаптации клеток к Рп выявил наличие клеток, образующих мелкие и крупные колонии. При этом увеличение количества клеток, дающих крупные колонии в процессе адаптации, сопровождается повышением разложения Рп общей популяцией клеток (табл.3). Для разных штаммов Е. coli деградативная активность клеток крупных и мелких колоний могла отличаться или быть одинаковой. Так, у Е. coli KS 272 клетки, образующие крупные колонии, разлагают Рп в 1,6 раз интенсивнее клеток, образующих мелкие колонии, тогда как у Е. coli El5 существенной разницы между продуктивностью этих двух типов клеток не наблюдается. В дальнейшем, в качестве адашированных использовали клетки, дающие крупные колонии, то есть, способные более быстро расти на твердой среде в присутствие Рп.

Таблица 3. Динамика популяции клеток Е. coli EIS в процессе их адаптации к Рп

Условия

фосфорного Pi Рп Разложение Рп

питания (метан,

Время адаптации Крупные Мелкие Крупные нмоль/ОП)

(сутки) колонии колонии колонии

1 160 136 0 50

2 216 66 48 140

3 207 46 145 195

В таблице представлены средние результаты шести опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%

С помощью электронной микроскопии выявлена также морфологическая гетерогенность популяции клеток в процессе их адаптации к Рп (рис.4). Одни кле!ки полностью или частично лизируются, другие - интактные клетки, имеют гомогенную цитоплазму и многослойную оболочку с расширенной периплазмой. При этом у части этих клеюк (1:6) наблюдакмся инвагинации мембран с липидами в гексогональной фазе (рис.4). Образование дополнительных мембранных структур связано, возможно, с биогенезом многокомпонентною С-Р лиазного комплекса.

0,2 мкм

Рис.4. Морфология клеток E.coli Е15 после адаптации к Рп

На рисунке представлены клетки после инкубации на среде с Рп в течение 72 часов

3. Селекция адаптированных к Рп клеток повышает скорость разложения клетками этого субстрата

Крупные колонии были отобраны как адаптированные клетки и изучены их некоторые физиологические и биохимические свойства.

Во-первых, отобранные адаптированные клетки разлагают Рп и начинают расти на нем уже в первые часы инкубации в отличие от общей популяции адаптированных клеток (рис.5). Во-вторых, они приобретают способность разлагать эфиры метилфосфоповой кислоты, такие как изопропиловый и пинаколиловый. И, наконец, они сохраняют эти свойства при длительном хранении и пересевах.

Рост клеток на Рп

Разложение Рп

0.3 -I

300

с о

0.2

0.1

О

2 1

0 1 2 3 4 5 6 7

0 1 2 3 4 5 6 7

Время,час

Время, час

Рис. 5. Динамика роста и разложения Рп: исходные клетки (1), общая популяция адаптированных к Рп клеток (2) и селектированные адаптированные (3) клетки Е. соН Е15

Клетки засевали с начальной ОП=0,05

Мы исследовали разложение Рп, находящегося в среде в концентрации 0,5мМ, эквивалентной количеству ортофосфата, потребляемого клеткой на этой среде. Однако даже адаптированные клетки разлагают не более 30 -40% от этой концентрации Рп. В настоящей работе мы показали, что неполное разложение Рп не связано с токсичностью субстрата или накоплением в среде ортофосфата. При снижении концентрации Рп в среде полнота его разложения увеличивается при сохранении той же скорости роста клеток и разложения Рп. На среде, содержащей ортофосфат (Pi), адаптированные клетки растут быстрее, чем на Рп, свидетельствуя, что Pi остается для них, по-прежнему, наиболее предпочтительным источником фосфора.

4. Выявлены физиологические и биохимические факторы, влияющие на разложение Рп различными штаммами Е. coli

Из-за трудностей выделения и тестирования С-Р лиазной активности вне клетки механизм разложения Рп с помощью С-Р лиазы не изучен. Однако гипотетические схемы этого процесса (Frost et al, 1987; Corderio et al., 1986) предполагают либо окисление Рп по первому углеродному атому, связанному непосредственно с фосфором, путем включения атомарного или молекулярного кислорода в это положение в аэробных условиях роста, либо редокс-зависимое свободно-радикальное дефосфорилирование

алкилфосфонатов. Ни тот, ни другой механизм не имеют пока веских экспериментальных доказательств, хотя существование второго механизма более вероятно с учетом природы известных интермедиатов этого процесса (Frost et al., 1987). Независимо от деталей предполагаемых механизмов

аэрация и pH среды должны иметь для них существенное значение. Однако в настоящее время сведения о роли аэрации в этом процессе практически отсутствуют, а имеющиеся — противоречивы.

4.1. Низкое парциальное давление кислорода является оптимальным условием для разложения Рп

Для оценки роли аэрации в процессе разложения Рп в настоящей работе проведен детальный анализ влияния дозированных порций кислорода на разложение Рп клетками Е. coli El5, адаптированными к Рп (габл.4). Этот анализ показал, что содержание кислорода существенно не влияет на разложение Рп, лишь слабо подавляя этот процесс и рост культуры по мере увеличения концентрации кислорода. Однако если культура продувается кислородом под давлением в 2 атм наблюдается более заметное снижение разложения Рп (в 1,7 раз), что коррелирует с ослаблением роста культуры. Азот в аналогичных условиях еще больше подавляет этот процесс (в 4 раза), не влияя, однако, на рост культуры в большей степени, чем кислород. Таким образом, для разложения Рп наиболее благоприятны микроаэрофильные условия (т.е. низкое парциальное давление кислорода), создаваемые в условиях герметически замкнутого пространства с воздухом в газовой фазе.

Таблица 4. Влияние аэрации на разложение Рп клетками Е. coli Е15, адаптированными к Рп

Газовая фаза Содержание газа (%) Разложение Рп (метан, нмоль/ОП) ОП

Воздух 100 550 0,580

о2 10-70 520-540 0,530-0,420

80 470 0,350

о2 Продувание в течение 5 мин 480 0,210

n2 380 0,250

о2 11родуванис в течение 20 мин 470 0,240

n2 310 0,250

о2 Продувание под давлением 2 атм. 330 0,230

n2 135 0,250

Примечание. Клетки инкубировали на среде с Рп в течение 22 часов. Начальное ОГ1=0,05. В таблице представлены средние результаты шести опытов. Стандаршое отклонение не превышало 10%

4.2. рН=8 является оптимальным для разложения Рп

Исследование роли рН было проведено с использованием как растущих культур Е. соН, так и плотных суспензий клеток в отсутствие их роста в буферных реакционных смесях с разными рН (табл.5). рН=8 оказался наиболее оптимальным для разложения Рп. При рН ниже 6 происходит полное подавление роста клеток и разложения Рп. В этом случае, возможно, Рп не разлагается в результате отсутствия роста культуры при низком рН. Однако клетки из логарифмической фазы роста, интенсивно разлагающие Рп, помещенные в буферы с различными рН, максимально разлагают Рп при рН=8, а при рН ниже 7 - не разлагают совсем. Повышение рН (например до рН=9) снижает разложение Рп растущими культурами и не влияет на его разложение в отсутствие роста (табл. 5).

Таблица 5. Влияние рН на разложение Рп клетками Е. соН В\¥11733 в процессе роста и в отсутствие роста на этом субстрате

pH Клетки в процессе роста Клетки в отсутствие роста

ОП нач. ОП кон. Разложение Рп (метан, нмоль/ОП) ОП нач. ОП кон. Разложение Рп (метан, нмоль/ОП)

9,0 0,05 0,300 140 0,5 0,430 130

8,0 0,450 240 0,520 120

7,0 0,370 200 0,510 60

6,0 0,350 90 0,510 3

5,0 0,06 0 0,520 0

4,0 0,06 0 0,510 0

Примечание. Клетки из середины логарифмической фазы роста переносили в среду или буфер с Рп с разными рН и инкубировали в течение 6 часов. В таблице предс1авлены средние результаты трех опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.

4.3. Клетки из логарифмической фазы роста наиболее активно разлагают Рп

Разложение Рп анализировали в клетках на разных фазах роста культуры в процессе ее инкубации на среде с Рп в качестве единственного источника фосфора. Наиболее активно разлагают Рп клетки на логарифмической фазе роста, т.е. в процессе интенсивного роста культуры (рис.7). При переходе культуры в стационарную фазу разложение Рп замедляется, и удельное разложение Рп падает. Чтобы выяснить причину этого, клетки Е. coli BW11733 из разных фаз роста освобождали от культурапьной жидкости, а затем переносили в свежую среду, в ту же самую культуральную среду или в буферную смесь, и анализировали разложение Рп.

оп

08 -

07 -06 -05 -04 03 02

"И

Метан, нмоль/ОП

350 300

Разложение клетками Рп;

- Рост клеток

0 5 10 15 20 25 30

Время, час

Рис. 7. Разложение Рп клетками Е. coli Е15 из разных фаз роста культуры

Клетки засевали с начальной С)П=0,05

Оказалось (табл.6), что клетки независимо от фаз роста практически одинаково разлагали Рп в свежей минеральной среде.

Таблица 6. Разложение Рп плотными суспензиями клеток Е. соП В\¥11733 в разных условиях

Фазы роста Инкубационная среда Разложение Рп (метан, нмоль/ОП)

Ранняя логарифмическая Культуральная жидкость 160

Свежая минеральная среда 110

20мМ Трис HCl буфер, рН=8 130

Логарифмическая Культуральная жидкость 130

Свежая минеральная среда 80

20мМ Трис HCl буфер, рН=8 110

Стационарная Культуральная жидкость 5

Свежая минеральная среда 120

20мМ Трис HCl буфер, рН=8 60

Примечание. Клегки из разных фаз роста на среде с Рп собирали центрифугированием и переносили (ОПнач=0,5) в разные среды. Инкубировали в течение 20 часов В таблице представлены средние результаты пяти опытов Стандартное отклонение не превышало 10%

Клетки из стационарной фазы роста способны разлагать Рп в свежей среде так же, как клетки из логарифмической фазы роста. В буфере они разлагают Рп слабее, чем клетки из логарифмической фазы роста. Особенно большой ингибируюший эффект имеет культуральная жидкость из стационарной культуры, которая почти полностью подавляет процесс (табл.6). Это свидетельствует, что как сами клетки, так и их культуральная жидкость имеют свойства, лимитирующие разложение Рп. Частично роль ингибирующего фактора играет низкий pH культуральной жидкости (в конце культивирования он равен 4,7), так как ее нейтрализация частично восстанавливает активность культуры. Возможно, существуют и другие факторы неизвестной природы, которые могут влиять на этот процесс. Известно, что в стационарной культуре Е. coli в среду выделяются тиолы, которые являются важным регулятором редокс-состояния клетки и ее мембран (Смирнова и др., 1998). Не исключено, что они могут лимитировать процесс разложения Рп, который является редокс-зависимым.

4.4. УФ облучение стимулирует разложение Рп

Гак как разложение Рп предположительно является свободно-радикальным процессом, можно ожидать его стимуляцию с помощью ультрафиолетового облучения. Клетки Е. coli облучали УФ-светом при длине волны 254 им, поглощаемой этими клетками, используя разные дозы ультрафиолетового облучения (рис.8).

I 100 200 300 400 500 600

УФ-облучение, Дж/м2

400

350

О 300

ц 250 О

5 200'

X

х" 150 CS

О 100

s

50

| Разложение клетками Рп

I I Рост клеток

0 100 200 300 400 500 600

УФ-облучение, Дж/м2

^ Удельное разложение клетками Рп

Рис. 8 Влияние ультрафиолетового облучения ()^=254нм) на разложение Рп клетками Е. coli BW11733

При облучении клеток Е. coli УФ лучами с мощностью в интервале от 40 до 160 Дж/м2 наблюдается некоторое увеличение разложения Рп этими клетками по сравнению с контрольными необлученными клетками. Дальнейшее усиление мощности облучения значительно (вдвое) снижает этот процесс. Одновременно УФ облучение снижает рост клеток тем больше, чем большей дозе облучения они подвергались. Это приводит к тому, что удельное разложение Рп существенно увеличивается при низких дозах облучения (в 1,7 раза), достигая максимума при облучении дозой 80 Дж/м2. Более высокие дозы облучения существенно не влияют на удельное разложение Рп. Результаты свидетельствуют в пользу того, что УФ облучение в определенных дозах может стимулировать процесс разложения Рп за счет индукции синтеза или активации С-Р лиазы. Дальнейшие эксперименты по УФ облучению с использованием, в частности, контролируемой газовой фазы представляются перспективными в поисках ответа на вопрос о механизме разложения Рп.

5. У рекомбинантных штаммов Е. coli не выявлено усиление разложения Рп

Одним из подходов к интенсификации процессов, катализиремых белками, является увеличение копий генов, кодирующих эти белки. Кластер генов, кодирующих белки С-Р лиазного комплекса, ответственного за деградацию Рп у Е. coli в настоящее время идентифицирован и клонирован (Metealf et al, 1990; Wanner and Boline, 1990; Metcalf and Wanner, 1993; Wanner and Metcalf, 1992) в лаборатории профессора Ваннера (США). Предполагается, что семь из идентифицированных генов (phnG - phnM) отвечают непосредственно за катализ разложения алкилфосфонатов и являются компонентами С-Р лиазного комплекса (Metcalf and Wanner, 1993).

Сравнение разложения Рп клетками, экснрессирующими хромосомальные гены С-Р лиазы, и клетками, экспрессирующими гены С-Р лиазы, клонированные в плазмидах, неожиданно выявило отсутствие различий в деградативной активности этих клеток (табл. 7). Дополнительное подтверждение этому было получено при сравнении С-Р лиазной активности штамма Е. coli BW20736, полностью лишенного генов С-Р лиазы, и того же штамма, содержащего плазмиду с phn генами. Это сравнение подтвердило экспрессию плазмидных генов, однако, разложение Рп было таким же, или даже ниже, чем в природных штаммах с хромосомальным уровнем экспрессии phn генов. Возможно, С-Р лиазный комплекс имеет важные для его функционирования мембранные белки, повышенный синтез которых не может реализоваться на уровне активности С-Р лиазы из-за ограниченного количества сайтов встраивания их белков в мембраны.

Таблица 7. Разложение Pn С-Р лиазой, кодируемой хромосомальными генами phn и генами, клонированными в плазмиды

Штамм Е. coli Разложение Pn (метан, нмоль/ОП)

El5 адаптированные 400

El 5 адаптированные/pGYl 300

BW 20136(phn) 0

BW 20736/pGYl 110

BW 11733/pBW 120 540

Примечание. Клетки инкубировали на среде с Рп в течение 30 часов. Начальное 0п=0,05. В таблице представлены средние результаты пяти опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.

Нельзя исключить и другие ограничения, например, регуляцию С-Р лиазной реакции ее продуктами или их производными. В любом случае результаты показывают, что С-Р лиазная активность клеток и разложение ими Рп не лимитируются количеством С-Р лиазы. Преимуществом рекомбинантных штаммов является то, что они проявляют способность разлагать Рп без предварительной преинкубации в присутствие Рп.

5.1. Выявлены белки С-Р лиазного комплекса (продукты phnGHIJKLMNOP генов) и их локализация в клетке

Генетический анализ предсказывает существование нескольких белков -продуктов phnGHIJKLMNOP генов, отвечающих за С-Р лиазную активность и разложение Pn (Metcalf and Wanner, 1993). Но эти белки пока не были выявлены и охарактеризованы. Нами был изучен белковый состав родительских и рекомбинантных штаммов, содержащих плазмиды с phn генами, с целью выявления белков С-Р лиазного комплекса и получения доказательств их повышенного синтеза в условиях индукции кодирующих генов. Действительно, в штаммах Е. coli, имеющих плазмиды с клонированными генами С-Р лиазного комплекса, обнаружено повышенное содержание ряда белков по сравнению с таковым исходных ипаммов, не имеющих плазмиды. Содержание этих белков увеличивается также по мере инкубации клеток в условиях индукции экспресии phn 1енов под контролем разных промоторов. Это исследование показало, что рекомбинантные штаммы, не способные к повышенному разложению Рп, имеют повышенное содержание белков, соответствующих компонентам С-Р лиазного комплекса, подтверждая, что лимитирующим фактором разложения Рп не является

количество белков С-Р лиазного комплекса. Это сравнение позволило также выявить 7 белков, которые соответствуют продуктами phn генов по молекулярным массам, предсказанным на основе структуры этих генов. Чтобы оценить локализацию белков С-Р лиазного комплекса, проведено фракционирование клеток и сравнение белкового состава субклеточных фракций клеток рекомбинантных штаммов Е. coli: периплазмы, цитоплазмы, мембран. В качестве контроля служили соответствующие фракции штаммов, не содержащих плазмиды с генами phn, а также рекомбинантных штаммов, выращенных в условиях отсутствия индукции генов phn. Показано, что белки С-Р лиазного комплекса действительно локализованы во всех компартментах клетки (рис.9).

Часы: 404 404 404 404 Клетки периплазма цитоплазма мембраны

Рис.9 Белковый состав субклеточных фракций Е.соИ В\У20736/рСУЗ.

Некоторые из них, например, белки М и I характерны для периплазмы. Другие, например, белки .1 и К - для цитоплазмы, а белок Ь обнаружен как в периплазме, так и в цитоплазме, где он преобладает. В мембране обнаружены белки Н и й. Неожиданно большинство из этих белков оказалось растворимыми, а не мембранными, как предполагалось. Однако требуются дополнительные исследования локализации и функциональной идентификации компонентов С-Р лиазы.

Итак, в работе проведен широкий поиск факторов, влияющих на разложение Рп и участвующих в физиологической и биохимической регуляции процесса. Селекция адаптированных клеток и оптимизация условий за счег использования факторов, стимулирующих процесс, позволило повысить скорость разложения Рп. 11о-видимому, существуют

факторы лимитирующие процесс пока не выясненной природы. Выявление таких факторов позволит не только повысить эффективность процесса, но и понять его механизм.

ВЫВОДЫ

1. Различные штаммы Е. coli способны разлагать Рп по С-Р лиазному механизму с образованием метана в отсутствие других источников фосфора. Процессу предшествует длительный период адаптации.

2. Адаптация клеток к Рп происходит эффективнее при чем при 37°С, но не зависит от концентрации Рп в среде и сопровождается специфическими изменениями морфологии клеточной популяции.

3. Селекция адаптированных клеток значительно повышает скорость роста клеток на Рп и его разложения. Однако при использовании Рп в качестве единственного источника фосфора этот субстрат потребляется не полностью (не более 50% от внесенного в среду). Pi остается наиболее предпочтительным источником фосфора для роста даже адаптированных к Рп клеток.

4. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli. Оптимальными условиями для этого процесса являются: низкое парциальное давление кислорода,

30°С, рН=8 и логарифмическая стадия

роста культуры.

5. Показано, что увеличение содержания белков С-Р лиазного комплекса при индукции экспрессии их генов в составе плазмид не приводит к повышенному разложению Рп, свидетельствуя о наличии факторов, ограничивающих этот процесс и не связанных с количеством белков С-Р лиазного комплекса.

6. Путем сравнения белкового состава клеток исходных и рекомбинантных штаммов Е. coli выявлены белки С-Р лиазного комплекса, соответствующие по молекулярным массам продуктам phn i енов. Белки локализованы во всех компартментах клетки и являются преимущественно растворимыми.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Матыс С.В.. Лауринавичюс К.С., Несмеянова М.А. Разложение меч илфосфоновой кислоты и его физиологическая регуляция у Escherichia colU Микробиология, 1996, т.65, вып.4, с.481-487.

2. Матыс С.В.. Лауринавичюс К.С., Несмеянова М.А. С-Р лиазная активность клеток Escherichia colt влияние физиологических условий и селекции активной популяции "Ферменты микроорганизмов", 1998, Унипресс, Казань, с. 17-25.

3. Matys S.V., Laurinavichius K.S., Krupyanko V.I., and M.A.Nesmeyanova. Optimization of degradation of methylphophonate - analogue of toxic pollutant with direct C-P bond by Escherichia coli. Proc.Boichem., 2001,36,821-827.

4. Матыс C.B.. Несмеянова М.А. C-P лиазная активность Е. coli, физиологическая и генетическая регуляция. Тезисы, конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмов" Москва, 1993,'20.

5. Матыс С.В.. Лауринавичюс К.С., Несмеянова М.А. Влияние условий культивирования на разложение метилфосфоновой кислоты клетками Е. coli. Тезисы, конф. "Биотехнология защиты окружающей среды" Пущино, 1994,13.

6. Матыс СВ.. Лауринавичюс К.С., Несмеянова М.А. Разложение метилфосфоната и его физиологическая регуляция у Е. coli. Тезисы, 6 Российская конф. "Новые направления биотехнологии" Пущино, 1994, 32.

7. Matvs S.V.. Laurinavichius K.S. and M.A.Nesmeyanova. C-P lyase activity of Escherichia coli: influence of physiological conditions and selection of active cell population. International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology", Pushchino, 2000, 116.

8. Matvs S.V.. Laurinavichius K.S. and M.A.Nesmeyanova. Degradation of organophosphorus compounds with direct C-P bond by cells of Escherichia coli. Seminar-presentation of scientific and technical innovation projects "Biotechnology-2000", Pushchino, 2000, 159-160.

9. Матыс C.B.. Лауринавичюс K.C., Несмеянова М.А. С-Р лигиная активность клеток Escherichia coli. Сборник тезисов 111 съезда биохимического общества, Санкт-Петербург-, 2002, 594-595.

10.Matvs S.V.. Kuzmina N.M., Laurinavichius K.S. and M.A.Nesmeyanova. Environmental regulation of mcthylphosphonate degradation in Escherichia coli. FEMS Congress of European Microbiologists, Slovenia, 2003, 343.

\Soog * 1 800 8

Подписано в печать 24 октября 2003 г. Заказ 377. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз Отпечатано в салоне оперативной печати АртПолиграф Москва, Б Якиманка, 13, оф. 410. Тел. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Матыс, Светлана Владимировна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФОСФОНАТЫ И ИХ ДЕГРАДАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМАМИ.

1.1. Фосфонаты - фосфорорганические соединения с С-Р связью.

1.1.1. Природные и синтетические фосфонаты.

1.1.2. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов.

1.1.3. Ферменты, разлагающие фосфонаты с активированной С-Р связью.

1.2. Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью.

1.2.1. С-Р лиаза, разлагающая С-Р связь алкилфосфонатов.

1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы алкилфосфонатов.

1.3. Физиологическая и генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов.

1.3.1. Физиологическая регляция разложения алкилфосфонатов.

1.3.2. Генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов со стороны Pho регул она.

1.3.3. Гены, кодирующие разложение алкилфосфонатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты"

Актуальность проблемы, Фосфорорганические соединения, имеющие углерод-фосфорную связь (С-Р) - фосфонаты, широко распространены среди природных соединений во всех царствах живых существ, а также среди химических веществ антропогенного происхождения - ксенобиотиков (гербицидов, компонентов химического оружия и т.д.)» бесконтрольно поступающих в окружающую среду и становящихся ее токсикогенным фактором. Углерод-фосфорная связь, особенно неактивированная С-Р связь алкилфосфонатов, очень устойчива к химическому гидролизу, термальному разрушению и фотолизу, и расщепляется только прокариотическими микроорганизмами за счет функционирования фермента С-Р лиазы. В отличие от ферментов, разлагающих фосфонаты с активированной С-Р связью (такие как фосфоноацетат и аминоэтилфосфонат), которые выделены и хорошо охарактеризованы, функционирование С-Р лиазаы выявлено только в интактных клетках. Обнаружить ее активность в бесклеточных экстрактах пока достоверно не удалось. Поэтому фермент до сих пор не выделен и не изучен, а механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути не известен и мало понятен, являясь лишь предметом теоретических дискуссий.

Поиск путей биодеградации алкилфосфонатов с прямой связью С-Р и понимание молекулярных механизмов этого процесса является актуальной проблемой физико-химической биологии, исследование которой необходимо и для решения практических задач биотехнологии защиты окружающей среды. Потребность в решении этих задач возросла в связи с всемирной программой уничтожения химического оружия, в состав которого входят и соединения с С-Р связью. Сказанное определяет как теоретическую, так и практическую значимость исследования проблемы разложения алкилфосфонатов бактериями.

Состояние проблемы. Способность бактерий использовать алкилфосфонаты в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно (Zeleznick et al., 1963; Harkness, 1966; Cook et al, 1978; Wackett et al, 1987; Lee et al, 1992). Однако особенно большой интерес к процессу деградации Рп возник лишь в последние годы в связи с экологическими проблемами и с задачами ликвидации химического оружия. До недавнего времени исследователи уделяли внимание лишь скринингу микроорганизмов, способных разлагать алкилфосфонаты, типичным представителем которых является метилфосфонат (Рп), а также изучению генетической характеристики системы. В результате выявлены микроорганизмы способные к деградации Рп (Hidaka et al., 1990; Kamigiri et al, 1992; Nakashita et al, 2000). Проведено картирование и молекулярное клонирование phnipsiD) генов, ответственных за С-Р лиазную активность и разложение Рп у Е. coli (Wanner and Boline, 1990; Metcalf and Wanner, 1993) и у Rhisobium (Parker et al, 1999). Показано, что за использование фосфонатов клетками Е. coli отвечает кластер из 14 генов - одна из наиболее крупных транскрипционных единиц Е. coli, а экспрессия некоторых из этих генов контролируется РЬо-регулоном и экзогенным ортофосфатом (Wackett et al, 1987). Эти данные являются основой для изучения различных аспектов проблемы, ранее практически не рассматривавшихся. Так локализация С-Р лиазы в клетке, специфичность этого фермента и механизм его действия практически неизвестны, а немногочисленные попытки обнаружить С-Р лиазную активность in vitro пока не увенчались успехом (McMullan et al, 1991; Murata et al, 1988; Murata et al, 1989). Однако иденитифицировать С-Р лиазную активность in vitro, понять механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути невозможно без знания физиологической и биохимической регуляции этого процесса в клетках бактерий. Оно позволило бы так же оптимизировать процесс разложения и послужило бы основой для развития биотехнологий детоксификации этих соединений в окружающей среде. Однако сколько-нибудь систематических исследований в этой области до сих пор не проводилось.

Цель настоящей работы - выявить физиологические и биохимические особенности разложения алкилфосфонатов бактериями на примере грамотрицательной бактерии Escherichia coli.

У этой бактерии впервые была выявлена способность разлагать метилфосфонат (Рп) и хорошо изучена генетическая система, контролирующая этот процесс.

В задачи исследования входили:

1) сравнительный анализ разложения Рп различными штаммами Е. coli;

2) изучение особенностей адаптации клеток Е. coli к Рп;

3) селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп;

4) поиск физиологических и биохимических факторов, влияющих на разложение Рп различными штаммами Е. coli;

5) изучение разложения Рп рекомбинантными штаммами Е. coli, содержащими клонированные гены С-Р лиазного комплекса, кодирующие этот процесс;

6) выявление белков С-Р лиазного комплекса и изучение их локализации.

Научная новизна работы. Большинство данных, полученных в настоящей работе, является новыми. Впервые показано, что длительный латентный период при выращивании клеток на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора, связан с адаптацией клеток к Рп, которая подробно изучена. Показано, что адаптация происходит эффективнее при 30°С, чем при 37°С, но не зависит от концентрации Рп и сопровождается изменением физиологических и морфологических характеристик клеточной популяции. Впервые проведена селекция адаптированных клеток, что существенно повышает скорость разложения Рп и рост клеток на этом субстрате. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli: возраст культуры, температура культивирования, аэрация, рН среды и УФ-лучи. Определены оптимальные условия для разложения Рп: низкое парциальное давление кислорода, 30°С, рН=8 и логарифмическая фаза роста культуры.

Путем анализа белкового состава рекомбинантных штаммов с клонированными в плазмидах генами С-Р лиазного комплекса впервые выявлены белки этого комплекса и их распределение между субклеточными фракциями. Впервые установлено, что повышенный синтез белков С-Р лиазного комплекса в условиях индукции кодирующих генов, не приводит к увеличению активности С-Р лиазы и разложения Рп, что свидетельствует о существовании факторов неизвестной природы, лимитирующих этот процесс и не связанных с количеством белков С-Р лиазного комплекса.

Научно-практическое значение. Полученные в работе новые данные расширяют наше представление о физиологической и биохимической регуляции процесса разложения алкилфософнатов клетками бактерий, что послужит основой для оптимизации биосинтеза С-Р лиазы и ее дальнейшего исследования in vitro с целью понимания механизма разложения алкилфосфонатов. Результаты могут быть полезны при разработке биотехнологий биоремедиации почв.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Матыс, Светлана Владимировна

ВЫВОДЫ

I 1. Различные штаммы Е. coli способны разлагать Рп по С-Р лиазному механизму с образованием метана в отсутствие других источников фосфора. Процессу предшествует длительный период адаптации.

2. Адаптация клеток к Рп происходит эффективнее при 30°С, чем при 37°С, но не зависит от концентрации Рп в среде и сопровождается специфическими изменениями морфологии клеточной популяции.

3. Селекция адаптированных клеток значительно повышает скорость роста клеток на Рп и его разложения. Однако при использовании Рп в качестве единственного источника фосфора этот субстрат потребляется не полностью (не более 50% от внесенного в среду). Pi остается наиболее предпочтительным источником фосфора для роста даже адаптированных к Рп клеток.

4. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli. Оптимальными условиями для этого процесса являются: низкое парциальное давление кислорода, 30°С, рН=8 и логарифмическая фаза роста культуры.

5. Показано, что увеличение содержания белков С-Р лиазного комплекса при индукции экспрессии их генов в составе плазмид не приводит к повышенному разложению Рп, свидетельствуя о наличии факторов, ограничивающих этот процесс и не связанных с количеством белков С—Р лиазного комплекса.

6. Путем сравнения белкового состава клеток исходных и рекомбинантных штаммов Е. coli выявлены белки С-Р лиазного комплекса, соответствующие по молекулярным массам продуктам р/ш-генов. Белки

Ф локализованы во всех компартментах клетки и являются преимущественно растворимыми.

3.7. Заключение

• В настоящей работе на примере грамотрицательной бактерии Е. coli, у которой ранее впервые была выявлена способность разлагать алкилфосфонаты, проведен систематический анализ физиологических и биохимических факторов, влияющих на динамику процесса и его эффективность. Адаптация к Рп и селекция адаптированных клеток позволила существенно повысить скорость процесса. Оптимальными условиями этого процесса, выявленными в работе, является рост клеток при 30°С, при низком парциальном давлении кислорода и рН среды, равном 8. Процесс стимулируется УФ облучением и происходит более интенсивно в логарифмической фазе роста культуры. Повышенный синтез белков С—Р лиазного комплекса не приводит к повышению С-Р лиазной активности клеток и разложению ими метилфосфоната. Выявленные закономерности, к сожалению, не позволяют ответить на вопрос, почему разложение Рп не т происходит полностью. Вся совокупность фактов свидетельствует о существовании факторов, лимитирующих процесс разложения Рп. Этими факторами не являются: количество белка (С-Р лиазы), проницаемость наружной мембраны, токсичность Рп для клетки. Полученные данные позволяют предположить, что некоторые из этих лимитирующих факторов могут накапливаться при переходе к стационарной стадии роста. Не исключено, что этими факторами являются интермедиаты реакции, или какие-то кофакторы, содержание которых ограничено в данных условиях культивирования. Мы так же, к сожалению, не смогли ответить на вопрос, почему разложение Рп не происходит in vitro, бесклеточными экстрактами этой бактерии. Присутствие большинства белков С-Р лиазного комплекса в растворимом состоянии (в цитоплазме и периплазме) частично снимает остроту вопроса о необходимости сохранения интактности мембраны для функционирования С-Р лиазного комплекса при получении бесклеточного экстракта. Отсутствие положительной зависимости между концентрацией клеток и разложением ими Рп, характерной для ферментных систем, а так же независимость процесса от количества белков, катализирующих этот процесс, подтверждают, что лимитирующим фактором процесса являются какие-то кофакторы, или субстраты систем, сопряженные с С-Р лиазной реакцией, а так же, возможно, интермедиаты самой реакции. Дальнейший поиск этих факторов, который уже проводится в лаборатории, будет способствовать не только дальнейшей оптимизации процесса разложения бактериями алкилфосфонатов, но и выяснению его механизма.

Накопление фундаментальных знаний о механизме биодеградации фосфорорганических соединений с С-Р связью послужат, в свою очередь, основой для создания биотехнологии деградации токсических органофосфорных соединений со стабильной С-Р связью, бесконтрольно поступающих в окружающую среду в виде гербицидов и других продуктов хозяйственной деятельности человека.

87

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Матыс, Светлана Владимировна, Пущино

1. Вершинина О.А. и Знаменская Л.В. Pho регулоны бактерий. Микробиология, 2002, 71, 581-595.

2. Викторова JI.C., Арзуманов А.А., Широкова Е.А., Ясько М.В., Александрова Л.А., Шипицын А.В., Скоблов А.Ю. и Краевский А.А., Модифицированные нуклеозид-5-трифосфаты с повышенной стабильностью к дефосфорилирующим ферментам. Мол. Биол., 1998, 32, 162-171.

3. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н. и Октябрьский О.Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli. Микробиология, 1998, 67, 594-600.

4. Досон Р.М.К., Элиот Д.К., Элиот В.Х. и Джонс К.М. Справочник биохимика. Мир, Москва, 1991,354-369.

5. Кононова С.В. и Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами. Биохимия, 2002, 67, 220-233.

6. Нифантьев Э.Е. Химия фосфорганических соединений. Изд-во МГУ, Москва. 1971.

7. Несмеянова М.А., Гонина С.А., Кулаев И.С. и Северин А.И. Метаболическая регуляция некоторых фосфогидролаз Е. coli. Микробиология, 1974,43, 955-960.

8. Allen J.G., Atherton F.R., Hall M.J., Hassall C.H., Holmes S.W., Lambert R.W., Nisbet L.J. and Ringrose P.S. Phosphonopeptides, a new class of synthetic antibacterial agents. Nature, 1978, 272, 56-58.

9. Amemura M., Makino K., Shinagawa A., Kobayashi A. and Nakato A. Nucleotide sequence of the genes involved in phosphate transport and regulation of the phosphate regulon in Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1985, 184, 241-250.

10. O.Ames G.F.-L. Lipids of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structure and metabolism. J. Bacterid., 1968, 95, 833-839.

11. Avila L.Z., Draths K.M. and Frost J.W. Metabolites associated with organophosphonate C-P bond-cleavage — chemical synthesis and microbial-degradation of (P-32) ethylphosphonic acid. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1991,1,51-54.

12. Baer E. and Stanacev N.Z. Phosphonolipids. V. Synthesis of phosphonic acid analogues ofL-alphalecithins. J. Biol. Chem., 1965, 240,3754-3759.

13. Bardin S., Dan S., Osteras M. and Finan Т. M. A phosphate transport system is required for symbiotic nitrogen fixation by Rhizobium meliloti. J. Bacterid., 1996, 178, 4540-4547.

14. Bayer E., Gugel K.H., Hagele K., Hagenmaier H., Jessipow S., Konig W.A. and Zahner Z. Phosphonothricin and phosphonothricyl-alanyl-alanine. Helvetica Chimica Acta, 1972, 55,224-239.

15. Bode R. and Birnbaum D. Specificity of glyphosate action in Candida-Maltosa. Biochem. Physiol. Pflanzen., 1989, 184, 163-170.

16. Bowman E.D., Mc Queeney M.S., Barry R.J., and Dunaway-Mariano D. Purification and characterisation os the Tetrahymena pyriformis P-C bond forming enzyme phosphoenolpyruvate phosphomutase. Biochemistry, 1990, 29, 7059-7063.

17. Branum M.E., Reardon J.T. and Sancar A. DNA repair exicision nuclease attacks undamaged DNA. A potential source of spontaneous mutations. J. Biol. Chem., 2001, 276, 25421-25426.

18. Brzoska P., Rimmele M., Brzostek K. and Boos W. The pho regulon-dependent Ugp uptake system for glycerol-3-phosphate in Escherichia coli is trans inhibited by Pi. J. Bacteriology, 1994, 176, 15-20.

19. Bujacz В., Wieczorek P., Krysko-Lupicka Т., Golab Z., Lejczak B. and Kavfarski P. Organophosphonate utilization by the wild type strain of Penicillium notatum. Appl. Envir. Microbiol., 1995, 61, 2905-2910.

20. Chan F.Y. and Torriani A. PstB protein of the phosphate-specific transport system of Escherichia coli is an ATPase. J.Bacteriol., 1996,178,3974-3977.

21. ChaIvardjian A. and Rudnicki E. Determination of lipid phosphorous in the nanomolar range. Anal. Biochem., 1970, 36,225-226.

22. Cook A.M., Daughton C.G. and Alexander M. Phosphanate utilization by bacteria. J. Bacteriol., 1978, 133, 85-90.

23. Cordeiro M.L., Pompliano D.L. and Frost J.W. Degradation and detoxification of organophosphonates: cleavage of the carbon to phosphorus bond. J. Am. Chem. Soc., 1986, 108,332-334.

24. Dumora C., Lacoste A.-M. and Cassaigne A. Purification and properties of 2-aminoethylphosphonate: pyruvate aminotransferase from Pseudomonas aerogenosa. Eur. J. Biochem., 1983, 133, 119-125.

25. Egli T. (An)aerobic breakdown of chelating agents used in household detergents. Microbiol.Sci., 1988, 5, 36-41.

26. Fest C. and Schmidt K.-J. Organophosphorus pesticides. 1982. Springer-Verlag, Berlin Fine, Sprecker. Fleisch W. Bisphosphonates. Pharmocology and use in treatment of tumor-induced hypercalcaemia and metastatic bone disease. Drugs, 1991,42, 919-944.

27. Freedman L.D. and Doak G.O. The preparation and properties of phosphonic acids. Chem. Rev., 1957, 57, 479-523.

28. Frost J.W., Loo S., Cordeiro M.L. and Li D. Radical-based dephosphorylation and organophosphonate biodegradation. J. Am. Chem. Soc., 1987, 109,2166-2171.

29. Garen A. and Levinthal C. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. coli. I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. BBA, 1960, 38, 470-483.

30. Han J.S„ Park J.V., Lee Y.S., Thony B. and Hwang D.S. PhoB-dependent transcriptional activation of the iciA gene during starvation for phosphate in E.coli. Mol.Gen. Genet., 1999, 262, 448-452.

31. Harkness D.R. Bacterial growth on aminoalkylphosphonic acids. J. Bacteriol., 1966, 92, 623-627.

32. Hasegawa S., Tamari M. and Kametaka M. Isolation of diacylglyceryl-2-aminoethylphosphonate from bovine liver. J Biochem (Tokyo), 1976, 80, 531-535.

33. Hayes V.E., Ternan N.G. and McMullan G. Organophophonate metabolism by a moderately halophilic bacterial isolate. FEMS Microbiol. Lett., 2000, 186, 171-175.

34. Hidaka Т., Imai S., Нага O., Anzai H., Murakami Т., Nagaoka K. and Seto H. Carboxyphosphonoenolpyruvate phosphonomutase, a novel enzyme catalyzing C-P bond formation. J Bacteriol., 1990, 172, 3066-3072.

35. Hidaka Т., Hidaka M., Kuzuyama T. and Seto H. Sequence of a P-methyltransferase-encoding gene isolated from a bialaphos-producing Streptomyces hygroscopicus. Gene, 1995, 158, 149-150.

36. Hilderbrand R.L. and Henderson T.G. Phosphonic acids in nature. In: The role of phosphonates in living systems. Ed R.L.HiIderbrand, 1983, 5-30. C.R.C. Press, Inc., Boca Raton, Florida.

37. Horiguchi M., and M. Kandatsu. Isolation of 2-aminoethane phosphonic acid from rumen protozoa. Nature, 1959, 184,901-902.

38. Jaworski E.G. Mode of action of N-phosphonomethylglycine: inhibition of aromatic amino acid biosynthesis. J. Agric. Food Chem., 1972, 20, 11951198.

39. Jiang W., Metcalf W.W., Lee K.S., and Wanner B.L. Molecular cloning of the genes for phosphonate breakdown by the phosphonatase pathway of Salmonella typhimurium LT2. J. Bacterid., 1995, 177, 6411-6421.

40. Kamigiri K., Hidaka Т., Imai S., Murakami T. and Seto H. Studies on the biosynthesis of bialaphos (SF-1293) 12. C-P bond formation mechanism of bialaphos: discovery of a P-methylation enzyme. J. Antibiot (Tokyo), 1992, 45,781-787.

41. Kasahara M., Makino K., Amemura M., Nakata A. and Shinagawa H. Dual regulation of the ugp operon by phosphate and carbon starvation at two interspaced promoters. J. Bacteriol., 1991, 173, 549-558.

42. Kertesz M., Elgorriga A. and Amrhein N. Evidence for two distinct phosphonate-degrading enzymes (C-P lyases) in Arthrobacter sp.GLP-1. Biodegradation, 1991,2, 53-59.

43. Kim S.K., Wilmes-Riesenberg M.R. and Wanner B.L. Involvment of the sensor kinase EnvZ in the in vivo activation of the response-regulator PhoB by acetyl phosphate. Mol. Microbiol., 1996, 22, 135-147.

44. Kitteredge J.S., Roberts E. and Simonsen D.G. Occurrence of free 2AEP in he sea anemone, Anthopleura elegantissima. Biochemistry, 1962, 1, 624625.

45. Kittredge J.S. and Roberts E. A carbon-phosphorus bond in nature. Science, 1969,164,37-42.

46. Krzysko-Lupicka Т., Strof W., Kubs K., Skorupa M., Wieczorek P., Lejczak B. and Kafarski P. The ability of soil-borne fungi to degrade organophosphonate arbon-to-phosphorus bonds. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 48, 549-552.

47. Kulakova A.N., Kulakov L.A., Akulenko N.V., Ksenzenko V.N., Hamilton J.T. and Quinn J.P. Structural and functional analysis of the phosphonoacetate hydrolase (phn A) gene region in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacteriol, 2001, 183, 3268-3275.

48. Kulakova A.N., Wisdom G.B., Kulakov L.A. and Quinn J.P. The purification and characterization of phosphonopyruvate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond cleavage enzyme from Variovorax sp Pal2. J. Biol. Chem., 2003, 278, 23426-23431.

49. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.

50. La Nauze J.M., Rosenberg H. and Shaw D.C. The enzymic cleavage of the carbon-phosphorus bond: purification and properties of phosphonatase. Biochim Biophys Acta., 1970,212,332-350.

51. La Nauze J.M., Coggins J.R. and Dixon H.B.F. Aldolase-like imine formation in the mechanism of action of phosphonoacetaldehyde hydrolase. J. Biochem., 1977, 165,409-411.

52. Lee P.J., Joy K.W., Ramos J.L. and Guerrero M.G. The action of 2-amino-4-(methylphosphinyl)-butanoic acid (phosphinothricin) and its 2-oxo-derivative on the metabolism of cyanobacteria and higher plants. Phytochemistry, 1984, 23, 1-6.

53. Lee,K.S., Metcalf W.W. and Wanner B.L. Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter aerogenes. J Bacteriol., 1992, 174, 2501-2510.

54. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193, 265275.

55. Magbanua J.P., Fujisawa K., Ogawa N. and Oshima Y. The homeodomain protein Pho2p binds at an A/T-rich segment flanking the binding site of the basic-helix-loop-helix protein Pho4p in the yeast Pho promoters. Yeast., 1997, 14, 1299-1308.

56. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kimura S. and Nakata A. Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli: activation of the pstS transcription by PhoB protein in vitro. J. Mol. Biol., 1988,203, 85-95.

57. Makino К., Shinagawa H., Amemura M., Kawamoto Т., Yamada M. and Nakata A. Signal transduction in the phosphate regulon of Escherichia coli involves phosphotransfer between PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol., 1989,210, 551-559.

58. Makino, K., Kim S.-K., Shinagawa H., Amemura M. and Nakata A. Molecular analysis of the cryptic and functional phn operons for phosphonate use in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1991, 173, 26652672.

59. McGrath J.W., Wisdom G.B., McMullan G., Larkin MJ. and Quinn J.P. The purification and properties of phosphonoacetate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond-cleavage enzyme from Pseudomonas fluorescens 23F. Eur.J.Biochem., 1995, 234, 225-230.

60. McGrath J.W., Hammerschmidt F., Quinn J.P. Biodegradation of phosphonomycin by Rhizobium huakuii PMY1. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64,356-358.

61. McMullan G. and Quinn J.P. In vitro characterization of a phosphate starvation independent C-P bond cleavage activity in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacteriol., 1994, 176, 320-324.

62. McMullan G., Watkins R., Harper D.B. and Quinn J.P. Carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of Enterobacter aerogenes ATCC 15038 and Pseudomonas sp. 4ASW. Biochem. Int., 1991, 25, 271279.

63. McMullan G. and Quinn J.P. Detection of a novel carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of an environmental Pseudomonasfluorescens isolate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 184, 10221027.

64. Metcalf W.W., Steed P.M. and Wanner B.L. Identification of phosphate starvation-inducible genes in Escherichia coli K-12 by DNA sequence analysis of psi::lacZ(Mudl) transcriptional fusions. J. Bacteriol., 1990, 172, 3191-3200.

65. Metcalf W.W. and Wanner B.L. Involvement of the Escherichia coli phn ipsiD) gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite, Pi esters, and Pi. J. Bacteriol., 1991,173, 587-600.

66. Metcalf W.W. and Wanner B.L. Mutational analysis of an Escherichia coli fourteen-gene operon for phosphonate degradation, using TnphoA elements. J. Bacteriol., 1993, 175,3430-3440.

67. Metcalf W.W. and Wolfe R.S. Molecular genetic analysis of phosphite and hypophosphite oxidation by Pseudomonas stutzeri WM88. J. Bacteriol., 1998, 180,5547-5558.

68. Miura T. and Mizushima S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membrane from spheroplast membrane of E. coli. BBA, 1968, 150, 159-161.

69. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F. and Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products. Environ.Health Perspect, 1999, 107, 933-974.

70. Murai and Tomizawa C. Chemical transformation of S-benzyl O-ethyl phenylphosphonothiolate (Inezin) by ultraviolet light. J. Environ. Sci. Health, 1976,11,185-197.

71. Murata K., Higaki N. and Kimura A. Detection of carbon-phosphorus lyase activity in cell extracts of Enterobacter aerogenes. Biochem. and Biophis. Res.Communs., 1988, 157, 190-195.

72. Murata K., Higaki N. and Kimura A. A microbial carbon-phosphorus bond cleavage enzyme requires twu protein components for activity. J. Bacteriol., 1989, 171,4504-4506.

73. Nakashita H., Shimazu A., Hidaka Т., and Seto H. Purification and characterisation of phosphoenolpyruvate phosphomutase from PseudomonasgladioliB-l. J. Bacteriol., 1992, 174, 6857-6861.

74. Pancrazio J.J., Keefer E.W., Ma W., Stenger D.A., Gross G.W. Neurophysiologic effects of chemical agent hydrolysis products on cortical neurons in vitro. Neurotoxicology, 2001,22,393-400.

75. Parker G.F., Higgins T.P., Hawkes T. and Robson R.L. Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti phn genes: characterization and identification of their protein products. J Bacteriol, 1999, 181,389-395.

76. Pipke R., Amrhein N., Jacob G.S. and Kishore G.M. Metabolism of glyphosate by an Arthrobacter sp. GLP-1. European Journal of Biochemistry, 1987, 165, 267-273.

77. Pipke R. and Amrhein N. Carbon-phosphorus lyase activity in permeabilized cells of Arthrobacter sp. GLP-1. FEMS Microbiol Lett., 1988,236, 135-138.

78. Pollack S.J., Freeman S., Pompliano D.L. and Knowles J.R. Cloning, overexpression and mechanistic studies of carboxyphosphonoenolpyruvate muase from Streptomyces hydros copicus. European Journal of Biochemistry, 1992,209, 735-743.

79. Quinn J.P., Peden J.M.M. and Dick R.E. Carbon-phosphorus bond cleavage by gram positive soil bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 31, 283287.

80. Radicella J.P., Park P.U., Fox V.S. Adaptive mutation in Escherichia coli: a role for conjugation. Science, 1995, 268, 418-420.

81. Rao N.N., Torriani A. Utilization by Escherichia coli of a high-molecular-weight, linear polyphosphate: roles of phosphatases and pore proteins. J. Bacteriol., 1988,170, 5216-5223.

82. Rao N.N. and Kornberg A. Inorganic polyphosphate regulates responses of Escherichia coli to nutritional stringencies, environmental stresses and survival in the stationary phase. Prog. Mol. Subcell. Biol., 1999, 23, 193195.

83. Reinolds E.S. The use of lead citrate of high pH as an electronopaque stain in electrone microscopy. J. Cell. Biol., 1963,17, 208-212.

84. Sambrook J., Fritch E. and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989,319.

85. Scnaitman C. Solubilization of the cytoplasmic membrane of E. coli by Triton-ХЮО. J. Bacteriol., 1971, 108, 545-552.

86. Schowanek D. and Verstraete W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples. AppI.Environ.Microbiol., 1990, 56, 895-903.

87. Selvapandiyan A. and Bhatnagar Raj K. Isolation of glyphosate-mQlaboWsmgPseudomonas: detection, partial purification and localization of carbon-phosphorus lyase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994,40, 876-882.

88. Shinabarger D.L. and Braymer H.D. Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. strain PG2982. J Bacteriol., 1986, 168, 702-703.

89. Siedel H.M., Freeman S., Seto H., and Knowles J.R. Phosphonate Biosynthesis Isolation of the Enzyme Responsible for the Formation of a Carbon Phosphorus Bond. Nature, 1988, 335, 457-458.

90. Small M.J. Compounds formed from the chemical decontamination of HD, GB, and VX and their environmental fate. Tech Rpt8304; AD A149515.

91. Fort Detrick, MD:U.S. Army Medical Bioengineering Research and

92. Development Laboratory, 1984.

93. Smith J.D. and Lepak N.M. Purification and characterization of phosphonic acid containing glycoprotein from the cell membranes of Tetrahymena. Arch. Biochem. Biophys., 1982, 213, 565-572.

94. Smith J.D. Metabolism of Phosphonates. In: The role of phosphonates in living systems (Hilderbrand, R.L., ed.) CRC Press, Boca Raton, 1983, 3154.

95. Steed P.M. and Wanner B.L. Use of the rep technique for allele replacement to construct mutants with deletions of the pstSCAB-phoU operon: evidence of a new role for the PhoU protein in the phosphateregulon. J Bacteriol., 1993,175, 6797-809.

96. Stevens J.B., de Luca N.G., Beringer J.E., Ringer J.P., Yeoman K.H. and Johnston A.W. The purmn genes of rhizobium-leguminosarum and a superficial link with siderophore production. Mol. Plant Microbe Interact., 2000, 13,228-231.

97. Surin B.P., Rosenberg H. and Cox G.B. Phosphate-specific transport system of Escherichia coli: nucleotide sequence and gene-polypeptide relationship. J. Bacteriol., 1985, 161, 189-198.

98. Tan S.A. and Tan L.G. Distribution of ciliatine (2-aminoethylphosphonic acid) and phosphonoalanine (2-amino-3-phosphonopropionic acid) in humantissues. Clin. Physiol. Biochem., 1989, 7,303-309.

99. Ternan N.G. and McMullan G. The utilization of 4-aminobutyiphosphonate as sole nitrogen source by a strain of Kluyveromyces fragilis. FEMS Microbiol Lett. 2000, 184,237-240.

100. Ternan N.G.1 and Quinn J.P. In vitro cleavage of the carbon-phosphorus bond of phosphonopyruvate by cell extracts of an environmental Burkholderia cepacia isolate. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1998, 248, 378-381.

101. Ternan N.G.2 and Quinn J.P. Phosphate starvation-independent 2-aminoetylphosphonic acid biodegradation in a newly isolated srain of Pseudomonasputida, NG2. Syst. Appl. Microbiol., 1998, 21,346-352.

102. Ternan N.G., McGraff J.W., McMullan G. and Quinn J.P.

103. Organophosphonates: occurrence, synthesis and biodegradation by microorganisms. World J. Microbiol.Biotechnol., 1998, 14, 635-647.

104. Torriani A. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by Escherichia coli. BBA, 1960, 38, 460-466.

105. Torriani A. Alkaline phosphatase from Escherichia coli. In: Procedures in Nucleic Acid Research. Eds Gantoni G., Davis R. New York: Harper and Row, 1966, 224-234.

106. Tyhach R. J., Engel R. and Tropp. B. Metabolic fate of 3,4-dihydroxybutyl-l-phosphonate in Escherichia coli. Formation of novel lipid, the phosphonic acid analogue of phosphotidilglycerophosphate. J. Biol. Chem., 1976,251,6717-6723.

107. Van Bogelen R.A., Olson E.R., Wanner B.L. and Neidhardt F.C. Global analysis of proteins synthesized during phosphorus restriction in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1996, 178,4344-4366.

108. Wackett L.P., Shames S.L., Venditti C.P. and Walsh C.T. Bacterial carbon-phosphorus lyase: products, rates, and regulation of phosphonic and phosphinic acid metabolism. J. Bacteriol., 1987(a), 169, 710-717.

109. Wanner B.L. Is cross regulation by phosphorylation of two-component response regulator proteins important in bacteria. J. Bacteriol., 1992, 174, 2053-2058.

110. Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria. J. Biol. Chem., 1993,51,47-54.

111. Wanner B.L. Molecular genetics of carbon-phosphorus bond cleavage in bacteria. Biodegradation, 1994, 5, 175-184.

112. Wanner B.L. and Boline J.A. Mapping and molecular cloning of the phn (psiD) locus for phosphonate utilization in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1990, 172, 1186-1196.

113. Wanner B.L. and Metcalf W.W. Molecular genetic studies of a 10.9-kb operon in Escherichia coli for phosphonate uptake and biodegradation. FEMS Microbiol Lett., 1992, 79, 133-139.

114. Wanner B.L. and Wilmes-Riesenberg M.R. Involvement of phosphotransacetylase, acetate kinase, and acetyl phosphate synthesis in control of the phosphate regulon in Escherichia coli. J Bacteriol., 1992, 174, 2124-2130.

115. Wassef M.K. and Hendrix J.W. Ceramide aminoethylphosphonate in the fungus Pythium prolatum. BBA, 1976, 486, 172-178.

116. Yakovleva G.M., Kim S.-K. and Wanner B.L. Phosphate-independent expression of the carbon-phosphorus lyase activity of Escherichia coli. Appl. Mocrobiol. Biotechnol., 1998,49, 673-678.

117. MO.Zboinska E., Maliszewska I., Lejczak, B. and Kafarski P. Degradation of organophosphonates by Penicillium citrinum. Lett. Appl. Microbiol., 1992, 15,269-272.

118. Zeleznick L.D., Myers T.C. and Titchener E.B. Growth of E. coli on methyl- and ethyl-phosphonic acids. BBA, 1963, 78, 546-547.