Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация 2,4-дихлорфенола иммобилизованными и суспендированными клетками Bacillus cereus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Деградация 2,4-дихлорфенола иммобилизованными и суспендированными клетками Bacillus cereus"

На правах рукописи

ЦЕНТЕР Ирина Михайловна

ДЕГРАДАЦИЯ 2,4—ДИХЛОРФЕНОЛА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ И СУСПЕНДИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ BACILLUS CEREUS

03.00.23 - «биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

□ОЗ173525

Улан-Удэ, 2007

003173525

Работа выполнена в Байкальском институте природопользования Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Батоев Валерий Бабудоржиевич Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Руш Елена Анатольевна, кандидат технических наук Санданова Туяна Владимировна

Ведущая организация:

Управление водных ресурсов озера Байкал Министерства природных ресурсов Российской Федерации

Защита состоится « 06 » ноября 2007 г. в 10 часов на заседании Регионального диссертационного Совета ДМ 212 039.02 при Восточно-Сибирском государственном технологическом университете по адресу 670013, г Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГТУ

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью учреждения, просим

отправлять по указанному адресу ученому секретарю Совета

Автореферат разослан « 05 » октября 2007г Ученый секретарь

Регионального диссертационного Совета, доктор технических наук,

профессор Хамнаева Н И

Актуальность работы.

Признание озера Байкал, как участка мирового природного наследия, накладывает на мировое сообщество и, в первую очередь, на Россию обязательства по сохранению озера для будущих поколений людей. Среди органических акваэкотоксикантов особую опасность для экосистемы озера представляют полихлорированные фенолы Согласно разработанному «Перечню веществ, вредных для экосистемы озера Байкал», полихлорированные фенолы относятся к категории «Особо опасных» веществ, содержание которых в воде озера Байкал и его притоков недопустимо (Перечень. , 2004) В действительности же, на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате (БЦБК) полихлорфеволы образуются при хлорной отбелке целлюлозы и обнаруживаются в воде озера Байкал, в зоне сброса очищенных сточных вод (Бейм и др., 1997). Присутствие полихлорфенолов в бассейне реки Селенги, главного притока озера, обусловлено локальными антропогенными и природными источниками (Батоев и др, 2005). Особенностью этих соединений является высокая токсичность для акваэкосистем, способность к биоаккумуляции, относительная устойчивость к разложению в окружающей среде Поэтому, актуальной является проблема их принудительной деградации, с целью защиты окружающей среды.

Биологический метод, основанный на применении активных микроорганизмов-деструкторов, в большинстве случаев является наиболее экономически обоснованной альтернативой химическим и физико-химическим методам Причем, эффективность биологической обработки повышается при иммобилизации клеток микроорганизмов, что широко используется в практике при очистке промышленных стоков (Пирог и др., 2005)

Весьма перспективным является применение метода адсорбционной иммобилизации на неорганическом носителе - природных цеолитах, обладающих биологической активностью,

кислотоустойчивостью и уникальным сочетанием адсорбционных, катионообменных и каталитических свойств В связи с этим, несомненный интерес представляет исследование воздействия цеолитов на бактериальные клетки и возможности их использования в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов с целью интенсификации биологической очистки сточных вод, содержащих полихлорфенолы Ранее, из ила пруда-аэратора БЦБК была выделена и идентифицирована как Bacillus cereus культура, обладающая наибольшей деструктивной способностью по отношению к 2,4-дихлорфенолу (2,4-ДХФ) (Matafonova et al.., 2006)

Поэтому, обоснованной и актуальной представляется проблема обезвреживания токсичных полихлорфенолов с применением новых микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на природных цеолитах.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Байкальского института природопользования СО РАН по научному направлению подпрограммы СО РАН 17 7, «Защита атмосферы, природных вод и почв» и является частью проекта «Разработка физико-химических основ новых высокоэффективных технологий обезвреживания стойких органических зафязнителей природных и сточных вод».

Цель работы. Исследование процесса иммобилизации йа природных цеолитах культуры Bacillus cereus (далее В cereus) и разработка биотехнологического способа обезвреживания полихлорированных фенолов с использованием иммобилизованных и суспендированных клеток.

Основные задачи

• исследовать влияние природных цеолитов Холинского месторождения Республики Бурятия на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства В. cereus;

• определить характеристики сорбции клеток В. cereus природными цеолитами Холинского месторождения;

• исследовать процесс иммобилизации клеток В. cereus на природных цеолитах, получить иммобилизованные клетки В cereus,

• изучить кинетику биодеградации 2,4-ДХФ иммобилизованными на природных цеолитах и суспендированными клетками В cereus,

• идентифицировать продукты биодеградации 2,4-ДХФ и оценить их токсичность;

• разработать биотехнологическую схему очистки сточных вод с использованием иммобилизованных клеток В cereus.

Научная новизна работы. В работе показана возможность использования природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия) в качестве матрицы для иммобилизации микроорганизма В cereus Исследован механизм сорбции клеток В cereus на природных цеолитах Холинского месторождения Продемонстрирована способность иммобилизованных на природных цеолитах клеток В cereus разлагать 2,4-ДХФ в статических условиях. Методом хромато-масс-спектрометрии идентифицированы основные продукты биодеградации 2,4-ДХФ данным микроорганизмом и установлена их нетоксичность Выявлена перспективность применения

иммобилизованных клеток В, сегет для эффективной утилизации полихлорированных фенолов

Практическая значимость. Получены иммобилизованные клетки микроорганизма-деструктора полихлорфенолов В сегеш с использованием природных цеолитов Холинского месторождения, определены оптимальные условия их иммобилизации Показано, что после иммобилизации клетки сохраняют деструктивную активность по отношению к 2,4-ДХФ.

Проведены укрупненные производственные испытания разработанной технологии очистки сточных вод от полихлорфенолов (ЗАО «Кондитерпром», г. Улан-Удэ (Акт испытаний №1 от 17 07 2007г.))

Результаты исследований включены в отчеты Байкальского института природопользования СО РАН по экспедиционным грантам СО РАН, гранту федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 года» (2004 г.) по теме «Комбинированное фотолитическое и биологическое окисление хлорированных фенолов с применением ультрафиолетовых эксиламп емкостного разряда», гранту Правительства Республики Бурятия для молодых ученых на выполнение НИР по теме «Инновационная технология обезвреживания промышленных стоков, содержащих хлорфенолы» (2005 г), гранту ФЦНТП РИ-19 0/001/014 «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы по теме «Разработка инновационной окислительной технологии деградации фенольных пестицидов иммобилизованными микроорганизмами» (2006 г ).

Апробация работы. Результаты работы представлялись на международных и региональных конференциях и симпозиумах: «Проблемы устойчивого развития региона» (г Улан-Удэ, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (г. Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004), «Кожа и мех в XXI веке, технология, качество, экология, образование» (г. Улан-Удэ, 2006), «Трансграничные аспекты использования природно-ресурсного потенциала бассейна реки Селенги в новой социально-экономической и геополитической ситуации» (г. Улан-Удэ, 2006), «Участие молодых ученых, инженеров и педагогов в разработке и реализации инновационных технологий» (г. Москва, 2006), Всероссийская конференция молодых ученых «Экология в современном мире- взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), IV школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов и списка использованных источников (135 наименований) Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для йсследования; процессов биодеградации 2,4-ДХФ объектом являлась бактериальная культура В. сегеш, выделенная из ила пруда-аэратора БЦБК и идентифицированная ранее на основе секвенирования последовательности 168 рДНК, а также морфолого-культуральных и физиологических характеристик, (Ма1ай>поуа а1., 2006)

Исследование адсорбционной иммобилизации клеток В. сегеш проводили на природных цеолитах Холинского месторождения (Республика Бурятия), которые относятся,к каркасным алюмосиликатам с содержанием цеолита - клиноптилолита - 50-60 % (ТУ 2163-002-1276 3074-97 "Цеолит природный Холинского месторождения - фильтрующий и сорбирующий материал для очистки природных и сточных вод").

Для исследования адсорбционной иммобилизации клеток В сегеш природные цеолиты отмывали от органических примесей и пыли, стерилизовали при 121+1°С в течение 20 мин. (стерилизатор паровой марки ВК-75-01), размер отобранных гранул составил 2,5-4 мм. Клетки суточной культуры В. сегеш центрифугировали при 6 000 об/мин в течение 30 мин Осажденные клетки отмывали от питательной среды в физиологическом рартворе и готовили суспензию 108- 109 клеток в 1 см3. Полученной суспензией клеток в объеме 1см3 смачивали 1см3 цеолита Процесс сорбции проводили в плоскодонных колбах при температуре 28°С в течение 2 ч в статических условиях, для интенсификации процесса пробы переносили в холодильник. Дальнейшую сорбцию вели при температуре 4°С в течение 3 ч. Затем в колбы вносили 10 см3 физиологического раствора, встряхивали 10 мин., взвесь осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин Фракции цеолита с прикрепленными клетками хранили при температуре 4°С.

Учет количества клеток В сегеш до и после контакта с природными цеолитами осуществляли путем количественного посева надосадочной жидкости опытных и контрольного (без сорбента) образцов на твердые

среды, используя метод серийных разведений Количество выросших колоний выражали общим числом колониеобразующих единиц (КОЕ)

Исследование влияния природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства В. cereus проводили по стандартным методикам (Нетрусов А И. и др, 2005; Нецепляев C.B. и др., 1990; Панкратов А Я и др., 1975).

Токсичность природных цеолитов, 2,4-ДХФ и продуктов биодеградации 2,4-ДХФ определяли по методике (Нетрусов А.И. и др., 2005) В качестве тест-организма использовали Escherichia coli (далее Е coli).

Характеристики сорбции включали в себя показатели адгезии и десорбции

Деградацию 2,4-ДХФ суспендированными и иммобилизованными клетками В. cereus осуществляли путем аэробного культивирования в шейкере-инкубаторе BIOSAN ES-20 (180 об/мин, 28°С) в жидкой минеральной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии 2,4-ДХФ [100 мкМ и 300 мкМ], следующего состава (г/л): Na2HP04 - 1,63, КН2Р04 - 1,48, KN03 - 0,5, MgCl2x6H20 - 0,2, (NH4)2S04 - 0,1 (Wang, Loh, 2001) Изменение концентрации исследуемого субстрата контролировали по изменению характера электронных спектров поглощения в УФ области с помощью спектрофотометра Agilent 8453. Продукты биодеградации анализировали на газовом хроматографе Agilent Technologies 5973 N с масс-селективным детектором.

Динамику изменения плотности клеток в культуральной жидкости контролировали по величине оптической плотности при 590 нм на концентрационном фотоэлектрическом колориметре КФК-2МП Размеры клеток определяли с помощью окулярного микрометра МОВ-1-15, используя микроскоп PZO SKÏ9 Биолам Р-16 (коэффициент пересчета -0,067) Подвижность клеток определяли окрашиванием жгутиков по Леффлеру. Фотографии клеточных препаратов после фиксации жаром и окрашивания по Граму получены при помощи микроскопа Motic В1 Series System Microscopes

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства культуры Bacillus cereus

Клетки В cereus представляли собой грамположительные палочки размером 2-5 мкм, образующие длинные и короткие цепочки Края колоний округлые, концы гладкие. Цвет колоний молочный, профиль выпуклый, структура колоний однородная, поверхность гладкая, консистенция - мазеобразная (таблица 1). Клетки В cereus подвижны за счет перетрихиальных жгутиков, движения активные Клетки образуют сероводород, индол и аммиак не образуют Каталазоположительные, имеют положительную реакцию при определении редуцирующей и сахаролитической способности, протеолитической и антагонистической активности.

Таблица 1 - Влияние природных цеолитов на морфологические свойства

Bacillus cereus

Показатели Клетки

контроль иммобилизованные на природных цеолитах

1 2 3 4 5

Средний диаметр колоний (1сут), мм 3,5±0,08 X 5,1±0,07 3,7±0,09 X 6,1±0,06 3,9±0,07 X 5,8±0,05 3,5±0,08 X 5,1±0,07

Форма клеток палочковид ная палочковидная палочковидная палочковид ная

Консистенция колоний мазеобраз ная мазеобразная мазеобразная мазеобраз ная

Поверхность клеток гладкая зернистая рыхлая рыхлая

Цвет колоний желтоватый желтоватый желтоватый желтоватый

Окраска по Граму грамполож грамполож грамполож грамполож

В результате проведения иммобилизации морфолого-культуральные и фгоиолого-биохимические свойства клеток не изменились, поверхность клеток приобрела рыхлость и зернистость (таблица 1).

Известно, что чувствительность микроорганизмов к веществу -токсиканту (токсичность), можно определить с помощью бумажных дисков, пропитанных исследуемым веществом, и помещенных на агаре. Второй способ - размещение субстрата (токсиканта) в лунках на поверхности агара. Если микроорганизмы чувствительны к данному токсиканту, то при их росте вокруг дисков и лунок образуются зоны просветления (зоны отсутствия роста).

В ходе эксперимента установлено, что природный, цеолит является нейтральным и нетоксичным сорбентом, о чем свидетельствовало полное отсутствие зон просветления вокруг лунок с цеолитом при росте на агаре тест-организма Е. coli

Обнаружено, что хлорфенол (2,4-ДХФ) токсичен по отношению к тест-организму Е coli - отмечены зоны просветления вокруг бумажных дисков на агаре, смоченных раствором 2,4-ДХФ, но нетоксичен по отношению к культуре В cereus.

Выявлено, что при внесении клеток В. cereus в среду 2,4-ДХФ [200 мкМ] клетка окружена капсулой. С помощью стандартных методик (Землянухин, 1985 г.), определена белковая природа капсулы.

Таким образом, иммобилизация клеток В cereus на природных цеолитах не оказала существенного влияния на их морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства, вследствие нейтральности сорбента и нетоксичности его по отношению к бактериальной клетке. Изменились лишь края колоний и поверхность клетки, физиологические процессы в клетках не нарушаются, активность клеток сохраняется Внесение 2,4-ДХФ в культуральную среду приводит к изменению клеточной стенки Bacillus cereus и образованию белковой капсулы

Характеристики сорбции Bacillus cereus природными цеолитами

КОЕ исходной суспензии составило 3,67*106. Характеристики сорбции приведены в таблице 2

Таблица 2 - Адсорбция и десорбция клеток Bacillus cereus на природных

цеолитах

№

образ КОЕ Адсорбция КОЕ Десорбция

ца образца (%) элюата (%)

1 4,6*105 87,5 3,6*10i 21,7

2 4,8*105 86,9 3,7*105 22,9

3 5,7*105 84,5 4,3*105 24,6

Из таблицы 2 видно, что природные цеолиты характеризуются высокой адгезией по отношению к клеткам В cereus Изучение ингибирующего действия природных цеолитов на размножение адсорбированных клеток В cereus показало низкую активность цеолитов Так, после инкубирования иммобилизованных клеток в течение 24 часов на агаризованной среде наблюдалось активное накопление биомассы, сравнимое с контролем при равной исходной концентрации свободных клеток

Биодеградация 2,4-ДХФ иммобилизованными и суспендированными клетками Bacillus cereus

Проведены эксперименты по исследованию способности иммобилизованных и суспендированных клеток культуры В. сегет утилизировать 2,4-ДХФ при аэробных условиях в синтетической минеральной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии 2,4-ДХФ

Найдено, что конечная концентрация субстрата после 12 суток культивирования при исходной концентрации 2,4-ДХФ 100 мкМ (16,3 мг/л) достигала следующих значений, в среде с иммобилизованными клетками 2,1 мг/л (изменение концентрации ДС = 15,6) , в среде с суспендированными - 6,5 мг/л (изменение концентрации ДС = 10,9)

Далее исследовали способность клеток В сегет утилизировать 2,4-ДХФ в течение 12 суток при исходной концентрации субстрата 300 мкМ (48,9 мг/л) Так, конечная концентрация 2,4-ДХФ в среде с иммобилизованными клетками составила 10,9 мг/л (изменение концентрации АС = 38), с суспендированными - 32 мг/л (изменение концентрации АС = 16,9) Причем, вклад химического окисления и испарения 2,4-ДХФ при исходной концентрации 300 мкМ в течение 12 суток незначителен, составил 0,3 % в контрольной пробе и 3,2 % в контрольной пробе с цеолитом

Таким образом, наибольшую способность утилизировать 2,4-ДХФ проявляют клетки, иммобилизованные на природных цеолитах

Параллельно исследовали динамику изменения биомассы клеток В. сегеш в иммобилизованном и суспендированном состоянии (рис. 1,2,3,4).

т 0 15

к

а то а ь

х §

х £

2 3 4 Время, сутки

-концентрация

-В—биомасса

Рис 1 Динамика деградации 2,4-ДХФ[100 мкМ] и изменение биомассы иммобилизованных клеток В сегет

60 т

Т о 15

2 5 6 7 Время, сутки

-.0 1

0 05

г

X

о ст> ■о

8

- концентрация

—О—биомасса

Рис 2. Динамика деградации 2,4-ДХФ [300 мкМ] и изменение биомассы иммобилизованных клеток В сегеш

2 5 6 7 Время, сутки

—□—биомасса

-аЬ— концентрация

Рис 3. Динамика деградации 2,4-ДХФ [100 мкМ] и изменения биомассы суспендированных клеток В, сегеш

5 с

оГ =г

а1

х £

2 5 6 7 Время, сутки

-г 0 06

• •004 |

о о> ю

О 0 02 §

• концентрация

—О—биомасса

Рис 4 Динамика деградации 2,4-ДХФ [300 мкМ] и изменение биомассы суспендированных клеток В. сегеш

Были оценены константы скорости биодеградации по уравнению реакции первого порядка Рассчитанные константы скорости биодеградации 2,4-ДХФ позволяют заключить, что скорость деградации субстрата иммобилизованными клетками В сегеш в 1,9 раза выше скорости деградации суспендированными клетками В сегеш при одинаковых условиях протекания процесса

Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что клетки В сегеш обладают высокой деградативной способностью по отношению к 2,4-ДХФ, способны разлагать эти загрязнители при высоких концентрациях, до 300 мкМ Клетки, иммобилизованные на цеолитах, полностью сохраняют свою деградативную способность, обладают стабильностью при хранении.

Идентификация интермедиатов методом хромато-масс-спектрометрии

Как известно, деградация ХФ может начинаться с гидроксилирования ароматического кольца с последующим дехлорированием и разрывом кольца, с образованием органических кислот (8о1уашкоуа 1Р, во1оу1еуа ЬА, 2004). При наших условиях экстракции и хроматографирования в качестве продуктов биодеградации 2,4-ДХФ суспендированными клетками В сегеш нами идентифицирована пропановая кислота, в случае с иммобилизованными клетками -пропановая и пропеновая кислоты

В обоих случаях обнаружена фталевая кислота. Известно, что в результате разрыва ароматического кольца после гидроксилирования и отщепления атомов хлора образовываются карбоновые кислоты цис, цис-муконовая и цис, г/момалеиновая, при взаимодействии которых образуется фталевая кислота.

Таким образом, методом ГХ-МС установлено, что в процессе биодеградации 2,4-ДХФ как суспендированными, так и иммобилизованными клетками В сегеш, образуется основной интермедиат - фталевая кислота, концентрация которого к концу культивирования увеличивалась

Установлено, что полученные продукты биодеградации после 12 суток культивирования нетоксичны.

Биотехнологическая схема очистки сточных вод с использованием микроорганизма-деструктора полихлорированных фенолов

На основе полученных данных предложен способ биодеградации 2,4-ДХФ иммобилизованными клетками В сегеш (рис.5)

Предложенная биотехнологическая схема очистки сточных вод включает пять этапов: первым этапом является культивирование микроорганизма В. сегеш на твердой питательной среде (МПА) при температуре 28°С в течение 24 ч На втором этапе микроорганизм В сегеш суспендируют в жидкой минеральной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии полихлорфенол при температуре 28°С в течение 24 ч. Третий этап - иммобилизация

клеток В сегеия на природных цеолитах Данный этап включает приготовление клеточной суспензии (108- 109 микробных клеток в 1 см3) путем центрифугирования клеток и отмывания полученных клеток в физиологическом растворе После подготовки природных цеолитов (фракционирование, промывание, стерилизация) следует этап получения иммобилизованных клеток (1 см3 клеточной суспензии на 1см3 сорбента) при температуре 28°С в течение 2 ч; затем при температуре 4°С в течение 3 ч. Четвертый, этап - обработка воды, загрязненной полихлорированными фенолами, иммобилизованными на природных цеолитах клетками В сегеш при температуре 28°С в течение 12 суток при аэробных условиях На конечном этапе в очищенной воде контролируют содержание исходных полихлорированных фенолов и токсичность продуктов их биодеградации.

Данная схема рекомендована для очистки стоков предприятий целлюлозно-бумажной промышленности и химических производств по синтезу полихлорированных фенолов. Эффективность очистки сточных вод при температуре 18±2°С с содержанием полихлорфенолов до 100 мкМ может быть достигнута 87,1%; до 300 мкМ - 77,7%.

Рис 5 Биотехнологическая схема очистки сточных вод

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что природные цеолиты не оказывают угнетающего действия на клетки В сегет вследствие нейтральности сорбента и нетоксичности его по отношению к бактериальной клетке. Показан стимулирующий эффект воздействия природных цеолитов на физиолого-биохимические свойства клеток В сегеш.

2. Определена сорбционная активность природных цеолитов Холинского месторождения по отношению к клеткам В сегет Адсорбция клеток В сегет на поверхности природных цеолитов происходит за счет белковых капсул Средняя степень адсорбции клеток В. сегеш на природных цеолитах составила 86%.

3. Разработан способ иммобилизации клеток микроорганизма В сегет, получены иммобилизованные клетки.

4. Установлено, что скорость деградации 2,4-ДХФ иммобилизованными на природных цеолитах клетками В сегеш выше в 1,9 раза скорости деградации 2,4-ДХФ суспендированными клетками в статических условиях.

5 С помощью хромато-масс-спектрометрии идентифицированы продукты биодеградации 2,4-ДХФ Найдено, что основным продуктом биодеградации 2,4-ДХФ является нетоксичная фталевая кислота

6. Разработана биотехнологическая схема очистки сточных вод, содержащих 2,4-ДХФ, при исходной концентрации до 300 мкМ, с использованием иммобилизованных на природных цеолитах клеток В сегеш.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1 В.Б. Батоев, В.Ж. Цыренов, Г Г. Нимацыренова, Е Г. Инешина, Г.С. Дабалаева, И.М Почерней (ИМ Центер). Деструкция хлорфенолов микроорганизмами пруда-аэратора Байкальского ЦБК // Экология и промышленность России - 2004, № 9 - С 22-24.

2. Почерней И.М. (И.М. Центер), Дабалаева Г С., Нимацыренова ГГ. Морфолого-культуральные и физиологические свойства микроорганизмов-деструкторов полихлорированных фенолов // Материалы докладов 3-й школы-семинара молодых ученых России "Проблемы устойчивого развития региона". - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2004 - С 242-244

3. В.Б. Батоев, В Ж. Цыренов, Е Г. Инешина, Г С. Дабалаева, Г.Г. Нимацыренова, И.М. Почерней (ИМ. Центер) Бактерии -деструкторы хлорфенолов Байкальского целлюлозно-бумажного комбината // Материалы Международной конференции "Научные основы сохранения водосборных бассейнов междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами". - Улан-Удэ - Улан-Батор. Изд-во БНЦ СО РАН, 2004. - С. 130-132.

4. И.М. Почерней (И.М. Центер), Г Г. Матафонова, Г.С Ширапова, В.Б. Батоев, Е.Г. Инешина, В.Ж Цыренов. Интенсификация биологической очистки сточных вод меховых производств от органических загрязнителей // Материалы II международной научно-практической конференции "Кожа и мех в XXI веке, технология, качество, экология, образование" - Улан-Удэ. Изд-во ВСГТУ, 2006 -С.265-270.

5. И.М. Почерней (ИМ. Центер), Г.Г Матафонова, Г.С. Ширапова, Е Г Инешина, В Б Батоев, В Ж. Цыренов Деструкция 2,4-дихлорфенола иммобилизованными клетками Bacillus cereus // Материалы Международной научной конференции "Трансграничные аспекты использования природно-ресурсного потенциала бассейна реки Селенги в новой социально-экономической и геополитической ситуации" -Улан-Удэ Изд-воГУЗРЦМПМЗРБ,2006 - С 170-173

6. И М. Почерней (И М Центер), Г Г Матафонова, Г.С. Ширапова, В.Б Батоев. Очистка промышленных стоков от полихлорированных фенолов // VI Международная конференция "Участие молодых ученых, инженеров и

педагогов в разработке и реализации инновационных технологий" - Москва, 2006. - С 717-720

7. И М. Центер, Г.Г Матафонова Деградация 2,4-дихлорфенола клетками Bacillus cereus, иммобилизованными на природных цеолитах // Всероссийская конференция молодых ученых "Экология в современном мире взгляд научной молодежи". -Улан- Удэ- Изд-во ГУЗ РЦМП МЗ РБ, 2007. - С. 332-333.

8 И.М. Центер, Г Г Матафонова, В Б. Батоев Исследование токсичности продуктов биодеградации 2,4-дихлорфенола клетками Bacillus cereus II IV Школа-семинар молодых ученых России "Проблемы устойчивого развития региона". - Улан-Удэ Изд-во БНЦ СО РАН, 2007 -С.165-166.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю дбн В Б. Батоеву, сотрудникам БИП СО РАН к.б.н Матафоновой Г Г и к.б.н Шираповой Г С за оказанную поддержку при выполнении работ Автор также приносит глубокую благодарность заведующему кафедрой биотехнологии ВСГТУ дбн, проф. В Ж Цыренову и к б н, доц Б Г Инешиной за ценные консультации и за помощь в микробиологических исследованиях

Подписано в печать 04 10 2007 г Формат 60x84 1/ 16 Бумага офсетная Объем 1 2 печ л Тираж 100 Заказ № 56

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновои, 6

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Центер, Ирина Михайловна

Введение.

1. Литературный обзор.

I. Полихлорированные фенолы.

1. Общая характеристика полихлорированных фенолов.

1.1 Физико-химические свойства.

1.2 Токсичность.

1.3. Источники поступления.

2. Методы деградации полихлорированных фенолов

2.1. Фотохимические методы.

2.1.1. Прямой фотолиз.

2.1.2. Сенсибилизированный фотолиз.

2.1.3. Каталитический фотолиз.

2.1.4. Новые окислительные технологии.

2.2. Биологические методы.

II. Деградация полихлорированных фенолов иммобилизованными клетками.

1. Общие сведения о цеолитах.

2. Адсорбционные методы иммобилизации микробных клеток. Взаимодействие минералов с микроорганизмами.

3. Применение иммобилизованных клеток для очистки сточных вод.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы исследований.

2.1.1. Микробиологические методы.

2.2.1.1. Определение численности клеток.

2.2.1.2. Размеры клеток.

2.2.1.3. Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов.

2.2.1.4. Изучение морфологии бактерий.

2.2.1.5. Окраска жгутиков по Леффлеру.

2.2.1.6. Метод раздавленной капли.

2.2.1.7. Протеолитические свойства микроорганизмов.

2.2.1.8. Определение сероводорода.

2.2.1.9. Определение аммиака.

2.2.1.10. Определение индола.

2.2.1.11. Определение редуцирующей способности.

2.2.1.12. Определение сахаролитической способности.

2.2.1.13. Определение каталазы.

2.2.1.14. Определение антагонистической активности.

2.2.1.15. Обнаружение капсулы и определение ее природы.

2.2.2. Физико-химические методы анализа.

2.2.2.1. Спектрофотометрическое определение полихлорфенолов

3. АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК BACILLUS С ERE US НА ПРИРОДНЫХ ЦЕОЛИТАХ

3.1. Исследование влияния природных цеолитов на морфологокультуральные и физиолого-биохимические характеристики Bacillus cereus.

3.2. Исследование влияния 2,4-ДХФ на морфолого-культуральные характеристики культуры Bacillus cereus.

3.3. Определение токсичности природных цеолитов и 2,4-ДХФ.

3.4. Характеристики сорбции Bacillus cereus природными цеолитами

4. БИОДЕГРАДАЦИЯ 2,4-ДХФ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ И СУСПЕНДИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ BACILLUS CEREUS.

5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНТЕРМЕДИАТОВ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. сю

6. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРООРГАНИЗМА-ДЕСТРУКТОРА

ПОЛИХЛОРИРОВ АННЫХ ФЕНОЛОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деградация 2,4-дихлорфенола иммобилизованными и суспендированными клетками Bacillus cereus"

Актуальность работы.

Признание озера Байкал, как участка мирового природного наследия, накладывает на мировое сообщество и, в первую очередь, на Россию обязательства по сохранению озера для будущих поколений людей. Среди органических акваэкотоксикантов особую опасность для экосистемы озера представляют полихлорированные фенолы. Согласно разработанному «Перечню вредных веществ, вредных для экосистемы озера Байкал», полихлорированные фенолы относятся к категории «особо опасных» веществ, содержание которых в воде озера Байкал и его притоков недопустимо [1]. В действительности же, на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате (БЦБК) полихлорфенолы образуются при хлорной отбелке целлюлозы и обнаруживаются в воде озера Байкал, в зоне сброса очищенных сточных вод [2]. Присутствие полихлорфенолов в бассейне реки Селенги, главного притока озера, обусловлено локальными антропогенными и природными источниками [3]. Особенностью этих соединений является высокая токсичность для акваэкосистем, способность к биоаккумуляции, относительная устойчивость к разложению в окружающей среде. Поэтому, актуальной является проблема их принудительной деградации, с целью защиты окружающей среды.

Биологический метод, основанный на применении активных микроорганизмов-деструкторов, в большинстве случаев является наиболее экономически обоснованной альтернативой химическим и физико-химическим методам. Причем, эффективность биологической обработки повышается при иммобилизации клеток микроорганизмов, что широко используется в практике при очистке промышленных стоков [4].

Весьма перспективным является применение метода адсорбционной иммобилизации на неорганическом носителе - природных цеолитах, обладающих биологической активностью, кислотоустойчивостью и уникальным сочетанием адсорбционных, катионообменных и каталитических свойств. Природные цеолиты также обладают способностью интенсифицировать клеточные процессы, но механизмы их цитотоксического и активирующего действия остаются неясными [5].

В связи с этим, несомненный интерес представляет исследование воздействия цеолитов на микробные клетки и возможности их использования в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов с целью интенсификации биологической очистки сточных вод, содержащих полихлорфенолы. Ранее, из ила пруда-аэратора БЦБК была выделена и идентифицирована как Bacillus cereus новая культура, обладающая наибольшим деструктивным потенциалом по отношению к 2,4-дихлорфенолу [6].

Поэтому, обоснованной и актуальной представляется проблема обезвреживания токсичных полихлорфенолов с применением новых микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на природных цеолитах.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Байкальского института природопользования СО РАН по научному направлению подпрограммы СО РАН 17.7. «Защита атмосферы, природных вод и почв» и являлась частью проекта «Разработка физико-химических основ новых высокоэффективных технологий обезвреживания стойких органических загрязнителей природных и сточных вод».

Цель работы. Исследование процесса иммобилизации на природных цеолитах культуры Bacillus cereus (далее В.cereus) и разработка биотехнологического способа обезвреживания полихлорированных фенолов с использованием иммобилизованных и суспендированных клеток.

Основные задачи:

• исследовать влияние природных цеолитов Холинского месторождения Республики Бурятия на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические характеристики В. cereus\

• определить характеристики сорбции клеток В. cereus природными цеолитами Холинского месторождения;

• исследовать процесс иммобилизации клеток В. cereus на природных цеолитах, получить иммобилизованные клетки В. cereus-,

• изучить кинетику биодеградации 2,4-ДХФ иммобилизованными на природных цеолитах и суспендированными клетками В. cereus;

• идентифицировать продукты биодеградации 2,4-ДХФ и оценить их токсичность;

• разработать биотехнологическую схему очистки сточных вод с использованием иммобилизованных клеток В. cereus.

Научная новизна работы. В работе показана возможность использования природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия) в качестве матрицы для иммобилизации микроорганизмов В. cereus. Исследован механизм сорбции клеток В. cereus на природных цеолитах Холинского месторождения. Продемонстрирована способность иммобилизованных на природных цеолитах клеток В. cereus разлагать 2,4-ДХФ в статических условиях. Методом хромато-масс-спектрометрии идентифицированы основные продукты биодеградации 2,4-ДХФ данным микроорганизмом и установлена их нетоксичность. Выявлена перспективность применения иммобилизованных клеток культуры В. cereus для эффективной утилизации полихлорированных фенолов.

Практическая значимость. Получены иммобилизованные клетки микроорганизма-деструктора полихлорфенолов В. cereus с использованием природных цеолитов Холинского месторождения (Республика Бурятия), определены оптимальные условия их иммобилизации. Показано, что после иммобилизации клетки сохраняют деструктивную активность по отношению к 2,4-ДХФ.

Проведены укрупненные производственные испытания разработанной технологии очистки сточных вод от полихлорфенолов (ЗАО «Кондитерпром», г. Улан-Удэ (Акт испытаний №1 от 17.07.2007г.)).

Результаты исследований включены в отчеты Байкальского института природопользования СО РАН по проекту 17.7 приоритетного направления СО РАН «Разработка физико-химических основ новых высокоэффективных технологий обезвреживания стойких органических загрязнителей природных и сточных вод», экспедиционным грантам СО РАН, гранту федеральной целевой программы "Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы" (2004 г.) «Комбинированное фотолитическое и биологическое окисление хлорированных фенолов с применением ультрафиолетовых эксиламп емкостного разряда», гранту Правительства Республики Бурятия для молодых ученых на выполнение НИР по теме «Инновационная технология обезвреживания промышленных стоков, содержащих хлорфенолы» (2005 г.), гранту ФЦНТП РИ-19.0/001/014 «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы «Разработка инновационной окислительной технологии деградации фенольных пестицидов иммобилизованными микроорганизмами» (2006 г.).

Апробация работы. Результаты работы представлялись на международных и региональных конференциях и симпозиумах: «Проблемы устойчивого развития региона» (г. Улан-Удэ, 2004), «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (г. Улан-Удэ - Улан-Батор, 2004), «Кожа и мех в XXI веке: технология, качество, экология, образование» (г. Улан-Удэ, 2006), «Трансграничные аспекты использования природно-ресурсного потенциала бассейна реки Селенги в новой социально-экономической и геополитической ситуации» (г. Улан-Удэ, 2006), «Участие молодых ученых, инженеров и педагогов в разработке и реализации инновационных технологий» (г. Москва, 2006), Всероссийская конференция молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007), IV школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов и списка использованных источников (135 наименований). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 10 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Центер, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что природные цеолиты не оказывают угнетающего действия на клетки В. cereus вследствие нейтральности сорбента и нетоксичности его по отношению к бактериальной клетке. Показан стимулирующий эффект воздействия природных цеолитов на физиолого-биохимические свойства клеток В. cereus.

2. Определена сорбционная активность природных цеолитов Холинского месторождения по отношению к клеткам В. cereus. Адсорбция клеток В. cereus на поверхности природных цеолитов происходит за счет белковых капсул. Средняя степень адсорбции клеток В. cereus на природных цеолитах составила 86%.

3. Разработан способ иммобилизации клеток микроорганизма В. cereus, получены иммобилизованные клетки.

4. Установлено, что скорость деградации 2,4-ДХФ иммобилизованными на природных цеолитах клетками В. cereus выше в 1,9 раза скорости деградации 2,4-ДХФ суспендированными клетками в статических условиях.

5. С помощью хромато-масс-спектрометрии идентифицированы продукты биодеградации 2,4-ДХФ. Найдено, что основным продуктом биодеградации 2,4-ДХФ является нетоксичная фталевая кислота.

6. Разработана биотехнологическая схема очистки сточных вод, содержащих 2,4-ДХФ, при исходной концентрации до 300 мкМ, с использованием иммобилизованных на природных цеолитах клеток В. cereus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Центер, Ирина Михайловна, Улан-Удэ

1. Перечень веществ, вредных для экосистемы озера Байкал. Проект. М., МПР РФ, 2004.

2. Бейм A.M., Белявцева Г.В., Горохова В.Г., Горохов А.Г., Бабкин В.А. Хлорорганические соединения, поступающие в Байкал со сточными водами Байкальского целлюлозно-бумажного комбината // Химия в интересах устойчивого развития, 1997. Т.5, №4 - С. 383-392.

3. Батоев В.Б., Нимацыренова Г.Г., Дабалаева Г.С., Палицына С.С. Оценка загрязненности хлорированными фенолами бассейна реки Селенги // Химия в интересах устойчивого развития, 2005, Т. 13, №1 -С. 31-35.

4. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Грегирчак Н.Н. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикладная биохимия и микробиология, 2005. Т.41, №1 - С.58-63.

5. Фалилеева О. Ю. О исследовании молочнокислых бактерий и природных сорбентов для получения препарата профилактического действия: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук / ВСГТУ.- Улан-Удэ, 1999.-21 с.

6. Kiefer M. C., Hengraprom S., Knuteson S., Environmental Engineering Chemistry II: Environmental Organic Chemistry, Organochlorines: Analysis of the Chlorophenol Group, 1998.

7. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Toxicological Profile for Chlorophenols. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 1999.

8. Environmental Handbook. Volume III: Compendium of environmental standards Chlorophenols, 1995.

9. Ю.Белоусова М.Я., Авгуль T.B., Сафронова H.C. Основные свойства нормируемых в водах органических соединений. М.: Наука, 1987. 104 с.

10. П.Федоров JI.A., Мясоедов Б.Ф. Диоксины: химико-аналитические аспекты проблемы // Успехи химии, 1990. Т. 59. № 11 - С. 1818-1866.

11. Бартулевич Я., Ягов Г.В. Методы определения ПАУ в объектах окружающей среды // Питьевая вода, 2001. № 6 - С. 11.

12. Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение, М.: Изд-во ВНИРО, 1999.

13. СанПиН 2.1.4.559-96. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества: Санитарные правила и нормы, М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России, 1996.- 111 с.

14. Crommentuijn Т., Sijm D., J. de Bruijn, К. van Leeuwen, E. van de Plassche. Maximum permissible and negligible concentrations for some organic substances and pesticides // Environm. Management, 2000. № 58 - pp. 297-312.

15. Ambient Water Quality Guidelines For Chlorophenols (Overview Report). Canada: Ministry of Water, Land and Air Protection, 1997.

16. Bright D., Hodson P., Lehtinen K.-J., McKague В., Rodgers J., Solomon K. Evaluation of Ecological Risks Associated with the Use of Chlorine Dioxide for the Bleaching of Pulp, 1993.

17. Juuti S., Vartiainen Т., Joutsenoja P., Ruuskanen J. Volatile organochlorine compounds formed in the bleaching of pulp with CIO2 // Chemosphere, 1996. -№33-pp. 437-448.

18. Елин E.C. Фенольные соединения в биосфере. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2001. - 392 с.

19. McNaught D.C., Beim A.M. Ecotoxicological assessment of treated effluents on phytoplankton and zooplankton of Lake Baikal // Siberian J. Ecol., 1997. -№ 2-pp. 199-203.

20. Белявцева Г.В., Горохова В.Г., Бабкин B.A., Бейм A.M. Идентификация токсичных хлорорганических соединений, поступающих в озеро Байкал со сточными водами целлюлозного производства // География и природные ресурсы, 1993. № 3 - С. 77-80.

21. Белявцева Г.В., Дубовенко Ж.В. Хлорорганические вещества в донных отложениях Южного Байкала // География и природные ресурсы, 1994. -№ 2-С. 61-64.

22. Артемова Н.Б., Барам Г.И., Надобнов С.В. Накопление хлорфенолов в рыбах приемных водоемов предприятий целлюлозной промышленности // Доклады Академии наук, 1989. Т. 309, № 2 - С. 508-511.

23. Барам Г.И., Маринайте И.И., Надобнов С.В. Групповое определение хлорфенолов в желчи рыб как тест на загрязнение водоема стоками предприятий целлюлозной промышленности // Журнал физической химии, 1991. -Т. 65, №12 С. 3369-3374.

24. Stepanova L. I., Glaser V. M., Savinova Т. I., Kotelevtsev S. V., Savva D. Accumulation of Mutagenic Xenobiotics in Fresh Water Lake Baikal and Marine Hornoya Island Ecosystems // Ecotoxicology, 1999. № 8 - pp. 8396.

25. WHO. World Health Organization, Environmental Health Criteria Monograph (EHC), Environmental Health Criteria 93. Chlorophenols other than pentachlorophenol, 1989.

26. The United Kingdom Marine Special Areas of Conservation (SACs), Project Report, 2001.

27. Gribble G. W. The diversity of naturally produced organohalogens // Chemosphere, 2003. № 52 - pp. 289-297.

28. Ballschmiter K. Pattern and sources of naturally produced organohalogens in the marine environment: biogenic formation of organohalogens // Chemosphere, 2003. № 52 - pp. 313-324.

29. Keene W.C. The Natural Chemistry of Inorganic Chlorine in the Lower Atmosphere: A Potential Source for Organochlorine Compounds, The Natural Chemistry of Chlorine in the Environment. Euro Chlor publication, 1999.

30. Asplund G., Grimvall A. Organohalogens in Nature // Environ. Sci. Technol., 1991.-Vol.25, №8-pp. 1347-1350.

31. Flodin C., Ekelund M., Boren H., Grimvall A. Pyrolysis-GC/AED and pyrolysis-GC/MS analysis of chlorinated structures in aquatic fulvic acids and chlorolignins // Chemosphere, 1997 Vol.34, №11 - pp. 2319-2328.

32. Hodin F., Boren H., Grimvall A. Formation of chlorophenols and related compounds in natural and technical chlorination processes // Water Science Technology, 1991. Vol.24, № 3/4 - pp. 403-410.

33. Miiller G. Sense or ло-sense of the sum parameter for water soluble «adsorbable organic halogens» (AOX) and «absorbed organic halogens» (AOX-S18) for the assessment of organohalogens in sludges and sediments // Chemosphere, 2003. №52 - pp. 371-379.

34. Grimvall A. Natural Organochlorines in Precipitation and Surface Waters. The Natural Chemistry of Chlorine in the Environment. Euro Chlor publication, 1999.

35. Аюкаев Р.И., Петров Е.Г., Аюкаев P.P. Проблемы удаления гумусовых веществ из поверхностных и подземных вод в России // Вода и Экология, 2000. № 1 с. 10-12 .

36. Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере // Соросовский образовательный журнал, 1997. №2 с.56-63 .

37. The Natural Chemistry of Chlorine in the Environment. A Series of Overviews by a Panel of Independent Scientists. Brussel: World Chlorine Council, 1999.

38. Peuravuori J., Paaso N., Pihlaja K. Sorption behavior of some chlorophenols in lake aquatic humic matter // Talanta, 2002. №56 - pp. 523-538.

39. Burrows H.D., M. Canle L, Santaballa J.A., Steenken S. Reaction pathways and mechanisms of photodegradation of pesticides // J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 2002. №67 - pp. 71-108.

40. Getoff N., Solar S. // Radiation Physics and Chemistry, 1986. №28 - p. 443.

41. Vollmuth S., Zajc A., Niessner R. // Environmental Science and Technology, 1994. №28 - p. 1145.

42. Pandiyan Т., Martinez Rivas O., Orozco Martinez J., Burillo Amezcua G., Martinez-Carrillo M.A. Comparison of methods for the photochemical degradation of chlorophenols // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 2002-№146-pp. 149-155.

43. Benitez F. Javier, Acero Juan L., J. Real F., Garcia J. Kinetics of photodegradation and ozonation of pentachlorophenol // Chemosphere, 2003. -№51-pp. 651-662.

44. Tarasenko V.F., Chernov E.B., Erofeev M.V., Lomaev M.I., Panchenko A.N., Skakun V.S., Sosnin E.A., Shitz D.V. UV and VUV excilamps excited by glow, barrier and capacitive discharges // Appl. Phys. A Suppl., 1999. -N69.-pp. 327-S329.

45. Zhang J.-Y., Boyd I.W. Lifetime investigation of excimer UV sources // Applied Surface Science, 2000. №168 - pp. 296-299.

46. Baum G., Oppenlander T. Vacuum UV - oxidation of chloroorganic compounds in an excimer flow through photoreactors // Chemosphere, 1995. -Vol.30, №9-pp. 1781-1790.

47. Bazyl O.K., Kopylova T.N., Sokolova I.V., Sosnin E.A., Svetlitchnyi V.A., Tarasenko V.F., Tchaikovskaya O.N. Improvement of photodecomposition methods of phenol containing ecotoxicants in aqueous media // Proceedings SPIE, 2002. Vol.4147 - pp. 240-244.

48. Vialaton D., Richard C. Phototransformation of aromatic pollutants in solar light: Photolysis versus photosensitized reactions under natural water conditions // Aquat. Sci., 2002. №64 - pp. 207-215.

49. Vialaton D., Richard C., Baglio D., Paya-Perez A-B. Phototransformation of 4-chloro-2-mrthylphenol in water: influence of humic substances on the reaction // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 1998. №119 - pp. 3945.

50. Silva M.I., Burrows H.D., Miguel M.G., Formosinho SJ. Tris-2-2'-bipyridylruthenium (II) peroxydisulphate as a photosensitizer in the oxidative degradation of 4-chlorophenol // Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 1996. -№100 -pp. 138-143.

51. Axelsson A.-K., Dunne L.J. Mechanism of photocatalytic oxidation of 3,4-dichlorophenol on T\02 semiconductor surface // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 2001. №144 - pp. 205-213.

52. Tseng J.M., Huang C.P. Removal of chlorophenols from water by photocatalytic oxidation // Water Science Technology, 1991. №23 - pp. 377-387.

53. Djebbar K., Sehili T. Kinetics of heterogeneous photocatalytic decomposition of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid over titanium dioxide and zinc oxide in aqueous solution // Pestic. Sci., 1998. №54 - pp. 269-276.

54. Legrini O., Oliveros E., Braun A.M. Photochemical processes for water treatment // Chem. Rev., 1993. №93 - pp. 671-698.

55. Kim S-M., Vogelpohl A. Degradation of organic pollutants by Photo-Fenton-Process // Chem. Eng. Technol., 1998. Vol. 21, №2 - pp. 187-191.

56. Hirvonen A., Trapido M., Hentunen J., Tarhanen J. Formation of hydroxylated and dimeric intermediates during oxidation of chlorinated phenols in aqueous solution // Chemosphere, 2000 №41 - pp. 1211-1218.

57. Fukushima M., Tatsumi K. Degradation pathways of pentachlorophenol by photo-Fenton systems in the presence of iron (III), humic acid, and hydrogen peroxide // Environ. Sci. Technol., 2001. №35 - pp. 1771-1778.

58. Benitez F.J., Beltran-Heredia J., Acero J.L., Rubio F. J. Contribution of free radicals to chlorophenols decomposition by several advanced oxidation processes // Chemosphere, 2000. №41 - pp. 1271-1277.

59. Mazellier P., Bolte M., 3-Chlorophenol elimination upon excitation of dilute1. У Airon (III) solution: Evidence for the only involvement of Fe(OH) // Chemosphere, 2001. №42 - pp. 361-366.

60. Yeber M.C., Rodriguez J., Freer J., Baeza J., Duran N., Mansilla H.D. Advanced oxidation of a pulp mill bleaching wastewater // Chemosphere, 1999.-Vol.39, №10-pp. 1679-1688.

61. Маркушева T.B., Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Уфа: Гилем, 2002. 108 с.

62. Соляникова И.П., Головлева JI.A. Фенол гидроксилазы: современное состояние вопроса (Обзор) // Биохимия, 1999. Т. 64, № 4 - С. 437-446.

63. Финкелыитейн З.И., Баскунов Б.П., Головлев E.JL, Моисеева О.В., Вервурт Ж., Ритьенс И., Головлева JI.A. Зависимость превращения хлорфенолов родококками от положения и числа атомов хлора в ароматическом кольце // Микробиология, 2000 Т.69, №1 - С.49-57.

64. Genthner B.R.S., Price II W.A., Pritchard Р.Н. Anaerobic degradation of chloroaromatic compounds in aquatic sediments under a variety of enrichment condition // Applied and environmental microbiology, 1989. -№55-pp. 1466-1471.

65. Takeuchi R., Suwa Y., Yonezawa Y. Anaerobic transformation of chlorophenols in methanogenic sludge unexposed to chlorophenols // Chemosphere, 2000. №41 - pp. 1457-1462.

66. Atuanya E.I., Purohit H.J., Chakrabarti T. Anaerobic and aerobic biodegradation of chlorophenols using UASB and ASG bioreactors // World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2000. -№16 pp. 95-98.

67. Моисеева O.B., Линько E.B., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus lcp I I Микробиология, 1999. T.68, №4. - С. 461-466.

68. Шадрин A.M., Белицкий И. А., Балтухин В.П. Природные цеолиты Сибири и возможности их применения в сельском хозяйстве // Применение цеолитовых туфов в сельском хозяйстве, 1990. № 1 С. 49.

69. Кодама Т., Накахара Т., Омори Т., Бинх Н.Т., Хашино К., Минода И. // Сб. тез. Рост микроорганизмов на С соединениях. - Пущино. - 1977. С. 213-215.

70. Шадрин A.M. О перспективах применения цеолитовых туфов при охране окружающей среды // Природные цеолиты в социальной среде и охране окружающей среды, 1990. № 2 С. 36-42.

71. Баурмистров В.А., Рачковская JI.H., Ровнина А.К. и др. Специфические иммуносорбенты для профилактики и лечения вирусных заболеваний // Сб. тез. Природные материалы на службе человека. Новосибирск. -1997. - С.169-171.

72. Рыбникова В.И., Закиева М.И. Очистка фенолсодержащих геотермальных вод иммобилизованными микроорганизмами // Химия и технология воды, 1990.Т.12, №9 С.857-858.

73. Шунгит, цеолит, фильтры для очистки воды. http://www.promc.ru/ceolite/characteristics.htm

74. Гвоздяк П.И., Моголевич Н.Ф., Куликова Н.И., Романова Е.А., Нездойминов В.И. Очистка фенолсодержащих сточных вод закрепленными микроорганизмами // Химия и технология воды, 1989. Т.11, №1 С. 73-75.

75. Sabhi S., Kiwi J. Degradation of 2,4-dichlorophenol by immobilized iron catalysts // Chlorophenols degradation on Nafion-Fe films. 2001. C.1994-2002.

76. Китова A.E., Кувичкина Т.Н., Аринбасарова А.Ю., Решетилов А.Н. Деградация 2,4-динитрофеиола свободными и иммобилизованными клетками // Прикладная биохимия и микробиология, 2004. Т.40, №3 -С.307-311.

77. Биотехнология. Принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса. Д. Беста, Д. Джонса.- М.: Изд-во "Наука" , 1988.479 с.

78. Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. Биотехнология. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. М.: Наука, 1987. 151 с.

79. Ростмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. Киев: Изд-во "Наука", 1978. 267 с.

80. Дубровский B.C., Виестур Э.У. Метановое сбраживание сельскохозяйственных отходов. Рига: Изд-во "Знание" , 1988. 303 с.

81. Lettingas C.S., Van Velson W., Hobma W. et al. // Biotechnolog. Bioeng., 1980. T. 22. C. 699-734.

82. Гвоздяк П.И. Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино, 1988. С. 56-61.

83. Сиденко В.П., Мордвинова Д.И., Яроцкая Н.Е. и др. // Микробиологический журнал, 1987. Т. 48. С. 26-29.

84. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 288 с.

85. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум пищевых продуктов животного происхождения. М.: Агропромиздат, 1990. 233 с.

86. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-331 с.

87. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

88. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. М.: Издательский центр "Академия", 2005. - 608 с.

89. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1985.- 128 с.

90. Панкратов А.Я., Григорьев B.C., Кащенко P.JI. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. М.: Изд-во "Пищевая промышленность", 1975.-218 с.

91. Wang Si-Jing, Loh Kai-Chee. Facilitation of cometabolic degradation of 4-chIorophenoI using glucose as an added growth substrate // Biodegradation, 1999. №10 - pp. 261-269.

92. В. Б. Батоев, В.Ж. Цыренов, Г.Г. Нимацыренова, Е.Г. Инешина, Г.С. Дабалаева, И.М. Почерней. Деструкция хлорфенолов микроорганизмами пруда-аэратора Байкальского ЦБК // Экология и промышленность России 2004, № 9 - С. 22 - 24.

93. Te-Fu L. Но, James R. Borton, 1998. Toxicity changes during the UV treatment of pentachlorophenol in dilute aqueous solution // Water Research, v.32, № 2, pp.489-497.

94. Petanen Т., Romantschuk, M., 2002. Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts. // Analytica Chimica Acta, 456 (1), pp.55-61.

95. Walker C.H., Hopkin S.P., Sibly R.M. and Peakall D.B., 1996. Principles of Ecotoxicology. Tailor & Francis Ltd., London, UK.

96. BarthaR., 1986. //Mycrobial Ecology, v.12, pp. 155-172.

97. Leahy J.G., Colwell R.R., 1990. // Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 54, pp. 305-315.

98. Morgan P., Watkinson R., 1989. // Critical Reviews Biotechnology v. 8, pp.305-333.

99. Streinberg S.M., Poziomek E.J., Englemann W.H. and Rogers K.R., 1995. A review of environmental applications of bioluminescence measurements // Chemosphere 30, pp.2155-2197.

100. Bulich A.A., Tung K.K. and Sheibner G., 1990. The luminescent bacteria toxicity test its potential as an in vitro alternative // J. Biolum. Chemilum. 5, pp.71-77.

101. Strachan G. et al. 2001. Use of bacterial biosensors to interpret the toxicity and mixture toxicity of herbicides in freshwater // Wat. Res., v. 35, № 14, pp.3490-3495.

102. Petanen T. et al. 2003. Assessing sediment toxicity and arsenite concentration with bacterial and traditional methods // Environmental Pollution 122, pp.407-415.

103. Cook, S.V., Chu, A., Goodman, R.H., 2000. Influence of salinity on Vibrio fisheri and /^-modified Pseudomonas fluorescens toxicity bioassays. // Environmentally Chemistry and Toxicology 19, pp. 2474-2477.

104. Pollumaa, L. et al., 2000. Toxicological investigation of soils with solid-phase flash assays: comparisation with other ecotoxicological tests. ATLA 28, pp. 461-472.

105. Sousa , S., Duffy, C., Weitz, H., Glover, L.A., Bar, E., Henkler, R., Killham, K., 1998. Use of /шг-modified bacterial biosensor to identify constrains to bioremediation of BETX-contaminated sites // Environ. Toxicol. Chem.17, pp. 1039-1045.

106. M. Kaushal Sharma, R.C. Sobti, 2000. Rec effect of certain textile dyes in Bacillus subtilis II Mutation Reseach 465, pp.27-38.

107. Hirano К., Hagiwara Т., Ohta Y., Matsumoto H., Kada Т., 1982. Rec-assay with spores of Bacillus subtilis with and without metabolic activation // Mutat. Res. 97, pp. 339-347.

108. Kada Т., Sadaie Y., Sakamoto Y., Hirano K., 1984. Use of the Bacillus subtilis rec-assay in environmental mutagen studies, in H. Ernest, Y. Chu, M.G. Walderico (Eds.) // Mutation, Cancer and Malformation, Plenum, New York, pp. 197-216.

109. McGrath R., Singleton I., 2000. Pentachlorophenol transformation in soil: a toxicological assessment // Soil Biology & Biochemistry 32, pp. 13111314.

110. Ruckdeschel G., Renner G., 1986. Effects of pentachlorophenol and some of its known and possible metabolites on fungi // Applied and Environmental Microbiology 51, pp. 1370-1372.

111. Walker G.C., 1984. Mutagenesis and inducible responses to DNA damage in Escherichia coli II Microbiol. Rev. 48, pp.60-93.

112. Sinclair G.M., Paton G.I., Mehard A.A. and Killham K., 1999. Lux-biosensor assessment of pH effects on microbial sorption and toxicity of chlorophenols // FEMS Microb. Lett. 174, pp.273-278.

113. Синицын А.П., Райнина Е.И., Бачурина Г.П. и др. -Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пущино, 1987. С. 86-95.

114. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Д. Вудворда. М.: Изд-во МГУ, 1998. - 215 с.

115. Домбровская В.А., Оверченко М.Б. Биотехнология, 4. 1988, 5. С. 643-647.

116. Шурубикова А.А. Исследование влияния природных цеолитов на Saccharomyces cerevisiae для решения биотехнологических задач: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук / ВСГТУ. -Улан-Удэ, 2004.-19 с.

117. Григорьев А.В., Картель Н.Т., Бондаренко В.М. и др. Адгезия патогенной микрофлоры на углеродных сорбентах // Микробиология -2001, №7 — С-11-13.

118. Малашенко Ю.Р., Гринберг Т.А. и др. Биотехнология, 3, 1987, 3. С. 383-390.

119. Биотехнология. Принципы и применение. Под ред. И. Хиггенса, Д.Беста, Д.Джонса. М., 1988. С. 479.

120. Beltran J. Н., Torregrosa J., Dominguez J.R., Gracia J. Treatment of black-olive wastewater by ozonation and aerobic biological degradation // Wat. Res., 2000. Vol. 34, N14. - pp. 3515-3522.

121. Solyanikova I.P., Golovleva L.A. Bacteria degradation of chlorophenols: pathway, biochemical, and genetic aspects // Journal of environmental science and health, 2004. -Vol. B39, N 3. pp. 333-346.