Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деформации клеточных мембран в электрических полях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Деформации клеточных мембран в электрических полях"

V

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ГРИЦЕНКО Галина Витальевна

УДК 577.352

ДЕФОРМАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЯХ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в отделе биоэлектрохимии. Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина АН СССР

Научный руководитель: член-корр. АН СССР Ю.А.Чизмадкев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин кандидат биологических наук А.А.Булычев

Ведущая организация: Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР

г Ро

7Ь час.

Защита состоится "С- г (У/г-дюУ I г. в

на заседании Специализированного совета К 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета.МГУ

Автореферат разослан "лТ" 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Изучение механических свойств клеточных ябран является одним из важных направлений современной эфизики. Способность клеточных мембран к деформации является цественным фактором, обеспечивающим многие процессы знедеятельности клеток, такие как изменение формы, образование зличных мембранных отростков, эндо- и экзоцитоз, слияние и др.

Наиболее подробно изучаются механические свойства мембран атроцитов. Это связано с важным физиологическим значением таких следований, поскольку деформируемость эритроцитов является ним из основных факторов, обеспечивающих нормальное нкционирование кровеносной системы. Кроме того, эритроциты зкопитащих являются относительно просто устроенными клетками, этому их часто используют для изучения различных свойств алогических мембран.

Большинство существующих методов позволяют лишь качественно учать деформируемость эритроцитов. Немногочисленные методы, торые позволяют количественно исследовать вязкоулругие рактеристики этих клеток имеют, как правило, значительные достатки и ограничения. Кроме того, подавляющая часть методов учения деформируемости связана с исследованием механических ойств целых клеток. Однако известно, что клеточная мембрана ладает функциональной неоднородностью, и локальные изменения ханических свойств отдельных ее участков могут играть важную ль в различных физиологических процессах. Трудности в следовании локальных механических свойств клеточных мембран язаны прежде всего с отсутствием соответствующих методов.

Значительный интерес представляет также способность еточных мембран к деформации под влиянием сильных электрических лей, которые в последние годы широко используются в олтехнологии для электропорации, электрослияния и ектротрансформации клеток разных типов.

Целью работы является исследование механических свойств еточных мембран и их отдельных участков. В работе поставлены едущие задачи:

Разработать метод, позволяющий качественно и количественно следовать механические и адгезионные свойства клеточных мбран.

2. Использовать этот метод для изучения деформируемости и адгег эритроцитов человека в различных условиях In vitro.

3. Разработать метод исследования локальных механических свойс отдельных участков клеточных мембран.

4. Применить этот метод для изучения локальных механичесг свойств мембран эритроцитов и способности этих клеток изменя свою форму.

5. Исследовать влияние сильных электрических полей на морфолог и деформируемость клеточных мембран.

Научная новизна и практическая ' ценность. Разработан hoi оригинальный метод качественного и количественного исследовав механических и адгезионных свойств эритроцитов, основанный явлении диэлектрофореза. Предложена (совместно с П.И.Кузьмины теоретическая модель деформации цепочки клеток, учитывают упругие свойства эритроцитов, их взаимодействие друг с другом в внешним полем. Оценена величина модуля сдвига мембраны эритроци и удельная энергия межклеточного взаимодействия для случ необратимых цепочек.

Разработан также метод локальной деформации одиночн эритроцитов с помоиц>ю внешней силы в высокочастотном перемени электрическом поле. Впервые установлено, что под действи приложенной к мембране внешней силы эритроцит может образовыва мембранные структуры, свойственные другим клеткам (отростки, ни ретракции, лаыеллоподобные структуры) но не способен стабилизировать. Обнаружено также, что локальные неоднородное (спикулы) на поверхности эхиноцитов контролируются упруг спектрин-актиновым мембранным скелетом эритроцита.

В работе исследованы также основные закономерное деформации клеточных мембран после наложения на клетки импульс высокой интенсивности. Показано, что данный процесс являет обратимым, осмотически зависимым, электроиндуцируемые деформац формируются преимущественно на полюсах клетки, где во вре электрической обработки напряжение максимально.

Предложенные в работе методы могут применяться д качественного и количественного исследования механических адгезионных свойств эритроцитов и других клеток, в также д изучения механических свойств отдельных участков клеточн мембран в норме и при различных патологических процесса

Тема диссертации является частью плановых работ отде Биоэлектрохимии ЮЛАН по изучению механических свойств клеточн

лбран в электрических шлях. Регистрационный № 0186.0055865, { Л 10103-987 от 19.06.8?.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались Всесоюзном рабочем совещании по биоэлектрохимии (Суздаль 35), на 4-м международном Фрумкинском симпозиуме (Суздаль 38), на Всесоюзном совещании по биоэлектрохимии мембран (Рига 90), на конференциях молодых ученых ИЭЛ им. А.Н.Фрумкина АН ЗР (1985-1990 гг.), на семинаре отдела Биоэлектрохимии ИЭЛ АН ЗР и на семинаре кафедры биофизики биологического факультета У им. М.В.Ломоносова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, список горых приведен в конце автореферата.

Объем__и__структура__дассертации. Диссертация состоит из

эдения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения,

водов и списка цитированной литературы. Работа изложена на _

раницах, иллюстрирована 26 рисунками. Список цитированной тературы содержит 215 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Свежие эритроциты человека получали непосредственно ред экспериментом у здоровых доноров. Использовали также клетки ителия трахеи быка (РВТ) из несинхронизированной монослойной льтуры, и фибробластоподобные клетки: ь-клетки мыши (линия 9), трансформированные фибробласты крысы (1?а1;-1), мышиные бриональные фибробласты (МЕР). Все клетки выращивали в среде ла с гидролизатом лактальбумина и 10$ сыворотки крупного гатого скота (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, оква). Для экспериментов использовали клетки на 2-3 день после ресева.

Подготовка__клеток__к__электричэской__дбр§Оотке. Эритроциты

¡нократно отмывали мягким центрифугированием в физиологическом ютворе (ФСБ), содержащем 145 мМ ГГаСХ, 3 мМ КС1, 3 мМ М&С12, I I СаС12, 5 мМ Нерев-ГСаОН, рН 7.4 и дважды в изотоничном растворе жарозьг, содержащем 290 мМ сахарозы и соответственно: I мМ ¡реэ-МаОН (рН 7,0 - 8,0), I ММ ЫЕВ-ИзОН (рН 5,0 - 7,0) ИЛИ I ММ !13-Н01 (рН 7,5 - 9,0). Для исследования деформируемости и сгезии эритроцитов в цепочках клетки ресуспендировали в ¡отоничном растворе сахарозы, помещали в экспериментальную гейку и подвергали электрической обработке.

Для изучения локальных деформаций разбавленную суспенэ эритроцитов в ФСБ наносили на покровные стекла и инкубировали мин при 37°С. Затем ФСБ заменяли на изотоничный раствор сахарс (290 мМ сахарозы, I мМ Нерев-МаОН, рн 7.4) и подвергали отдели эритроциты электрической обработке с помощью микроэлектродов.

РВТ-клетки снимали с • подложки культурального флако раствором трипсин-Версен (2:1), мер, rat-1 и ь-клетки - 0,2 раствором трипсина. Каплю суспензии клеток в ростовой сре помещали на покровные стекла и инкубировали 40-60 мин при 37 Перед экспериментом культуральную среду заменяли на ФСБ помещали покровные стекла в ячейку для электрической обработки.

Экспериментальные__ячейки_и__эл9к^отеская_обработка_клегд

Для изучения деформируемости и адгезии эритроцитов в потоке Он сконструирована специальная проточная ячейка, представляиц собой полую трубку диаметром 2 мм, внутри которой перпендикуляр оси трубки располагались электроды. Электродами служили остр: стальных игл, расположенные на расстоянии 86 мкм друг от друг. Каплю суспензии эритроцитов в изотоничном растворе сахароз: содержащую 103-104клеток помещали в ячейку и накладывали : электрода переменное электрическое поле частотой I МГц напряжением от 0 до 15 В по амплитуде (0-1700 В/см).

Для изучения деформируемости и адгезии эритроцитов I использовали также описанную в литературе ячейку с дву! параллельными цилиндрическими электродами (никелевые проволоч] диаметром 500 мкм, расстояние мезду ними 400 мкм). Каа суспензии эритроцитов (104-105клеток) в изотоничном раство; сахарозы помещали в ячейку и подавали на электроды перемени электрическое поле частотой I МГц и напряжением от 0 до 60 (0-1500 В/см).

Для изучения локальных деформаций эритроцитов к выбрани* клетке с помощью микроманипуляторов подводили два тонга вольфрамовых микроэлектрода (диаметр кончика 2-4 мкм) расстояния 10-15 мкм от поверхности клетки. На электроды подава. переменное электрическое поле частотой I МГц и напряжением от до 15 В (0-4500 В/см). В отдельных экспериментах в качест) электродов мы использовали тонкий слой алюминия, напыленного ] покровное стекло. В середине имелась непроводящая щель шириной ! мкм (участок стекла без металла), в которой прикрепившиеся стеклу эритроциты подвергались деформации при наложеш переменного электрического шля частотой I МГц и напряжением 32

500 В/см). 0

Для исследования деформаций клеточных мембран в сильных ектрических шлях была изготовлена разборная ячейка с раллельными электродами длиной 10 мм и расстоянием мевду ними О мкм. При стандартной электрической обработке на электроды давали серию из трех прямоугольных импульсов напряжением 72 В 300 В/см), длительностью 100 мкс и интервалом 0,4 с.

Световая микроскопия. За формированием цепочек эритроцитов и деформацией в электрическом поле и штоке наблюдали в томикроскоп "Carl Zeiss Jena" (ГДР), используя фазовый мерсионный объектив 40 и окуляр 12,5 со шкалой.

За изменением формы и локальной деформацией в электрическом яе одиночных эритроцитов наблюдали в инвертированный уоресцентный микроскоп РЬШУШТ "Leits" (ФРГ) при увеличениях 50 и 2000. Использовали фазовый иммерсионный объектив siaoo-100" о масляной иммерсией. Для наблюдения за деформацией зточных мембран после наложения серии импульсов использовали эт же микроскоп при увеличениях от 300 до 800.

■ Деформированные эритро-ш фиксировали в течение 5 мин 2%-швл раствором глутаральдегида 3erva", ФРГ) в изотокичном растворе сахарозы (290 мМ сахарозы, глутаральдегида, I мМ Hepes-NaOH, pH 7,2) в присутствии жтрического поля непосредственно под микроскопом. Затем шарага помещали в ФСБ с 2,5% глутаральдегида, pH 7,4 и [нксировали еще несколько часов. При деформации эритроцитов с ющью микроэлектродов какдый препарат содержал только одну :тянутую клетку, а при использовании тонкого слоя алюминия с фоводящей щелью - несколько десятков деформированных [троцитов в зазоре между электродами.

РБТ, МЕР, Rat-1 и L-клетки фиксировали 2,Ъ% раствором •таральдегида в ФСБ, pH 7,4 через разное время после наложения гульсов (от I до 20 мш).

Затем все препараты обезвоживали в возрастающих щентрациях ацетона, высушивали методом обхода критической ки в атмосфере С02, напыляли золотом и просматривали с помощью тирующего электронного микроскопа "Philips PSEM-500" (дерланда) или "Hitachi 405-А" (Япония) при увеличениях от 1250 20000.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Деформируемость и адгезия эритроцитов в клеточных цепочках, сформированных с помощью диэлектрофореза.

При наложении переменного электрического поля на суслен: эритроцитов в проточной ячейке или в ячейке с параллельш цилиндрическими электродами клетки концентрировались в зазс между электродами и формировали линейные агрегаты - клеточ! цепочки на электродах. Скорость движения клеток к электроду скорость формирования цепочек эритроцитов зависела от частота напряженности электрического поля. Характерное время процесса I стандартной электрической обработке (I МГц, 700 В/см) состава десятки секунд. В проточной ячейке мевду электрода формировалась только одна цепочка эритроцитов, а в ячейке параллельными цилиндрическими электродами - множество цепоче* полуцепочек (один конец цепочки свободен).

Деформация одиночной__цепочки эритроцитов в потоке. Постепен

увеличение скорости потока падкости (раствора сахарозы) че] проточную ячейку приводило к деформации (прогибу) цепе эритроцитов и при некотором критическом значении скорости клеточная цепочка разрывалась на две части в середине заз между электродами (Рис.16). Величина критической скорости у* прогиб цепочки при скоростях потока меньших V* зависели деформируемости -отдельных эритроцитов в цепочке, а также взаимодействия соседних клеток друг с другом и, следователь позволяли характеризовать эти свойства. Однако, получен информация оказалась недостаточной для количественной оце механических и адгезионных свойств эритроцитов в цепоч поэтому мы использовали также другой независимый метод. Деформация полуцепочки эритроцитов в переменном электрическом поле. Увеличение напряженности электрического поля в ячейкг параллельными электродами приводило к увеличению длины клеточ полуцепочек на электродах за счет деформации каждой из кле (Рис. 1а). При одинаковой величине силы, растягивая клетки, относительное удлинение полуцепочки эритроцитов та зависело от механических свойств клеточных мембран и свой межклеточных контактов.

Значения критической скорости ч* и прогиб одиночной цепе в штоке, а также деформируемость полуцепочек в шремеь

I

у=о

В

ни

щ

у =9*

%

■щ^яи

I. Деформация цепочки эритроцитов, а-полуцепочка эритроцитов на электроде (второй электрод удален) прн увеличении напряженности Е внешнего поля удлиняется за счет деформация каждой яз клеток; б-одгночная цепочка эритроцитов между электродами в проточной ячейке при увеличений! скорости потока деформировалась, н при крятпчесной скорости потока V* разрывалась на две части.

у* мм/с 10

500

то то е, а/см

8 рн

а-завясимость относительной длины подуцепочек эритроцитов от напряженности электрического поля (I МГц) в переходном интервале рН (значения рН - цифры у кривых); б-эавясимость критической скорости V"от рН среды в проточной ячейке. Напряженность поля 700 В/см.

электрическом поле зависели от условий эксперимента, и пре: всего от рН среда. Существенное изменение обеих характерно1 наблюдалось в области рН 6,2-6,3, причем увеличение критичеа скорости разрыва одиночной цепочки v* при уменьшении рН все: коррелировало с увеличением деформируемости цепочек и полуцепо эритроцитов в этих же условиях (Рис. 2). Подобное различие значениях критической скорости и деформируемости клеточ агрегатов при рН > 6,3 и рН < 6,2 отражало принципиаль изменение свойств цепочек. Гак, при выключении электрическ поля цепочки эритроцитов, сформированные в интервале рН от 6,3 9,0 быстро (за секунды) распадались на отдельные кле ("обратимые" цепочки). Напротив, линейные агрегаты, получен при рН 4,5 -6,2 после выключения поля оставались устойчивым течение длительного времени (60 мин. и более). Их мы бу называть "необратимыми". Напряженность электрического п практически не влияла на характер межклеточных взаимодействий обратимых (рН 6,3 - 9) и необратимых (рН 4,5 - 6,2) цепочках.

В течение некоторого времени после формирования (15-20 ы свойства цепочек можно было изменить, меняя внешние условия. 1 необратимые цепочки, сформированные при рН < 6,2 при повышения раствора сахарозы в ячейке до рН 6,4 и выше быстро (за неско; десятков секунд) изменяли свои свойства и после выключе электрического поля распадались на отдельные клетки (становш обратимыми). Одновременно изменялась также и деформируемо таких агрегатов -. она заметно уменьшалась и становш характерной для обратимых цепочек. Наоборот, при понижении обратимые агрегаты, сформированные при рН > 6,3 также за део секунд изменяли свойства и становились необратим Деформируемость таких цепочек также менялась (возраста. Свойства одних и тех же клеточных агрегатов можно было изме) несколько раз подряд. Важно, что изменение адгезионных cboi эритроцитов при изменении внешних условий всегда коррелирова: изменением их деформируемости, что связано, по-видимомУ: нарушениями в структуре мембранного скелета эритроцитов в условиях.

Адгезия эритроцитов в линейных агрегатах зависела так» ионной силы внешнего раствора. Построение клеточных цепоче помощью даэлектрофореза было возможно только при достат низкой ионной силе ( концентрация электролита не выше 1-2 Повышении ионной силы после построения цепочек (добавление

, 150 мМ NaCl, KOI, CaCl2) приводило к тому, что необратимые егаты довольно быстро (за секунда) становились обратимыми и падались на отдельные клетки. На степень необратимости агрегатов эритроцитов при рН ниже влияло также время наховдения клеток в контакте (время жизни очек, Табл. I, JK-3), и через 15-20 мин необратимые цепочки новились настолько прочными, что оказывались нечувствительными величению рН и ионной силы. Взаимодействие клеток в обратимых очках с течением' времени практически не менялось бл. I, * 6-8).

Таблица I

тическая скорость потока v*. необхо-ая для разрыва одиночных цепочек троцитов в проточной ячейке

Условия формирования t * у

цепочек мин мм/с

Обработка

рН среды проназой

6,1 - 0,5 9,0

6,1 - I 9,6

6,1 - 5 14,6

5,2 - 0,5 9,1

5,2 + 0,5 4,6

7,4 - 0.5 1,7

7,4 - I 1,8

7,4 - 5 2,0

7,4 + 0,5 1,75

В опытах 1-5 - необратимые (у^о.оэ), в 6-9 - обратимые (у** 0,01) цепочки. Напряженность электрического поля 700 В/см. ■ь-время жизни цепочки.

Для изучения возможной роли гликокаликса в образовании ледуемых менмембранных контактов эритроциты предварительно абатывали проназой (Табл. I, № 5,9). Из таких клеток при рН -7,4 получались практически нэдеформируемые обратимые цепочки, ако, при рН 4,0-5,4 обработанные проназой эритроциты мировали необратимые цепочки с заметно выраженной способностью деформации. Таким образом, эритроциты с частично удаленным кокаликсом в принципе были способны образовывать необратимые такты, но интервал рН, в котором такие агрегаты были Зратимыми, смещался в кислую сторону, и адгезия эритроцитов

•была заметно меньше, чем у контрольных клеток в этих же услов! (Табл. I, Ш 4,5).

Теоретическая модель. Для количественной обрабо' экспериментальных результатов нами совместно с П.И. Кузьмш была разработана теоретическая модель деформации цепо1 эритроцитов. В модели клетки представляются цилиндрами длиной радиусом Л и остаются цилиндрами при деформации цепочки. , случая необратимых цепочек данное допущение является правомера поскольку форма эритроцитов близка к цилиндрической из-значительной области контакта соседних клеток. Считается таю что площадь поверхности цилиндра Б0 остается постоянной ] деформации клетки.

Рассмотрим фрагмент цепочки, содержащий один межклвточ; контакт. Пусть длина этого фрагмента, равная длине клетки изменилась на малую величину <11. Натяжение цепочки Р, кото для данного фрагмента представляет собой внешнюю силу, соверш над ним работу Рса.Если цепочка находится в равновесии, то раб' внешней силы равна приращению свободной энергии фрагмента ада:

"<1УУ = Реп (I)

Энергию цепочки клеток № можно представить в виде суммы т слагаемых: энергии электрического поля И0Л , энергии упру деформации клетки и энергии межклеточного взаимодейст

(адгезии) яад:

« = «эл + "упр + 41 ал (2>

В описанных ячейках двух типов цепочки эритроци

деформируются двумя способами. В проточной ячейке одиноч

цепочка растягивается потоком вязкой жидкости (раство

сахарозы), направленным перпендикулярно цепочке. В этом слу

натяжение Р определяется скоростью потока V, вязкостью

плотностью р, длиной цепочки <1 (равной расстоянию ме

электродами) и прогибом цепочки б:

р = га2/86 (3)

где £ = 41сг)7/1п(7,4т)/^Д) - сила, действующая со стороны пот

жидкости на единицу длины бесконечного цилиндра диаметром А.Тс

условие равновесия цепочки клеток в проточной ячейке:

сУ 1с д2си га2

к(1-1 ж -®5- + 7)- •-■=;>--------7----= 0 (4)

0 Ы2 2 + 250/% 85

Здесь к - феноменологический коэффициент, учитывающий жесткс

этки; у - удельная энергия межклеточного взаимодействия, сленно равная работе, необходимой для разъединения двух нтактирущих мембран единичной площади; Ст-емкосгь единицы ощада контакта; V - напряжение на электродах; м-число клеток в почке. Это уравнение позволяет найти зависимость б(у) при нном напряжении.

В ячейке с параллельными электродами один конец цепочки ободен, другой - прикреплен к электроду. Натяжение Р в этом учае определяется напряженностью внешнего поля Е и зарядами q1, Аудированными около внутренних поверхностей клеточных мембран, ловие равновесия цепочки клеток в такой ячейке записывается в де:

л % &2(1)

1-10) - (С Е21Д(1)-2Т)- . -------7 = о (5)

т 4 VI + г50/%

о уравнение позволяет найти зависимость 1(Е2).

Оба условия равновесия (4) и (5) необходимо усреднить по емени, поскольку мы используем переменное электрическое поле (I ц). Такое усреднение сводится к заменам V2- у^/2 и Е2- Е^/2, е У0 и Е0 - амплитуда напряжения и напряженности внешнего поля ответственно.

Три группы экспериментов были обработаны с помощью выражений ) и (5). Во всех трех случаях цепочки были необратимыми, скольку именно в этом случае значение у представляет большой терес. Теоретические кривые проводили по методу наименьших адратов, при этом в каждом случае определяли два параметра ст/7 к/7.Затем из данных экспериментов в проточной ячейке с помощью рмулы (4) определяли значения Ст, 7 и к. Результаты приведены в бл.2.

Таблица 2

Рассчитанные на основании экспериментальных данных значения ;ельной энергии межклеточного взаимодействия 7 и жёсткости тки к (30 = 135 мкм2, 1р = 6,5 мкм)_

7-ГО4, 5К'М~2 к-Ю4, Н-м""1

0 1,1 + 0,1 1,8 ± 0,2

0 1,4 ± 0,1 2,6 ± 0,2

2 1,0 ± 0,2 1,8 ± 0,3

Если предположить, что основной вклад в "жесткость" клеи вносит сопротивление мембраны эритроцита деформациям сдвига, ч оценка соответствующего модуля упругости при деформащ эритроцитов в электрическом поле и потоке дает значение ц ~ кЛ ~ 1,5-Ю-5 Н/м. Данная величина весьма близка к значениям мода сдвига, полученным с помощью, некоторых других методов, наприме метода микропипеток. Это указывает на то, что в наш экспериментальных условиях деформация эритроцитов происходив по-видамому, по сдвиговому механизму.

Таким образом предложенный в настоящей, работе мето; основанный на явлении диэлектрофореза, может быть применен да качественного и количественного исследования механических адгезионных свойств клеточных мембран. Количественная оцеш межклеточного взаимодействия в необратимых агрегатах показал! что в определенных условиях (низкая ионная сила, рН < 6,2 наблюдается очень прочная агрегация эритроцитов, при котор< удельная энергия межмембранного взаимодействия на 1-2 порядю превышает изученные в настоящее время типы агрегации эритроцита С помощью данного метода впервые показана также коррелят механических и адгезионных свойств мембран эритроцитов различных условиях.

2. Локальные деформации одиночных эритроцитов в переменном электрическом поле.

С помощью переменных .высокочастотных электрических пол» можно изучать также локальные механические свойства одиноча клеток. Предложенный нами метод позволяет локально прикладывать клеточной мембране внешнюю силу заданной величины и деформирова клетку в любом направлении. С помощью данного метода ] исследовали способность эритроцитов изменять свою форму го действием силы, а также локальные механические свойства : мембран.

Изменение формы эритроцитов. Для изучения деформируемое одиночных эритроцитов мы использовали прикрепленные к покровно: стеклу клетки. К выбранной клетке подводили два микроэлектрода накладывали переменное электрическйе поле (0-40000 В/см, I МГ. Сила, действующая на мембрану эритроцита была направлена электродам и вызывала деформацию клетки (Рис За). Оставая

Распределение внешних сил, действующих на мембрану эритроцита в электрическом поле (I МГц, 0-4000 В/си). а-в системе с двумя мнкроэлентродами (диаметр острия 2-4 шш); б-в системе с ллосюшя электродами (ширина щели 90 ты).

<в>

а

© Щ.

—щ 5

1. Деформация одиночных эритроцитов в переменном электрическом поле (I МГц, 0-4000 В/см). а-обратнмая деформация дискоцита и б-обратнмая деформация эхнноцита с помощью мзкроэлектродов; в-деформацкя эритроцитов с использованием широких плоских электродов.

прикрепленным к стеклу, эритроцит вытягивался в обе стороны в; электрического поля и приобретал веретеновидную форму. На ос концах клетки появлялись тонкие мембранные выросты (по одном каждому электроду) с характерными утолщениями на концах (Рис 8,(5). Время процесса составляло десятки секунд. Длина отроет зависела от приложенной внешней силы (напряжение электрического поля) и составляла соответственно: 2000 В/см -I мкм, 3000 В/см - 3,5 ± 1,5 мкм, 4000 В/см -7-2 мкм.

Сканирующая электронная микроскопия позволила установи что такие отростки (и у даскоцитов, и у эхиноцитов) имели оди тот же диаметр по всей своей длине, одинаковый для раз эритроцитов (0,1 - 0,015 мкм).

У вытянутого веретеновидного эритроцита кроме длинных тон отростков к электродам с помощью сканирующего электронн микроскопа можно было обнаружить также короткие мембран отростки от мест прикрепления эритроцита к стеклу, наноминак нити ретракции у распластанного фибробласта.

Кратковременная деформация эритроцитов (в течение 1-5 м под действием внешней силы была обратимой. После выключения п большинство эритроцитов ( 80Я5 ) за 0,5-1,5 мин восстанавлива исходную форму.

При использовании плоских электродов с непроводящей ще внешние силы, действующие на клеточную мембрану распределялись разному (Рис. 36) в зависимости от места прикрепления эритроц в зазоре и конфигурации электрического поля вблизи клетки. Е эритроцит находился на одинаковом расстоянии от обоих электрод он вытягивался симметрично и приобретал веретеновидную форм: отростками на концах (Рис. 4в). Эритроцит, прикрепившийся вбл одного из электродов (на расстоянии 5-10 мкм) деформирова несимметрично и приобретал плоскую треугольную форму. Та эритроцит имел широкий ламеллоподобный край со стороны ближайш электрода и узкий веретеновидный противоположный край, чаете гонким отростком на конце в сторону второго, удаленн электрода.

Кратковременная деформация эритроцитов в этих условиях та была обратимой: после выключения электрического поля эритроц за 0,5-2 мин восстанавливали исходную форму.

Сила, действующая на клеточную мембрану. Предложенный н метод позволяет контролировать величину деформирующей внеш силы. Изменяя напряженность внешнего электрического поля

¡стояние между электродами мы можем варьировать внешнюю силу, итоженную к клеточной мембране. Плотность силы 1 может быть ¡считана по формуле:

I = ее0Е^/4 (6)

| в£0 - диэлектрическая • проницаемость воды, Е0~ амплитуда фяженности электрического поля вблизи поверхности эритроцита. (нки показали, что в нашем случае плотность силы лежит в ,'ервале 15-100 Па в зависимости от расстояния клеточной йраны до электрода.

Таким образом, эритроциты под действием внешних сил могут !енять свою форму и образовывать мембранные структуры, »йственные другим клеткам (длинные отростки, нити ретракции, юкие ламеллоподобные структуры), но не способны их )билизировать. Та или иная форма эритроцита определяется шчиной и направлением действующих на ее мембрану внешних сил. ;ле снятия внешней силы эритроцит восстанавливает исходную эму. В обычных условиях эритроцит таких структур не образует, с как из-за отсутствия цитоскелета и контакта с субстратом у 'о нет необходимых сил внутри клетки, которые могли бы вызвать эазование подобных мембранных структур и их стабилизацию.

5еформащя_эхшоуитов_в_переме1гадм_элек^ич . При

формации эхиноцитов внешней силой в переменном электрическом не (3500-4000 В/см) по мере вытягивания клеток вдоль поля исходило смещение и разглаживание неоднородностей (спикул) на поверхности, наблюдаемое в фазово-контрастный микроскоп (Рис. ). Более детальное исследование поверхности растянутых шоцитов с помощью сканирующего электронного микроскопа сазало, что при данных напряженностях электрического поля у шоцитов в одних случаях происходило полное разглаживание зкул, в других - они превращались в пологие широкие выпуклости, в некоторых случаях становились короче (не изменяясь в эмэтре) и сильно смещались по поверхности клетки при формации.

После снятия внешней силы, подавляющая часть (80-9058) ¡шоцитов за 0,5-1,5 мин восстанавливала свою первоначальную рму и поверхность, в том числе количество исходных спикул и их ¡сализацию на мембране. Локализация спикул восстанавливалась и еле нескольких деформаций подряд (3-5 раз), даже после их лного разглаживания в процессе деформации. Данный факт

свидетельствует о том, что локальные неоднородности поверхности эритроцитов (спикулы) контролирую1] спектрин-актиновым мембранным скелетом, отвечающим за ynpyi свойства мембран эритроцитов и поддержание формы этих клеток.

3. Деформации клеточных мембран при наложении на клетки импульсов высокой напряженности.

В разделах I и 2 мы изучали деформации клеток в перемет электрических полях не вызывающих нарушения барьерной фунта плазматической мембраны. В специальных экспериментах мы исследа также деформации клеточных мембран, возникающие при наложении клетки электрических импульсов высокой интенсивности, кото} используют для электропорации, электротрансфекции электрослияния клеток.

Образование электроиндуцированных деформаций после наложен электрических импульсов. Наложение на рВТ-клетки серии из t¡ последовательных прямоугольных импульсов напряженностью 1300 В/ длительностью 100 мкс и интервалом 0,4 с (стандартная процедур вызывало существенное изменение поверхности клеток, наблюдаемое фазово-контрастный микроскоп. В течение 0-5 с на клеточ! поверхности возникало большое количество мелких неоднородное« а через 15-30 с появлялись полусферические и сферичега деформации клеточной мембраны (блебы). Электроиндуцироваш блебы росли в течение 2-10 мин и их размеры по данным светово{ сканирующей электронной микроскопии варьировали в широ! пределах (0,5-10 мкм).

По форме и месту расположения на клеточной поверхности moi выделить несколько типов блебов:

1. Полусферические выпячивания на нераспластанных частях клето} либо на поверхности сферических клеток (1-10 мкм);

2. Блебы в виде вздутий на ламеллярной части распластанных кле! (0,5-6 мкм);

3.Сферические выпячивания на ламелле или "теле" клетки, отличе щиеся от первых двух типов (1-4 мкм); такие блебы встречал! относительно редко.

В сканирующем электронном микроскопе поверхность блебов вс типов выглядела однородной, лишенной каких-либо выростов микроворсинок.

Специальные тесты показали, что большая часть кле! (80-85Ж) после электрической обработки и образования блес

■ается жизнеспособной. Через 2-3 мин после наложения импульсов 1 - клетки окрашивали 0,2% раствором трипанового синего ;егуа", ФРГ) в»течение 10 мин. Доля окрашенных клеток в среднем ¡тавляла 15-205?. Такие клетки имели один или несколько очень шших блебов и были неспособны восстанавливать нормальную ¡ерхность (они необратимо повреждались при наложении ¡ктрических импульсов). Среди неокрасившихся клеток многие »лее 80%) также имели электроиндуцированные блебы всех типов, горне были меньших размеров (0,5-4 мкм). У таких клеток юрмации клеточной мембраны были обратимыми - через 15-25 мин [ комнатной температуре в ФСБ блебы исчезали, а в культуральной >де при 37°С этот процесс происходил еще быстрее (за 10-15 г). После исчезновения электроиндуцированных деформаций клетки шластывались (за 1-2 часа), росли и делились. По морфологии [ клетки не отличались от контрольных, их митохондрии красились 1амином 123 С^ёта", США, 10 мкг/мл, 10 мин), а процент зашенных трипановым синим клеток через сутки составлял не более

Размеры электроиндуцированных блебов, а также ¡неспособность клеток зависели от напряженности электрического ш во время импульса (1000-1700 В/см), от длительности гульсов (5, 10, 20, 100 мкс) и их числа в серии (от I до 10). с, например, после наложения на клетки импульсов длительностью ГО и 20 мкс (1300 В/см) блебы были очень маленького размера ,5-1,5 мкм) и быстро втягивались (за 5-7 минут при комнатной шературе). Все клетки оставались жизнеспособными.

|ли®Ш§ __кальция. Для выяснения возможной роли

сионов Са^+ в процессе электроиндуцируемого образования блебов, крепившиеся к покровному стеклу ЮТ- клетки отмывали смесью 5 (без Са2+): раствор Версена (I : I) и подвергали клетки вдартной электрической обработке (1300 В/см, 100 мкс) в ФСБ

3 Са .

В этом случае наложение на клетки электрических импульсов оке приводило к образованию электроиндуцированных деформаций у

4 клеток. Однако, рост блебов прекращался очень быстро (через 3 мин), они были небольших размеров и клетки очень быстро останавливали нормальную поверхность (за 5-Э мин при комнатной шературе в ФСБ без Са2+). Жизнеспособность клеток в такой зде была значительно выше чем в ФСБ с I мм Сайд. Процент тибших после электрической обработки клеток не превышал 3-55?.

Распределение__электроиндуцированных_____деформаций_____

поверхности клетки. Известно, что при наложении электрическс импульса максимальное напряжение возникает на участках мембрш ориентированных перпендикулярно электрическому полю. В связи этим значительный интерес представляет вопрос о распределе! электроиндуцированных блебов по поверхности клетки.

Рис.5. Участки клеточной мембраны, различно ориентированнь по отношению к направлению электрического поля время импульса. Напряжение максимально на участках мембраны, расположенных в секторах А-А.

В кавдой клетке мы выделяли четыре участка клеточ! мембраны, различно ориентированных по отношению к направлег электрического поля (Рис.5). В результате подсчета количесч блебов по секторам у всех клеток (с помощью светового микроског оказалось, что в секторах А-А располагается в среднем 72,2 - 3, от общего количества электроиндуцированных блебов, в в секто| В-В - 27,8 ¿ 3,6%.

Таким образом распределение электроиндуцированных деформащ по поверхности клетки является неравномерным. БлеСы образуки преимущественно на участках клеточной мембраны, где во вре импульса возникает максимальное напряжение.

Образование__блебов___-___осмотически___зависимый процес

Электроиндуцированные деформации клеточных мембран, в том числе живых клеток, могут достигать значительных размеров (4-6 мкм). этой связи возникает вопрос: сопровождается ли образование и р< электроиндуцированных блебов изменением внутриклеточного объем;

Мы проводили электрическую обработку ГВГ-клеток в ® содержащем осмотически активный углевод инулин, не проникании? клетки при электропорации ("Serva" ФРГ, 20 мМ в ФСБ, рН 7,4), также в ФСБ с фиколом ("Pharmacia", Швеция, полимер с М = 4000( сильно увеличивающий вязкость среды, IQ36 раствор в ФСБ, рН 7,'

В ФСБ с фиколом или инулином после наложения электрических ульсов (1300 В/см, 100 мкс) _ в течение 10 мин ктроиндуцированные блебы не появлялись (световая микроскопия), я в присутствии инулина (0,2яб раствор трипанового синего в ФСБ О мМ инулина) в течение 3 мин наблюдалось прокрашивание ядер у % РВТ-клеток. В присутствии фикола (0,2% грипановый синий в + 10$ фикола) мы не наблюдали прокрашивания ядер у погибших ток в течение 10 мин не только после стандартной, но даже ле летальной электрической обработки (1500 В/см, 100 мкс, 10 .). Однако, если через 1-2 мин после импульсов среду с лином или фиколом заменяли на ФСБ (0,2% трипановый синий в ), у 20-35% клеток появлялись и росли электроиндуцированные бы, а погибшие во время электрической обработки в присутствии ола клетки в течение 3 мин прокрашивались трипановым синим, кно, что и фикол, и инулин значительно увеличивали неспособность клеток после серии импульсов.

Для более детального изучения клеточной поверхности после ктрической обработки в среде с фиколом или инулином ЕВТ-клетки сировали 2,5$ раствором глутаральдегида через 5-6 мин после ульсов в присутствии фикола или инулина соответственно. При чении таких препаратов с помощью сканирующего электронного роскопа мы также никогда не обнаруживали электроиндуцированных бов, хотя клеточная поверхность в обоих случаях была ественно изменена. Клетки имели большое количество нообразных неровностей, отличавшихся от типичных микроворсинок онтрольных клеток.

Таким образом присутствие в среде инулина или фикола во мя электрической обработки и в течение некоторого времени ле нее предотвращает (или сильно замедляет) образование бов. Данные результаты свидетельствуют о том, что в азовании электроиндуцированных блебов участвуют осмотически исимые процессы, сопровождающиеся поступлением воды в клетку, ект фикола, вероятно, связан со значительным увеличением кости среды. При этом 10% фикола практически не повышают отического давления снаружи. Действие инулина, который лишь начительно увеличивает вязкость среды, связано с его отической активностью. При этом вход в клетки других веществ пример,трипанового синего) не затрудняется.

Образование__электроиндуцированных___^формаций___1___ШПЖ

ток. Кроме РВТ-клеток мы наблюдали образование

электроиндуцированных блебов всех типов после электричес обработки у мет, йа1;-1 ц ь-клеток. Во всех этих случаях при электроиндуцируемого образования Олебов был таким 'же, как : случае РВТ-клеток: он был осмотически зависим, 6.1 распределялись по поверхности клеток неравномерно, пс образования Олебов более 80$ клеток оставались жизнеспособные

Мы никогда не наблюдали образования блебов у эритрощ человека после электрической обработки. Увеличение напряженное поля (до 5 КВ/см) и числа импульсов в серии (до 10-15) привод к тому, что эритроциты без образования каких-либо деформг превращались в сфероциты, а затем лизировались.

Таким образом, образование Олебов после электричес обработки, по-видимому, достаточно универсальное явле^ характерное для клеток, имеющих нормальный цитоплазматичес скелет (РВГ, МЕР, Нат-1, ь-клетки). У эритроцитов челове лишенных цитоскелета (имеется только упругий мембранный ске; блебы не образуются даже при электрической обработке, вызывак гемолиз.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод качественного и количествен* изучения механических свойств и агрегации эритроцитов, основа* на явлении диэлектрофореза. С помощью данного метода исследоЕ влияние рН, ионной силы, времени нахождения в контакте, а те обработки протеолитическими ферментами на деформируемость адгезию этих клеток в линейных агрегатах - клеточных цепоч* Обнаружена корреляция механических и адгезионных сво( эритроцитов в различных условиях, а также резкое изменение ос характеристик при рН 6.2-6.3, связанное, по-видимому, нарушениями в структуре мембранного скелета.

2. Предложена теоретическая модель деформации цепочки кле в электрическом поле и потоке, позволяющая количественно оце} адгезию и механические свойства мембран эритроцитов. Показг что в определенных условиях (низкая ионная сила, рН ниже £ наблюдается очень сильная агрегация эритроцитов с удел! энергией межмембранного взаимодействия 7 ~ ю~4Дж-м~2. Значс модуля упругости |л ~ 1,5-10~&Н>м~1 по порядку величины совпа; с модулем сдвига для мембраны эритроцита, что указывает сдвиговый механизм деформации эритроцитов в электрическом по; потоке.

П1

3. Разработан метод локальной деформации одиночных роцитов с помощью высокочастотного электрического поля. Метод оляет прикладывать к мембране эритроцита внешнюю силу нной величины и деформировать эритроцит в любом направлении.

деформации полностью исключается механический контакт роцита с электродом.

4. Показано, что под действием внешних сил эритроцит может нять свою форму и обрезовнвать мембранные структуры, ственные другим клеткам: длинные отростки, нити ретракции, кие ламеллоподобные структуры, однако не способен такие ктуры стабилизировать.

5. Обнаружено, что при деформации эхиноцита внешней силой сходит разглаживание локальных неоднородностей (спикул) на

поверхности. После снятия внешней силы эхиноцит танавливает исходную форму, в том числе количество и лизацию спикул на мембране. Полученные данные свидетельствуют связи таких локальных неоднородностей с упругим грин-актиновым мембранным скелетом эритроцита и об участии равного скелета в поддержании структуры поверхности и формы роцита.

6. Установлено, что наложение на клетки млекопитающих трических импульсов высокой интенсивности (1-1,7 КВ/см) и ичной длительности (5, 10, 20, 100 мкс), приводит к зованюо полусферических деформаций на поверхности клеток -гроиндуцированных блебов. Формирование блебов не эвождается гибелью клеток и является обратимым.

7. Исследованы основные закономерности этого процесса, зано, что он является осмотически зависимым и электроиндуци-*е деформации формируются на участках плазматической эаны, где во время электрической обработки напряжение шально. Присутствие в среде физиологических концентраций

не влияет на образование электрокндуцированшх блебов, но ю замедляет. процесс восстановления клеточных мембран и зет жизнеспособность клеток после электрической обработки.

8. Полученные данные позволяют заключить, что электрические 1ьсн наряду с электропорацией приводят к более гомасштабным и относительно долгоживущим (2-5 мин) нарушениям руктуре клеточных мембран. Такие нарушения могут принимать гие в процессах электрослияния и эЛектротрансфекции зиотических клеток.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1.Гасс Г.В., Кузьмин П.И., Черномордик Л.В., Пастушенко В Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие и деформируемость мембра! клеточных цепочках, сформированных при диэлектрофоре: Биологические мембраны, I9S7, т.4, JH0, с.1059-1072.

2.Гасс Г.В., Черномордик Л.В. Обратимые крупномасшта< деформации клеточных мембран при электрической обработке кле( электроиндуцируемое образование блебов.- Биологические мембр 1989, т.6, ЖЗ. с.318-330.

3.Саез О.У., Chernomordik I.V. Reversible large-s deformations in the membranes oí electrically-treated, oe eleotroinduced bleb formation.- Biochira. et Biophys. Acta, 1 v.1023, p.1-11.

4.Гасс Г.В., Марголис Л.Б., Черномордик Л.В. Локальные деформ мембран эритроцитов в переменном электрическом по Биологические мембраны, 1990, т.7, Л6, с.647-659.

5.Gass G.Y., Chernomordik L.V., Margolis L.B. Local deforma of human red blood cells in high frequency eleotrio fieli Bioohim. et Biophys. Acta, 1991, v.1093, p.162-167.