Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

CpG-островки как инструмент поиска новых генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козырев, Сергей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ CpG - ОСТРОВКОВ В ГЕНОМАХ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ.

1.1.1.CpG —островки: строение, происхождение и функциональная роль.

1.1.2. Инициация репликации ДНК в CpG — островках.

1.1.3. Метилирование CpG — островков de novo.

1.2. ОСОБЕННОСТИ CpG - ОСТРОВКОВ В ГЕНОМАХ ПОЗВОНОЧНЫХ.

1.2.1. CpG —островки в геномах холоднокровных.

1.2.2. CpG —островки в геномах млекопитающих.

1.2.3. CpG —островки в геномах птиц.

1.3. ПОИСК НОВЫХ ГЕНОВ И КАРТИРОВАНИЕ

ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ CpG - ОСТРОВКОВ.

1.3.1. Выделение фрагментов ДНК, содержащих CpG —островки.

1.3.2. Notl— картирование генома человека.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

2.1.2. Реактивы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение геномной ДНК человека.

2.2.2. Пульс — электрофорез ДНК.

2.2.3. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле и элюция фрагментов ДНК из геля.

2.2.6. Электрофорез ДНК в ПААГ.

2.2.7. Получение Noil — "связующей" клонотеки.

2.2.8. Отбор индивидуальных рекомбинантных клонов.

2.2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.11. Клонирование кДНК гена LKLF человека.

2.2.12. Определение экзон — интронной структуры гена LKLF человека и клонирование 5' — промоторной зоны гена.

2.2.13. Получение радиоактивно меченного ДНК —зонда.

2.2.14. Блот- гибридизация РНК (Northern-blotting).

2.2.15. Определение хромосомной локализации гена

LKLF человека.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ "СВЯЗУЮЩЕЙ" Noil - КЛОНОТЕКИ И ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ КЛОНОВ.

3.1.1. Разработка нового варианта метода получения

Noil—"связующих" клонотек.

3.1.2. Составление банка индивидуальных Noil —клонов.

3.1.3. Анализ первичной структуры Noil —клонов.

3.1.4. Определение Noil — полиморфизма генов рибосомных

РНК человека.

3.2. КЛОНИРОВАНИЕ, АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ЭКЗОН-ИНТРОННОЙ СТРУКТУРЫ

ГЕНА ЬКЬЕ ЧЕЛОВЕКА.

3.2.1. Клонирование кДНК гена ЬКЬБ человека и анализ его тканевой экспрессии.

3.2.2. Анализ аминокислотной последовательности транскрипционного фактора ЬКЬБ человека.

3.2.3. Определение экзон — интронной организации и клонирование промоторного района гена ЬКи человека.

3.2.4. Хромосомное картирование гена ЬКЬБ человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "CpG-островки как инструмент поиска новых генов"

Гаплоидный геном млекопитающих состоит приблизительно из 3* 109 пар нуклеотидов, но только несколько процентов генома кодируют гены. Обилие повторяющихся нуклеотидных последовательностей, не несущих кодирующих функций, делает тотальное сквозное секвенирование геномов человека и других млекопитающих малоэффективным с точки зрения информативности и крайне дорогостоящим. Поэтому особую важность приобретает задача физического и генетического картирования в первую очередь кодирующих участков генома. При выборе стратегии картирования необходимо учитывать, что разные ДНК —маркеры имеют разную ценность и карты, созданные на их основе, также будут неравнозначны. Наиболее ценными будут геномные карты, на которых локализованы конкретные гены. Широко используемые в настоящее время микросателлитные маркеры не позволяют получать геномные карты, содержащие заметную долю кодирующих нуклеотидных последовательностей. Большинство маркеров, использованных для получения существующих карт геномов животных и человека, анонимны, доля конкретных генов в этих картах обычно не превышает 20%. База данных секвенированных кДНК человека (EST — Expressed Sequence Tag) также малопригодна для картирования генома, так как содержит огромное количество несистематизированных коротких (в среднем 200 п.н.) 3' —концевых фрагментов кДНК.

В последнее время интенсивно развиваются методы картирования, использующие различные особенности организации генома, в частности, CpG —островки (CGIs, CpG islands), которые представляют собой короткие (500 —2 ООО п.н.) неметилированные области геномов позвоночных, обогащенные динуклеотидом CpG и преимущественно локализованные в R и Т полосах метафазных хромосом. У человека больше половины генов ассоциировано с CpG — островками, включая все гены "домашнего хозяйства" и около 40% тканеспецифических генов. В большинстве случаев островки окружают промоторы и несколько первых экзонов гена. Поэтому стратегии картирования, использующие клонотеки CpG — островков, имеют определенные преимущества перед другими методами. Во — первых, поскольку каждый CpG — островок представлен единичной копией в гаплоидном геноме, то такие клонотеки также будут содержать эквимолярное количество островков, не зависящее от уровня и места экпрессии генов. Репрезентативная клонотека позволит получить информацию о более чем половине генов человека при относительно малом числе проанализированных клонов. Это выгодно отличает этот подход от проектов, использующих кДНК — фрагменты для картирования. Во —вторых, каждый CpG —островок представляет собой фрагмент геномной ДНК и имеет конкретную хромосомную локализацию, тогда как кДНК часто могут кодировать участки, отстоящие друг от друга на десятки и даже сотни тысяч пар нуклеотидов. В третьих, такая клонотека содержит информацию о большинстве промоторов и может упростить процедуру клонирования генов, кодирующих ДНК — связывающие белки.

Полным аналогом CpG — островковых клонотек служат Noil — "связующие" клонотеки, содержащие фрагменты геномной ДНК, окружающие участки узнавания эндонуклеазой рестрикции Noil. Это связано с тем, что, по меньшей мере, 89% всех Noil — участков (GCGGCCGC) локализованы в CpG — островках. Дополнительное преимущество "связующих" клонотек состоит в том, что в сочетании с "прыжковыми" клонотеками, в которых клонируют только "внутренние" концы Noil — фрагментов геномной ДНК, они позволяют не только клонировать новые гены человека, но и определять их взаимное расположение и расстояние между ними.

Несмотря на широкое использование Noil—"связующих" клонотек для поиска генов и картирования хромосом, в методе их получения обнаружены существенные недостатки, приведшие к потере большого числа Notl — фрагментов генома человека в указанных клонотеках. Поэтому цель настоящей работы состояла в разработке нового метода получения Noil — клонотеки и использовании ее для поиска и клонирования новых генов человека.

Исходя из поставленной цели, задачи исследования состояли в следующем: усовершенствование стратегии получения Noil — клонотек, позволяющее существенно увеличить представленность Noil — фрагментов в клонотеке, по сравнению с описанными ранее методами, конструирование Noil—"связующей" клонотеки генома человека и ее характеристика, определение нуклеотидной последовательности полученных Noil — клонов и их последующий анализ, клонирование кДНК нового гена человека, кодирующего транскрипционный фактор LKLF (lung Krüppel — like factor) и определение тканеспецифичности его экспрессии, клонирование геномного фрагмента ДНК, содержащего ген LKLF, анализ его экзон — интронной организации и установление хромосомной локализации.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Козырев, Сергей Владимирович

выводы

1. Разработан новый вариант получения Noil — клонотек. На основе нового протокола получена представительная Noil — клонотека генома человека. Определена первичная структура вставок геномной ДНК 300 Noil —клонов. Показано, что 33 клона имеют высокую гомологию с известными генами и кДНК человека и животных.

2. Показано, что клонотека содержит значительное количество коротких Noil — фрагментов геномной ДНК, что свидетельствует о том, что в геноме человека Noil —участки могут располагаться близко друг от друга. Такие сближенные участки составляют около пятой части всех Noil— участков и часто располагаются в кодирующих областях генов регуляторных белков.

3. Выявлены случаи внутривидового полиморфизма Noil— участков, расположенных в транскрибирующейся части генов рибосомной РНК человека.

4. Клонирована полноразмерная кДНК нового транскрипционного фактора человека, гомологичного фактору LKLF (lung Krüppel —like factor) мыши. Установлена первичная структура кДНК и на ее основе — первичная структура LKLF человека. Белок состоит из 355 аминокислотных остатков и имеет пролин — богатую N —концевую часть и три цинковых пальца на С — конце.

5. Определен характер тканевого распространения транскриптов гена LKLF. Ген максимально экспрессируется в легких и на низком уровне — в сердце, плаценте, скелетных мышцах и поджелудочной железе.

6. Клонирован геномный фрагмент ДНК (3,1 т.п.н.), содержащий ген LKLF и промоторную область, и определена его первичная структура. Ген LKLF человека состоит из трех экзонов. В промоторной области найдены участки связывания факторов транскрипции Spl, Ар2, GATA—1/2, ТВР II. В структуре гена обнаружен CpG — островок длиной 1,6 т.п.н., охватывающий проксимальный промотор и два первых экзона.

7. Установлена локализация гена LKLF человека на 19—й хромосоме в локусе р13.11 — р13.13.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю свою искреннюю признательность моему научному руководителю профессору Льву Львовичу Киселеву за неослабевавший интерес к исследованию и ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Дмитрию Анатольевичу Домнинскому — идейному вдохновителю проекта и активному участнику экспериментальной части работы, без чьих советов и помощи мне было бы трудно завершить работу, Евгению Забаровскому — руководителю "шведской" части проекта, Лотте Хансен за плодотворное сотрудничество при установлении хромосомной локализации гена ЬКЬР, Владимиру Михайловичу Захарьеву и Владимиру Капгубе, Андрею Борисовичу Полтараусу и Ринату Гизатуллину. Я благодарен также многим друзьям и коллегам — Нике Опариной, Людмиле Прокуниной, Наталье Холод, Дмитрию Литвинову, Екатерине Гупало, — чьи профессиональные знания, жизненный опыт и моральная поддержка были необходимы мне в течение всей работы над диссертацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе работы с Noil — клонотекой нами обнаружено, что примерно пятая часть всех Noil — участков генома человека расположена кластерно, причем в некоторых случаях расстояние между соседними участками составляет не более 30 нуклеотидов. Учитывая, что длина участка узнавания равна 8 п.н. (GCGGCCGC), этот результат является довольно-таки неожиданным и может объяснить, почему ранее не удавалось получить протяженных контигов при построении Noil —карты 3-й хромосомы человека. Все короткие Noil — фрагменты генома (а их, оказывается, немало) терялись при клонировании, в результате Noil —карты были неполными. Используемая нами клонотека по методу получения является "связующей", а по типу клонов — "прыжково —связующей", так как наряду со "связующими" содержит короткие "прыжковые" клоны. Несмотря на то, что короткие Noil — прыжковые фрагменты геномной ДНК не могут быть использованы самостоятельно для закрытия брешей в Noil —картах (так как отсутствует информация о последовательностях, прилежащих к этим Noil — фрагментам), они могут быть полезны для клонирования тканеспецифичных генов. Анализ показал, что сближенные участки Noil часто локализуются в кодирующих областях генов ДНК — связывающих белков, участвующих в регуляции процессов клеточной пролиферации и дифференцировки. По —видимому, такая предпочтительность локализации Noil— участков обусловлена тем, что активационные домены этих белков содержат протяженные повторы аминокислот аланина и пролина, GC — богатые кодоны которых могут участвовать в образовании Noil —участка. Гены, кодирующие регуляторные белки экспрессируются на очень низком уровне, в ограниченном числе тканей или клеток и в определенное время, поэтому их клонирование с помощью геномных клонотек, содержащих CpG —островки или их фрагменты, может быть более эффективным, чем с помощью кДНК-овых клонотек.

Для дальнейшего изучения нами был выбран один из клонов, содержащий короткий Noil — фрагмент гена человека, гомологичного Kruppel — подобному транскрипционному фактору мыши (LKLF), который, по —видимому, играет ключевую роль в поддержании зрелых Т — лимфоцитов в состоянии покоя, предотвращая спонтанную активацию Т —клеток и сопутствующий этому риск возникновения аутоиммунных заболеваний. Осуществлено клонирование полноразмерной кДНК гена LKLF человека, установлена его экзон — интронная организация и хромосомная локализация, проведен анализ тканевой специфичности экспрессии гена. Таким образом, клонирование гена LKLF человека, используя информацию о последовательности Noil — фрагмента гена, доказывает правильность подхода и ценность полученной клонотеки и открывает перспективы использования коротких Noil — фрагментов генома для поиска и клонирования генов новых регуляторных белков.

Выяснение биологической роли LKLF возможно станет одним из ключевых моментов в понимании основ аутоиммунных болезней. Важным этапом на этом пути может стать поиск генов — мишеней, регулируемых LKLF, и анализ тонкой регуляции его экспрессии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козырев, Сергей Владимирович, Москва

1. Cooper, D.N., Taggart, M.H., Bird, A.P. (1983) Unmethylated domains in vertebrate DNA. Nucleic Acids Res.ll, 647-58.

2. Shimizu, T.S., Takahashi, K., Tomita, M. (1997) CpG distribution patterns in methylated and non — methylated species. Gene 205, 103— 107.

3. Gardiner — Garden, M., Frommer, M. (1987) CpG islands in vertebrate genomes. J. Mol. Biol. 196, 261-82.

4. Craig, J.M., Bickmore, W.A. (1994) The distribution of CpG islands in mammalian chromosomes. Nat. Genet. 7, 376 — 382.

5. Gardiner, K. (1995) Human genome organization. Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 315-22.

6. Bird, A.P. (1995) Gene number, noise reduction and biological complexity. Trends Genet. 11, 94—100.

7. Brown, T.C., Jiricny, J. (1987) A specific mismatch repair event protects mammalian cells from loss of 5 — methylcytosine. Cell 50, 945 — 50.

8. Urieli —Shoval, S., Gruenbaum, Y., Sedat, J., Razin, A. (1982) The absence of detectable methylated bases in Drosophila melanogaster DNA. FEBS Lett. 146, 148-52.

9. Bird, A.P. (1986) CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature 321, 209-213.

10. Turker, M.S., Bestor, T.H. (1997) Formation of methylation patterns in the mammalian genome. Mutation Res. 386, 119—130.

11. Macleod, D., Charlton, J., Mullins, J., Bird, A. (1994) Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev. 8, 2282-2292.

12. Brandeis, M., Frank, D., Keshet, I., Siegfried, Z., Mendelsohn, M., Nemes, A., Temper, V., Razin, A., Cedar, H. (1994) Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature 371, 435 — 438.

13. Bird, A.P., Taggart, M.H., Nicholls, R.D., Higgs, D.R. (1987) Non-methylated CpG —rich islands at the human alpha — globine locus: Implications for evolution of the alpha —globin pseudogene. EMBO J. 6, 999-1004.

14. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. (1990) High levels of the novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell 62, 503-514.

15. Tazi, J., Bird, A. (1990) Alternative chromatin structure at CpG islands. Cell 60, 909-920.

16. Frank, D., Keshet, I., Shani, M., Levine, A., Razin, A., Cedar, H. (1991) Demethylation of CpG islands in embryonic cells. Nature 351, 239 — 241.

17. Bhattacharya, S., Ramchandani, S., Cervoni, N., Szyf, M. (1999) A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA. Nature 397, 579-583.

18. Carotti, D., Palitti, F., Lavia, P., Strom, R. (1989) In vitro methylation of CpG-rich islands. Nucleic Acids Res. 17, 9219-9229.

19. Jones, P.A., Wolkowitz, M.J., Rideout, W.M.I., Gonzales, F.A., Marziasz, C.M., Coetzee, G.A., Tapscott, S.J. (1990) De novo methylation of the MyoDl CpG island during the establishment of immortal cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6117-6121.

20. Aissani, B., Bernardi, G. (1991) CpG islands, genes and isochores in the genome of vertebrates. Gene 106, 185— 195.

21. Aissani, B., Bernardi, G. (1991) CpG islands: features and distribution in the genomes of vertebrates. Gene 106, 173— 183.

22. Cross, S., Kovarik, P., Schmidtke, J., Bird, A. (1991) Non methylated islands in fish genomes are GC —poor. Nucleic Acids Res., 19, 1469 — 1474.

23. Bernardi, G. (1993) The vertebrate genome: isochores and evolution. Mol. Biol. Evol. 10, 186-204.

24. Bernardi, G. (1993) Genome organization and species formation in vertebrates. J. Mol. Evol. 37, 331 -337.

25. Jabbari, K., Bernardi, G. (1998) CpG doublets, CpG islands and Alu repeats in long human DNA sequences from different isochore families. Gene 224, 123-128.

26. Bernardi, G. (1989) The isochore organization of the human genome. Annu. Rev. Genet. 23, 637-661.

27. Leeds, J.M., Slabaugh, M.B., Mathews, C.K. (1985) DNA precursor pools and ribonucleotide reductase activity: distribution between the nucleus and cytoplasm of mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 5, 3443 — 3450.

28. Wolfe, K.H., Sharp, P.M., Li, W.-H. (1989) Mutation rates differ among regions of the mammalian genome. Nature 337, 283 — 285.

29. Bernardi, G. (1995) The human genome organization and evolutionary history. Annu. Rev. Genet. 29, 445 — 476.

30. Jones, P.A., Rideout, W.M. (Ill), Shen, J.-C., Spruck, C.H., Tsai, Y.C. (1992) Methylation, mutation and cancer. Bioessays 14, 33 — 36.

31. Surralles, J., Sebastian, S., Natarajan, A.T. (1997) Chromosomes with high gene density are preferentially repaired in human cells. Mutagenesis 12, 437-442.

32. Delgado, S., Gomes, M., Bird, A. and Antequera, F. (1998) Initiation of DNA replication at CpG islands in mammalian chromosomes. EMBO J. 17, 2426-2435.

33. Jones, P.A. (1999) The DNA methylation paradox. Trends Genet. 15, 34-37.

34. Larsen, F., Gundersen, G., Lopez, R., Prydz, H. (1992) CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics 13, 1095— 1107.

35. Gardiner — Garden, M., Frommer, M. (1994) Transcripts and CpG islands associated with the pro — opiomelanocortin gene and other neurally expressed genes. J. Mol. Endocrinol. 12, 365 — 382.

36. Wutz, A., Smrzka, O.W., Schweifer, N., Schellander, K., Wagner, E.F., Barlow, D.P. (1997) Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. Nature 389, 745 — 749.

37. Macleod, D., Ali, R.R., Bird, A. (1998) An alternative promoter in the mouse major histocompatibility complex class II I — A(3 gene: implications for the origin of CpG islands. Mol. Cell. Biol. 18, 4433 — 4443.

38. Nakachi, Y., Hayakava, T., Oota, H., Sumiyama, K., Wang, L., Ueda, S. (1997) Nucleotide compositional constraints on genomes generate alanine —, glycine —, and proline — rich structures in transcription factors. Mol. Biol. Evol. 14, 1042-1049.

39. Bird, A.P., Taggart, M.H., (1980) Variable patterns of total DNA and rDNA methylation in animals. Nucl. Acids Res. 8, 1485- 1497.

40. Wang, S., Dijkwel, P.A. and Hamlin, J.L. (1998) Lagging — strand, early — labelling, and two — dimensional gel assays suggest multiple potential initiation sites in Chinese hamster dihydrofolate reductase origin. Mol. Cell. Biol., 18, 39-50.

41. Pelizon, C., Diviacco, S., Falaschi, A. and Giacca, M. (1996) High — resolution mapping of the origin of DNA replication in the hamster dihydrofolate reductase gene domain by competitive PCR. Mol. Cell. Biol., 16, 5358-5364.

42. De Villiers, J., Schaffner, W., Tyndall, C., Lupton, S. and Kamen, R. (1984) Polyoma virus DNA replication requires an enhancer. Nature, 312, 242-246.

43. Marahrens, Y. and Stillman, B. (1992) A yeast chromosomal origin of DNA replication defined by multiple functional elements. Science, 255, 817-823.

44. Giacca, M. et al. (1994) Fine mapping of a replication origin of human DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7119-7123.

45. Taira, T., Iguchi Ariga, S.M. and Ariga, H. (1994) A novel DNA replication origin identified in the human heat shock protein 70 gene promoter. Mol. Cell. Biol., 14, 6386-6397.

46. Kitsberg, D., Selig, S., Keshet, I. And Cedar, H. (1993) Replication structure of the human p —globin gene domain. Nature, 366, 588 — 590.

47. Zhao, Y., Tsutsumi, R., Yamaki, M., Nagatsuda, Y., Ejiri, S. and Tsutsumi, K. (1994) Initiation zone of DNA replication at the aldolase B locus encompasses transcription promoter region. Nucleic Acids Res., 22, 5385-5390.

48. Antequera, F. and Bird, A. (1993) Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11995-11999.

49. Somma, M.P., Pisano, C. and Lavia, P. (1991) The housekeeping promoter from the mouse CpG island HTF9 contains multiple protein — binding elements that are functionally redundant. Nucleic Acids Res., 19, 2817-2824.

50. Holmquist, G.P. (1989) Evolution of chromosome bands: Molecular ecology of noncoding DNA. J. Mol. Evol., 28, 469-486.

51. Yen, P.H., Patel, P., Chinault, A.C., Mohandas, T. and Shapiro, L.J. (1984) Differential methylation of hypoxanthinephosphoribosyltransferase genes on active and inactive human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 1759-1763.

52. Venolia, L., Gartier, S.M., Wassman, E.R., Yen, P., Mohandas T. and Shapiro, L.J. (1982) Transformation with DNA from 5 — azacytidine — reactivated X chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 2352-2354.

53. Schmidt, M. and Migeon, B.R. (1990) Asynchronous replication of homologous loci on human active and inactive chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 3685-3689.

54. Chuang, L.S., Ian, H.I., Koh, T.W., Ng, H.H., Xu, G. and Li, B.F. (1997) Human DNA—(cytosine —5) methyltransferase — PCNA complex as a target for p21WAF1. Science, 277, 1996-2000.

55. Bestor, T.H. and Verdine, G.L. (1994) DNA methyltransferases. Curr. Opin. Cell. Biol., 6, 380-389.

56. Lyon, M.F. (1992) Some milestones in the history of X —chromosomeinactivation. Annu. Rev. Genet. 26, 16 — 28.

57. Wigler, M., Levy, D., Perucho, M. (1981) The somatic replication of DNA methylation. Cell 24, 33-40.

58. Razin, A., Cedar, H. (1994) DNA methylation and genomic imprinting. Cell 77, 473-476.

59. Tycko, B. (1997) DNA methylation in genomic imprinting. Mutation Res. 386, 131-140.

60. Constancia, M., Pickard, B., Kelsey, G., Reik, W. (1998) Imprinting mechanisms. Genome Res. 8, 881 —900.

61. Makos, M., Nelkin, B.D., Lerman, M.I., Latif, F., Zbar, B., Baylin, S.B. (1992) Distinct hypermethylation patterns occur at altered chromosome loci in human lung and colon cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1929-1933.

62. Harris, M. (1982) Induction of thymidine kinase in enzyme — deficient Chinese hamster cells. Cell 29, 483-492.

63. Gounari, F., Banks, G.R., Khazaie, K., Jeggo, P.A., Holliday, R. (1987) Gene reactivation: a tool for the isolation of mammalian DNA methylation mutants. Genes Dev. 1, 899 — 912.

64. Cross, S.H., Bird, A.P. (1995) CpG islands and genes. Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 309-314.

65. Laird, P.W., Jaenisch, R. (1994) DNA methylation and cancer. Hum. Mol. Genet. 3, 1487-1495.

66. Greger, V., Passarge, E., Hopping, W., Messmer, E., Horsthemke, B. (1989) Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma. Hum. Genet. 83, 155—158.

67. Ohtani- Fujita, N., Fujita, T., Aoike, A., Osifchin, N.E., Robbins, P.D., Sakai, T. (1993) CpG methylation inactivates the promoter activity of the human retinoblastoma tumor — suppressor gene. Oncogene 8, 1063 — 1067.

68. Zion, M., Ben —Yehuda, D., Avraham, A., Cohen, O., Wetzler, M., Melloul, D., Ben —Neriah, Y. (1994) Progressive de novo DNA methylation at the bcr —abl locus in the course of chronic myelogenous leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10722-10726.

69. Zhang, S.J., Endo, S., Ichikawa, T., Washiyama, K., Kumanishi, T.1998) Frequent deletion and 5' CpG island methylation of the pi6 gene in primary malignant lymphoma of the brain. Cancer Res. 58, 1231 — 1237.

70. Issa, J.P., Ottaviano, Y.L., Celano, P., Hamilton, S.R., Davidson, N.E., Baylin, S.B. (1994) Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nat. Genet. 7, 536 — 540.

71. Cooper, D.N., Youssoufian, H. (1988) The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum. Genet. 78, 151 — 155.

72. Barker, D.r Schafer, M., White, R. (1984) Restriction sites containing CpG show a higher frequency of polymorphism in human DNA. Cell 36, 131 138.

73. Armes, N., Gilley, J., Fried, M. (1997) The comparative genomic structure and sequence of the Surfeit gene homologs in the puffer fish Fugu rubripes and their association with CpG —rich islands. Genome Res., 7, 1138-1152.

74. Tugores, A., Magness, S.T., and Brenner, D.A. (1994) A single promoter directs both housekeeping and erythroid preferential expression of the human ferrochelatase gene. J. Biol. Chem., 269, 30789 — 30797.

75. Bernardi, G., Bernardi, G. (1990) Compositional transitions in thenuclear genomes of cold —blooded vertebrates. J. Mol. Evol. 31, 265 — 281.

76. Bernardi, G., Bernardi, G. (1990) Compositional patterns in the nuclear genomes of cold —blooded vertebrates. J. Mol. Evol. 31, 282 — 293.

77. Matsuo, K., Clay, O., Takahashi, T., Silke, J., Schaffner, W. (1993) Evidence for erosion of mouse CpG islands during mammalian evolution. Somatic Cell Mol. Genet. 19, 543-555.

78. Cross, S.H., Lee, M., Clark, V.H., Craig, J.M., Bird, A.P., Bickmore, w.A. (1997) The chromosomal distribution of CpG islands in the mouse: evidence for genome scrambling in the rodent lineage. Genomics 40, 454-461.

79. O'Brien, S.J., Seuanez, H.N. (1988) Mammalian genome organization: an evolutionary view. Annu. Rev. Genet. 22, 323 — 351.

80. Rettenberger, G., Klett, C., Zechner, U., Kunz, J., Vogel, W., Hameister,

81. H. (1995) Visualization of the conservation of synteny between humans and pigs by heterologous chromosomal painting. Genomics 26, 372 — 378.

82. Fronicke, L., Chowdhary, B.P., Scherthan, H., Gustavsson, I. (1996) A comparative map of the porcine and human genomes demonstrates ZOO —FISH and gene mapping — based chromosomal homologies. Mamm. Genome 7, 285-290.

83. Goureau, A., Yerle, M., Schmitz, A., Riquet, J.r Milan, D., Pinton, P., Frelat, G., Gellin, J. (1996) Human and porcine correspondence of chromosome segments using bidirectional chromosome painting. Genomics 36, 252 — 262.

84. McQueen, H.A., Clark, V.H., Bird, A.P., Yerle, M., Archibald, A.L. (1997) CpG islands of the pig. Genome Res. 7(9), 924-931.

85. Hughes, A.L., Hughes, M.K. (1995) Small genomes for better flyers. Nature 377, 391.

86. Bloom, S.E., Delany, M.E., Muscarella, D.E. (1993) Constant and variable features of avian chromosomes. In: Manipulation of the avian genome . Eds Etches, R.J. and Gibbons, A.M.V., CRC Press, Florida, p. 39-59.

87. McQueen, H.A., Fantes, J., Cross, S.H., Clark, V.H., Archibald, A.L., Bird, A.P. (1996) CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes. Nature Genet. 12, 321—324.

88. Schmid, M., Enderle, E., Schindler, D., Schempp, W. (1989) Chromosome banding and DNA replication patterns in bird karyotypes. Cytogenet. Cell Genet. 52, 139-146.

89. Brenner, S., Elgar, G., Sandford, R., Macrae, A., Venkatesh, B., Aparicio, S. (1993) Characterization of the pufferfish (Fugu) genome as a compact model vertebrate genome. Nature 366, 265 — 268.

90. Cross, S.H., Charlton, J.A., Nan, X., Bird, A.P. (1994) Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genet. 6, 236-244.

91. Meehan, R.R., Lewis, J.D., Bird, A.P. (1992) Characterization of MeCP2, a vertebrate DNA binding protein with affinity for methylated DNA. Nucleic Acids Res. 20, 5085-5092.

92. Watanabe, T., Inoue, S., Hiroi, H., Orimo, A., Kawashima, H., Muramatsu, M. (1998) Isolation of estrogen — responsive genes with a CpG island library. Mol. Cell. Biol. 18, 442-449.

93. Shiraishi, M., Lerman, L.S., Sekiya, T. (1995) Preferential isolation of DNA fragments associated with CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4229-4233.

94. Valdes, J.M., Tagle, D.A., Collins, F.S. (1994) Island rescue PCR: A rapid and efficient method for isolating transcribed sequences from yeast artificial chromosomes and cosmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5377-5381.

95. Kato, R., Sasaki, H. (1998) Quick identification and localization of CpG islands in large genomic fragments by partial digestion with Hpall and Hhal. DNA Res. 5, 287-295.

96. Collins, F., Weissman, S. (1984) Direction cloning of DNA fragments at a large distance from an initial probe: A circularization method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6812-6816.

97. Poustka, A., Pohl, T., Barlow, D., Frischauf, A., Lehrach, H. (1987) Construction and use of chromosome jumping libraries from Notl — digested DNA. Nature 352, 353-355.

98. Lindsay, S., Bird, A.P. (1987) Use of restriction enzymes to detect potential gene sequences in mammalian DNA. Nature 327, 336 — 338.

99. Zabarovsky, E.R., Klein, G., Winberg, G. (1993) Lambda SK diphasmids: phage lambda vectors for genomic, jumping, linking and cDNA libraries. Gene 127, 1-14.

100. Sanford, J., Kim, B.W., Deaven, L.L., Jones, C., Higgins, M.J., Nowak, N.J., Shows, T.B. (1993) A human chromosome 11 Noil end clone library. Genomics 15, 653 — 658.

101. Pook, M.A., Thakrar, R., Pottinger, B., Harding, B., Porteous, D., van Heyningen, V., Cowell, J., Jones, C., Povey, S., Davies, K.E., Thakker, R.V. (1996) Eagl and Notl linking clones from human chromosomes 11 and Xp. Hum. Genet. 97, 742-749.

102. Hosoda, F., Arai, Y., Kitamura, E., Inazawa, J., Fukushima, M., Tokino, Т., Nakamura, Y., Jones, C., Kakazu, N. Abe, Т., Ohki, M. (1997) A complete Noil restriction map covering the entire long arm of human chromosome 11. Genes Cells 2, 345 — 357.

103. Himmelbauer, H., Germino, G.G., Ceccherini, I., Romeo, G., Reeders, S.T., Frischauf, A.M. (1991) Saturating the region of the polycystic kidney disease gene with Noil linking clones. Am. J. Hum. Genet. 48, 325 334.

104. Ichikawa, H., Hosoda, F., Arai, Y., Shimizu, K., Ohira, M., Ohki, M. (1993) A Notl restriction map of the entire long arm of human chromosome 21. Nature Genet. 4, 361 —366.

105. Wang, D., Smith, C.L. (1994) Large —scale structure conservation along the entire long arm of human chromosome 21. Genomics 20, 441 — 451.

106. Межевая, E.B., Степанова, В.П., Яровой, Б.Ф. Пульсфорез как новый инструмент в генетике. (1993) Успехи современной генетики, вып. 18, с. 136-162.

107. Смит, К., Клко, С., Кантор, Ч. Пульс — электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК. В кн.: Анализ генома. Методы. Под ред. Дейвиса, К., М.: Мир, 1990, с. 58-94.

108. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

109. Glazer, A.N., Rye, H.S. (1992) Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high — sensitivity fluorescence detection. Nature 359, 859-861.

110. Baskaran, N., Kandpal, R.P., Bhargava, A.K., Glynn, M.W., Bale, A., Weissman, S.M. (1996) Uniform amplification of a mixture of deoxyribonucleic acids with varying GC content. Genome Res. 6, 633 — 638.

111. Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S.A. (1997) Betaine improves the PCR amplification of GC —rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958.

112. Silver, J. Inverse polymerase chain reaction. In: PCR: A practical approach. Edited by McPherson, M.J., Quirke, P., and Taylor, G.R. Oxford University Press, New York, 1994, v.l, p. 137-146.

113. Kozyrev, S.V., Hansen, L.L., Poltaraus, A.B., Domninsky, D.A., Kisselev, L.L. (1999) Structure of the human CpG — island — containing lung Krüppel —like factor (LKLF) gene and its location in chromosome 19pl3.11-13 locus. FEBS Lett. 448, 149-152.

114. Wales, M.M., Biel, M.A., el Deiry, W., Nelkin, B.D., Isse*, J.P., Cavenee, W.K., Kuerbitz, S.J., Baylin, S.B. (1995) p53 activatesexpression of HIC — 1, a new candidate tumour suppressor gene on 17pl3.3. Nature Med. 1, 570-577.

115. Gerber, H. — P., Seipel, K.r Georgiev, O., Hofferer, M., Hug, M., Rusconi, S., Schaffner, W. (1994) Transcriptional activation modulated by homopolymeric glutamine and proline stretches. Science 263, 808 — 811.

116. Mitchell, P.J., Tjian, R. (1989) Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence — specific DNA binding proteins. Science 245, 371 — 378.

117. Trifonov, E.N., Bettecken, T. (1997) Sequence fossils, triplet expansion, and reconstruction of earliest codons. Gene 205, 1—6.

118. Bird, A.P., Taggart, M.H. (1980) Variable patterns of total DNA and rDNA methylation in animals. Nucleic Acids Res. 8, 1485— 1497.

119. Gonzalez, I.L., Chambers, C., Gorski, J.L., Stambolian, D., Schmickel, R.D., Sylvester, J.E. (1990) Sequence and structure correlation of human ribosomal transcribed spacers. J. Mol. Biol. 212, 27 — 35.

120. Gonzalez, I.L., Sylvester, J.E. (1995) Complete sequence of the 43 —kb human ribosomal DNA repeat: analysis of the intergenic spacer. Genomics 27, 320 — 328.

121. Erickson, J.M., Schmickel, R.D. (1985) A molecular basis for discrete size variation in human ribosomal DNA. Am. J. Hum. Genet. 37, 311 — 325.

122. Luoh, S.W., Jegalian, K., Lee, A., Chen, E.Y., Ridley, A., Page, D. (1995) CpG islands in human zfx and zfy and mouse zfx genes: sequence similarities and methylation differences. Genomics 29, 353 — 363.

123. Bellefroid, E., Lecocq, P.J., Benhida, A., Poncelet, D.A., Belayew, F., and Martial, J.A. (1989) The human genome contains hundreds of genes coding for finger proteins of the Krüppel type. DNA 8, 377 — 387.

124. Anderson, K.P., Kern, C.B., Crable, S.C., Lingrel, J.B. (1995) Isolation of a gene encoding a functional zinc finger protein homologous to erythroid Krüppel —like factor: identification of a new multigene family. Mol. Cell. Biol. 15, 5957-5965.

125. Kuo, C.T., Veselits, M.L., Leiden, J.M. (1997) LKLF: A transcriptional regulator of single — positive T cell quiescence and survival. Science 277, 1986-1990.

126. Kuo, C.T., Veselits, M.L., Leiden, J.M. (1997) LKLF and FasL expression: correctiona and clarification. Science 278, 788 — 789.

127. Kuo, C.T., Veselits, M.L., Barton, K.P., Lu, M.M., Clendenin, C., Leiden, J.M. (1997) The LKLF transcription factor is required for normal tunica media formation and blood vessel stabilization during murine embryogenesis. Genes Dev. 11, 2996 — 3006.

128. Kozak, M. (1991) An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control. J. Cell. Biol. 115, 887 — 903.

129. Proudfoot, N.J., Brownlee, G.G. (1976) 3' non — coding region sequences in eukaryotic messenger RNA. Nature 263, 211—214.

130. Wani, M.A., Wert, S.E., Lingrel, J.B. (1999) Lung Krüppel-like Factor, a Zinc Finger Transcription Factor, Is Essential for Normal Lung Development. J. Biol. Chem. 274, 21180-21185.

131. Nagata, S., Golstein, P. (1995) The Fas death factor. Science 267, 1449-1456.

132. Wani, M.A., Means, R.T. Jr., Lingrel, J.B. (1998) Loss of LKLF function results in embryonic lethality in mice. Transgenic Res. 7, 229 — 238.

133. Williamson, M.P. (1994) The structure and function of proline —rich regions in proteins. Biochem. J. 297, 249 — 260.

134. Koleske, A.J., Buratowski, S., Nonet, M., Young, R.A. (1992) A novel transcription factor reveals a functional link between the RNA polymerase II CTD and TFIID. Cell 69, 883-894.

135. Boulikas, T. (1993) Nuclear localization signals (NLS). Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 3, 193-227.

136. Miller, J., McLachlan, A.D., Klug, A. (1985) Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes. EMBO J. 4, 1609-1614.

137. Pavletich, N.P., Pabo, C.O. (1991) Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268 —DNA complex at 2.1 A. Science 252, 809 — 817.

138. Miller, I.J., Bieker, J.J. (1993) A novel, erythroid cell — specific murine transcription factor that binds to the CACCC element and is related to the Kruppel family of nuclear proteins. Mol. Cell. Biol. 13, 2776 — 2786.

139. Perkins, A.C., Sharpe, A.H., Orkin, S.H. (1995) Lethal (3 thalassaemia in mice lacking the erythroid CACCC — transcription factor EKLF. Nature 375, 318-322.

140. Shields, J.M., Christy, R.J., Yang, V.W. (1996) Identification and characterization of a gene encoding a gut — enriched Kruppel — like factor expressed during growth arrest. J. Biol. Chem. 271, 20009 — 20017.

141. Sogawa, K., Imataka, H., Yamasaki, Y.r Kusume, H., Abe, H., Fuji — Kuriyama, Y. (1993) cDNA cloning and transcriptional properties of a novel GC box-binding protein, BTEB2. Nucleic Acids Res. 21, 15271532.

142. Kadonaga, J.T., Carner, K.R., Masiarz, F.R., Tjian, R. (1987) Isolation of cDNA encoding transcription factor Spl and functional analysis of the DNA binding domain. Cell 51, 1079-1090.

143. Shields, J.M., Yang, V.W. (1997) Two potent nuclear localization signals in the gut —enriched Kruppel —like factor define a subfamily of closely related Kruppel proteins. J. Biol. Chem. 272, 18504-18507.

144. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия, М.: Наука, 1989, с. 224-229.

145. Bucher, Р. (1990) Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J. Mol. Biol. 212, 563-78.

146. Eichler, E.E., Hoffman, S.M., Adamson, A.A., Gordon, L.A., McCready, P., Lamerdin, J.E., Mohrenweiser, H.W. (1998) Complex p —satellite repeat sructures and the expansion of the zinc finger gene cluster in 19pl2. Genome Res. 8, 791-808.