Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация цитокиновых генов на пятой хромосоме человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация цитокиновых генов на пятой хромосоме человека"

ÜÜAJ ОПУСОО ОЗЗЯбЭСЮМ* üJOOSObQtä

"ОоЭд^пп бсЭбШУпЛюблСоБо йпщ^Сnjjti-

bOCBúPjñob лсдйо* Oùâlaneo ¿JlínSUJO (jnni^jnù Oiljpi)

и^ЬзЗэй6¡¡ fjiysrjsa ¿рЭя0озс\3» Ьоа^ЯаддслЬ.в»où ôjSjôtioj IMJ-¿330 блзjffrî ^jûâj iOj^tfJCSflUO" ОоЛоворо ihij33öo po övjo^bc^ ^ ôorjsfoenjfi öjpajEoonflJia«

06.0/.09 вдЯ^Зз^э«^ 06,01 i 12 po

«i&fntyîjfloio /iîjOJP jBoíj/ вЗоройо /PS/

Печатных п. Учвмв-иэдат.л. Бе euлат»«

Заказ * <5 7 УЭ Тира* 100

Кввкмтельван лаборатория Груз.ЗВЛ'И Тбилиси-107, Крцаииси.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ЗИШ им.И.Ы.Шешвагаа и Ю.А.Овчинтвпза

На правах рукописи

СМИРНОВ Дмитрий Васильевич

структлтя ОРГАНИЗАЦИЯ ЦИТОКЙНОНК гаюв НА ПЯТОЙ ХРОМОСОМЕ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте Сиооргаиической зошии

при ({мнеисовой подцерике Государственной научно-технической программы Российской Федерации "Геиои человека"

Научный руководитель -кандидат биологических наук Е.И.Фролова

Официальные оппонента -доктор биологических науп, профессор П.М.Рубцов

доктор (Заодогнческих наук, профессор Н.К.Янковский

Ведущая организация -Аеиа-гологичесхий научный центр РАШ .

DD

Защита состоятся 23 ншя I9S3 г- в 10 часов на заоедагии Ссециалшзированного совета Д 002.35.01 яря Института йаооргани'ческоа хиыш ии.М.Ы.Шемякина и В.А.Овчиншшяш цо адресу: II787I, Москва, ул.йаклухо-Уаиая, 16/10.'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бирорганической хшши иы.М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан 2 1993г.

им.М.М.Шгиякша к Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

/

Ученый сгкрегерь

Следи алкзирсЕзняого совета

кевдидв? КЕэчесгшх наук

-3-

ХАРАКШМСТША РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследованием процессов, проте-кахщих в организме, в отдельной клетке на уровне хранения и использования информация, передачи ее из поколения в поколение занимаются генетика и молекулярная биология. Одним из проектов, возникших на стыке двух дисциплин, явхяется "Геном человека". Существуют как национальные, так и «еадународаые программы его осуществления. В целом проект предполагает уточнение и детализацию генетических карт хромосом человека, построение физических карт хромосом, определение полной нуклеотвдной последовательности отдельных частей генома. Конечной целы» проекта является выявление в характеристика более чем 100000 генов человека, что позволило Си поставить дальнейшие биологические исследования на новый качественный уровень.

Прикладное значение этого проекта заключается в идентификации тех генов, которые играют ключевую роль в наследственных заболеваниях и в заболеваниях, связанных с приобретенными нарушениями генома.

Одним из интересных объектов исследоваши в ранках этого проекта представляется область большого плеча хромосомы 5 - 5q23-3I. Она является критической областью делений при некоторых видах лейкозов и киелодаспластическоы синдроме. Ранее нетодаш In situ гибридизации в 5q23-3I были картированы гены интерлейкинс-З (ИЗ), колониестимулирупцего фактора 2 (CSF2), ПА, IL5.

Цель работы. Целыз настоящей работа явилось картирование и клонирование области длинного плеча хромосомы 5 человека вблизи кластера цитокиновых генов; определение взаимного расположения генов 1X3, CSF2, НЛ и US.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате выполненных исследований были клонированы гены ДЗ, CSF2, ЛЛ, 3X5 и протяженные области renoua, прилегающие к зим, общим размером около 355 тыс.п.о. ; построена их тонкая рестрикционная карта, найдены места кластеризации сайтов узнавания редаощедящшги рестриктазаки, получены набор« уникальных олигонуклеотидннх зондов, равномерно расположенных вдоль клонированных областей. Это позволило провести картирование области длиной 540 тыс.п.о.,

содержащей гены 1Ы, 115, ЖР1 (интерферон регулирующего фактора-1); определять расстояние между ними, их взаимную ориентации. Для области генов ИЗ, СЭК!, расположенных на расстоянии 10.5 тыс.п.о. друг от друга, построена субхроносокная физическая карта длиной 1.2 шш.п.о. На основании полученных результатов и цитогенетических данных сделано предположение о взаимном расположении всех пяти генов.

Используя клонированные фрагмента из области генов ИЗ, СБР2 в качестве проб для гибридизации с рэстрикционными фрагментами ДНК человека, был обнаружен полиморфизм длин рёстрикционных фрагментов в 5'области от гена ИЗ. Это позволило, применив многоточечный анализ сцепления, разместить гены вблизи маркеров 05852, 1)5365, 1)5567 на генетической карте. Таким образом, удалось сопоставить генетическую и физическую карты этой области.

Полученные результаты позволяют выявлять тонкие структурные изменения, затрагивавшие район цитокиновых генов; Солее точно определить границы критической облвсти делеций путем сравнения физических карт данного кластера в нормальных клетках и клетках, подверженных канцерогенезу; начать поиск новых генов в данном локусе.

Апробация диссертации. Результаты исследования были представлены на Международном симпозиуме "Молекулярные факторы геиатопозза" (СССР-ФРГ, Волга-Вилседе, 1Э90); на IV Всесопзной школе-семинаре молодых ученых (Рига, 1990); на 2-ом Международном сишознуие "Молекулярная биология гематопоэза" (Австрия, Инсбрук, 1991); на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); на 2-ой Европейской конференции Организации "Геном человека" (Н!КЮ) "Различия в геноме человека" (Италия, Порто-Конте, 1992), на Международном симпозиуме "Биологически активные полипептида" (Россия-ФРГ, Волга-Вилседе, 1992).

Публикации. По материалам диссертации имеется 7 публикаций.

-5-

ОСГОВШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I.Создание фаговой и косыидаой геномных библиотек человека.

Основном подходом для клонирования фрагментов геномной ДНК является конструирование геномных библиотек. Поэтому получение клонов, содержащих гены ИЗ, CSF2, 1X4 и 115 и прилегашие к ним области, было начато с создания сначала фаговой, а впоследствии и косыидаой геномных библиотек из лейкоцитарной ДНК человека.

Для приготовления фаговой клонотеки был использован вектор замещения MIX фирмы Stratagene (рис.1). Он позволяет клонировать фрагменты длиной 9-22 тыс .п. о. В отличие от векторов HURT, и Charon вектор хРГХ имеет по краям сииметричнш полилинкеров промоторы дня ТЗ я Т7 РНК полимераз, что позволяет синтезировать РНК копни концевых участков клонируемых фрагментов. Наличие этих промоторов удобно и для определения структур! концевых фрагментов клонированной ДНК с использованием И н 17 праймеров и непосредстенво ДНК рекомбинантного фага в качестве матрицы.

Подготовка ДНК \УЗХ к клонированию была сделана путем расщепления рестрнктазой 3hoI и последукцей достройкой 5' шступапцих ("липли") тетрануклеотидных концов до динуклеотидных "лишаи" концов с помощью фрагмента Кленов а, которые не могут быть залкгированы сами на себя (рис.1). Однако они лигируются с комплементарными динуклеотидныын "липюста" концами вставки геномной ДНК, которые получается аналогичным образом (рестрикция проводится Sail 3AI) и тоге не могут литероваться друг с другом. Этот подход позволил избегать восстановления ивтактного фага. образования "мозаичных" вставок при эртефактлом лигировавии.

Для конструирования космидноО библиотеки использовался космидаый вектор pWEl5 (Stratagene). Си является производной от космиды рС710Т и содеряпт промоторы для ТЗ и Т7 РНК полимераз по обе стороны от сайтов узнавания для редкощепя-щей рестриктазы Not1. Космида позволяет клонировать фрагменты экзогенной ДНК длиной 33-44 тыс.п.о. по ВалН1 сайту между ТЗ и Т7 промоторам. pVfEl5 имеет один cos сайт, ген устойчивости к неомицину (кзнамищшу) -SV2neor, ori репликации SV40

^ "о о "5 " 'о £ ГГ t7 "о в о х О а л О £ о о Л

cosi

Э>«сриотим«скаа гснвмиав ДНК

9 тыс ао.

'C0SL А-

tcga&.

PeerpUKUUR Xhol

red* da*n4

---GAGCT

KOKJO¡> фрагментом

Юемоба o npucyic:6uu dTTPüdCTP (Ииами&аци* среднего q^arwcMta!

TC3AC-

CQSR

CTG-

Чаж>чиое расаепдемд -Sol) 3AI и

Средшц paiwcp <ypoiMe»no¿ Ti-20 т»сло.

1Д capota „/ЛЖИХ-" комиоЬ фрагментом Кд«но6а o npucyicrfi

dATP u dGTP

TCCAQ ** dqm* CTC CTC—■-

GAGCT

Липдо&оное ДНК a*«oí>

Неидемо&ьй фцдъгр-ремика

TuSpt^uaayus и pajüoaitorpcqxífl

оЪ

Г, o ¿

2±ЗУ

- -реплыа

TCGAG

Fue« I #Общая схема создания фаговой геысиной библиотеки,

fSVtOcri

SY2neo vi^—З^росиенлеии« BoruHl 05pq6owq CIAPq __

SV2neo

Эукарисмсскоя геномная ДНК

1Час»мое росшепдение Scu3Al и фращийиаро&шие

V4/S/ /SfsS^S \s\S\/ Qpc^uû размер доогиентоб 35-40 ТЫС.П.О-

Amp T3

ЛигироЬание ДНК jufuoù Бактериофага Ti

WW

Упако&м m vitra Ь eparobbte иааииы

агор с Кшшшимом

Инфекция ш>м ЕшН HB »1 и селекция Ка тршеформаигоб

Тилтр-реллико—

Гибридизация и родиооЬогрофи» -7--РодмоаЬтогроф

Рис.2.Общая схеиа создания косцидной геноцкой библиотеки.

¡I последовательности, усиливающие экспрессии клонированных генов в эукариотических клетках., ген устойчивости к ампицилину (Ашрг> И СоШ ori репликации (рис.2).

Для-клонирования коснида была обработана рестриктазой £зшН1 с посхедупцим удалением концевых фосфатов щелочной фосфатазой из кишечника теленка (CIAP) для предотвращения лигирования вектора самого на себя.

ДНК дли библиотек, как упоминалось выше, была выделена из лейкоцитов человека. Операции г.о очистке проводились с соблюдением всех мер предосторожности, чтобы избежать ферментативного, химического и механического повреждений ДНК, а следовательно уменьшения ее длины. Для приготовления фаговой библиотеки длина ДНК должна быть не меньие 80 тыс.п.о., для косывдной - не меньше 150 тыс.п.о. В результате выделения было получено несколько шшшграмм высокомолекулярной ДНК нужного размера и нужной чистоты.

Для получения фрагментов ДЕК нужной длины, которые могут Сыть встроены в вектор, проводился частичный гидролиз рестриктазой Sau3¿l. Шделение фрагментов соответствующего размера производили путем центрифугирования в солевом или сахарозном градиенте. Альтернативный подход заключался во фракционировании с помощью электрофореза в 0.3% агарозном геле с последующим использованием ЕШ5 целлхлозы для удаления из геля ДНК нужной длины. Этот метод применим в случае фаговой библиотеки: ДНК больших размеров плохо злшруется с DEAE целлюлозы. Выход фрагментов нужного размера при первом подходе составлял I-3S, а при втором - 0.5-1% от начального количества ДНК, взятого на рестрикции.

"Липкие" концы ДНК для клонирования в xFIX достраивались фрагментсы Кленова в присутствии dGTP и d¿IP. Оптимальным весовым соотношением плечей ко вставке при лидировании оказалось 1.2:1, как показала последупцая трансфекция- При датировании косиида со вставкой молекулярный избыток вектора выбирался 10 кратным, чтобы избежать лшвровгния фрагментов геномной ДНК друг с другом.

Лигированная смесь по окончании реакции упаковывалась в акстрактн Gigapack Gold (Stratagene), и полученные фаговые частицы использовались для трансфекции меток E.coli, приготовленшх соотвегствукцим образом. Для фаговой

бкблиотеки использовались птакш DH5« и ТАР90. Они хорошо трансфецировались и давали высокий выход фаговых частиц при-наращивании. В нашем случэе эффективность клонирования составила 2*10®Б0£/икг (ВОЕ - ОляшкооОразующие единицы). Для создания косыидаой библиотеки наилучшим оказался штамм НВ101, который, обладает слабой RecA активностью. С помощью него удалось добиться эффективности трансфекции в пределах 5*105-2*Юбколоний/мкг датированной ДНК.

Библиотека на основе фага к?1Х была высеяна на 50 квадратных чашек Петри при средней плотности 60 тыс. БОЕ на чашку. Половину чашек использовали для получения первично-аышшфицированвой библиотеки. Этот шаг являлся вынужденным, поскольку средняя продолжительность хранения библиотеки на чашках не превышает I-I.5 месяцев. Со второй половины чашек были приготовлены 4 комплекта фильтров-ре пяяк, когорте мы гибридизовали со специфическими пробами. Таким образом, для скрининга использовалось 1.5«10 клонов, что составило 8 кратный геномний эквивалент и позволило получать в дальнейшем более одного клона при гибридизации с уникальной пробой.

В случае космвдпой библиотеки, бнла применена та же стратегия: половина ее использовалась для приготовления фильтров-реллкк, а половина - для приготовления первичноамплифицированноЯ библиотеки. В общей сложности для скрининга использовалось 0.-5*10® клонов (25 чаиек по ЗОтыс. клонов), т.е. 6 кратный геномный эквивалент.

2.Составление протяженных контигов в области 5q23-3I.

Сконструированные фаговая и косындвая геномные библиотеки позволили начать клонирование прогяхан&ых участков из области 5q23-3I. Поиск клонов осуществлялся гибридизацией с шсокагеченыш олигонуклеотаднЕит пробами на гены ИЗ, CSF2, П4, 115. Одновременно с одшш зондом гибридизовались два набора реплик, что позволяло более точно определить местоположение исковых клонов на чашке. Для получения, индивидуального клона проводился вторичный и третичный скрининг.

2.1.Составление контига клонов, перекрывающих область, содсргащут) гены IL3 к CSF2.

К началу шей работы по поиску взаиивоперекрываодихся

клонов в навей^ лаборатории Хумабаевой Б., Мазо И.А. и Долгановым Г.Ы. был получай набор космидных и фаговых клонов (рис.3) на пробы к генам ПЗ и СЖ, и обнаружено наличие обоих генов в одной фаговом клоне. Независимо от группы зарубежных ученых ■ было показано, что гены 113 и С5Р2 располохеш тавдеано в ориентации хвост к голове на расстоянии 10.5 тыс.п.о., построена рестршщиошая карта клонированное области длиной 70 тыс.п.о.

Для дальнейшего продвижения в обоих направлениях уне било необходимо получить уникальные пробы на концевые участки клонированной области. С этой целы» гибридизацией с тотальной ДНК человека были определена фрагменты ДИК из полученных клонов, не содержащие частых повторов. Исходя из этих данных, были субклонированы концевые фрагменты сов-2 и сов-С рекомбинаятнях космид, и определена их первичная структура. Для этого использовался модифицированный метод Сэнгера. Реакция синтеза проводилась с помощью тершстабильной Таё-полимераэы, что позволило использовать двухцепочечную матрицу и заменить щелочную денатурацию температурной. На основе первичной структуры клонированных фрагментов были синтезироваш олигонуклеотида й 1241-42 и 608-9. Они использовалась для гибридизации с первичноянплифицирозанной коснидной библиотекой. В результате были получены космвды соэ-гт на первый зовд и соаСШ. совСШа на второй (рис.3). Построена их рестрикционная карта. Вновь проведено определение последовательности концевых фрагментов, и синтезироваш зонды 1329-30, 1238-1342 на концевой фрагыгнт сов2У и 1260-61 на коззцавсй Лрагиент совСШа, и сделан третий "шаг" по косиидной библиотеке, в результате которого область, перекрываемая предыдущими и вновь найденными клонами составила 146 тыс.п.о. (рис.3)

2.2.Составление контига клонов, перекрывающих область, содержащую ген ПХ

Параллельно с составлением контяга клонов в области генов ПЗ/СЖ аналогичинй подход был применен мной к району локализации гена ИД. Первые фаговые и коснчдше клоны были получены путем скрининга геномных библиотек на зонда из 5' и 3'областей сДК данного гена. Из косища сов23 был субклзни-

t S ХВЭД КХЬКШЕ X XXX

cosui • ш<т I I urn mi ii>nt_i.i д

1260-61

iXtg jjU.

1329-30 1гвв-134г

X X EC XEEEE

' ■ ' 'I-uu СЬЙУ

f В В ШХЗ 1ЕШЕЯХ X cos-си .ill., .i,,i .11 in mi mill

. . „ x'a* «тхчк^ s* p н

• rtmmw кштттп

606 iL-j csf-г eca-9

cos-2

Л8з

• Л5Л

ces-c

Л?!

-50

-HO _j_

-50 i

-20

-ID

0

10

20 I ■

30

-J_

w

—J-

50 _i_

50 _JL

Рис.З.Коптит juiouob из сблаоти гвноз IL3/CSP2 о укаааяязи положения зондов и его рестркквдоннся карта высокого разрешения. Стрелки укйзкваот ориентацию генов от 5' к 3' концу. Е - EcoRI, В - ВалИ1, В*- ВввНИ, 0 - Clal, F - Sill, Н - Hindlll, N - NotI, S - Gall, S3phl, S - SacII, X - Xbal, X - Xhol

70т не .и.о.

-40

•Ж

*25 1_

J * г i

-J >J7

J 1 t

cos 153 L. 1_

J ли

_J мт J XNN't

-j mi

C0S62 L

1290-32 ___

!f? Itf

x б| t xe x xb xe be вхх"хйе в f efbs e x sxeifexijfh x »

—11.1J I ILiJLJJ_liil. II I li III I II; \\\v I • I

T „ (¿йхшЙЙJ r

1205-« 628-9 329-30 1201-2 1262-«3

2Q . 30 . чр . 50 6.0 . /О

10

JA

to

I

Рис.4.Коптит клонов иа ооласта гока TLA с указанием положения зондов и его рестрияционная карта высокого разрешения. Стрелки указывают ориентацию гена от 5' к 3* концу. Е - 2coRI, В - BfflfiHI, В*- ВввНИ, С - Clsl, 7 - Sill, Н - Mlul, И - Nrul, 5*- Sacll, X - Xbal, X*- Xhol.

рован концевой фрагмент, и проведено чсстичное определение его последовательности. ДКК фага непосредственно использовалась для установления последовательности концевого участка с помснсью прайиерз Т7. В результате сягггззлрэЕанные олигонуклеотидаые зонда S28-9 и I20I-2 позволяли получить счереднув серию клоноз. Вновь било проведено определение коедевах учасгкоэ^ :i сшгтээмровары зонды 1203-4, 1290-92 на 5'копцезую от гена П4 область и Т252-63 на 3' псвдепу». Они позволили дополнительно полу-ять клоны cosí 55 и cos62. Такиы оброзоы, 1^рт4фов8Енгя и клоккроЕЕШг?я область состгвила 119 тыс.п.о. (рис.4)

2.3.Составлены? контага клоков, герекрива'зггх область, содерзааую ген~Ш>~

"экхе как и в случае гена "CL4, на "основе, йос'эдгзатэль-ностн кДК генэ Ж Сдам скЕтезирорвяг: зонда es 5' и З'хокцы S35-6 и 987-8. В результате скри&лнгз фаговой библиотеки был ползчен ряд церекрзвдгщется монов- и гострсзнн их рестрик-цнсчшне карты. Cú-эя аротякенлос^ь клоккрсвашого учгсткэ составила 2Э,5 ко.п.о. (ряс.5). опрэ/елешез ксег?вой последовательности клока ч24 цаоволняо скпчезрфсвгть пару олктокутглготядов - 1203-6, зонд на 3"область от гена 1X5. С пассць'о него <5кя проЕеден повторный скрлашг фаговой библиотеки- и удалось продвинуться а.ще кз 9 тес.п.о. в 3'область от гепз П5. ГЕиредаззция зондов 9G5-5 ш 1205-6 в дгльнэйишы с досщцноё Сгбяпотекой позволила получить ряд хловоз общеЗ протетенносгь 90 ткс.п.о., переарываЕцсх кжидкеся саговые клеш. (ртс.5).

З.Псгск CpG осхроЕкоь.

SSpHstv с асс-фосзЕсл рестртцпояннх х>лрг высокого рсз-ргаепая ltí исследовглк три кпонзроБанЕпе области, содетагаппе гепы EL3/UEF2, ГЫ я Hi, hs ла.тгаге сайтов узнавания рэдкоцэпяз5Е21 рсстракгг-аг:. Последовательности ДПК, распо-знавяемые этим« фаруентаич, обычно имеет в ьзоек составе один илч двэ дяяутиеотвда CpG, кетилировекие дезокежцигидта в которых блокирует гидролиз редаацепящкка рестртктзззаи. Встречаемость CpG якнтклеотцяа ь 5 раз нкжа, "еи других динуклеотидов в тотальной ДЕК илекопитакщх. Зггжчгяо, что

s*s' в*

h b*m hrhh s s'

Oi£i£_ML£L

x* д

A irÎI»

a и п.. ни r. i i

rh x«

JUJL

rh rr

■ЛП11

J--u.l .1 ,1.111

1390-91

x*cos2!

_LI

gosis çoss

~7L

¿2L

-1,0

j xic

lise J X12C

j л18с j AZ4

j x19

_i m

j x2n

в но в -i ,..ilj„

x*

BH в

.11,1. л

ее

-LL

x* sa l 1

1Z05-6 1?_,

087-3'

_SSL

hbhb e ehh в и .e " пи / i

jL-5"-98S-6

ю

50

J9

R

Рис.Б.Контиг клонов из области гена IL5 с указанием положения зондов и его рестрикционная карта высокого разрешения, стрелян указывают ориентацию гена от 5' к 3' концу. Е - SaoRI, в - BamHI, В*- BseHII, H - HinûIÏI, M -MluI, N - Hotl, S - Sali, S* - SacII, X - Xhol

упасткя узнавания редкощепящиш рестриктазами часто кластеризуется в CpG островках (СС богатые участки длиной 1-2 тыс.п.о.). Было поксзэно такЕе, что такие островка часто обнаруживаются в 5'концевых областях генов и, следовательно, могуг служить в качестве маркеров мест потенциального распо-лозения генов. Во-вторых, точная локализация таких остроз-ксв, содеряа/цих участки узяавгняя редкочешщяш рестриктаза-ш, способствует построении суихроиосошзис физических карт.

Для поиска CpG богатых островков иы картировали участки узнававин рестриктазами BssHII (сайт узнавания 5'G"CGCGC3'), Mini (Б'А^СССС^З'), Not1 (5'GC*GGCCGC3'), SacII (5'CCC-CAGG3'} я Síil (5'GGCCN laM^NGGGra'). Как показано на рис.3-5, были найдепы: островок на расстоянии 17 тис.п.о. от 5' конца гена НА, содержаний EesHII и SacII сайты, два островка на расстоянии 44 к 50 тис.п.о. от З'конца гена 115. Они содержат в свозн состава сайга узнавания líotl, BssHII, SacII и БббНИ, Secll, Mini соответственно. Ж еще один островок бич сбиару-кек на расстоянии 50 тыс.п.о. от 5'конца гена IL3 с помогаю MotI,.SacII, BbsHII. Отсвде следовало, что по крайней мере три последних CpG островгш с болшой вероятностью легат вблизи генов, отличных от аышелеречнслеишх. Расстояние от генов ИЗ к IL5 до соответствухйда участков достаточно велико: обычно регуляторзье области, функция которых, возможно, пргсда CpG островкам, находятся не дальше 2 тыс.п.о. от начала кодаруг^да последовательностей. Кроме того, в случае гена IL3 но соседству с oci-розкои леяат уникальные (не содержат повторов) звсдащиозно консерзатшгнка (дамг гябрядн-ззцшо с ДЖС рззлггтаых жгвотвых) последовательности.

ЗЛ.Располсаение гена ШР1.

Хва сильно перэ:;ржгщиеся хоиздные клона cod 5 и сов21, распо-поганвыз з З'конззезой области от гена IL-5 н содерзвдпе два шшаупояЕнутнх CpG островка, были зеггбрпдазовснн с радиоаптиЕлоие^окыии олагопуклеотидаш, кошяементаршвги 5' и 3'концам кДНК гена ШР1. Этот ген ранее был локализован в YAC клона, содержащем гена IL4 и Q5, путем прямой селекцки кДНК. Гибридизация зонда на 3'конец этого гена с cosí5 и сов21 не дала положительного сигнала на радиоавтографе. Зонд se на 5' конец

габрвдйзовался с BssHII-EcoRI концеЕьвш фрагментами косыид длиной 1.5 и 3.2 тис.п.о. соответственно (EcoRi сайт находился в полилинкере кссдад), в то вре^я как длина гена превышает эти размера. Наличие сайта BssHII перед зондом на 5*конец гена соответствовало данным о первичной структура Е'нетраслзруемой области. Все эти результата в сумме сввдетельствсва.ш о сокепрааленноста генов IL5 и ГОЧ. На основании построенной рестеккдхонной карта (рис.5) было вычислено расстояние uaxps ншк - 50.5 тнс.п.о.

4.Составление субяроыосошых фязпческаз. карт.

Данные по рссшлскайю Upïï острсзков способствовали таете построена субхрососоышх фхзшьсюш карт областей, содерзавдх гена IL3/CSF2, ГЬ4, IX5/IRF1. Для этого был проведен анализ по Саузерку с ксподьзоьэыксы редкои;здйцнх рест-ркктаз. Гекогшай шсокоиолекулярная вцделеизгя в ага-розкых блоках, из дейкоцстсЕ человека, была обработана по отдельности ферцекгаг.ж BesIIÏI, lîlul, Hael. ï?otl, 5e.cII и SÎ11. ¿гарэза служи1 заикам каркасом для Д1£€, что позволяет мети к ыивимузу цзхавичзеша шврот'деЕая при еь вдделекш. В результате ерэдай размер недалекой геномной ДЕК npsEscss-ст несг-ольхо шдх.п.о. При гидролизе такой ДЕК рэдаезаежзал растряктазши образуется Фрагмента длиной насколько cov-ch тыс-п.о. Раздолэнке фрагментов такой дпаш возкогно только путем фореза в пульоирузнеззи злектряческои поле. Наиболее совершенной ка сегсдкжзй день является систека CHE? Juoatcur claiiroed homogeneous field), которая позволяет раздеяять молекулы ДНК размером от 10 тыс.п.о. до 12 млн.п.о. Используя установку CHEF-II DR фятз^а Bio-Raft, работажста по втк*у принципу, был проведен электрофорез рйетрктцксншх Лрагыен-тов с последугаэм переносом ДаН на фзльтр с ашощыэ кгшл-лкрпого блота. Кар»ера1»и душны слупили zpawoom .rpux'aS Saccharomyces cerevlatae и культи^гр фага х. для анализа по Саузерну ксшльзоваигсь проби, полученные в результате геномного шагания (рис.З-Б): 1329-30, 1241-42, 603-Э, I20I-2, 1203-4, 985-6 и проба не З'конец гена IRF1. Результата пЮрвдзаций предечгзлеш табл.1.

ТаОища I.Размеры рестршадаокшх фрагментов в тыс.п.о., полученных в результата полной и ч а стачной рестрикций, гиб-рядпзутщяхся о указанными пробами.

проба фратеят 1201-2 1203-4 1320-30 1¿4l-4£ ÔOè-9

BssHïI 24û 240 135 260 310 310

aiui 550 550 100 н/д >soo >900 >,900

Nasi *

кэдо- 200 240 240 50 2S0 290 290

рестршст 330 330 330 500 500

Noil 345 345 345 125 950 410 410

SacII 135 195 130 130 250 250 290

SJÍI 135 270 270 270 97 97 45

нздо- 340 340 340 240

рестрпкт ' 390 390 390

420 420 420

4.1 .Составление субэгромссоиной ф^зетескоЯ карты в

сОлйстз гэясв EL4/IL5/I3I?1.

' Наши лашшь подтвердили йнзкческое сцепление генов П4 к IL5, показанное рзпее гкбрвдязЕщей с другкка прсбаии. Зонда I20I-2, 1203-4, 1205-6 гкбридазовадись о Not1 фрагментом длтиок 345 тнс.п.о., э дНК, расцепленная BssHTI, ¡íaoí и SÜ1 по отдельности, дгвала одинаковые полоса лрп гибридизация с 1203-4 и 1205-6. С другой сторону, зонда I20I-2 и I2Í33-4 из сбдас-гп гена IL4, лекащыз по разные сторош от CpG островка, шяалгиш BssSII, Ыае1 к Síil фрагмента разней jpiк-КН; т.е. сайта узпгзаннн дапнглет рестркктззаки не Сылп подвержены метялнровапяи в ганошой лейкоцитарной ДНК. Эти результаты соэдетельствоЕэж о ток, что ген П4 обращен 5'концом в вспрзвлашш к гену IL5. Все три зовда I20I-2, 1203-4, I2C5-5 давали полосы разной длины при гкбрадизацкя с Sac II &p?7Ues.TSMiî - 135, IS5 н 130 тыс.и.о. соответственно. На сс-еовйякп з?ях даянна, давннх о даане ВвеНИ фрахиеятов и данных о рясстоянж кеяду ганом ПЛ к CpG островком в 5'облаете был сделан вывод, что «езду генаш - 220 тыс.п.о., их разделяет по крайней ¡дера два SacII сайта, а ген 1X5 находится в рестр1пщяониоы фрагигнте BssHIÏ-SacII длиной 65 тыс.п.о.

Рестр1Екцпонные керта внеокого рззрегпаншз областей, со-дерягщих геш EL4 и IL5, получение нсет в экспериментах по

клонироваша и картированию, позволили определить ориентацию обоих генов друг относительно друга. Ш использовала гибридизацию геномного блотв, содержащего Xho1, Sali, BssHII-Sall BssHII-Xho1, SacII-Sal1, SacII-2ho1, SacII-BssHII рестрякци-оннке Фрагмента, разделенные глектрофорезоы в пульснрущем воле, с пробами на 5'конец гена ÏL5 (зонд 585-6) и на 3.'удаленную от этого гена область (зовд 1205-6; (фсто.1). Из тонкого рестршсциопного картирования фагосых клоаов из района гена П5 было известно, что кавду пробеги Э85-Б и 1205-6 находится по сдаоиу сайгу Sali и Xho1, проба 1?05-6 выявляет 2Ьо1 фрагмзит длиной 12 тыс.п.о. Как показала гибридизация с генсмшц блотса;, вьвБзтречйСлеъдае сайты узнавания Sali и Zhol оказались кэыетплароБанвыия и доступными для расщЕдлвник ферментами в дегдохдтарзоЁ Jüpäit, BasHII-SacII фрагмент, гибридязукщйся с обошли зондами, как

ЗОИ 1205-6 ЭОШ StS-й

öoto.I.FFGS ьв&шз гексжной ДЗК с . исьользованке:» Sali, Xboï, Be^HII+Salï, BasHEMhoI, SacII+Sdl, SarIMboI, BssHII+SacïI . Ыльтры были ЗЕГИбрадоэовавы соответственно с пробши 1205-6 и 985-6.

и следовало озддзть, был 65 тнс.д.о. Пробе 985-6 вкявлдла (¿ратаеяты SecII-Xîioï к SacII-Sall дааной 22 я 20 гис.п.о. соответственно, а проба 1205-6 - BesSII-SalI йрагоент длиной порядка 45 тас.п.о., т.е. 5'конец гена ЦБ располагался бли-зе к SacII сайту, лежащему малду двумя генслм. Эти дсакае позволяли располагать геш на суОгромосомиой рестрикциснной карте в ориентации голова к голове (рис.б). Этот вывод впоследствии подтвердился тем, что были найдены космидаые

клоны (cosí 5 и cos21), содераащие CpG островок с сайтами узнавания BssHII, Notl, MluI на расстоянии 45 тыс.п.о. от 3'конца гена IL5, перед 5'концом гена IKF1. Таким образом, были установлены расстояния между генами IL4, 115 и IEF1 и их взаимная ориентация; построена субхромосомная рестрик-ционная карта этой области протяженностью 540 тыс.п.о.

в* s* к

В N S* F B*N S* B*B*FF N S'B*

Il I J_LJU^_I_□

IRF1 ILS IL4

0 80 Г60 240 320 400 480 560 тыс.п.о.

1 I ' ' ' I I I I_I. .1_I_I_I-1

Рис.б.Субхромосомная карта области, содержащей гены ИЛ, И£ и 2RF1. B-BssHII, F-SJil, W-Notl, S-SacII. Стрелки показывают ориентацию генов от 5'конца к 3'концу.

4.2.Составление субхрокосоиной физической карты

в области генов IL3/CSF2. Данные по гибридизации 5 зондами 1241-42, 608/9, 1329-30 (табл.1) позволели построить рестрикционную карту с использованием редкощепящих ресгршстаз общей протяженность» 1.4 ин.п.о. (ряс.7). Участки узнавания Notl и BesHII в CpG островке бали неиетилироваш, о чем свидетельствовали фрагменты разной длина, гибридазуящеся с зондами 1329-30 и 1241-42; Sacïl фрагмент, однако, был один и тот же.

Зонд I32S-30 лежит по другув сторону от CpG островка относительно гена 1L3, поэтому данные по гибридизации с ним бшш интересны с точки зрения возможного сцепления между Ш/П5/1КР1 и Ü3/CSF2 кластерами генов. Одаако не было обнаруиено общих фрагментов ви для одной рестриктазы при гибридизации с этой пробой и пробами I20I-2, 1205-6 и на 3'конец IRF1, т.е. нам не удалось продемонстрировать физическое сцепление этих двух кластеров. Но данные, полученные Huebner и коллегами по соматическим клеточнш гибридам и клиническим образцам от пациентов с приобретенными делецаями 5q, предполагают следующий порядок этих четырех генов на

-20-

длинном плече 5-ой хромосомы:

сеп-(Ш-П£-ПШ1)-ПЗ-СЗР2^ег. . Основываясь на такой порядке генов и на длине N011 фрагментов (табл.1), мы предполагали, что расстояние, разделявшее ПЗ и П4/П5/1КР1 гены не меньше 1050 гас.п.о.

В F \

В FN F F В N

J_Ч ,.i I I I

ÍL3 CSF2

0 200 400 600 800 1000 12Q0 НООтыс.п.о.

1 I I I_I 1 I I I I_J_!_I I I

Рис.8.Субхроиосомная карта области, содеряащей гены ИЗ, CSF2. В-ВввНП, ?-SíiI, N-Hotl. Стрелки показывают ориентацию генов от 5'конца к 3*концу.

Тесное сцепление цитокиновых генов (особенно генов ИЗ и CSF2) и гена П0?1 (является транскрипционным фактором, активирующим экспрессию р-штерферока, а также, зозиссно, и ряда, других генов, в том числе.геной цитокйков) наводит на шсль о их координирований регуляция при экспрессии Т-лимфоцитами. Возыаано, таксе, что цитокиновые гены произошли от общего родоначальйого гена, сформировавшего на хромосоме 5 кластер генов, ответственных за гематопозз.

Показано, что в геноме шш 113 и csX2 гены расположены на расстоянии 14 тыс.п.о., они имевт такую se ориентацию как и в геноме человека с картируются sa хроноеоые II. Геш 114, 115, irí1 у. мели расположена в том желокусе хроыооош II, что и два предадудах, и гены 114. и. 115 находятся на расстоянии II0-I80 тыс.п.о., что коррелирует с, расположением одноименных человеческих генов. Консерватизм сцепления монет говорить в поддержу обоих цредполасзннй, и дальнейшее изучение ДНК в окрестностях этих пяти генов вашо" с " точки зрения определения локализации других генов, причастных к регуляции гематопозза.

5.Обнаружение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ИДГО) в области генов 1L3/CSF2 й использование его для генетического картирования"

С цель» соотнесения физической й генетической карт области цитокиновых генов был проведен поиск ПДРФ в клонированных последовательностях. Гибридизация с тотальной ДНК человека позволила определить рестрикциониые фрагменты в области генов H3/CSF2, не содержащие повторов. Они были суб-клонированы, и изучена возможность их использования в качестве проб для выявления полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) путем гибридизации с геномными блотами, содерзацими образцы ДНК нескольких человек. Проба рбОб (рис.3), расположенная в 5'области от гена ИЗ, табрядизозалась с полиморфными EglII и. Pst1 фрагментами (фото.2,табл.2). ПДРФ по BglII независимо был обнаружен K.Jaguet и коллегами с помощью кДНК ИЗ.

Мы показали с помощью СЕРН (Centre Etude du Polymorphisme Humaine) панели ДНК 40 сеней, содержащих

BgUI PMI

Фото.2. ПДРФ вблизи гена IL3. Высокомолекулярная ДНК четырех независимых челозек была рестрик-тнровапз BglII и ïstl и проведен Саузерн блот анализ с пробой рбОб. Размеры фрагментов указаны в тыс.п.о.

представителей двух-трех поколений, что эти два полиморфизма имеют комбинированную гетерозиготность величиной 63%. Т.е. 632 индивидуумоз информативны по крайней мере в отношении одного ПДРФ, и не наблюдается рекомбинации медцу ними. Использование кешнызгерных программ 11ЖА£Е и МАРШИШ? позволило установить сцепление меяду пробей рбСб и другими маркерами па В^Ш и Рв1) генотипы были скомбинированы в гаплотапы, и проведено двухточечное сравнение с 53 маркерами пятой хромосомы из базы данных СЕРН. В результате ШЗ/СЖ! локус бал помещен меаду маркерами 05348 и 05552, наибольшее

-22-

ТабдЛ .ВДРФ в локусе ПЗ/СБК.

аллель фрагмент частота встречаемости аллеяя

А1 18.0 0.88

А2 4.5 0.12

В1 4.0 0.75

В2 2.5 0.25

оцепление вштлялось с 05Б52, С5Б65 и 05367 (рис.9).

ОНРйп

ит-

Ш6—I

ная- 4""

на. (^2-

иги-

10

7«Шч

1.1194 в

РШ-

св1ч в

ыб- 2

53

Рис.9.Схема хромосомы 5. Слева показано расположение генетических маркеров ва длинной плече хромосомы 5, расстояния даны в сантиморганах. Справа показано расположение ряда генов ростовых факторов и рецепторов: АБВВ2К - £2 субъединицы адренергического рецептора, СИ. - глюко-кортикоидаого рецептора. ЮТА - кислого ростового фактора фибробластов, САВЙА1 - с>1 субъедивицы рецептора г-аииномасля-ной кислоты, СБР1Й -рецептора колониеспиу-лирувдего фактора 1(РИЭ) РШга - ростового фактора из тромбоцитов. Расположение гена ИНК* (дегидрофалат редуктазы) приведено для соотнесения генетической карты с физической.

Тагащ образом, удалось соотнести физическую карту кластера цитокиковнх генов с генетической. 1ЩРФ является также удобный инструментом при картировании делеций в раковых клетках. В случае гетерозиготности пациента по полиморфному маркеру путем сравнения . нормальной ДНК и ДНК из злокачественных клеток можно обнаруживать делеции в одной из гоиологачных хромосом. Анализ клеток при острой миелоидной лейкемии затруднен относительной редкостью заболевания, сложностью в очистке злокачественных клеток от нормальных клеток из

костного аозга и отсутствием наследственных случаев. Адаптируя данные по полиморфизму к использованию метода ПЦР, можно анализировать отдельные лейкозше клетки на предмет делеций на ранних стадиях.

Выводы.

1.Созданы геномные библиотеки человека на основе фага ^РГХ и косиидного вектора р*Е15 общей представительностью 1.5*10б клонов и 0.5*10 клонов соответственно.

2.Получены контиги фаговых и косыидных клонов из геномных библиотек человека в области генов И4, И5/ШУ1 и ИЗ/СБРг общей протяженностью 119 тыс.п.о., 90 тыс.п.о. и 146 тыс.п.о.

3.Построзны рестрикционные карты высокого разрешения этих районов, и обнаружена три СрС богатых островка перед генами 3X4, ГКР1 и ИЗ.

4.Получены наборы уникальных олигонуклеотидных зовдсв (БТЗ), равномерно расположенных вдоль контигов со средним расстоянием ыевду соседнини пробами 10-20 тис.п.о.

5.Построены субхромосомные физические карты областей, содержащих гены ПД/Пб/ШЧ и ПЗ/СБРг, и определено взаимное расположение этих генов.

6. Обнаружен ПДРФ в 5' области от гена 1ЬЗ, и на его основе установлены тесное сцепление генов 1ЬЗ/С£Р2 с генетическая маркерами Б5552, В5Б65 и 55557 и локализация генов между 05558 и Б5562.

Основше результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

l.Prolova ЕЛ., Dolganov С.Н.,гит)ег G., Smirnov D.V., Mazo

1.A., BistroY N.S., Severtsova I.V. Structural organization oi the genes lor hemapoletic growth lectors in the genome oi normal and leukemic patients.-In: International . symposium on Molecular i act or в oi hematopoiesis and stem cell. Abstracts.- USSR-FRG, Volga-ffilsede, 1990, p.12.

2.Frolova E.I., Dolganov G.M., Наго I.A., Smirnov D.V., Copeland P., Stewart C., O'Brien S.J. . Dean Ы. Linkage mapping oi human CSF-2 and Д-3 genes.-Proc. Matl. Acad. Sci.USA, 1991, vol.88. pp.4821-4824.

3.SmirnoY D.V., irolova E.I. Structural organization of the human interleukin 4 and interleukin , 5 genes linkage group.-Int. J. Cell Cloning, Symp.Ser., 1991, vol.9, J6 4, p.382. -

4.Смирнов Д.В. Физическое картирование и клонирование области большого плеча 5-ой хрокосош человека, содержащей гены интерлейкина-4 и интерлеЁкика-5.- В сб.: 2-ого Всесоюзного сишю^иука по теоретическим и прикладный аспектам молекулярной биологии. Тезисы докладов.-Саиярканд, 1991, с.178.

5.irolova E.I., Smirnov D.V., Dolganov G.K., Eazo I.A., Bistrov M.S., Severtsova I.V. Structural organization oi Cytokine gene cluster on human chromosome 5.-In: Haemotology and Blood Transfusion vol .35/Uodem trends In Human leukemia IX/E.Meih et al.(Eds.).-Berlin, Heidelberg: Sprlger-Verlag, 1992, p.166-174.

6.Frolova I.I., Smirnov D.V., Harkelov U.L., Sherbinskaya U.K. Physical mapping of tbe cytokine gene cluster on human chromosome 5. - in: 2nd European HUGO conference on human genome diversity. Abstracts.-Italy, Porto-Conte, 1992, p.110.

7.Frolova E.I..Smirnov D.V., Jiarkelov И.1., Sherbinskaya Ы.К. Physical napping of the cytokine gene cluster on human chromosome 5.- in: International Symposium on Stucture & Junction of regulatory polypeptides. Abstracts, Vol.2.-Bussia-PRG, Volga-Wilsede, 1992, p.11.