Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Чувствительность бактерий к антимикробным препаратам при различных температурах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Чувствительность бактерий к антимикробным препаратам при различных температурах"

Р Г 5 ОД

л « •.«• г- На правах рукопи©

ШМИДТ Елена Наумовна

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ БАКТЕРИЙ К АНТИМИКРОБНЫМ .ПРЕПАРАТАМ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

На правах рукописи

ШМИДТ Елена Наумовна

'¡УЕСТБГГЕЛЬКСчЛЪ БАКТЕРИЯ К АНТИМИКРОБНЫМ .ПРЕПАРАТАМ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург ¿096

Работа выполнена в Санкт-Петербургской Государственной медицинском университете имени академика И.П. Павлова.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.В.Тец.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор К.О. Гранстрем доктор медиииноких наук, профессор Г.Е. Афиногенов

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Защита состоится " 0> " ¿¿¿ОНлЯ 1985 г. и ' ~иаеов на заседании диссертационного совета К.084.21.01 при Санкт-Петербургской Государственной медицинской академии (195007, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской Государственной . медицинской академии.

Автореферат разослан " ^Г " & ^ 199В Г.

Ученый оахретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профеооор

А.Г. Бойцов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актудл;чмг><угь темы; Антибиотики относятся к числу наиболее широка используемых фармацевтических препаратов. Однако, несмотря на успехи в создании, изучении и внедрении в медицинскую практику новых антимикробных средств, антибактериальная терапия нередко оказывается малоэффективной. Конечный результат применения антибиотиков а значительной степени зависит от особенностей структуры, генетической организации, характера и условий роста конкретного штамма микроба,, вызвавшего заболевание.

Одним из существенных фактора» — оилпы, -гг~.~:___„¡м мп

киэнвявят«»»: 4нигг»г*Л/ ."игляатоо гемгезратур®. В последние го-

достмгнуги значительные успехи в изучении воздействия температуры на различные свойства бактерий. Показано, что она влияет но только на скорость роста и Интенсивность протекания метаболичес-. ких процессов в микробной клетке, но также ла физико-химические особенности поверхности бактерий, способность к адгезии, антигенные свойства, продукцию внеклеточных белков; й тон числе ферментов и токсинов, а также принимает непосредственное участие в регуляции вирулентности микробов. Изменение температуры тела пациента (лихорадка или локальная гипертермия) является характерным симптомом при различной инфекционной патологии. Вместе с тем, вопрос о влиянии температуры на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам до сих пор не являлся предметом направленного, комплексного изучения. Имеющиеся данные весьма ограничены, касаются отдельных видов бактерий и не охватывают физиологически значимый диапазон температур. Практически отсутствуют сведения о воздействии индуцибальных систем температурной адаптации (системы теплового шока), принимающих участие я регуляции вирулентности патогенных микробов, на проявление их антибиотикоустойчивости.

В последнее время установлено, что в естественных условиях, в том числа в организма человека, патогенные микробы, как и представители нормальной микрофлоры« существуют в виде адгеэированкых биопленок и колоний. Свойства микробов, входящих в состав биоопенок, в том числе их чувствительность к токсическим веществам {антибиотикам и дезинфектантам), существенно- отличаются от таковых у диффузно растущих бактериальных клеток'<Coвteгtoп ОМ., 1987). В то же время,, колонии остаются в этом отношении практически не изученными . Общепринятые методы определения чувствительности бакте-

рий к антимикробным агентам не учитывают особенностей жизнедеятельности микробов внутри колоний и биопленок. Отсутствуют также данные о роли температуры в регуляции свойств бактерий, находя-клхся в составе колоний.

Пяльи настоящей работы являлось изучение и сравнительный анализ роли температуры в регуляции выживаемости и изменчивости бактерий как в интактных колониях и диФФуэно растущих культурах, так и в присутствии антимикробных препаратов. В процессе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучение особенностей поведения бактерий в составе колоний при различных температурах.

2. Сравнительный анализ влияния температуры на выживаемость бактерий в колониях и диффузно растущих культурах в присутствии антимикробных препаратов.

3. Изучение уровня спонтанной изменчивости бактерий в колониях и диффузно растущих культурах.

4. Изучение антибиотикочувствительности штаммов, дефектных по генам системы теплового шока.

УЭгнпямня пплгчгяммя. п^пгищт мя адпмту

1. Динамика роста популяции энтеробактврий, находящихся в составе холоний, и в бульонных культурах зависит от температуры культивирования.

2. Бактерии в составе колоний лучше выживают в присутствии антибиотиков, чем диффузно растущие микробные клетки.

3. Температура культивирования оказывает более существенное влияние на выживаемость в присутствии антимикробных препаратов энтеробактерий, находящихся в составе колоний, по сравнению с диффузно растущими культурами. При температурах, близких к верхнему пределу Физиологического диапазона, бактерии в составе колоний хуже выживают в присутствии различных антибиотиков.

4.Частота встречаемости спонтанных мутаций антибиотикоустой-чивости у энтеробактерий, растущих в составе колоний ниже, чем при росте в виде суспензии. Научная новизнп.

Исследована динамика изменения количества жизнеспособных клеток в популяциях бактерий, растущих диФФуэно и в составе колоний. Впервые продемонстрировано, что бактерии в составе интактных колоний более чувствительны к повышению температуры культивирования, что проявляется в ускорении процесса их гибели. Полученные

экспериментальные данные подтверждены результатами электронно-микроскопического изучения интактных бактериальных колоний при различных температурах культивирования.

Впервые изучено влияние температуры культивирования на выживаемость бактерий, находящихся в составе колоний, в присутствии антимикробных препаратов. Показано, что при температурах, близких к верхнему пределу физиологического диапазона, энтеробактерии в

СОСТаВв КОЛОНИЙ Хуяв ВЫЖИВаюТ В ПРИСУТСТВИИ ----. «¡яииотн-

коа.

Петтуч-ки данные, свияетельствукие о снижении частоты встречаемости спонтанных мутаций (в т.ч. устойчивости к антимикробным агентам) у энтеробактерий, находящихся в составе колоний, по сравнению с диФФузно растущими культурами. .Практическая значимость.; ■

Данные о повышенной выживаемости бактерий, находящихся а составе колоний, в присутствии антимикробных.препаратов позволяют по-новому оценить эффективность использования последних в терапии инфекционных состояний. В работа показано влияние изменений температуры в рамках физиологического диапазона тела человека на активность действия определенных антимикробных агентов в отношении бактерий, растущих диффузно и в составе колоний. Полученные данные указывают на значимость изучения на биологических моделях эффективности лечения антибиотиками в зависимости от температуры тела и разработки практических рекомендаций для врачей. На основании результатов изучения мутационной изменчивости бактерий, находящихся в составе колоний, можно оценить рвальтага темпы изменчивости микробов во внешней среде и организме хозяина, что ваано при прогнозировании темпов Формирования а! ггибиотико резистентных кленов. \ .' - '•

Апробация..работы..

Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедры инфекционных болезней СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Основные материалы диссертации доложены на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им.. Пастера (Санкт-Петербург, 25-27 мая-1993 г.), отчетной- конференции.СП6СГМИ "Актуальные вопросы профилактической и клинической медицины" (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 1994 г.). »КгЛ■"■*'•■ ■ :*'

, Внедрений результатов работы.

Основные результаты исследований внедрены,в учебную (практические занятия и лекционный курс обшей, частной и клинической микробиологии для студентов 2, Э и в курсов и врачей) и экспериментальную работу кафедры и практику лабораторных исследований бактериологической лаборатории клиник СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Лублнкаини.

По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Объем и структура пиесг;ртя""и Работа изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Библиография - 368 наименований, 20 на русском и 348 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и_методы исследования. Объектом исследования

служили бактерии из коллекции кафедры микробиологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Использованы следующие штаммы: вирулентные, выделенные от больных Escherichia coll VT1240 (0124), E.coll VT1110 (Olli), E.coll VT550 (055), E.coll 018ac 1, E.coll 018ac 116, E.coll 018ac 152, Shigella flexnerl VT100, S.Bonnol VTS2, Salmonella typhlmurlum VT80, Staphylococcus aureus 668 и лабораторные штаммы E.coll В, E.coll AB1157 и E.coll AB1157dnaK.

В качестве основных питательных сред использовали мясо-пеп-тонный бульон (МПБ) и ЗХ мясо-пептонный агар.

Биохимическую активность бактерий изучали на средах Гисса.

Чувствительность использованных в работе штаммов к антимикробным агентам определяли методом дисков (Bauer A.W., et.al., 19вв).

Вирулентность бактерий устанавливали по кератоконъюнктиваль-ной пробе (Soreny В., 1957), а также при внутрибрюшинном заражении беспородных белых мышей (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962.), гемолитическую активность изученных штаммов оценивали по способности бактерий вызывать гемолиз эритроцитов при росте на кровяном агаре.

Минимальные ингибируюиие концентрации (МИК) определяли при 18-20, 37, 40 и 42*С методом микроразведений в плоскодонных 86-луночных платах для иммунологических реакций (Mackowlak P.A., et.

al., 1982). Наличие видимого роста бактерий учитывали черва 2448 ч инкубации.

Выживаемость бактерий в бульоне и присутствии 2хМИК антибиотиков определяли через 2 и 24 ч роет» при 18-20, 37 и 42*С методом количественного высева 10-кратких разведений культуры на плотную питательную среду.

Выживаемость бактерий, находящихся я .составе» односуточиых колоний, в присутствии антибиотиков определяли путей перемещения участка агара с несколькими колониями на свв*ий агар, солво-

жаЩИЙ аНТИМИКООбньЛ —Г"". «мямп»«""- _____ и »unD-

и«»«- .. ¡■¿■„'„¿Сипни пг;' есотвэтствуюеей температуре методом количественного высева на плотную питательную среду. Выживаемость выражали в процентах от количества хивык клеток в односуточиой колонии.

Частоту встречаемости опонтанных мутаций оценивали по при- . знаку устойчивости к рифампицину. Исследование проводили через 24, 48, 72, S3 и 120 ч роста бактерий. Частоту встречаемости мутаций вычисляли как отношение количества уствйчигых мутантов к обявму числу жизнеспособных клоток п колонии или a 1 ил бульонной культуры.

Злзктронно-микроскопическов изучение бактерий проводили о "помощью метода негативного окрашивания 0.1% йодным раствором ура* нилацетата (Brenner S. , Hörne R.W. , 1959). При изучении ультра-* структурной организации бактерий препараты готовили по методу A.Ryter и E.KeHenberger (1957).

Срезы готовили на ультрамикротоие LKB - QS00. Препарат» рассматривали я электронном микроскоп» JEM - 100С при ускоряющем напряжении QOkV.

Структуру колоний изучали с помошьй сканирующего электронного микроскопа JSM - 35С. Колонии клеток фиксировали последовательно а парах акролеина и четырахокиои осмия,, после чего производили напыление золотом' (BlacJt J.Т. ,1074).

Электронно-цитохимическое изучение мукополисахаридных капсул выполняли с помощью метода T.Kobayaei и G.Saboe-Haneen (1971).

Автор выражает благодарность 01В.Ры6альчвико эа помощь в выполнении электронно-микроскопических исследований.

Полученные количественные данные были обработаны о использованием методов вариационной статистики. Наряду оо средним арифметическим значением М вычисляли величины среднеквадратичной ошибки

- а -

сигма (Монцевичюте-Эрингене Е.В. 1964), коэффициент корреляции R (Плохинский H.A. 1970), доверительные границы выборочного параметра и коэффициента корреляции m (Плохинский H.A. 1870).

. Результаты. и..,обсуждение..

Результаты изучения свидетельствуют, что температур.*, культивирования по-разному влияет на динамику изменения количества жизнеспособных бактерий в диффузно растущих культурах и находящихся в составе колоний. При комнатной температуре пролиферация диффуэ-но растущих бактерий происходила значительно медленнее, чем при оптимальных и температурах, близких к верхней границе ростового диапазона. Однако, в стационарной Фазе роста (через 24 ч) число живых бактерий в культурах, выращенных при разных температурах, отличалось незначительно.

Количество жизнеспособных бактерий в составе интакткых колоний характеризовалось более выраженной зависимостью от температуры: наибольшее возрастание числа жизнеспособных клеток через 48 ч роста по сравнению с таковым в односуточных колониях отмечалось при комнатной температуре (примерно в Б раз), наименьшее -при 42"С (в 2-3 раза). Полученные результаты свидетельствует об ускорении процессов гибели микробов в составе интактиых колоний при повышении температуры инкубации. г

Изучение воздействия температуры культивирования на уровень чувствительности к антимикробным агентам (величину МИК) бактерий, растущих диффузно в жидкой питательной среде, показало отсутствие существенных вариаций в рамках ростового диапазона. Вместе с тем, при температурах, близких к границам оптимального роста, - подавление пролиферации микробной популяции может происходить при меньших концентрациях антибактериального агента, чем при оптимальной температуре (37"С). Это явление было более выражено в области нижней границы оптимального диапазона (1S - 20°С) при использовании тетрациклина, рифампицина и цефтизоксима (2-х кратное снижение МИК наблюдалось в 38.2X случаев, 4-х кратное - в 17.7SO. Наблюдаемое повышение чувствительности может быть связано с отсутствием при 16-20'С образования многих клеточных компонентов (кап-аулы, пилей, ЛПС), которые могут препятствовать поступлению препаратов внутрь бактериальной клетки. При 42*С (верхняя, граница оптимального диапазона) достоверное снижение МИК было зарегистрировано только для гентамииина.

V Температура также оказывала воздействие на интенсивность ги-

бели бактерий в первые часы после добавления антибиотика (Таб.1). При низких температурах (18 - 20*С) бактерии выживали лучив, чем при оптимальной (37°С). Вместе с тем, после 24-Х часовой экспозиции в присутствии 2-4хМИК антибиотика во всех испытанных случаях более 99.993» бактерий утрачивали жизнеспособность.

Таблица 1.

Выживаемость бульонной культуры бактерий через 2 часа инкубации в присутствии антимикробных агентов при различных температурах.

ьактерия - t'C КОЕ/мл Антибиотик Ампициллин Налидиксовая кислота

Shigella sonnel VT92 К* 37 *C 42*C (2.0±0.3)х10в (1.4±0.1)х10Т <3.4±0.3)х10* (4.7±1.1)х10в (2.4±0.4)х10< (2.В±0.2)хЮ»

Esoherlchla coli VT1240 К 3?*C 42'C (4.5±0.5)х109 <1.2±0.3)х10т (4.2±0.6)х10< (1.5±0.3)х10о (1.4±0.1)х10* (1.9±0.3)х10®

* Комнатная температура (18-20*С)

Очевидно, у разных бактериальных штаммов уровень и степень выраженности термической индукции тех или иных механизмов изменения чувствительности к антимикробным препаратам различны, что проявляется неоднозначностью результатов, полученных при изучении влияния температуры на эффективность действия антибиотиков в отношении различных неродственных и родственных микробов, яклвчая представителей одного вида бактерий (Швидченко И.Б. 1977; Mateots-Мога М. et. al., 1988; Sierra-Madero J.G. et. al., 1988; Trsoín-aki K. et. al., 1993; Whlte-Ziegler C,A. et. al., 1992.) Термическая индукция одновременно нескольких разнонаправленно действующих механизмов модификации урбвня чувствительности микроба к тому или иному антибиотику может приводить к отсутствию видимого воздействия температуры на его конечный эффект (величину МИК и ИБК). что продемонстрировали наши эксперименты.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии высоко-лф-фектив"ых механизмов адаптации микроорганизмов к росту в широком диапазоне температур. Одним иэ ее проявлений является сохранение примерно равного уровня выживаемости диффузно растущих бактерий в

присутствии антимикробных агентов при различных температурах физиологического диапазона.

Бактерии, находящиеся в составе односуточных колоний, оказались существенно менее чувствительными к бактерицидному действию антимикробных препаратов, по сравнению с микроорганизмам., в бульонной культуре. Наибольшую активность в отношении бактерий, находящихся в составе колоний среди испытанных антибиотиков проявили-гентамицин (Ген) и эритромицин (Эр): через 24 часа инкубации бактериальных колоний при 37'С в присутствии 2-5хМИК этих антибиотиков жизнеспособность сохраняли не более 10% бактерий. Аналогичное снижение количества жизнеспособных микроорганизмов имело место в присутствии 10-20хМИК ампициллина <Амп), 25-50хМИК налиликсовой кислоты (Нал), 50-100хМИК хлорамфеникола (Хф). Наименее активным оказался цефтизоксим (Цеф), который в аналогичных условиях вызывал десятикратное снижение числа жизнеспособных бактерий в составе колоний в концентрации 500хМИК.

Механизмы снижения чувствительности к антимикробным препаратам бактерий в составе колоний малоизучены. В некоторых случаях причиной может являться взаимодействие препарата с поверхностными структурами (поверхностной пленкой и межклеточным веществом, в которое погружены микробные клетки в колонии) (Nichols W.W. et. o.l., 1989). Другой причиной наблюдаемой устойчивости бактерий могут являться физиологические особенности адгезированных клето;-; (низкий уровень метаболизма) "(Brown M.R. et. al., 1988). Еще одной причиной может являться высокая концентрация клеток в колонии. Кроне того, морфологические особенности клеток в поверхностных слоях колонии могут способствовать адсорбции ими антибиотика, что будет препятствовать проникновению последнего в более глубоко лежащие зоны колонии и способствовать выживанию находящихся таи бактериальных клеток. Наконец, возможность накопления микробных продуктов, способствующих связыванию'или инактивации антибиотика, внутри колонии, покрытой поверхностной пленкой, подобно тому, как это происходит в перипла^матическом пространстве грамотрицатель-ках бактерий, несомненно, 'является одним из факторов высокой "устойчивости этих образований к антибиотикам (Nichols Vi,W., 1989; Nikaldo H., 1989).

Эффект температуры на выживаемость бактерий, находящихся в

составе колоний, в присутствии антибиотиков оказался значительно более выраженным, чем в случае» диффуэно растущих культур, и на глияалоя чере-г 24 часа инкубации с антикнкрзб1шм препаратом. Полученные результаты свидетельствуют о снижении выживаемости бак-торий в колониях о присутствии антимикробных препаратов при гоги-шении темларпт"/р!_- инкубации. Характер и выражонность тегмоиилуци-руемых изменений кыгиепскости зависали от использование!'» препарата и ннднаидуАпьювс особенностей микроба.

Для больщиистйл и-.—--«^«миииия ________ иггвим*

" —::.....r.CnKi-u «г»»» температуры инкуба-

ции до <12*0 способствовало усилению гибели бактерий п присутствии антибиотиков. Более 99% процектоз микробов погибали при текпора-туре 42°С з 35.°i случаев, белее 10% бактерий сохраняли хизнеспо-собность только з 13% случаев. В тех хе условиях при 37*С более 10% микроогранизмов выживали в 39% испытанных комбинаций, а более 99% погибали только в S% случаев. Таким образом, имеет место отчетливая тенденция к снижению пыжисаемости 6а::торнй, находлыихся cnCTAve kc/ic.hi , приеугстс.и!! антибиотиков при ' ^эь-.^нии тем-гторптуры яикуОации.

'-!". :•.'£ о,-, о у •.•i!j>!!4seimao ьависимссть бактерицидного действия от ^-l e'Mi^p^Tyr'i'- .интибиотика, относящегося к группе --

•fowuM'-iwi, - гентнмиш-иа. В присутстти »того препарата вижи-'iiur/iv .if« комнатной температуре по всех испытанных случаях г.г-'ОГ'-та.пл . Погашение т^ипе-ратуры инкубации до присолило

от:,,.»:.:■:-::;,о е-сгизавиогти на 2 порядка и более. При Л'Л'С погибал» ь 5-10 р-дг> t>or.tS3 Сактврии, чем при 37*С.

Антибиотики - блокатопч клеточной стенки (Ann и Неф)

окаса.чнсь а 2-0 ¡.-аз оолоч активны при '¡2°, чем при 37°С. Иккубч-лил бактерий iii-'.i Kot3ts.Tt»ft i-wMiiepaType ti присутствии атих препаратов могла как приводить к повышению выживаемости {в 6-9 раз), так и не влиять на нее.

Эритромицин также екасш&л бактерицидный эффект в отношении микроорганизмов, находящихся в составе колоний. Наиболее интенсивная гибель микробов имела,,место при 42'С: сохраняли жизн-сп • собность не более <1% бактерий. При 37°С выживали 5-9% микроорганизмов, тогда как при комнатной температуре около 50% бактерий сохрангли способность к образованию колоний. # Менее однозначный характер зависимости от температуры пока- •

зан для выживаемости бактерий в присутствии хлорамфеникола. Пред-

ставители рода Shigella продемонстрировали высокую выживаемость, уровень ее практически не зависел от температуры инкубации. Колонии всех изученных штаммов E.coli оказались чувствительны к действию этого препарата, причем, эффект антибиотика усиливался при повышении температуры инкубации: менее 1% бактерий со храняли жизнеспособность в присутствии хлорамфеникола через 24 ч при 42*С. Выживаемость при 37° С была в 5 - 15 раз выше.

Как и другие антибактериальные агенты, налидиксовая кислота при комнатной температуре оказывала наименьший микробицидный эффект в отношении бактерий, находящихся в составе колонии, и существенно более выраженное действие при 37еС. Инкубация при температуре 42*С могла как приводить к дальнейшему усилению гибели микробов (снижение выживаемоеги в 4 - Э раз), так и не оказывать влияния на выживаемость по сравнению с 37 ° С.

Эксперименты с грамположительными бактериями, относящимися к роду Staphylococcus (штамм S.aureus 66S) продемонстрировали высокую устойчивость этого микроба, находящегося в составе колоний, к большинству испытанных антибиотиков (Амп, Цеф, Эр). Уровень выживаемости практически не зависел от температуры инкубации: во всех случаях сохраняли жизнеспособность более 405» от первоначального количества живых клеток а колонии.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что, хотя бактерии в составе колоний в присутствии антимикробных препаратор выживают лучше, чем диффузно растущие культуры, бактерицидный эффект Антибиотиков в отношении микроорганизмов в колониях существенно зависит от температуры культивирования: при температурах, близких к верхнему пределу оптимального ростового диапазона (42*С), выживаемость бактерий, находящихся в составе колоний, в присутствии антибиотиков оказалась наименьшей. Очевидно, бактери альные колонии как "-целостные интегральные структуры значительно боле» чувотвительны к изменению такого Физиологического параметра, как температура, чем отдельные бактериальные клетки.

Имеются данные (Hoyl^B.D. et. al, 1992; Ketyl I., 1991; Le-Chevalller M.W, et. «1., 19S3), что в ряде случаев именно обраэо-j*hhu поверхностной пленки, иэолируххцей колонию от внешней среды, является причиной снижения чувствительности к антибиотика»! бактериальных клеток в ее составе. Ускорение образования и увеличение толщины этой пленки при повышенной температуре (42*С) может препятствовать проникновению препаратов внутрь колонии в этих уело-

Выживаемость бактерия, находящиеся и составе колонка, з присутствии антимикробна* агентов при различных темпер V рзх (в процентах ст коа ннтактноЯ одкосуточной колони«

Таблица. 2

niTaMH Еикива.£мость {%)

t*C Антибиотик.

АКП 1 X'? Ген Нал

Shigella ; flexneri VT49 K* . 37* С 42* С 19.342 2 . D40. /' 21.5x0.3 16.Oil.0 А. 340.3 0. 1240.12 19.143.5 5.141.!

Shigella sonnei VT92 К 37* С 42\С 13.243.1 14.042.9 1.540.4 22.010.5 14.540.5 4.642.5 0 .3240.19 43.842.7 14.240.1 3.340.7

Escherichia coli VT1240 К 37* С 42* С 10. 140.4 12.Л40.5 5 . '140. 9 Е 87.245.4 16.3+1.5 14.744.7

Escherichia . coli. Olli .; К 37* С 42* С 17.542.5 5.140.1 8.640.S 0.9540.:

Escherichia coli 018ac/l R зге 42* С 40.148.0 6.641.0 0.9140.21 25.342.1 5.240.9 0.32+0.08 45.749.2 0. 2740.07 0.3440.02 60.448.2 7.942.1 7.141.2

Escherichia coli OlBac/2 К 37* С 42* С 52411 3.441.0 4.ОН.2 29+4.5 1.0+0.23 0.18+0.05 •1249.1 0.04г0.02 <0.001 9.042.У 1442.3

Escherichia coli OlSac/3 В 37* С 42* С 4542.5 5.040.4 0 . 8<540.12 41+6.1 8.642.0 0.78+0.17 53+4.1 о. ;:з+о.о9 0.14+0.06 :

L!ei> | Vp

17.0.11.0 3.Ö+0.8

8.2+2.9 1.740.9 -

-

13.1+0.1 1.8+0.01 -

: 33.4+4.1 3.8+0.7 2.6+0.7

- 52.9411.3 4.7+0.3 1 .9Ю.7

: 59.7 *'7. 3 Э.7±и.7 3.440.3

* Комнатная температура (18-;!0"С)

виях и таким образом способствовать увеличению выживаемости микроорганизмов в присутствии антимикробных препаратов. С яругой стороны, состав и структура поверхностной пленки, покрывающей колонии, практически не изучены. Тем более, отсутствуют данные о влиянии температуры на ее проницаемость в отношении различных химических соединений, включая антимикробные препараты. Нельзя также исключить вероятность изменения концентрации микробных продуктов, связывающих или инактивирующих антибиотики, внутри колоний при повыщениии температуры как следствие увеличения скорости диффузии и/или изменении проницаемости поверхностной пленки.

Вместе с тем, наличие поверхностной пленки не всегда объясняет увеличение выживаемости а присутствии антибиотиков бактерий, находящихся в составе колоний. В ряде случаев этот эффект, очевидно, связан с физиологическими особенностями клеток, в частности, со снижением скорости их роста и метаболической активности (Brown M.R. et. al, 1983; Ûilbert P. et. al., 1990). Не исключено, что ускорение старения бактериальных клеток в колониях при повышении температуры объясняет усиление бактерицидного эффекта многих антимикробных препаратов и отношении бактерий в этих условиях.

Элактроно-микроскопическое изучение микробных колоний, выращенных при различных температурах, позволило подтвердить это предположение. Полученные нами данные свидетельствуют о влиянии температуры инкубации на ультраструктуру бактериальных колоний и строение бактерий в их составе. Культивирование при 42*С приводит к раннему образованию ттоверхностной пленки, что свидетельствует об ускорении процессов их старения. В колонии уже после 24 ч роста при 42*С имеется значительное количество морфологически измененных клеток. Отмечается также увеличение электронной плотности бактерий, что является одним из проявлений их адаптации к неблагоприятным внешним " условиям (Рыбальченко О.В., Савкова Г-А., 1989: Жуковский А.П. и др. ,1991).

С целы» изучения влияния на чувствительность к антимикробным препаратам продуктов геноЬ^систеиы теплового шока <ТШ) исследовали дикий штамм E.coli ABl157 и изогенный мутант по регуляторному секу системы ТШ dnaK. Выживаемость бактерий, находящихся в составе односуточных колоний> определяли при оптимальной и максимальной ростовых температурах для мутанта dnaK: 30 и 37*С. В интакт-кых колониях мутанта, выращенных при оптимальной температуре

30°С, в ходе дальнейшей инкубации при 37еС имела место интенсивная гибель бактерий.

Результаты экспериментов свидетельствуют об отсу :твии отличий в выживаемости бактерий дикого типа и мутанта в присутствии антибиотиков при указанных температурах. Характер зависимости выживаемости от температуры оказался сходным в обоих случаях. Инкубация колоний в присутствии антибиотиков при 37°С приводила к несколько более выраженному снижению выживаемости в-случае мутант-ного штамма, что, вероятно, является следствием чувствительности

«HTekiheA оактвпми. ~ гМ- _ , ... iiTwri 1 Dt4!iCUrt—

туре. Тот что нам на удалось экспериментально установить

различий в выживаемости в присутствии антимикробных препаратов мутанта по гену dnaK системы ТШ и иэогенного микрооргьниэма дикого типа, возможно, обусловлено особенностями диапазона ростовых температур мутанта: максимальная температура, при которой еще возможна его пролиферация, - 37°С - требует ограниченного присутствия белков ТШ. Отрицательный результат в данном случае не исключает возможность активного участия последних в модификации чувствительности к ант(.оиотикам при более высоких температурах.

Частоту встречаемости спокталпых мутаций в популяции бактерий, растущих в виде суспензии в жидкой питательной среде и в составе колоний, изучали на примере двух штаммов: E.coli VT1240 и S. ¡зоппеi VT92. Определяли встречаемость спонтанных мутаций по признаку устойчивости к рифампицину на разных сроках и при различных температурах культивирования бактерий. Достоверных отличий в частоте встречаемости и динамике накопления устойчивых мутантов в составе колоний изученных температурах (10-2О"С, 37 и 42'С) гыявитъ не удалось. В то яе время частота встречаемости спонтанных мутпиин в суспензионной культуре бактерий оказалась достоверно выше, чем в микробных колониях, причем, различия увеличивались с повышением температуры культивирования бактерий,-' .

Причиной наблюдаемого эффекта, вероятно, являются особенности Физиологической активности бактерий, растущих в составе колоний. Данные об изменении интенсивности мутирования бактерий, находящихся в составе колоний, доказывают необходимость пересмотра существующих представлений о вероятных темпах Формирования анти-биотикорезистентных вариантов возбудителей в естественных условиях. ■

Лихорадочная реакция макроорганизма на присутствие инфекци-

Таблица 3.

Частота встречаемости спонтанных мутаций устойчивости к рифамлицину в бактериальных колониях при различных температурах.

Бактерия t*C Частота встречаемости рифампицин - устойчивых бактерий

Shigella sonnai VT92 К» 37*C 42*C (1.9±0.31)х10-в (2.6±0.42)х10-в (2.9±0.46)х10-в

Eecherichia coll VT1240 К 37*C 42*C (1.9±0.25)х10-в (1.2±0.22)х10-в (1.4±0.38)х10-в

* Комнатная температура {18-20*С) .

онного агента (локальная гипертермия в очаге инфекции и общая -. лихорадка) являются как следствием возрастания интесивности протекания метаболических процессов и гиперемии в поврежденных тканях и органах (Cyan G., 1987), так и выделения возбудителем продуктов, оказывающих опосредованное пирогенное действие (эндотоксины грамотрииательных бактерий и пирогенные токсины грамположи-тельных микробов) <He.Hci>ti ¿\fil(i|.c£,fISS^J Schlievert P.M., 1993) . Последние, активируя иммуннокомпетентные клетки, преимущественно макрофаги, стимулируют продукцию эндогенных пирогенов - цитокиков, оказывающих прямое воздействие на гипоталамические центры терморегуляции (интерлейкины 1,2 и б, фактор некроза опухолей и гамма- интерферон) (Jones Т.Н., et. а!., 1993; Mackowiak P.A., 1991). Очевидно, сам возбудитель способен принимать активное участие в гекезе гипертермии. По современным представлениям (Мао-kowlak P.A., 1994), повышение температуры тела больного, в первую очередь, в случае местного процесса, играет важную роль в стимуляции защитных сил организма и, таким образом, оказывает положительное влияние на борьбу с инфекцией. Наши данные о снижения выживаемости бактерий, находящихся в составе колоний, в присутствии антибиотиков и уменьшении доли микробных клеток, несущих спонтанные мутации, при повышении температуры в рамках Физиологического диапазона организма человека согласуются с этими представлениями. Повышение температуры тела пациента моХет не только стимулировать иммунный ответ, но, также, существенно изменять уровень чувствительности возбудителя; к антимикробной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Динамика изменения количества жизнеспособных энтеробактерий, растущих диффузно и в составе колоний, зависит от температуры культивирования. Энтеробактерии, находящиеся в составе колоний, более чувствительны к повышению температуры культивирования, что

проявляется в ускорении процесса их гибели.

2. При повышенных температурах (42°С) изменяется ультраструктура микробных колоний и составляющих их клеток, что проявляется в

и образовании электронно-плотных клеток.

3. Температура культивирования влияет на выживаемость диффузно растущих энтеробактерий в присутствии антимикробных агентов только в первые часы контакта и не оказывает существенного воздействия на величину МИК через 24 ч.

4. Бактерии в составе колоний лучше выживают в присутствии антибиотиков, чем диффузно растущие микробные клетки. Уровень устойчивости зависит от использованного препарата и обусловлен механизмами его проникновения внутрь колонии.

5. Температура культивирования оказывает существенное слияние на выживаемость энтеробактерий, находящихся в составе колоний, в присутствии антимикробных препаратов. При температурах, близких к верхнему пределу Физиологического диапазона, бактерии в составе колоний хуже выживают в присутствии различных антибиотиков.

6. Частота встречаемости спонтанных мутаций (в т.ч. устойчивости к шггимикробиам агентам) У энтеробактерий,,растущих в составе колоний, ниже, чем при росте в виде суспензии. Указанные различия нарастают с повышением температуры культивирования. Сниженная частота встречаемости спонтанных мутаций з бактериальных колониях при крайних температурах росяного диапазона имеет значение для оценки скорости формирования ■ антибиотикорезистентных вариантов возбудителей во внешней среде и в организма больного.

Список работг опубликованных пп тимя пигояптяиии 1. Роль температуры и величины засевной дозы в развитии микробных популяций// Веб.: Структурно-функциональные основы патогенеза заболеваний. - СПб: СПбМИ им. акад. И Ж Павлова, 1992. - с.17. (Соавт. Ждан-Пушкина С.М.) \

- IB -

2. Влияние повышенной температуры на антибиотикочувствительность бактерий в составе колоний//В сб.: Актуальнуе проблемы инфекционной патологии. - СПб: СПбНИИЭМ им. Пастора, 1993. - ч.1, с.92. (Соавт. Тец В.В. )

3. Влияние температуры на чувствительность Shigella eonnei к ам-пициллину//В сб.: Актуальные вопросы профилактической и клинической медицин: тезисы докладов научной конференции (26-28 апреля 1994 г.). - СПб: СПбГСГМИ, 1В94. - с.48-49.

4. Temperature effect on the antimicrobial susceptibility of bacteria inelde the colonies// Принята к публикации в Journal of Microboloey. (Соавт. TeuB.B.)