Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Численное моделирование, физико-математический анализ и экспериментальное изучение явления гипотонического лизиса
ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Численное моделирование, физико-математический анализ и экспериментальное изучение явления гипотонического лизиса"

11АЦ1ОНАЛЬНА АКАДИЛЯ НАУК УКРА1Ш 1НСТЙТУТ ПРОБЛЕМ КРЮБЮЛОГП ТА КР10ВДЩШ

РГБ ОД

- з ЛИ1)

На правах рукопису

Коваленко 1гор Федорович

ЧМСЕЛЬНЕ МОДЕШЗАННН, Ф13Ж04|АТа!АТИЧНИИ АНАЛ13 ТА ЕКСПЕРИШГГАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ЯВИДА ГШОТОШЧГОГО Л13ИСУ

03.00.22 - кр(об)олог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступ!ню кандидата 01олог1чних наук

Харк1в - 1995

Робота виконана в Шститут! проблем крЮб (олог 1Т та кр1омедищши Нац1онально1 Академ И наук Укра1ни

Иауковий кер1вюж: доктор 0!олог!чнюс наук

е.о.горд!енко

0фЩ1йн1 опоненти: доктор б!олог1Чяих наук, профвсор

ВЛ.МоЮеев

доктор б1олог1чяих наук

А.Ю.Петренко

Пров!дне установа: 1кстктут Ф!з1ологП 1м. 0.0.Богомольца

на зас1данн1 спец1ал1зовано! ради Д 01 при 1нститут1

проблем кр1оС1олог11 та кр1омедицинй НйН Укрэ1ни (310015. м.Харкгв, вул. Переяславська, 23).

3 дисертад1ею мовна ознайомитись у б Юл!отец!, 1нституту проблем кр!об!олог!I та кр!омедицини.

Автореферат роз!слано "/У

Вчений сегфетар спец1ал1зовано! ради, доктор медичних наук,

профвсор А.Н.Гольцев

НАН Укра1ни, м. Ки!в

1995 р. в /5 годин

ЗАГАЛЫЙ ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальность теми. Явшце г!потон!чного л!знсу кл!тин е одним з ведучих фактор!в пошкодження кл!тин на заключних етапах циклу 1х кртконсервування [Woolgar,Morris, 1973/Meryman et al, 1977/Levin, Miller,i981 ]. Пошкоджуюча д!я ЦЬОГО фактору най01льш 1мав!рна на етапах вилучення кр!опротвктору з заморожено! -Biflirpt то! суспвнз t¡ та трансфуз!! дэконсервованого 01оматер!алу з органiзм рэцишента, коли кл!тши вступають у контакт з розчином» осмотичний тиск якого ниете внутр1шньо-кл!тинного. За сучасними уявленнямя [Burton,1979/ Козлов» Марк!н,1984/ Горд!енко е.О., Горд!енко ОЛ.,1986] гШотон!ч-ний л 1зис зумовленкй вшикненням макроскоп!чно! пори в !зо-тропно розтягнут!й осмотичнимя силами мембран! кл1тини, кр(зь яку частина внутр(тньокл!тинного середовада викндаеть-ся назови!, п!сля чього пора закриваеться. Одним з перекон-ливих експеримвнталышх Шдтвэрднень сама такого мехен t зну г!потон!чного л!зису е реактивний ефзкт (стрибкоподЮке переменяя еритроциту в момент гемол!зу), що описаний у робо-т1 [Горд1енко, Некоз.1989]. Явице г!потон1чного л!зису часто викориотовуеться ! для Еш!рювашя транспортних характеристик кл!тинних мембран [Hazur', 1976], ! як тест на зберезкення бар'ерно! функцП кл!тин [Шраго,1984]. У зв'язку з попе-редньУвикладеним вивчення причини, законом!рностей та мвха-Шзму осмотичного л!зису кл1тин е вакливим як з точки зору кр!об!олог!1 (задля пошуку ефективних 3aco6iB його sano6i-гання та оптим!зац!1 процедури кр!оконсервац!! кл1тинних суспенз!й), так 1 з загально0!олог!чяо! точки зору. Зараз в експериментальн1 данi, як! супервчать сучасним уявленням про, г!потон!чний л!зис, теоретичний анал1з цього явища не врахо-вув Tie! обставши, що деформацП кл!тинних мембран при най-

б1лып типових експернментальних умовах не е отац1онарними, BlflGyTHtft достатньо посл1довний к1льк!сний анал1з цього явища, що затрудняю з1ставленыя теорвтичних та експвршэиталь-них данях в метою вибору адекватно! к1льк1сно! моделt rino- . тон!чного л!зису. 3 другого боку, tснують передумови для к!льк!снаго вивчення причин, законам{рнастей та механ1аму г!потон!чного л!зису, наприклад, тако! кл1тини, як еритроцит лвдини, про який е достатня для чисельного моделювання вка-заного явища к1льк1сть в!домоотей щодо геометричних та б!о-ф!аичних параметр¡в. 1снування передумав для к!льк!сного вивчення причин, механ{зму та законом(рностей г1потон1чного л!зису та його важлива роль у пошкодкенн! кл!тишшх структур осмотичним фактором обумовлюють актуальню'ть та доц!льн1сть запланованого досл!джвння.

Мета та задач! робота. Метою роботи е побудова к!льк1с-но! модел1 явища г1потон!чного л1эису еритроцит!в лвдини, яка здатна з'ясувати причину, механ1зм та законом!рност! цього явища, а такс® обгруятувати можлив1 засоби його запо-б!гання.

Зг1дао з поставлено» матов даредбачали вирГшення таких задач:

1)мо5Щом мэлокутового розо(шня св!тла,досл!дити к!не-■гику г1штон}чного л!зису еритроцит!в донороько! кров! люди-ни;

2)методом оптичноГ м!кроскоШ1 вивчити особжвост! про-цэсу г1тотон!чного л1зиоу яйцекл!тш та двухкл!тинних ембр!- . OHlB мишЦ

3)обгрунтувати модаф!кований спасfб вим!рювання коеф(-щенту пронгаииводт! еритрощ1т!в щодо молекул 1ф!опротектора по KlHemtf Ix г!пото'н1чного л!зису;

4)по0удувати ф!зико-математичну модель г1потон1чного л!зису кл!тин та провести чисельна моделювання цього явща для конкретно! кл!тиш - еритроциту людини.

Наукова новизна. Побудована ориг!нальна к!льк!сна б!о-ф1зична модель г!потон!чного л!зису кл!тин, яка ц!лком задо-в!льно ошсуа експершентальн! результата у випадку еритро-■ цит!в людини. Отримано ряд теоратичних та експершантальних дених, як! шдтверджують впсунут! в роботI уявлання про причину, механ! зм та законом¡рност! явища г!гготон!чного л 1 зису. Одержан! нов! дан1 про залекн!сть коеф1ц!ента проникливост! мембран еритроцит1в донорсько! кров1 лвдини щодо молекул гл!церину в!д концентрацП останнього та рН в оточуючому 1сл! тини середовищ 1.

Теоретична та практична значения робота. Залропонова-но та обгрунтовано модиф1кований метод вим!рювання коеф!ц!-ента проникливост! кл1тинних мембран щодо молекул крЮпро-тектора, заснований на сполучеш! реестрацП Штенсивност! малокутового розс!яння св1тла суспенз1ею кл!тин упродовж процесу г1потон!чного л!зису та чисельного моделювання цього процесу на ЕОМ. Розвинут! в робот! уявлення мокуть Оути ви-користан! як основа для побтановки, анал!за та тлумачення . результат!в кр!об!олог!чншс акспвримент!в.

Шлоканяя, як! виносяться на- захист:

1) побудовано к!льк!сну термодинам!чну модель явшда г!потон!чного л!зису еритроцит!в донорсько! кров! людини, яка з'ясовуе причину, механ!зм та законом!рност! цього яви-Ща;

2) обгрунтовано та випробувано у- випадку еритроцит!в донорсько! кров! людини модиф!кований метод вим!рювання ко-еф!ц!енту проникливост! кл!тинно! мембрани щодо молекул

G

кр!опротектора, заснований на сполученн! реестрацП розс!я-ного суспенз1ею кл1тин св!тла упродовж 1х г!потон!чного л1-зису та чисельного моделювання цього явшца на ЕОМ;

3) встановлено залеш!сть коеф!ц!ента проиикливост! мембрани еритроциту людини щодо молекул глШерина в1д концентрат I кр1опрот.ектора та значения рН в оточуючому кл! тяни . середовищ!.

Апробац!я робота. Матер!али дасертац!йно1 робота наведен! на 29 щор!чн!й конференцП Товариства кр!об!олог1в ' (Ithaoa, New York, 1992).

Публ!кацН. По материалам дисертацП надруковано 6 ро-

б!т.

Об'ем та структура роботи. Дисертац1йна робота внкладе-на на 109 стор!нках машинописного тексту та складаеться з вступу, огляду л!тератури, опису натер! ал ¡в та метод1в дос-л1даення, глави, в як!й викладен! результата власаих досл1д-жень та 1х обговорення, висновк1в: робота м) стать 40 малюн-к1в та 4 таблиц!. Список л!тератури включае 102 роботи.

МАТЕР I АЛИ ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДШШ.

Одним з об'ект!в досл1дження бум еритроцити донорсько! кров! людини. Цей виб1р обумовлений передус!м т!ею обстави-ною, що !х транспорта), геометричн1 та 1нш! б1оф!зичн! характеристики, як! необх1дн! для к1льк!сного моделювання про-цесу г!потон1чного л!зису, вивчен! найб1льш повно пор!вняно з !ншими б!ооб'ектами. Еритроцити практично не вабруднен! кл!тинами 1нших тип!в, доступн! в.потр1'бн!й к!лькост1, в!д- ' носно гомогенн! i в той ко час можуть слукити як модель для вивчення осмотично! реакцИ б 1лыг складах кл1тин. Виконуючи роботу, використовували еритроцити з терм1ном збер!гання при 4°с не С!льше трьох д!б.

Як другий об'ект досл1дшення було обрано яйцешптгощ та двохклiтшшt GMOpiони миш!, одержан! Btд самок мшаей л!нП США аба г!бридних самок Р1в!д схроцування (СБАхС57ВЬ). Статей! кл!тшш здобували промиванням з1дпрапароваш1Х яйцевод!в ф1з!олог1чним розчшом Дюльбекко при к!мнатнгй температур! по стандартна методиц!. В експериментах вккористовували юЛтини. ЯК1 мали ц!лу zona pelluoida та пдазматнчн! мембра-ни, прозору цитоплазму та правильну форму бластомер1з.

ВиШрювання розе 1яного (вперед п1д кутом 9 градус!з до напрямку падаючого пучка) суспенз!ею эритроцит! в св!тда здШснювалось на експериментальному макет!, який зклачаз кол!мованв дкерело св!тла з д!апазоном спектрально! характеристики в1д 950 до НОО нм та фотоприймач, встановлений шд кутом 9 градус]в до напрямку падаючого пучка, а такой внш-рювальну схему, яка резструе !нтэнсивн!сть падаючого на фотоприймач потоку розс!яяого кл1 тшшою суспенз1ей св1тла. Виносний кюввтний блок обладнаний системами термостатування в д1апазон! температур 10...37°с та шрам!шувашя суспензН

КЛ1ТНН.

М!кроскоп1чш доелгдкення проводили на екстарименталь-ному стенд!, який включав 'ШтерференЩйно- поляризац!йний MiKpocKon, приставку для Шдтримання температури в камер! на заданбМу piBHi та кшокамеру. ЗдШснювалась фотограф¡чна реестращя вих!дного стану кл1тини. Пот!м робили зач!ну се-редовкщь Дюльбекко на розчин, :д!я якого випробувалась, i починали кшорэестрац!ю кtнетики осмотично! реакцП кл!тини. Контроль за температурою в об'ект! зд!йснювявся хремель-копелевою термопарою, яка була розмщена безпоевредньо в препарат!.

Чисельна моделввання явшца гшотон!чного л1зису в вод-

них розчшах гл!церину проводилося на ЕОМ ДВК-ЗМ шляхом ви-р!швННЯ модифшованих р1внянь Kedem, Katohaleky, трансформо-ваних до виду, який б зручнин для опису досл!джуваного яви-ща.

Статистична обробка результат!в здШснювалась за стандартною методикою Ф1шера- Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТ« ВЛАСНИХ ДОСЛЮТНЬ ТА !Х ОБГОВОРЕННН.

Доел t давно зал9кн!сть (нтенсивно'ст! розс!яного суспен-з!ею еритроцит!в св1тла з р1зними к!лькостями кл!тин в н1й. До 3 мл ф!з!олог!чного розчину додавали 0,0025 мл, 0,005 мл, 0,01 мл, 0,02 мл, 0,03 мл, 0,04 мл або 0,05 мл донорськоГ кров! з гематокрятом 0,45. По отриманим даним побудована кал!бровочна крива, з розгляду яко! вит!кае, що при доданн! до ф|-310л0г|чн0г0 розчину 61ЛЬШ, Ht« 0,015 мл кровь tHTöH-сивн!сть розс!ввання не зб!льшуеться. Очевидно, при цьому к!льк!сть кл!тин в.суспензН стае наст!лыш великою, що ви-никав ефект багатократного розс1ювання. Таким чином, реест-рац1ю кШвтвчнйх ефект!в, як! пов'язан! з! зб!льшенням об'е-му кл!тин або з! зменшенням Ix к!лькост! при г!потон!чному л!зис! треба проводити, додаючи до в)доов!дних розчин!в (3 мл) не б1льш, як 0,01 мл кров1. 3 другого боку зменшення к!лькост! кл!тин в суспензИ, яке виникае при додаванн! до 3 мл розчину менше, н!е 0,005 мл кров!, як вит!кае з кал!бро-вочноГ криво!, викликае значив зменшення !нтенсивност! роз-с1яного вперед св!тла, що в нвещриятливим фактором. Сама ' цьому при досуПдаенн! явища г1потон!чного л!зису використо-вували додавання до 3 мл водного розчину глЩерицу 0,01 мл кров! з гематокртгом 0,45. На мал. I показана залежн!сть в!д часу 1нтенснвност! розс!яяого п!д кутом 9 градус!в до напря-

¿53 mU

глицерин!

/ A

JB5

- -

H>

es . is:-> аг© 2S? згг> • эзг> 4аг<

Мал Л. ЗапеанЮТь Штенсивност! розс!яння вперед сусгонз!еа еритроцшПв в!д часу Шсля додавання 0,01 мл aöo 0,005 мл кров! до 20&-НОГО- водного розчину глщоршу (рН=7,о; температура - +37°С).

мку падаючого пучка cBiwia теля контакту 0,01 мл або 0,005 мл донорсько! кров1 лндшш а 3 мл 20%-ного водного розеину гл1ц0рина.При таких se умовах шляхом чисельного вирШення на БОМ модиф!кованих нами р!внянь Hedem 0., Katchalßky А.

= Т0ьр Pi Rn - - й- - - 3.

-S? = -ад Rn - - ^ «1 з

Ар = - 2г [ ( у/усф у*- 1 ]/[нс$( у/усф ),/3]. (t-час, s0- початковэ значения площт повэрхн! кл!ткнно1 мем-брани, т та v0- поточне та початкове значення об'ему кл!тк-ни, у- вгдносний об'ем клшши, усф та ксф- об'ем та рад1ус сфероцнта у в1дсутност1 деформат! кл!тшшо! мембрани, 7o=sc/V" поверхньо- об'емне в!дношення клгаши, га

чг^1- осмотичний тиск крЮпротектора ззовн! та всередеш кл!-,тини, it|ut- осмотичний тиск електрол!та в оточуючому кл1ти-

ни середовищ!, n^g - осмотичний тиск ф!з!олог1чного розчику, Ар- перепад Пдростатичного тиску на мембран!, bp- коеф!ц|-ент ф1льтрацН кл(тинноГ мембрана, К,- коеф!ц!ент проникли-boctI khItehhoI мембрани щодо молекул кр(опротектора, о,-коеф!ц!ент в!дбивання кл!тинно! мембрани для кр!опротектора, а- об'емна частка осмотично навктивнгос речовшх веереден! .кл1тйни, г- модуль 1зотерм1чного стискування мембрани в пло-ц! б!слою, розрахували час до початку гемол!зу ери-

троцита при. р1зних значениях коеф!ц)ента проншишвост! його мембрани для молекул глЩерину К1. При цьому на етап! набухания, коли V<1.45V0, розрахунок цроводився при Лр=о та s=s0. Об'ем кл1иши vh, при якому в мембран! утворюется мак-роскопична пора, на в!дм1ну в!д поцередн!х роб!т, не зада-вався a priori, а розраховувався таким чином. У стац!онарно-~ му вшадку середн!й час утворення пори в 1зотропно розтягну-т1й мембран! визначаеться виразом

^(0 V

де о = Г (s-SoJ/Sq, к- пост(йна Больцмана, Т- абсолютна

темрература, 7- лШ1Йне натяк|нняпори, о-натяж!ння мембрани, s- шточш значения шод1 поверхн! кл!тияно! мембрани, D(o)- коеф!ц!ент дкфузП система в простор! розм!р!в пори. В нвстац!онарному а випадку, коли розтягування мембрани ерит-роцита безшрервно 8б1лывуеться п!д д!бю осмотичнйх сил по деякому закону y»y(t) в(д 8начвння у=1.45, мозша ввакати, що пора в мембран» утворюеться за умови

= I^fer » (3)

а саме, коли характерний час леребування кл1тини при деякому значекн! в!даосного об'ему дор!внвв часу утворення макроско-

п1чно! пори в стаШонарно розтягнут!й мембран! при тому ж зиаченн! об'ему. При цьому з кл1тшзд через утворену в мембран! пору викидаеться частина розчину, яка приблизно дор1в-нюе Уь(у-1.45). У зв'язку з цим в момент початку гемол!зу об'ем кл!тини в максима льним. В той же момент часу й Штен-сивн!сть розс!яного кл!тиною св!тла стае максимальною, ос-к!лыот в умовах, як! реал!зуються в эксперимент!, як показуе теор1я розсШвання, б!ля 40% розс!яного св!тла не заленить ,в1д показника заломлення частки, яка розс!ве, в!дносно серэ-довища, а залеж1ть т!лыш в!д розм!ру частки, зростаючи по м1р1 зб!льшення II ефективного д!аметра. Таким чином, можна ототойяйти момент початку гемол!з'у, той розраховуеться, з моментом 1;тах, коли 1нтенснвн!сть розс!яння св!тла кл!тинами стае максимальною. Шдбираючи те значения коеф1ц!енту прони-кливост! К1, при якому теоретично розрахований час утзорення мзмбрапио! пори зб!гаеться з експеряментально вим1реним часом 1 » №1 тим самим у в!дпов!дност! до висунутих уявлень про процес гемол!зу визначаемо д!йсний коеф!ц!ент прониклн-вост! мембрани еритроциту щодо молекул глЩерину. В табл.1 показано час, за який, як витшае а експеримент!в, (нтенсив-н!сть розс!яння досягае максимального значения, а також розрахован! вказаним вище чином значения коеф!ц1енту проник-ливост4 мембран еритрощшв донорсько! кров! людини щодо молекул гл!церину при р!зних концентрац!ях кр!опротектора. В табл.2 представлен! дан! про т!.ж величини в залекност! в!д рН позакл!тинного водного розчину гл!церину з концентрац!ями 20£ та 3035 (об'ем/об"ем) при 37°о.

Як випливае з отриманих результат!в, час до початку г!потон1чного гемол!зу еритроцит!в у водному 'розчиш глЩерину зростае з! зб!льшенням його концентрацИ, хоча коефЩ!-

ент проникливост! 1х мембран щодо молекул гл1церину при цьо-

Таблиця I

Залекн1стъ часу, при якому 1нтенсивн1сть розсияння суспензию еритроцит!в п1д кутом 9 градус1в до напрямку падаючого пучка св!тла стае максимальною (Ъ зменшуеться на чверть С-ьтУл) та наполовину (ъ,/2), а такой коеф1ц!ента проникливост! мембран еритроцит!в щодо молекул гл!церину в1д концент-рац! I позакл1 тинного юдного розчину гл!цер1шу при температурах 37°0 та 20°С (рН=7,0)

концент-рац1я ГЛ!Ц0- Ш^об) Температура, °С t шах' 0 /i, 0 0 К,х107, М/с

5. 10 . 20 30 40 37 37. 37 37 37 10,7±2,4 20,0±4,5 30,1±3,5 39,2±4,8 "1,0+7,3 27,0± 4,6 67,3± 5,5 165,8+ 8,2 277,7±14,3 340,1+25,4 41.,2± 9,8 103,0± 12,1 238,6í 13.0 422,4± 26,2 545,3* 38,8 2,695 2,852 3,875 4,404 5,610

5 10 20 30 20 20 20 20 21 ,6+ 4,8 40,0± 2,9 58,0± 3,9 99,3*17,5 101,5± 7,8 107,1±18,3 320,5±25,4 821,9±39,9 156,0+ 3,5 149,5± 4,2 471,8± 51,1 1168,84188,1. 1,289 1,366 1,951 • 1,708

му дещо збШдуеться. Ця обставина, мабуть, е свtдоцтвом прямо! х!м!чно!'ВзаемодП позакл!тинного розчину з мембранами кл1тин, яка нев1домим поки.що чином полегшуе проникнення кр(опротектора в кл!тиш. Пад1ння температуря призводить до зменшення коеф!ц!енту проникливост! мембран еритроцит!в щодо молекул кр!опротектора. Енерг!я активацП процесу переносу молекул гл!церина-!ф1зь мембрани еритроцит1в людини в 1нтер-вал! температур 20... 37°С е 32.7 кда/моль при концентрацП позакл!тинного розчину Ъ% та IOS?, 30.Б кда/моль - при 20%, 42.1 кдк/моль- при 30$. Значения 'рН позакл(тинного розчину слабо вшшвае на к!нвтику г!потон!чного л(зису еритроцит!в ая до значень, близьких до 3. Через наявн!сть пори в мембран! еритроциту р!вняння, як! описують процеси масопереносу на

етап! в!д утвореняя макроскоп)чно! поря в його мембран! до

Таблиця 2

Залекн(сть часу, при якому ¡нтенсивШсть розс!яняя суспензию еритроцит1в п(д кутом 9 градус1в до напрямку падаючого пучка св 1 тла стае максимальном (ътвх), зменщуеться на чверть (ъ1/д> та наполовину (г1/2), а також коеф!ц!ента проникливо-ст{ мембран еритроцяПв щодо молекул глЩерину при концент-рац!ях 20% та 30$ (температура 37°С)

ШЦШЬа- ! ,Ц!Я г

% С оо/оо^

рН

тах-с

Л

1/4' с

1/2' с

к^юТ

м/с

30 30 30

•зо

30 30 30 30

7,50 7,00 6,20 5,25 4,50 4,05 3,50 3,35

•37,0± 4,4 39,2± 4,0 43,4± 7,3 25,24 4,3 27,5±Ю,8 42,24 9,7 47,5410,5 72,5432,3

289,0414,7

277,0414,3 2бб,6±12,7

135.0415.1

130.0416.2

229.6415.3 285,0428,3 490,0435,7

333.5423.7 422,442?,2 393,0411,9 195,0421 ,5

197.5410.8

358.0415.9 372,5428,1 695,0415,«

4,631 4,40? 3,951 7,060 6,225 4,023 3,720 2,357

20 20 20 20 20 20 20

7,40 7,00 5,80 5,00 4,00 3,50 ЗИ5

29-,24 5,3 ■•30,14 3,5 • 36,0414,9 34,24 5,3 30,0413,0 35,54 4,8 123,544а,3

145,0410,2 165,84 8,2 135,0410,8 100,0411,2 83,04 9,7 128,0413,6 645,0±35,8

224,5424,3 238,6413,0 200,5420,2

129.0421.5

133.0421.6 175,0421,2 757,3±5б,4

3,955 3,875 3,241 3 350 3,959 3,349 0,926

Щлковитого л1зису кл1тини, ускладнюють.ся та щгойиавть виг-ляд:

-Г - № ^ -1 Ь - +

<3а „пи/- -и _ к

1Г ° а ' . Р1---&ТПг

втрлБ.'

де а- рад 1 ус пори, ь- товщина мембрани, 1)- дамам !чиа в'яз-Юсть.Бри а -» 0 система р!внянь (4) перетворюеться в систему р1внянь (I). Як початков! умови при вирШанн! с!стеми р!в-нянь (4) треба брати значения вмПших, при яких зак!нчуеться розрахунок на попередньому етап!, а сама, в мить, коли в мембран! утворюется пора. Система р!внянь (4) ошюуе, зокре-ма, процес виходу гемоглоб1на (якяй мокна розглядати як одну !з ,складових осыотично неактивншс внутрШяьоюНтшпш. речо-вин) з кл!тини назови! кр1зь утворену в мембран! пору. Коли частина внутр1шйьокл!тинного розчину викидаеться з кл!тини, натяж!ння мембрани зменшуеться та, к!нець к!нцем, падае до значения, при якому наявнЮть пори стае енергетично програш-ноа ! пора аникае.'

Проведен! розрахунки показують, 'що пром!кок часу, за який в!дбуваеться вшшд внутр!шньокл!тайного розчину назови! ( а сама в!д моменту■ утворення мембранно! пори до Я "зал!кдвування") займае т!льки сот! дол! секунда. Тому вкладом цього етапу в загальну тривалЮть гемол!зу клгагаи мокна знехтувати, ввакаши, що етап викиду в!дбуваеться миттево. В мить, коли пора зникае, в!дносний об'ем шптини виначаеться р!вшстю;

5о= _23с1££ Г Л^2'3

с 7 Я^г/з

( -V4} • (Б)

гуг ■ г

II! с ля "зал1ковування" пори еритроцит знову починае набухати, а його мембрана в!дпов!дно розтягуватись ак до моменту, коли в н!й знову утворюеться пора. Таким чином .процес г!потон!ч-ного гемол!зу в!дбуваеться циклами, шляхом викиду гемоглоб!-ну з кл!тини назови! в дискрета! моменти часу так, як пока-

зано на мал.2. В ц!лому процес виявляеться затягнутим- в ча-. с!, а не в!дбуваеться зПдно з принципом "все або н1чого". В який небудь певний момент процесу Ппотон!чного гемол!зу через неминучий в популяцП еритроцит1в розквд кл!тинних

Мал.2. Динам 1ка змпш об'емно! частки осмотично неактивних внутр I шньокл(тинних. речовин упродовж контакту еритроцит!в з 2035-ним водним розчином гл!церину при 37°С.

параметр1в р!зн1 кл1тини втрачають неоднакову к!льк1сть ге-моглоб!ну, 1 в зв'язку з цим не можна твврдати, що зруйнува-лась яка- небудь певна к!льк!сть кл1т!ш.' К (нетика накопичен-ня гемоглоб(ну в зовн!шньокл1 тинному середовшц! заложить в!д умов е'ксперименту, '1 тому побудова експериментальноГ криво! типу "!нтенсивн!сть розс'!яного св!тла- % гемол1зу", яку зви-чайно використовують в експериментах по г!потон1чному гемо-л!зу, не мае сенсу.

Ми ввакали, що коеф!ц!ент проникливост! мембран еритро-цит!в людини для молекул глЩерину в популяцП клСпот мае логарифтно нормальний розпод!л з гцIльнIстю■1мовIрностI

реки. и_ О = 1 . (в)

к УШ 0 *

Оск!льке середне значения логарифму коеф|ц!ента проникливос-т! мембран еритроцит!в залек!ть в!д його концентрацП в по-зак"1тинному середовшц!, то розпод1л кгЛткн залэжить

в1д умов експерименту. 3 урэхуванням вказаного вище розпод!-лу кл!тин по коеф!ц!енту -.проникливост! 1х мембран цодо молекул гл!церину нами розрахована сумарна кIнетика накопичення гемоглоб1ну в оточуючому кл!тини середовиц1 та п1д!брана залекн!сть 1нтенсивност1 розс!явдя св!тла окремою кл!тиною в!д вм1сту гемоглобШу в н(й таким чшом, щоб усередяэна по в1дггов1даому розпод!лу. 1нтенсивн1сть розс!яного суспенз!ею кл1тин св!тла в ц!лому при розрахунку Шнетики геыол!зу зб!-галася з ¡экспериментом. Ця кал!бровочяа крива пот!м викорнс-товувалась в ус1х' !ших випадках, вокрема, для розрахунку моментIв часу, при яких !нтенсивн!сть розс!яного вперед п!д кутом Э градус!в. до напрямку падашого пучка св!тла вмешу-еться на чверть (г1/4) або наполовину (1;1/г). Розрахован! таким чином та опостерекен! в оксперкмент! значения t1/,д та ц1лком задов!льно погодкуються.

' Треба привернута увагу до т1е1 обставили, що внасл1Док несшетричност! логарифм 1чно нормального розпод!лу, наприк-лад, 50^- шй гемол!з ус!е! суспензИ еритроцит!в у ц!лому настае через аначда б!льший пром!кок часу, н1к кокно! кл!ти-ни окремо. Звичайно, в експеримент! з суспенз1 ею кл!тин дис-кретний характер виходу гемоглобШу з еритроцит1 в ! цшШчн! чоливання його об'ему приховуються за рахунок усереднення.

Нами здобут! експериментальн! дан!, як!, на наш погляд,• такой п!дтверд«ують оправедлив!сть висунутих уявлвнь про механизм г!потон!чного л!зису стосовно нвзашмднених яйце-клIтам миш!. Якщо 8 хвилин по тому, як яйцекл1тина миш1 була помИцена в 30£- ний вадвдй розчин д1мет!лсульфэксиду, пере-

нести II в розчин Дюльбекко, осмотичний тиск якого становить, 01ля 400 м!л!осмол!в 1 в!дпов1дае норн!, то кл!тина починае набухати, оск!льки тепер позаклЦинний розчин стае г!пото-н 1 чяим • по в!дноиенню до внутр!шньокл1 тинного. Безпосередньо п!сля пом!ценна яйцеюПташ в розчин Дюльбекко на П поверх-н! В1шикае макроскоп1чна пора, д!аметр яко! становить прйб-Л!зно 1/5 в!д д1амвтра кл!тини в момент розриву. Локальний розрив мембрани наступав при невеликому зб!льшенн! площияи ■ поверхн! кл!тини по в1дношеннк> до почакового значения (порядку 10^5). Час изал1ковування" пори становить 01 ля 20 секунд.. 1нод1 сл!дом за виникненйям першо! пЬри (на тому*, к м!сц!) Биникае друга пора. Не мохна з упевнвн!стю твердите, що друга пора з плином часу зал1кову.еться таким ке чином, як 1 попередня, через втрату ч!ткост! зображення я*цекл!тики, яку не удаеться уникнути в процес! експерименту. Описане явище спостер!гаеться т!льки в деяких експеримвнтах, як! 1дентйчн! описании. У тих випадках, коли воно не спостер!га-еться, мокливо, пори утворюються, ала розташован! в невиПд-ному для в!зувльного спостерзкення м!сц! .(наприклвд, на зво-ротньому боц! кл!тини). В дейких експеримвнтах * локальний розрив мембрани, ятй на ступа с п!сля'пом1щення яйцекл 1 тини в розчин Дюльбекко, не зал!ковуеться. При цьому розм!р утворе-но1 пори &о порядку величини пор!вняняй з д!аметром кл!тини. Утворення макроскоп1чних мембранних пор в двохкл!тинних емб-р1онах мии! в аналог!чних умовах не спостер!галося. На в!д-м!иу в!д незагоНдаено! яйцекл(тини ембр1он на раня!х стад!ях розвитку мае великий запас мембранного матер!алу, який, !мо-в!рн!ше усього, м!ститься в мембранних м!'кроскпадках. Як вит1кав з наша к експеримент!в, плотна мембрани блэстомера може зб!льшуватися в 1,5- 2 рази без розриыу, що, мабудь.

функц!овально обумовлено готовы!стю коп тин до подалыюго под!лу. Упродовк набухания бластомери заповнюють увесь пери-в!телиновиЙ простер, ! подальше набухания юПтин не в^дбува-еться через наявн!сть так звано5 твердо! блискучо! оболонки. Очевидно, в даному випадку розтяхцшя мембрана, яке е необидною умовою для утворення макроскоп 1чно! мембранно? пори, в1дсутне.

Спираючись на розвинут! в робот! уявлення про механ!зм г!потон!чного гемол!зу, мокна пояснити основа 1 законом!рнос-т1 .цього явища, як! в!дом! з л!тератури. Наша модель не т!льки з'ясовуе наявн!сть так званого сферичного пер!ода, !снування якого зумовлено необх1дя!стю розтяж!ння мембрани до певного р!вня та подолання енергетичного бар'вру м!к станами з нулевим та в!дм!шим в!д нуля рад!усом пори, але й дозволяе визначитс йога тривал!сть к!лы'Лсно. ОтричаШ нами результата та анал!з л!тературних даних в.сукупност! е св!-доцтеом на користь уявлення про та.'що мехаШзм г!потон!чно-го л!зиоу кл 1 тин полягаз у фл.уктуац!йному утворанн! макроскоп !чцо! пори в !зотрошю розтягнут!й мембран!. Позитивною як!стю-побудовано! в робот! модел! е те, що к!льк!сн! розра-хунки проведен! в!д початку до к!ндя щодо конкретно! кл!ти-ни- еритроциту людини.

Розроблена модель в сукуаност! з реестрац!ею 1нтенсив-кост! малокутового розс!яння св!тла суспенз1ею еритроцит!в е еоретичним грунтом для розробки методу ивидкого автоматизо-ваного вим!рювання транспортних характеристик мембран ерит-роцит!в з метою д!агностики. Сама по соб!. модель, звичайно, справедлива не т!льки щодо еритроцдалв, а мае б!льщ ун!вер-сальне значения та в перспектив! моке'бутп використана для к!льк!сного анал!зу явкща г!потон!чного л!зису !нших кл!тин.

В результат! чисельного моделювання процвс!в масопере-посу, як! мають м!сце на етаШ вилучення кр!опротектора з суспензП деконсервованих кл!тин, отриман! дан! про залеж-шсть ступ!ню набухания кл!тин в!д параметра (в!дношення сумарного об*ему кл1тини до об'ему суспензИ в ц1лому, у випадку еритроцнт!в- гематокрит), вм!сту в!дмиваючого розеину та деяких кл!тинних параметр^.. Показано, яким чяком за допомогою чисельного моделювання можна знайти прийнятну з точки, зору запоб1гання надм!рно! деформацП кл!тинних мембран, а отзке ! г!потон:чиого л!зису, процедуру вщшвання суспензп в!д крюпротектора. . "

ВИСНОВКИ.

1. Побудована к!льк!сна модель явища г!потон!чного л!-зису еритроцит!в донорсько.1 кров! людини, яка пояснюе його причину, механ!зм та основн! законом¡рност!.

2. Теоретично обгрунтовано та апробовано модиф!кований спос1б вшлрювання коеф! ц!енту проншшюост! мембран еритро-цит!в щодо молекул кр!опротектора, заснований на з'Ютавленн! результат^ вим!рювання !'нтенсивност! ррзс!яного 'суспенз1ею еритроцит!в (п!д кутом 9 градус!в до напрямку падаючого пучка) св!тла при контакт! кл!тин з водним розчином кр1опротек-тора та Ясельного моделювання явища г!потон1чного л1зису на ЕОМ.

3. Встановлено, що коеф!ц!ент проникливоет! мембран еритроцит!в людини для молекул гл1церину зб!льшувться з ростом ггочатково! концентрац! !• кр!опротектора в позакл!тинному розчин1, та в!рог!дно, не залекить в!д значения рн останньо-го в облает! 4- 7,5, р!зко зменшушись при рН < 3,5..

4. Енерг!я активацП процесу переноса молекул гл!церина

кр!зь мембрани еритроцпт!в людини в облает! температур 310... 293 К становить 32.7 кда/моль при концентрац!ях поза-кл!тинного розчяну Ъ% та 105? (об"ем/об1 ем), 30.5 кдж/моль -при 20&- н!й концентрац!I та 42.1 кда/моль - при 30%- н!й (рН = 7.0).

5. Отримаш теоретичн! та експериментальн! дан! про г!потон!чний л!зио еритроцит!в людини та яйцекл!тин миш!, як! св!дчать на користь уявления про те, що махан!змом г! по-то^чного л!зису е у творения поодиноко! макроскоп 1чно1 'пори в. 1зотропно розтягнут!й мембран!.

6. Продемонстровано задов!льну згоду м!к розрахованими по к!льк1сн!й модел! параметрами процесу г!потон1чного гемо-л1зу та експериментальними даними про зм1ну !нтенсивност! розс!яного кл!тинами св!тла при г1потон!чному гемол1з! в аналог!чних умовах,'

7. Встановлено, що на В1дм!ну в(д цезашПднеко! яйце- . юПтини миш!, локалышй розркв яко! в!дбуваеться при зб1ль-шен! площини поверхн! кл!тини на б- 10%, площа поверхн! мембрани бластомер!в двохкл1тинного ембр!ону може без розриву . зб!льыитись в 1,6- 2'рази.

8. Продемонстровано, як за допомогою чисельного моделю-вання полегшити розробку прийнятно! з точки зору запоб!гання г1потон!чяого л1аису процедури в!дмивання деконсервовано! суспензИ кп!тин в!д кр!опротектора.

Список роб!т, опубл1кованих по тем! дисертац!!.

I. Гордаенко Е.А., Коваленко И.Ф. Осмотическая реакция клеток на контакт с гипертоническими средами // Криобиология.-198Э.-N2.-с.3-9.

. 2. Гордиенко Е.А., Коваленко И.Ф. Осмотическая реакция

клеток на контакт с гипертоническими средами и охлаждение. // Криобиология.-I989.-КЗ.-С,3-7.

3. Гордиенко Е.А., Гордиенко-ОХ, Коваленко И.Ф., Смо-льяшпгава Е.И. К вопросу о механизме осмотического лизиса клеток // Биол. мембраны.-1993.-т.10,КВ.-С.627-63!.

4. Гордиенко Е.А., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф., Смо-льянинова Е.И. Влияние концетращт. внеклеточного хлористого натрия на проницаемость мембран яйцеклеток и эмбрионов мыши для молекул вода//Проблемы криобиологии.-1993.-N4-0.25-28."

5. Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф. Экспериментальное изучение кинетики гипотонического -и кислотного гемолиза эритроцитов человека методом малоуглового рассеяния // Проблемы криобиологии.- 1994.- Ni.-С.32-39.

6. Gordienko E.A.-, Kovalenko I.F., Rosanov L.P., Smoly-aninova E.X. Physioo-mathematioal analysis, and experimental conformation of hypotonic lysis oell meohanism//Cryobiolo-gy.- v.30, N6.- 1993.- p. 62Q- 621.

Коваленко И.Ф. "деленное моделирование, физико- математический анализ и экспериментальное изучение явления гипотонического лизиса". Рукопись. Диссертация на соискание ученой степачи кандидата биологических наук по специальности 03.00.22- криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украина, Харьков, Î995. ' '

Построена физико- математическая модель гипотонического лизиса клеток, отличающаяся от существующих тем, что это явление рассматривается как растянутый во времени циклический процесс, а не единовременной выброс внутриклеточного.

содержимого из клетки наружу. Уточнены способы определения коэффициента проницаемости эритроцитов и других клеток для криопротектора, основанные на определении времени лизиса клеток в средах, которые являются гипотоническими по отношению к не проникающему через клеточные мембраны веществу. Показано, что механизм гипотонического лизиса клеток заключается во флуктуационном образовании и залечивании одиночной макроскопической пора в изотропно растянутой клеточной мембране. Методами светорассеяния и микрокшосъемки получена экспериментальные данные, подтверждающие справедливость выдвинутых представлений о механизме указанного явления.

Kovalenko I.F. The numerical modelling, physico-roathematical analysis and experimental studing of the hypotonic lysis phenomena. Thesis of the Candidate of Biological Science with the speciality in cryobiology, Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedioine of the National Academy of Scienoe of the Ukraine, Kharkov, 1995.

A phyaioo-mathematical model of hypotonic lysis. of oelle has been developed. It differs ^rom the existing ones in that it considers this event as.a oyolio time oourse, and not as a single thrust of the intracellular content out of the cell. The methods of determining permeability coefficients of membranes of erythrocytes and other oells for cryop-rotectants have been specified,. wioh are based on the evalu-Лоп of the duration of cell lysis in the medium, wioh are hypotonio with respeot to the substanoe, incapable of penetrating throught plasma membrane. A mechanism of cell hypotonic lysis has been shown to involve fluctuation formation and healding of a single macroscopio pore in the isotropioa-lly stretched oell. membrane. The experimental data, euppor-

ting the above assumptions on the mechanism of the said phenomenon, have bean obtained using the methods of light scattering and microfilming.

Ключов! слова: гтотон!чниЯ л!зис, еритроцит людйни, ф1зико-математичний анал!з, чисельне моделювання, розс(яння св1тла.

В!дпов1дальний за випуск B.I. Гриценко

Щ^. до'друку 21-02.95. Формат 60 х т Г/1б. 1,0 ум.-друк.арк., 1,0Ф1з.друк.арк. Ifrpaa ГОР. Зам.153.

*Д1льнипя оперативного друку Харк1вського ДАУ.