Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР •ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н.БАХА

О На правах рукописи

{

РАСУЛОВ Ахат Султанович

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА 11 ОИЗИКО-ХИ1ШЧьСКИЕ СВОЙСТВА ГДУШЖСКНГЕТАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ

(Специальность 03.00.0^ - Биологическая химия)

1

Автореферат диссертации на соискание ученой степеки кандидата биологических наук

М о о к в а 137?

(

Уо

и* ш п» н

Работа выполнена в лаборатории энзимологш Ордена Ленина Института биохимии имени А.Н.Баха АН СССР.

Научные руководителя: ^

член-корреспондент АН СССР, профессор В.Л.Кретошч доктор биологи адских наук 3. Г. Евстигнеева.

ч «Г

1 Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О.Л.Поляновскиа доктор биологически: наук профессор Г.А.Дебэрин.

Ь

На официальный отзыв работа направлена на кафедру био-хжишг МГУ шле ни М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан л$( " /С&ъРу*^?^ 1977 г.

Задята диссертации состоится " ле^асЛ /ґи 1977 г. на заседании специализированного совета^ 002.9i.0i по при-суядению ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии имени А.Н.Баха АН СССР.

С диссертацией можно ознаноашться в библиотеке Института (Цосква В-71, Ленинский проспект, 33).

кандидат биологических наук

М

К • (Н.Н.)ь,—ов)

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Глуташнсинтета э а (ГС; Н.Ф. 6.5.1.2), катализирующая реакцию синтеза глутаиива, является одним из важнейшх ферментов азотного обмена (Кретовдч, 1972). Центральное полокенге, которое занимает гдуташн в азотном обмене растений, определяется не только тем, что он является первичным продуктом ассгмиляшд аммиака, но такга тем, что реакдая его синтеза является "пусковой" реакцией нескольких разветвленных метаболических путей, приводящих к синтезу пурянових, гаримдиноЕнх соединений, глю-козагдш-6-фосфата, карбамоил-фосфата и др. ( 1973;

1973).

Актуальность теш. Структура регуляторного (аллостерпче-ского) фермента ГС, обладавшего как и всякий регуляторнкй фермент не только каталитической функцией, но и функцией регулжцзл целых метаболических цепей, представляет несомненный интерес.

В настоящее время имеются данные о структуре ГС бактерий и животных, к отсутствуют данные о структуре и фззико-хи:я1ческих свойствах ГС автотрофных организмов *- в том числе хлореллы.

Изучение структуры и физико-химических свойств 1С как ключевого, регуляторного фермента хлореллы представляет интерес в связи о вопросами направленности азотного метаболизма этой водоросли, используемой как источник кормового белка, витаминов и биологических стимуляторов (Иузафаров и соавт., 1974). 1Ьмо- ■ билизованная ГС мохет быть использована в ыедицзне как фермент, устранящяй из тока крови токсичный для организма аггмнак, переводя его в глутаиан, и в производстве для синтеза Л -глута-яна. Цель и задач:! исследования. Целью данной работы явилось исследование четвертичной структуры и некоторых физико-химлческих свойств ГС СА£пе£&г. /уылоЫоха . Исходя из цели работы,били поставлены следующие задачи:

1. Получить гоаюгенвый препарат ГС из клеток хлореллы, выращенной автотрофно.

2. Изучить условия диссоциации толекул ГС с целью получения дополнительной информация о четвертичной структуре фермента, шлекулярном весе фермента и его коноиеров, а также характере связей, участауп№Х"-в-жщдер$аЕИя™идагЬмерной струк-

Т Кучм* ^

¡гг.к, г>;. с»*"-;, с.:? д.

туры фермента.

3. Установить аминокислотный состав, изоэлектрпческую точку и выяснить значение двухвалентных катионов для стабилизации структуры фермента и проявленая его активности.

4. Исследовать четвертичную структуру ГС с помощью метода электронной микроскопии.

5. Получать иююбя лизованную форму ГС хлореллы.

6. В связи с вопросо« о наличия в клетках хлореллы механизма регуляции ГС путем диссоциации - ассоцяащш фермента исследовать диссоцпацгш ГС хлореллы под действием мочевины раз-лачкой концентрации и влияние на этот процесс субстратов.

7. Выяснить наличие и роль 5Н-грутщ цист<?ина и имидазольной :грушш гистидина в активном центре ГС хлореллы.

8. Разработать методику определения активности ГС потендаометрическим методом.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований, впервые из клеток хлореллы выделен гомогенный препарат ГС, охарактеризованный методами диск-электрофореза и Аналитического ультрацентрифугирования. Установлен молекулярный вес фермента и его мономеров, определен аминокислотный состав и изоэлектрическая точка. Исследовано пространственное расположение мономеров ГС и показано, что нолекута фермента состоит из шести мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 32. Т&кой тип структуры из всех исследованных ГС показан только для ГС хлореллы.

Установлено, что ГС хлореллы отличается высокой стабильностью, При выделении и хранении для ГС хлореллы, в отличие от ГС других организмов, не требуется присутствие двухвалентных катионов, цкетеила, ЗДТА и др.

Впервые осуществлена иммобилизация ГС на ¿ь^-активирован-но2 сефарозе. '

Разработана новая методика определения активности ГС. Показано, что при диссоциации ГС хлореллы распадается ка неактивные мономеры без образования промежуточных молекулярных форм.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные углубляют нахи знания о структуре, свойствах, механизма действия и регуляции активности ГС и некоторых общих особенностях механизма действия этого фермента," внося определенный вклад в

развитие фупдаментальных исследований в области этимологии,

В иммобилизованном состоянии ГС хлореллы может быть использована для синтеза I -глуташна, а также в медицине.

Апробащя работы« Основные положения диссертации доложены и обсуздены на: !

- советско-американском симпозиуме по химии белка, Рига, 1976;

- всесоизной конференции по электронной микроскопии» Ташкент, 1976;

- конференции молодых ученых Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР, 4976;

- материалы диссертационной работы отмечены премией на конкурсе научно-технического творчества молодежи Института биохимии им. А.Н.Баха, посвшеиной 60-летаю Великой Октябрьской революции, 1977;

- работа отмечена П-й премией на конкурсе за лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.Баха4АН СССР, посвященном 60-летаю Великой Октябрьской революции, 1977.

Публикации. Ло теме диссертации опубликовано 8 работ. Объем работы. Диссертация изложена на страницах текста и содерзят таблиц 7 и ^рисунков. Список литературы включает отечественных 4г# и /Ж иностранных публикадай.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была выбрана одноклеточная зеленая водоросль 82Т. Хлореллу выращивали ав-

тотрофно на среде Т&мзЙя. Выраадвапие проводили на свету в камерах из органического стекла с непрерывным продуванием возду- ' ха, содерзкааего 0,5-1# СО£; для освещения культуры использовали люминесцентные лампы ЛД-40 (8000 лк), оптимальная температура выращивания 32°, рН среды 6,5. Шрагценную культуру отделяла от культуральной среды на суперцептрифуге С-44. Полученную пасту использовали для получения ферментного препарата.

Бесклеточные ферментные экстракты получали двумя методами; 1) разрушением клеток в дезинтеграторе с кварцевыми бусами (Романов и др., 1965) и 2) разрушением клеток в механическом прессе Хыоза-Итона (Любимов, Львов, 1968).

Определение активности ГС. Определение синтетазной активности ГС проводили 2 методами: фосфатным (Пушкин и др., 1972) по количеству ортофосфата, образующегося в реакции синтеза глу-

тгмина: ^

Л -глутамат + N Н4 + АИ Л? д - I. -глута.\етн + АДФ-ФН и гидроксаматным ( бй&зй^ 1953,1955; Евстигнеева, Грошко, Асеева, 1971) - по количеству ^-глугамилгидроксамата ( -ГГЯ), образующегося в реакции: лг .

I -глутамат + ЛШ20Н + АТФ—Н$л (Ма / ¿--ТТК + АДМа. ГвдроксаиатныЗ'метод использовали для определения активности ГС в экстрактах, а фосфатный - для определения активности очищенного препарата ГС. За единицу активности ГС принимали образование 1 мкыоль ортофосфата и 1 шшоль -ГТК за 1 гаа.; удельную активность выражали числом единиц активности на 1 иг белка.

Трансферазную активность ГС определяли по количеству -ГГК ( Fo.xe.Xasj лЬгъя^ 1966) в реакции:

/ -глутамин + N Н20Н ^^^— -Г-ГГК + мн3

ОбразущиЙся ^--ГГК определяли так хе, как и при определении синтетазной активности ГС. В некоторых опытах (для определения активности иммобилизованной ГС) применяли потенциометрический метод, разрзботаннкй наш.

Определение белка в растворах производили по методу Лоури ( Мося-гу 1951) и Варбурга-Христиана. Определение аминокислотного состава в гидролизатах белка проводки на аминокислотном анализаторе ВС-201 фирмы по методу Мура и Штейна С Г1о(Пг1 1963), Определение Ы -концешх аминокислот проводили по методу Грея и Хартли С 1963). Триптофан определяли с помочью спектрофотометрического метода ■ /( Нуз^а ьл, 1972)» Диск-электро$орез проводила в 7,0%-ном полтгаяряламадном геле при рН 8,9 по методу Дэшса и Орстайна < 1964; ¿^¿¿¿л 1954). Для определения молекулярного веса ГС д присутствии додецилсульфата натрия использовали электрофорез по Веберу и Осборну ( Ов£сппг 1969) в 10а—ном полиакриламидном геле. Для определения изо эле к три ческой точки ГС применяли метод электрофокусировки белков ( -¿*ъ£е>и?р S<rens$on.i 1969) в колонке объемом 110 мл; использовали смесь а^олинов, образующую градиент рН от 3 до 10 и затем от 4 до 6» Длительность электрофореза 72 часа, напряжение 800в при 4°. СедиментационныЙ анализ ГС для проверки гомогенности препарата и определения молекулярного веса проводили методой

сединенташонного равновесия в малом слое ©"применением теневой оптики (Боуэн, 1973; tiüxs> 1971) в аналитической ультрацентрифуге SfusLce модель Е (США), используя ротор AN- Е (скорость 6116 otí/аин, время 6 час., 16°). Молекулярный вес яативного фермента и его субъединиц определяли методом гель-фильтрапли через сефадекс 6--200 в присутствии и отсутствии 8,0 М мочешны.

Электронная микроскопия. Контрастирование препаратов осуществляли 5^-ным раствором кремневольфрамата калия. Шкрсфото-гргфзи получены с помощью электронного ткро скопа JЕМ-100 В при увеличении х50 000 и ускоряющем напряжении 80 кВ,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССДЕЯОЁАНИЙ Очистка глутамзнейнтетазы хтореллц

Процесс очистки ГС, ввдёленной из клеток хлореллы,представлен на схеме 1, Все процедуры очистки проводили при температуре 4°.

На графике 1 показана последняя стадия очистки фермента с помощью гельфильтравди на улирогеле АСА-22. Как видно из графика, ГС выходит вторым симметричным пиком.

Atao

1.0

OS

"г

I

zoo -isa -tso № tío ■too ■во бО 4o го ■о

I

%

i

í; -с

Рис.1. Хроматография ГС на ультрогеле АСА-22. Кривая - белок (поглощение при

^280^' — уд. активность ГС.

фракции

- Схека І

выдаисг а очистка штл.'шг^штЕТАзи из ш>еелш Сырщразсеа ідатек (100 г)

Разруені'е в дезнн-гегртате о 0,05 ГІ трпе-ШІ буфером,р.Ч 7,5, Свдержаэеа 0,002 X 0,001 І1 га стел на, 0,002 ІІ ІІуіО,

Сеятрд^углро аз гее 20 к<н. при 8000 X ^

оеадои ------повторіте ікнтртугкровше;* епторвагавта

©тОроюен пр^'іо&ОІЇ—V іЧеченце 60 как.

Осюяенге ігучте;гпоім]< кпелот добавлением іонного стре птои^ сііїсульіата до концевт-рзцки 1$, Оставлено на 30 та. при

Центрифугирование £0 :.<с1н. Орт 8000 X £

Гдіітсиї'угат

Добавлено суль-їата аи-Юния до 35Й насыпе-тая 7,5, оставлено на 30 каи.

Цептрифугигобаніїй 20 хян. Ори 8000 х Ц

Дозевтепосульфата акмоетя-до 60Ї насцаз-1ИН при^ 4°, рН 7,5, остзЫэи» «а 80 »38.

Центрифугирование го кан. ирг 6000 х $

осадок-отброшен

Осадок

Ценгра^угаг отброзйн

ПсрОрЛСТЬОМЫ В 5 МЛ КСІОД1ЮГО трас-КСІ б;Еера рИ 7,5

Дивлгз протаа 0,001 3 Трао-КСХ буїера рН 7,5, содержащего до-Сааіа - і'іаада. 0,1 Ш іастекяа, В,0 а

Актаеше Фгатаа (о 10 по 20) о колошо» й-£00, диализ против 0,03 1 тріс-НСІ буфера рН 7,5, со-дерищего 1 »і* ааТА, 01 *£Л шотсипэ, 2 М

^ їроіатлгро^ая на И-52 в лянейном градиенте трис-ШІ буфера рН 7,5 «оэрастакцед концентрации!

Срекшя (с 12 по 13) с колоюсг ИЕ-52. Доба влево суліЛата а«мошя до 605 ішскїсшія. Остапівно на 4<і ьыв.

ИеатріІ-упгроадяпе 20 «га, ира БООО X$

осадок-»-— Иевгркйтат отброшен верерастворен в исхода©«----

0утере Диалгэ против 0,05 М трие-ВЛ втїера рН 7,0 о

1 дооавкакл

^каАзат I

Фракцяокгрогаше аа угьгрчгеде АСЛ-23, Элкгия 0,05 и трге-НЗІ Сгієрои рй 7,0, содгрішсвч добавка и 0,1 Л ЛЬ«

Удельная активность энзима во всех фракциях была одной и той же, что является одним из критериев гомогенности ферментного препарата. Электрофорез этого препарата давал одну белковую полосу. Анализ N -концевых аминокислот тоже указывает на гомогенность полученного препарата, так как в качестве Л/-концевой аминокислоты в препарате ГС обнаружен только глицин. Таким образом, как видно из данных таблица X, разработанный нами метод позволил получить гомогенный препарат фермента с выгодой по активности 12В% и по белку 0,34$. Очистка при этом достигалась в 376 раз. '

Таблица I

Очистка ГС из клеток.хлореллы 1

Для получения фермента использовали 100 г клеточной пасты.

Активность фермента определяли в присутствии Мд1*

Стадия очистки Общее количество белка мг Удельная активность Общая активность Выход в % по активности Заход в Ъ по белку Степень очест- кй

1. Экстракт после 1800 л 3510 0,40 1404 100 100 1.0

2. Экстракт после 144 ООО X 1^75 0,60 1125 1.5

3. Осаздени^ стре-птомлщщсуль-фатоа 4. (АНЧ^ от 35-60^' 1732 480 0,66 3,50 1135 1680 1,65 8,75

5. Сефздекс &-200 36 48,5 1726 121,0

6. Целлюлоза ДЕ'-ЗЙ 22 81,5 1783 202,0

7. Ультрогель АСА-22 12 150,0 1800 128 0,34 376,0

Оизико-хзизческие свойства глутаминсинтетазы хлореллы

Гдутаминсинтетаза, выделенная из хлореллы по вышеописанной, методике, в виде раствора,' содержащего 0,01 М трис-НС1 буфер, рН 7,8 при температуре 4° хранится в течение 6 месяцев.

практически не теряя активности. Нужно отметить, что неочищенные или частично очищенные препараты ГС без стабилизаторов (ЭДТА или шстеина) быстро теряют свою активность даже при -70°, очистка ГС приводит к увеличению стабильности фермента.

Определение опгимумов рН для действия ГС, актиьлруемой как так и , для очищенного препарата с удельной актавно-стью 150, показало, что оптимум рН для ГС, активируемой %2Т, находится при рН 8,2-8,5, а для ГС активируемой Мл t-при рН 5,2-5,3. Активность фермента с Щ2* в два раза выше, чем с

Известно, что в отсутствие двухвалентных катионов металлов, особенно молекулы ГС из S.CO& "расслабляются", происхо-

дит обратимое конформациошое изменение фермента, сопровождающееся значительной потерей активности í GcnsCuíp, Siaatíman, 1973). Аналогичные данные имеются для ÍXJ "ни то золя" корневых клубеньков сои ( МсРал&игЛe¿а/ 1976) и для ГС других организмов ( Siizc¿¿ncín > 1973).

При'выясненид роли металлов в структуре ГС хлореллы нами были поставлены следупаяе опыты. 1. Всю процедуру выделения и очистки фермента проводили двумя параллельными методами: с использованием буферной смеси с и без добавки Полученные тем и другим методом препараты имели одинаковую удельную активность. 2. Для удаления металлов ферментный раствор дваады диалазовали в течение 24 час. Удельная активность фермента не снижалась. 3. При обработке фермента высокими ко я це нтрацаяда ЭДТА активность ГС не изменялась. 4. Электрофорез препарата ГС, предварительно обработанного 50 мМ ЭДТА в 7,5% голиакриламзд-ном геле показал наличие одной белковой полосы, характерной для недиссоциированной $opia ГС. Следовательно, ГС хлореллы в присутствии ЭДТА не распадается на субъедикицы. 5. Исходя из предположения об экранировании металла в молекуле ГС хлореллы, опыты, указанные в варианте 3, были проведены в присутствии 2,0 М мэчевины, которая была добавлена вместе с ЭДТА к раствору фермента и раствору для диализа. Снижение активности в контрольном и опытных вариантах было не выше 2-3#.

На основании этих данных, а также проведенного нами анализа на содержание Ы«.^ методом ЗПР с использованием лиофзльно высушенного препарата ГС, можно предположить, что роль металлов, в частности Лг2+, в конфориэцси ГС хлореллы незначительна» В то же время Мл2^ и Ы^ необходим для образования актив-

ного фермент-субстратного комплекса. Соотношение концентраций АТ5 и в значительной степени определяет активность ГС. Для высокоочищзнной ГС оптимальное соотношение Mg2*:AT3 - 3;1, Йя^їАЇВ - 1:1.

Как видно из таблицы П, ГС хлореллы состоит из 492 ашвони ело тных остатков и отличается высоким содержанием гистидкна, глутаиі новой кислоты и низким содерганием пролина, фенилалани-на и тирозина. Низкое содержание про лина .возможно,характеризует ГС как белок с кесткой -структурой. Минимальный молекулярный вес фермента, рассчитанный на основании данных аминокислотного состава, равен 52 019.

Таблица П

Аминокислотный состав ГС хлореллы

Амияо- Число остат- Ашно- Число остаї- Ашно- Число ос таг-кисла- ков на моле- кисло- ков на моле- кисло- ков на шле-

та кулу та кулу та Кулу

Лиз 48 Глу 60 Мет 15 •

Гис 46 Про 4 Иле 32

Арг 20 Гли 50 Лей 4

Асе 48 Ала 42 Тир 4

Тре 18 Цтс 2 Фен 6-

Сер 28 Вал 20 Три 3,6

Суїса ажнокислотных остатков на мономер 492 Минимальный молекулярный вес мономера = 52 019

Электрофокусировка частично очищенного препарата (после 6-200) ГС показала, что фериент характеризуется как кислый белок с изо эле ктриче с кой точкой 4,6 (рис,2).

Установленная нами высокая стабильность ГС хлореллы, обусловленная, по-ввдинкщу, особенностями структуры, позволила провести иіиобилизадаю ГС на ЬъСЫ -активированной сефарозе с целью виясненая возможности практического использования этого фермента. При иммобилизации сохраняется около 3052 активности ГС, при этом фермент становится значительно более стабильным. Оптимум рН иммобилизованного фермента сдвигается незначительна в щелочну» зону (рас.З); Ка длк гдутамата не изменяется.

Таким образом, Исследование ГС хлореллы выявило ряд особея-

ностей этого фермента по сравнению с ГС других организмов.

и п « н »6 17 іь 19 їв гг гг а ¿ї « г? гь 19 за

Непера фро^ции '

г I

< Рис.2. Фраквдонирование препарата ГС методом из о электрического фокусирования. 1 - градиент рН, 2 - белок, 3 - активность фермента, І-ІУ - пики элхяруемнх белков.

1

* ъ *

1 №•

і 60 -

! го -

Еис.З. Оптимум рН ГС хлореллы:

1 - нативная ГС (в растворе),

2 - иммобилизованная на ¿к/ТУ-сефарозе ГС.

Четвертичная структура глутажнсинтетазы хлореллы

Одной из важнейших характеристик ферментов является значение их молекулярных весов. До настоящего времени молекулярный вес ГС хлореллы не был известен. В связи с этим был проведен ряд опытов по определений молекулярного веса исследуемой ГС различными методами. Данные по определения молекулярного веса ГС с помощью гельхроматографаи представлены на рис.4. Молекулярный вес, рассчитанный по калибровочногду графику, в отсутствие мочевины равен 520 ООО.

Как показали аналогичные опыты в присутствии 6,0 и мочеви-ны^молекулярный вес ГС равен 55 ООО; Молекулярный вес мономеров ГС определяла такке методом аналитического электрофореза в 10$-ном полнакрялаиидном геле в присутствии 1^-ного додецвлсульфата" натрия. График зависимости электрофоретической подвижности от молекулярного веса субъединац ГС представлен в виде полулогарифмической шкалы на рис.5. Полученные данные свидетельствуют о том, что ГС состоит из идентичных по молекулярное весу мономеров, молекулярный вес которых равен 53 ООО.

Таким образом, результаты определения молекулярного веса ГС методом гел1фпльтрадаи в присутствии мочевины и аналитического электрофореза в полиакриламидшзм геле в присутствии до-цилсульфата натрия довольно близки.

Равнове6но-седдментацаонный анализ ГС показал, что молекулярный вес фермента равен 520 ООО, что согласуется о результа-

Ч.

Г.6 I$

и а и

} - 120000)

Котол&З'э (210000)

Рио.4. Определение молекулярного веса ГС методом гель-фильтрации через сефадекс &-200.

(Лаоса) |

I

3 А- -5 е 7 Ю

i

11

* V \ !'1

в 7 С

/ ♦

т 3

/

ег о.б ел <о

Лодбижносгггъ б&цса

Рис.5. Определение молекулярного веса ГС, обработанное додешлсульфатом натрия, методом диск-электрофореза в полиакрилакддком геле.

таш, полученными методом гель-фильтрации на сефадексе 6-200.

Близость значений ьюлекулярных весов, определенных методом гель-фильтрацет (319 500) и в опытах по седаментацпойноыу равновесию (320 000), свидетельствует о тон, что молекула ГС является компактным глобулярши белком, так как в первом случае значение молекулярного веса обусловливают форма и размер молекулы, во втором - вклад коифоркации отсутствует и имеет значение только молекулярный вес белка. Седиментадаонный анализ в градиенте сахарозы по Ыартину и Эйдгису показал, что ГС характеризуется симметричным пиком с коэффициентом седиментащш

Определение молекулярного веса фермента методом электрофореза и гель-фильтравди в присутствии додешлсульфата натрия и 8,0 М мочевины позволило установить, что ГС хлореллы состоит аз 6 идентичных субъединиц о молекулярным весом 53 ООО кавдая. Так как распад фермента на мономеры происходит в отсутствии р -меркаптоэтанола, мокло сделать заключение об отсутствии - 5- 5- связей мезду мономерами. Поскольку ГС хлореллы распадается сразу на мономеры без образования каких-либо проыэку-точных форм, т.е. распад происходит однотактно, мозано думать, что сила связи мевду мономерами одинакова.

В дальнейших исследованиях по изучению четвертичной структур« ГС мы применили методику электронной микроскопии белковых

14,7 .У.

макромолекул. Эту часть работы мы провели совместно с Институтом кристаллографии в секторе электронной микроскопии под руководством доктора биологических наук Н.А.Киселева. Электронная микроскопия препаратов ГС вьгашла несколько характерных типов изображений молекул. Анализ этих изображений позволяет предположить модель четвертичной структуры этого фермента, согласно которой его молекула состоит из шести удлиненных субь-еданиц (отношение диаметра к длине 1:1,4), расположенных с точечной группой симметрии 32 по вераянам искаженного октаэдра. Эта модель в различных проекциях показана на рас.6,

Рис»6, Модель четвертичной структуры ГС хло- -реялы в различных проекциях,

Наблвдаемые ва микрофотографиях шестиугольные частицы диаметром 100-110 А соответствуют мэдели, просматриваемой вдоль оси третьего порядка (рис.ба). Темное пятно в центральной части связано о внутренней полостью фермента, заполняемой конт-растерои. Один из вариантов модели (рзс.бб) напоминает как бы два повернутых на 180° и на ло кеннцх_друг на друга треугольника, размеры которого около 85 х 95 А, и соответствуют модели, просйгатриваемой поперек псеадооси третьего порядка. Размеры частиц другого варианта 75 х. 100 А лучше согласуются с очертаниями модели, просматриваемой поперек оси третьего порядка (рлс.бв). Другой вариант крестообразных частиц, когда две субъединицы удлинены (суммарная длина до 130 А), а две укорочены, показан на рпс.бг! Он согласуется с проекциями модели, просматриваемой вдоль оси второго порядка.

Как видно из рис.7, ГС хлореллы отличается от ГС ряда микроорганизмов и животных и характеризуется более низким молекулярном весом и меньшим числом субъедингзд (6 вместо 8 или 12) в о лаге мере. В то se гремя молекулярный вес'мономеров ГС хлореллы вьазе, чем у других ГС.

Бактериальная ГС Мономера расположены параллельно в виде двух гексагональных колец с точечной группой сим. метрия 62. Цол. вес олигомера 600 ООО, мол. вес мономера 50000, количество гономеров 12.

ГС из животных клеток Мономеры рассоложена параллельно в виде двух тетрамерных компонентов с точечной группой симметрии 42. Мол. вес олигомера 335 000 -400 ООО, мол. вес мономера 42 ООО - 45 ООО, количество мономеров

. ГС хлореллы

Мономеры расположены с точечкой группой симметрии 32 по вершнам нею га иного октаэдра. Мол, вес олигомера 320 ООО, мол. вес!- мономера 52 ООО, количество шномеров 6.

Рис.7. Четвертичная структура ГС разных организмов.

Таким образом, сравнивая четвертичную структуру ГС бактерий, тавотных и ГС одноклеточной водоросли хлореллы, в настоящее время шено (различать три типа ГС. Единственным представителем третьего типа структуры ГС в настоящее время является ГС хлореллы.

Необратимая инактивашя и дне со шатая глутамин-сиптетазы хлореллы •

. Ранее было установлено, что ГС высокоактивна в клетках хлореллы, выращиваемых на среде с нитратом в качестве единственного источника азота. При переносе клеток на среду с аммонием наблюдается резкое необратимое снижение активности ГС на фоне накопления в клетке хизреллы глутамина, АИ и АЫ5 (Акимова, Евстигнеева, Кретовлч, 1977).

В связи с вопросом о налички в клетках хлореллы механизма регулядаи ГС путем диссовдаща-ассовдаши фермента ( е/ л/, 1974; Мс/тап е/а/^ 1975), задачей данной чаотв работы было исследование ¿я ¿¿¿ю характера диосодааызи ГС хлореллы под дей-14

(

ствием мочевины и влияние на этот процесс субстратов и кофакторов.

Для изучения действия шчешш на активность ГС проводили прейнкубадаю фермента с различными концентрациями мочевины при температуре 25°.

Как видно из рис.8, в течение пятя минут наблвдается снижение активности ГС в присутствии 0.5 М; 1,0 М; 2,0 М и 3,0 М мочевина соответственно на 14$, 75? и на.ВОа. Дальнейшее увеличение времени преинкубаиш 1С в присутствии мочевины не влияет на активность фермента.

; 15 І5 $5 2*0

Рис.8. Кинетика ингибирования ГС хлореллы различными концентрациями мочевины.

Влияние различных концентраций мочевины на четвертичную структуру ГС хлореллы изучали методом гель-фильтрации. Как известно, по изменению ^рбъема выхода можно проследить за различными стадиями диссоциации белка ( /а ¿&$а 1566).

К I шг вцсо коочшце нно го препарата ГС добавляли перекристал-лаз ованнуи мочевину до концентрати 2,0 а, 4,0 М и 6,0 М и ш-дершвали при +4°С в течение 24 час., затем пропускали через колонку с ультрагелем АСА-22, уравновешенную раствором мочевины соответствующей концентрации. Результаты этого опыта приведены на табл.Ш.

Тадлгш Ш

Влияние мочевины на объем выхода ГС ()

Концентрация мочевины ¿А • Удельнаяактивность в % от контроля

1 Контроль (натквнкЗ фермент без добавок) 2 2,0 М мочевина 3 4,0 Ы мочевина 4 6,0 Ц мочевина 1,50 1,30 1,20 2.45 100 52 0,0 0,0

Как видно из таблицу Ш,2,0 М мочевина уменьшает объем выхода ГС, при этом активность сохраняется на белок выходит одшм паком. В присутствии 4,0 М мочевины активность ГС исчезает, но при этом, если судить по объему шкода, фермент, как в в случае 2,0 М кочевину, еще не диссощирует на субъединивд, а, наоборот, кажущийся молекулярный вес ГС увеличивается, что говорит о релаксации фермента; белок шходит также од!2И! пиком. Из таблицы южно видеть, что шход объема белка в присутствии 6,0 М мочевины резко возрастает по сравнению с выходом объема нативного фермента. Принимая во внимание ранее полученные данные, можно сказать, что этот объем выхода соответствует выходу объема мономеров исследуемой ГС.

Результат электрофореза ГС в присутствии различных концентраций мочевины, показала, что при концентрациях мочевины в пределах от 0,5 до 4,0 И не наблюдается диссоциации тале кул ГС, при концентрации мочевины 5,0 М на электрофореграммах наблюдается наличие двух белковых полос, соответствующих олигомерной и ыономерной формам ГС.

При более высоких концентрациях мочевины - 5,0 М, 6,0 М и 8,0 М происходит диссоциация ГС на мономеры, при этом на злект-рофореграммах каких-либо промежуточных полос не проявляется. На основании этих да ниш: можно думать, что ГС хлореллы при диссоциации под действием мочевины не о'бразует промежуточных форм, т.е. тетраыеров, тримеров или дамеров, как это имеет место в случае ГС Ыеигох/ила при действии уже 2,0 М мочешна

( Ио/гоог г/в^ 1969; «Ы, Кормл, 1971) или ГС СалсШо.

<£Іі&5 при накоплении в клетках гдутамина (' $¿71$ ^а/, 1974).

Кинетические параметры ГС, полученные после обработки фермента 2,0 М, 3,0 М тче ви ной, свидетельствуют, что релаксация ГС сод влиянием мочевины сопровождается изменением Км только для аммония, но в то же время Юл для глутамата не изменяется. На основании этих данных мокно предположить, что состояние активного центра для связывания аммония зависит от степени релаксации фермента.

Для разрешения вопроса о влиянии субстратов и кофакторов на диссоциацию и инактивацию ГС под действием мочевины били поставлены опыты, где к ферменту добавляли какой-либо субстрат или кофактор и затем, после экспозиции в течение 60 мил., добавляли раствор мочешны до концентрации 2,0 М и выдерживали 5 мин. при 20°С. В качестве коятролей служили варианты опыта с мочевиной без субстрата или кофактора и фермент без добавок. Полученные результаты свидетельствуют о том, что защитный эффект исследованных субстратов и кофакторов очень незначите- ' лея. Отсутствие занятного эффекта субстратов и кофактора возможно связано с тем, что эти соединения по отдельности не взаимодействуют с активным центром фермента ( 1973),

В специальных опытах по реактивации нам не удалось восстановить активность ГС, диссоциировавшей до мономеров. Электрофорез препарата после попыток реактивации ГС показал наличие только одной полосы, которая соответствует молекулярному весу мономеров исследуемой ГС. Следовательно, отсутствие активности обусловлено тем, что реассокиащя фермента под действием ис- ( пользованных наш реактиваторов не происходит. Фракция мономеров, полученная с колонки, не обладает ни синтетазной, ш трансферазной активность». Необратимость диссоциации ГС хлореллу возможно, обусловлена тем, что при распаде фермента нарушаются комплементарные центры на поверхности мономеров.

Данные, полученные при изучении характера действия мочевины на ГС хлореллы, вызывающей в концентрации до 4,0 М релаксацию ферментного белка, а затем, при более высоких концентрациях, необратимой распад на неактивные мономеры, позволяют высказать предположение, что механизм необратимой инактивации ГС в условиях іл } наблюдаемый при ассимиляции хлореллой аммонийного азота, обусловлен особенностями структуры ГС хлореллы и характером ее диссоциации.

І7

Седиментапионный анализ в градиенте сахарозы экстрактов из клеток хлореллы, выращенных в разных условиях (на нитрате, на аммонии и на среде без азота); показал, что все препараты ГС, хотя и различаются по уровню активности, но обладают как синтетазной, так и трансферазной активностью и характеризуются симметричными активными пиками с коэффициентом седиментации 14,7-5 , Следовательно, в клетках хлореллы, выращенной как на нитрате, так и на аммонии, содержится только одна молекулярная форма ГС, т.е. в "аммонийных" клетках не наблвдается появления каких-либо промежуточных,менее активных форм ГС, как это показано, например, для ГС из1 клеток ¿¿Л?

ассимилирующих аммоний ( ¿¿а?, 1974). Однако это не ис-

ключает возможной диссоциации ГС в "аммонийных" клетках хлореллы сразу, одноактно, на неактивные' мояокеры,как это пока-

зано вами для данной ГС в условиях ¿п ¿-¿¿ъо о помощью мочевины.

НЕОБРАТИМАЯ ДИССОЦИАЦИЯ Г £ ПОД ДЕЙСТВИЕМ МОЧЕВИНЫ

1ССШЛЯЦЯ1

КЙГКЬИЮВАНИБ И НЕОБРАТИМАЯ ДИССОЦИАЦИЯ ГС В УСЛОВИЯХ . АССИМИЛЯЦИИ АМНОНИЯ (

Рис.9. Схема регуляции ГС хлореллы цутеы изменения конформации фермента.

Принимая во вникание результаты, полученные ранее, можно предполагать, что процесс инактивации ГС при ассимиляции хлореллой аммония обусловлен сначала действием метаболитов-ингибиторов (глутамин, АМФ, АДФ), быстро нахашгаваодахся в клетках в этот период, а затек действием неизвестных эффекторов.

вбизвеотще «поьсиаты,

яамсшагсёес! ига

1 ппмш

вызывающих процесс необратимой диссоциации ГС на неактивные мономеры (рис.9).

Идентификация аминокислотных остатков активного центра глутаминсинтетазы хлореллы

Участие S Н-групп ГС в катализе синтеза гдуташна показано для ГС £ с0& ( Shctfww, Siactónast;, 1966), для ГС мозга свиньи í SeAnasi&Ls\ fatrucie, 1966) И ряда ДИТЯ* ГС ( Ufe-e¿a/t 1958; U£t, 1965).

В опытах по выяснению типа -SH-групп в молекул? исследуемой ГС было показано, что 3* Ю-5 М п-ХМБ, добавленный в опытную смесь, ингибирует активность ГС- irás 15 ша. экспозиции на 50% <К - 3-10"5).

В ряде случаев возможность реактивации ингибированных п-ЕШ ферментов адетеином или дитиотреитолом указывает на наличие в данном белке свободных ^Н-групп (ЮрчннскиЙ, 1977).

При частичном ингнбировании исследуемой ГС п-ХМБ (10~5 Ы) активацию удавалось осуществить путем добавления дитаотреито-ла (Ю-2 М).,На основании этих данных шхно думать, что в молекуле ГС хлореллы имеются свободные ^Н-группы, модифицируемые п-ЖВ. Однако, при полной ингабировании фермента высокими концентрациями п-ХМБ С10"^ М) происходит необратимый распад

Fac.10

Скорость иншбирования ГС под действием п-ХМБ при различных рН. Концентрация п-ХМБ 1*10"6 Ы. Время преинкубаши: 1-5 мин.; 2-10 шн.; 3-15 шн. Активность ГС в присутствии п-ХМБ вычислена по отношению к активности фермента в отсутствие ингибитора.

)

фермента аа неактивные мономеры.

юз -

ta ■

£ ta ■

ta •

ь

1 ta-

i

se-

а

ч ia-

?

« ta-

1 lo ■

ta •

te s-o

—i—i—i—i—i— 10 йЛ S.0

Аналогичный результат воздействия высоких концентраций П-ХМБ наблюдала Стедман и сотр. ( ¿Йго^ггм, 1966)

на ГС из сой' . Результаты этих опытов указывают на возможную роль 5 Н-групп также в поддержании третичной структуры исследуемого фермента.

Из данных рис.10, можно видеть, что при значениях рН выше я ниже нейтральной зоны, п-ХЛБ проявляется сильное ингибпрухн щее действие. Поскольку в щелочной зоне рН ^Н-группы белка находятся в виде меркаптидного иона Я 5+ Н*" и легко реагируют с п-ХМБ, снгибироваше в этом случае обусловлено взаимодействием п-ХУБ о ионизированными .ГН-группами белка. Инактивация / ГС в кислой зоне обусловлена, по-видимому, действием п-ХМБ на 5Н-группы, освобождающиеся при развертывашш молекулы белка в условиях низких значений рН ( СЬю/еп^ Шх&х, 1966).

Таким образом, данные, полученные прг иягибировании ГС хлореллы п-ХМБ при разных значениях рН и реактавапяи фермента дитиотрентолом, дают возможность предполагать, что исследуемый фермент обладает как доступными ХН-группгмз, так и экранированными 5Н-группамя, погруженными внутрь молекулы ГС.

Данные о наличии экранированных ^Н-грутш в молекуле исследуемой ГС были подтверждены опытами.по действию п-ХМБ на фермент, предварительно обработанный 2,0 М мочевиной (рис.11) и опытами с НуС1£>. В последнем случае было показано,'что небольше по объему молекулы Н^ С12, способные проникать внутрь

Рис.11

Влияние 2,0 М ючеваны на скорость инактивации ГС 2,5-Ю"6 а п-ЬШ

1 - ГС + + п-ХМБ

2 - ГС + 2,0 М мочевина + + п-ХМБ.

глобули, в концентрации в ХО раз меньшей (3*10~6 Ц), чей концентрации п-ЖБ, вызывает то те 50^-ное ингпбирование активности фермента.

При исследовании защитного действия глутамата, амдаяия и магния, взятых в отдельности, было показано отсутствие защитного эффекта этих субстратов и кофактора. Некоторым защитным эффектом обладают АТФ и ЭДТА. Защитный эффект АЇФ по-видимому связан с тем, что АТФ в виде комплекса с М^2*. присоединяется к тому же содержащему iH-группы участку молекулы ГС, что и п-ХМБ.

В опытах по выяснению возможной роли ^Н-группы при взаимодействии PC с АЇФ был использован препарат ГС, преинкубиро-вандаЯ,с п-ХМВ в концентрации 7,5*10"^ М в течение двух интервалов времеии-5 и 15 ш. Модифпсавдя SH-груш ГС в данном случае приводит к увеличению Км для АТФ (рте. 12), а ман-

1/£AT9>]t П~* [ Глуто^т^іі*

Рас.12 Рис.13

/

График двойных обратных величия ингибирования ГС п-ШБ в зависпдастя от концентрация А1Ф (рис.12) и глутамата (рис. 13). Концентрация ингибитора 7,6«1СГ5 М. Определение Км л VU* проводили через 5 и 15 шн. после добавления п-ЖИБ (2,3 соотв.) 1 - график зависимости 11/ в отсутствие ингибитора. )

симальная 4корость реакции не изменяется, следовательно п-ХМБ является в отношении АТФ конкурентным ингибитором.

На основании выше приведенных данных можно предположить, что блокируемая в этих условиях п-ХИБ группа участвует только

У ряда ферментов связь 5Н-групп с субстратами опосредована через вон металла. Поскольку реакция синтеза глуташна протекает только в присутствии или М**^ то, по-видимому, SH-группы ГС участвуют в связывании ATS в виде комплекса АТФ - Ме2+ с образованием меркаптидного мостика через ион металла. Йп ингибироваяия ГС п~ХИБ по отношению к аммонию и магнию f носит смешанный характер,

В опытах по влиянию времени преинкубации фермента с п-ХМБ на Vmvt в зависимости от концентрата глута-иата показано, что по мере увеличения времени преинкубацци ГС с п-Ш> наблюдается снижение VU«* . График зависимости 1/j от l/s (рис. 13) имеет вид, характерный для случая неконкурентного ингиби-роваязя, и, следовательно, ^Н-грушш хлореллы не участвуют в связывании глутамата.

На рис.14 представлена кривая зависимости рКм от рН. В работе был использован графический метод Диксона ( , 1952), позволяющий определить величину константы иошззасЕН группы, участвующей в связывании субстрата.

Близкие значения рк имеет только N -3~имадазолыюе кольцо гистдцина ÎpK - 5,в-7,0), рК других амшокаслотЕих остатков находится в значительно более кислой и щелочной зоне. Это указывает на участие гистидина в связывания глутаминовой кислоты.

в связывании субстрата - АТФ.

pKrt

3 ■

2 •

Рис.14

Зависимость Км для

i •

50 60 70 80 ЭЪ

Известно, что при фотоокислении фермента в присутствии метиледового синего наблвдается зависимость мечку потерей ферментативной активности и разрушением гистздиновых остатков, указывающая ва наличие остатка гиствдина в активном центре ( Зекигг^, 1963). Как видно из риоД5, фотоокисленке

ГС в присутствии метиленового синего при рН 7,5 приводит к резкому снижению ее активности (в течение 20 мин. ва ЮО^К

Еко.15

Кинетика фотоокисления ГС в присутствии метиленового синего.

1 - ГС + свет

2 - ГС + метилеаовый СИ-

НИЙ^ В темноте

3 - ГС метиленовый си-

ний'+ свет.

$ їв к го гі

&рспАа І МНИ

Таким образом, результаты опытов по определению константы ионизации группы, связывающей глутамат, и опытов с фотоокасле-ниеу гистадина однозначно указывают на наличие в активном центре ГС хлореллы остатка гиствдина, участвующего в связывании глутамата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время известно, что глутаминсинтетазы организмов, занимающих, различное пологе ни е в эволюционной лестнице характеризуются в равной мере высокой специфичностью в откоэе-нии субстратов - гдутамата и АТ$, в то время как аммоний может быть заменен гидроксиламиком. В качестве кофакторов все глутаминсинтетазы, используют катионы двухвалентных металлов, преимущественно магний и марганец. Для всех глутаманоинте таз активность в значительной мере определяется соотношением концентраций АТО и .

В то зе время четвертичная структура ГС бактерий, кшотных и таких растительных организмов, как дрожат и Ыеи,ье>$/и?га. сга$$<г.

различна. Как показали наш исследования, ГС хлореллы представляет третий тип структуры, ранее неизвестный для этого фермента.

Исследованные глутаминсинтетазы различаются по аминокислотному составу, однако в связывании АТФ на активном центре ГС как бактерий, так и животных участвуют ^Н-группы цистеп-ва.

В активном центре ГС хлореллы нами показано наличие JH-груїш, участвующих в связывании А1Ф, а также наличие гистидд-на, участвующего в связывании глутамата.

Все исследованные глутаминсинтетазы регулируются по принципу отрицательной обратной связи, однако для некоторых организмов установлено наличие специфических для них форм регуляции, а именно, для ряда бактерий показана регуляция ГС путем химической модификации фермента (аделидирование - деадешли-рованке), и для ГС дрожсей и клеток культуры тканей китайского хомячка показана регуляция активности путем деструїсцяи ГС на субъединицы (тетра-, три-, и димеры), обусловленной накоплением глутакина.

Работами Кретовдча, Евстигнеевой и сотр. было установлено, что ГС хлореллы подвергается контролю путем действия ряда метаболитов-ингибиторов. Однако неясным оставался вопрос о механизмах необратимой пнакткващш ГС при внращавашш хлореллы на аммонийной среде.

Полученные кади данные позволяют высказать предположение, что одной нз форм регуляции исследуемой ГС является необратимая деструкция фермента на мономеры в условиях накопления глу-тамина при высоком уровне аммонийного азота в среде.

Таким образом, ГС организмов, стоящих на различных ступенях зволюцконного развития, имеет ряд различий в структуре и в механизмах регуляции, некоторые из пах, по-видимому, обусловлены особенностями четгертпчной структуры.

ВЫВОДЫ

I. Разработана методика выделения ГС из хлореллы; фермент очищен в 378 раз с выходом по белку 0,345! и с удельной активностью 150 мкмоль фосфата за ша. на иг белка. Гомогенность фермента была проверена методом гель-фальтрации, ультрацватри-

фугированием, электрофорезом в пожакриланад ном геле г определением N -концевой аминокислоты.

П. Различными способами определен молекулярный вео ГС а ее мономера.

1) Определение молекулярного веса гомогенной ГС методом гель-фильтрации и методом равновесной седиментации дало веж-тану 320 ООО,

2) Методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия было показано, что ГС хлореллы состоит из шести мономеров с молекулярный весом 53 ООО кавдый.

3) Определен аминокислотный состав и вычислен ьншшдьша молекулярный вес мономера ГС, равный 52 019, '

Ш. Изучено действие различных химических агентов на структуру и функцию ГС хлореллы. О

1) Показана впервые возможность иммобилизации ГС на МП-активированной сефарозе. Изучены кинетические свойства иммобилизованной ГС.

2) Определена иэоэлектрпческая точка ГС, равная рН 4,8.

3) Изучение характера диссоциации фермента сод действием различных концентраций мочевины показало, что ГС хлореллы при дпссовдащш не образует да-, три- и тетрамерную форму, при концентрата мочевины 6,0 М ГС распадается на шесть неактивных мономеров с молекулярным весом 55 ООО каэдый.

4) Изучено влияние п-ХМБ на кинетические свойства ГС хлорелла. Показана возмэдность участия 5Н~групп в связывании субстрата - АТ5. На основании полученных данных по фотоокдс-лениэ гистядина и определения константы ионизащи аминокислот, входящих в активный центр ГС, можно предположить, что в связывании глутамата участвует юшдазольная группа гистидина.

IV. На основании данных электронной микроскопия препаратов ГС предложена молекулярная модель четвертичной структуры фермзята. Согласно этой модели, молекула ГС хлореллы состоит из тести удлиненных мономеров, рас поло генных по вершнам искаженного октаэдра с точечной группой симметрии 32.

V. Разработана новая методика определения активности ГС, основанная на определении концентрация протонов в реакционной смеси при гидролизе АТФ.

VI. На основании полученных данных предложена схема регуляция активности ГС хлореллы путем диссоциации фермента на

неактивные мономеры.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Д., 1977. Физико-химические свойства глутамивсинтетазы хлореллы. ДАН СССР, 223. » 4, 726-729.

2. Расулов A.C., Стельмшцук В.Я., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л., 1976, Исследование четвертичной структуры глута-из ней нте тазы хлореллы. Советско-американский симпозиум по химии и физике белка. Рига, 80.

3. Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л., Стель-/мащук В.Я,, Самсонидзе Т.Г., Киселев H.A., 1977. Очистка,

свойства и четвертичная структура глутаминскатетазы хлореллы. Биохимия, 42, » 2, 350-358.

4. Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., 1977 (в печати). Иммо-билизавдя глуташнеинтетазы хлореллы. Прикл. биохим. и макробиология.

5. Расулов A.C.. 1977 (в печати). Потендаометрический ха~ тод определения активности'глуташнеинтетазы хлореллы. Прикя. биохимия и микробиология. /

6. Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., Кретошч В.Л., 1ЯГ7

(в печати). Необратимая инактивация глуташнеинтетазы хлореллы мочевиной. Биохимия.

7. Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., Кретошч В.Л., 1977

(в печати). 0 наличии 5Н-групп и гистядина в активном центре' глутампнейатетазы хлореллы. Биохимия,

8. Самсонидзе Т.Г., Расулов A.C., Евстигнеева З.Г., 1976. Четвертичная структура глуташнеинтетазы из хлореллы. Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Ташкент.

т-гслог QT.i^/Oçr р.______________________ÏSEi^oo

Типография 1030 Госплана СССР