Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Брюшнотифозный препарат содержащий комплекс ВИ- и К-антигенов (экспериментальные исследования)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Брюшнотифозный препарат содержащий комплекс ВИ- и К-антигенов (экспериментальные исследования)"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР Н АУЧ Н О-ИССЛ ЕД О ВАТЕЛ Ь С КИ Й ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи Для служебного пользования Экз. N ' ' .1 ;

АГЕЕВА ВЕРА АЛЕКСАНДРОВНА

БРЮШНОТИФОЗНЫЙ ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ КОМПЛЕКС ВИ- и К-АНТИГЕНОВ (экспериментальные исследования)

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

/ ■/

Раоота выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Научный руководитель - доктор медицинских наук Л.К.Степанова Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.М.Бондаренко доктор медицинских наук, профессор В.В.Сергеев

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский институт

I

эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР им.Г.Н.Габричевского.

Защита диссертации состоится¿_ х —_ 1391 г. в _ часов

на заседании специализированного совета КОСИ.ОТ.СИ в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. (123098 Москва Д-98, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им.Н.Ф.Гама-леи АМН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

Актуальность проблемы. Благодаря проведению широкого комплекса профилактических мероприятий в нашей стране достигнуты значительные успехи в области снижения заболеваемости брюшным тифом. Однако, в некоторых регионах эта инфекция продолжает удерживаться на определенных уровнях, не проявляя тенденции к дальнейшему снижению. На отдельных территориях страны удельный вес брюшного тифа в общей структуре кишечной патологии остается высоким и превышает общесоюзные показатели в 5-10 раз (Бургасов П.Н., 1987, Покровский В.В., 1981, Кондрусев А.И., 1989).

Брюшной тиф распространен повсеместно. Ежегодно в мире регистрируется до 33 млн случаев (1_еуте М.М.. 1989). Однако, фактическая заболеваемость значительно превышает регистрируемую в связи с тем, что зачастую инфекция протекает атипично и высокий процент случаев остается нерасшифрованным (Вюлл. 303, 1980, Хрон. ВОЗ, 1976, 1984. Ес)е1тап Я.Е. ег а1, 1984).

Одной из характерных особенностей брюшного тифа в настоящее время шляется высокая заболеваемость и тяжелое течение инфекции у детей первых ;-.ч жизни и лиц молодого возраста. Все более широкое распространение почучзюг устойчивые к антибиотикам и химическим препаратам формы возбудителя. Часты случаи формирования длительного, трудно поддающегося лечении: бактерионосительства, являющегося, как известно, основным источником инфекции. После перенесения заболевания примерно в 20% случаев возникает сстрое и в 12-33% - хроническое бактерионосительство, длящееся иногда многие годы (Билибин Д.Ф. и др., 1965-1978; Килессо В.А. и др., 1976, Погорельская Л.В.. 1986. Поставит В.А., 1983, Ьеуте М.М. ег а1, 1983).

Снижение заболеваемости брюшным тифом не может быть достигнуто противоэпидемическими мероприятиями.

3 сьйзп с этим создание вакцин против брюшного тифа с целью имму-иоп^оф1:чэ.<тки и иммунотерапии продолжает оставаться актуальной задачей здравоохранения и является необходимым звеном в общей системе мер борьбы с этим заболеванием. Несмотря на накопленный большой опыт, до сих пор су'клпвует брюшнотифозных вакцин, полностью удовлетворяющих требова-

ниям здравоохранения (Кондрусев А.И.. 1989, Ес1е1тап Я.Е. ег а1, 1986, Сегтагнег R., 1984, 1_еуте М.М. ег а1, 1987, ^¡Ьаэ! А. ег а1, 1988.). Применяемые с целью специфической профилактики пзрэнтеральные вакцины реактогенны и не обеспечивают развития полноценного иммунитета.

Проведенные ВОЗ контролируемые испытания брюшнотифозных вакцин различных методов приготовления (1954-1964, 1976 гг) и накопленные к настоящему времени материалы свидетельствуют о том, что для создания полноценного иммунитета против брюшного тифа недостаточно наличия в вакцинах только О-, Ви- и Н-антигенов. Необходимо присутствие также дополнительного "защитного" антигена, близкого по лабильности к Н-антигену (Бюлл. ВОЗ, 1979, 1980, .Зоо I., 1971).

При исследовании антигенной структуры сальмонелл, в том числе брюшнотифозных бактерий, был идентифицирован и иммунологически охарактеризован поверхностный К-антиген. Установлено, что К-антиген обладает высоко выраженными антигенными свойствами и протективной активностью, стимулируя антибактериальную устойчивость макрофагов к внутриклеточному размножению возбудителей (Степанова Л.К. и др., 1976,1978).

Исходя из новых данных об антигенном составе сальмонелл, в НИИЭМ им.Гамалеи АМН СССР разработан принцип щадящего одномоментного извлечения поверхностных 0-, Ви- и Н-антигенов (Геккер З.Д., Сергеева Н.С., 1973). В последующих работах в нашей лаборатории было показано, что при этом способе выделяется также протективный К-антиген (Степанова Л.К. и др., 1976, 1978).

Этот метод был использован для получения из производственной реакторной спиртовой массы брюшнотифозных бактерий (Горьковский НИИЭМ) нового химического комплексного препарата, содержащего 0-, Ви и К-энтигены (Степанова Л.К. и др., 1986).

Цель работы. Целью настоящей работы являлось экспериментальное исследование иммунологической эффективности и безвредности (нового комплексного брюшнотифозного препарата.

Запачи исследования.

1. Изучить антигенный состав, иммуногенные свойства и протективную активность нового комплексного брюшнотифозного препарата.

2. Провести сравнительное изучение протективной активности полученного брюшнотифозного препарата и коммерческой спиртовой вакцины, обогащенной этим комплексом.

3. Разработать модель длительного сальмонеллезного бактерионосительства.

4. Определить иммунотерапевтическую и иммунопрофилактическую эффективность нового препарата на модели длительного сальмонеллезного, в том числе брюшнотифозного, бактерионосительства.

5. Определить безвредность препарата на различных экспериментальных моделях.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые охарактер.' зован полученный из реакторной спиртовой массы брюшнотифозных бактерий методом мягкой экстракции новый комплексный брюшнотифозный препарат, содержащий, наряду с Ви- и незначительным количеством О-антигена, поверхностный протективный К-антиген.

- установлены безвредность, нетоксичность, отсутствие аллергизирующих и колейкемогенных свойств нового препарата, а также вакцины спиртовой брюшнотифозной, обогащенной этим комплексом.

- показана высокая иммунизаторная и протективная активность комплекса Ви- и К-антигенов и значительное (в 40 и более раз) усиление протективной эффективности коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакцины при обогащении ее этим комплексом в экспериментальных условиях.

- разработана модель длительного сальмонеллезного бактерионосительства (АС N1412500 от 22 марта 1988 г). Выявлены выраженные санирующие свойства брюшнотифозного комплексного препарата с К-антигеном, обеспечивающего полное и стойкое очищение организма животных от инфицирующих микробов. Установлена важная роль К-антигена в развитии

антиинфекционного поствакцинального иммунитета.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе решались задачи, связанные с использованием нового химического брюшнотифозного препарата, полученного из коммерческой спиртовой биомассы, и содержащего, наряду с Ви- и О-антигенами, протективный поверхностный K-антиген, в целях иммунопрофилактики и иммунотерапии брюшного тифа и бактерионосительства.

- на различных экспериментальных моделях, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к новым вакцинам, и при испытании 20 серий препарата проведен первый этап доклинических испытаний препарата: установлена безвредность, практическая ареактогенность, высокие иммуногенные и протективные свойства комплекса Ви- и K-антигенов, а также коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакцины, обогащенной этим комплексом. Полученные данные являются обоснованием для перехода к следующему этапу - испытанию вакцины на добровольцах.

- впервые показана принципиальная возможность использования комплекса Ви- и K-антигенов брюшнотифозных бактерий с иммунотерапевтической целью для лечения бактерионосительства.

- по материалам диссертации защищено 2 изобретения: "Штамм бактерий Salmonella typhimurium, используемый для моделирования длительной перси-стенции сальмонелл", АС N1412500 от 22 марта 1988 г. и "Способ профилактики брюшного тифа", положительное решение от 27 апреля 1990 г. на заявку N 4692768/13/069754.

Работа выполнялась в соответствии с отраслевой программой С-30, межведомственными программами "Фундаментальные науки медицине" и "Профилактика острых кишечных заболеваний".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях лаборатории иммунологии энтеральных инфекций и /Моратории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Диссертационная работа апробирована на научной конференции лаборатории иммунологии энтеральных

инфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР 4 июля 1990 г

Разработанная экспериментальная модель длительного сальмонеллезного бактерионосительства, защищенная авторским свидетельством, используется в ряде лабораторий, что подтверждено актами о внедрении.

Материалы диссертационной работы легли в основу "Инструкции по изготовлению и контролю вакцины спиртовой брюшнотифозной, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов". Инструкция утверждена Комитетом ММБП для дальнейшего испытания обогащенной вакцины в клинике.

Проведение исследований нового комплексного брюшнотифозного препарата, содержащего Ви- и К-антигены, включено в "Целевую комплексную программу НИР по разработке новых и усовершенствованию имеющихся вакцин на 1990-1995 гг" АМН СССР.

литературы (3 главы), описания материалов и методов, результатов собственных исследований (6 глав), заключения, вы_адов и списка использованной литературы, содержащего 249 источников, из которых 112 - зарубежных.

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит 27 таблиц и 15 рисунков.

Для решения поставленных задач были использованы методы микробиологического и иммунологического анализа.

Эксперименты поставлены на 4200 нелинейных мышах, 300 инбредных мышах линии СВА и гибридах (СВАхС57В1б), 200 мышах линии BALB, 120 морских свинках и 80 кроликах. Получено более 300 иммунофореграмм. Исследовано 20 серий ампулированного нового комплексного химического брюшнотифозного препарата.

Материалы и метопы.

В работе использован штамм S.typhi Ту-2 N4446, обладающий типичными морфологическими, культуральными, ферментативными и серологическими свойствами; стабильный спонтанный авирулентный мутант S.typhimurium - Кзо.

[. Диссертация состоит из введения, обзора

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

полученный в лаборатории иммунологии энтеральных инфекций Л.К.Степановой. Штамм имеет в своем составе К-антиген и небольшое количество О-антигена. В работе использованы генетически аттенуированные штаммы БдурЫтигшт N8-41-2, N5-495-5, несущие две мутационные метки и характеризующиеся сниженной вирулентностью. Штаммы получены Б.И.Маракушей в лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им.Гамалеи.

О-соматические антигены бактерий выделяли методом водно-феноловой экстракции по \Л/е$1рЬа1 (1952) и по методу Вотп (1934). Полный набор растворимых антигенов по Грассе получали из живых микробных клеток путем многократного (8-10 раз) замораживания и оттаивания.

Химический брюшнотифозный препарат, содержащий комплекс Ви- и К-антигенов, выделяли го методу, описанному В.Д.Геккер и Н.С.Сергеевой (1973), при непосредственном участии Н.С.Сергеевой из реакторной спиртовой массы брюшнотифозных бактерий Горьковского НИИЭМ. Метод заключается в одномоментном щадящем извлечении трихлоруксусной кислотой комплекса поверхностных протективных антигенов.

Антисыворотки получали путем внутривенной гипериммунизации кроликов антигенами, живыми или инактивированными прогреванием культурами.

Изучение антигенного состава нового комплексного препарата проводили методом иммуноэлектрофореза в агаре (ИЭФ), методом встречного иммуноэ-лектрофореза (ВИЭФ) и с помощью реакции коагглютинации (РКА). Реакцию коагглютинации ставили совместно с О.Ф.Белой по методике, описанной Ю.А.Белой с соавт. (1981).

Химический анализ проводили совместно с В.Г.Петрухиным. В препаратах определяли белок по 1.оип, общие сахара по Сгодег, общий азот по Кьельдалю.

Токсичность комплексного Ви- и К-препарата определяли при подкожном внутрибрюшинном, пероральном введении мышам и пероральном введении кроликам. Морфологические исследования внутренних органов животных при изучении острой и хронической токсичности комплексного Ви- и К-препарата проводили совместно с А.М.Харитоновой и С.И.Быковской (лаб. микробиологии

латентных инфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи).

Протективную активность изучаемых препаратов оценивали путем определения средней иммунизирующей дозы ЕД50.

Модель длительного сальмонеллезного бактерионосительства разрабатывалась на нелинейных мышах с использованием вирулентного штамма S.typhi Ту-2 и аттенуированных мутантов S.typhimurium-NS-41-2 и NS-494-5, несущих 2 генетические метки, что позволяло дифференцировать их от культур естественного происхождения.

Безвредность комплексного препарата проверяли на белых мышах и морских свинках.

Для изучения аллергизирующих свойств разработанного препарата использовали модель гиперрергической воспалительной реакции - феномен Шварцмана метод Ribi и Larson в рекомендации Е.Н.Меликовой и С.В.Лесняк (1969) для испытания брюшнотифозных вакцин.

Коонкогенное действие Ви- и К-знтигенов изучали в острых и хронических опытах на модели вируса лейкоза Рзушера совместно с А.Е.Снегиревой и Г.М.Шапошниковой (лаб. интегративных инфекций НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи).

Комплекс Ви- и К-антигенов был также изучен в реакциях кожной ГЗТ, торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) в совместно проведенных исследованиях с Т.Н.Николаевой.

Статистическую обработку полученных данных проводили по П.П.Ашмарину и А.А.Воробьеву (1962) с оценкой статистической значимости по t-критерию Стьюдента.

Результаты собственных исследований.

Определение антигенного спектра нового препарата методом иммуноэлек-трофореза в агаре (совместно с Н.С.Сергеевой) показало, что путем мягкой экстракции трихлоруксусной кислотой из реакторной спиртовой микробной массы получен комплекс недеградированных поверхностных брюшнотифозных антигенов. С использованием гомологичной антисыворотки и антисывороток к индивидуальным Ви-. К- и О-антигенам установлено, что новый химический

брюшнотифозный препарат состоит, в основном, из комплекса Ви- и К-антиге-ноб Применение О-антисыворогки показало наличие в нем также О-антигена

г;

Рис.1. Антигенный спектр комплекса Ви-'и К-антигенов.

В лунках - комплекс Ви- и К-антигенов,

в траншеях - антисыворотки - А - к живым бактериям Ту-2

- Б - к Ви-антигену

- В - к К-антигену

- Г - к О-антигену

Количественное содержание индивидуальных! антигенов в препарате изучено с использованием методов ВИЭФ и реакции коагглютинации (РКА) на стекле.

В сравнительных испытаниях методом ВИЭФ очищенных Ви- К- и О-анти-генов, полученных в лаборатории иммунологии энтеральных инфекций, и выделенного из спиртовой реакторной биомассы комплекса антигенов, было установлено, что чувствительность примененного метода с соответствующими специфическими антисывороткэми составляла для Ви-антигена 0.7 мкг/мл. для

К-антигена - 0.7 мкг/мл и для липополисахарида О-антигена - 1.5 мкг/мл. Результаты определения показали, что содержание Ви-антигена в комплексном препарате составляло 23%, К-антигена - 35%, О-антигена - 15% (р> 0.05).

Количественное содержание Ви-, К- и О-антигенов было определено в комплексном препарате также с использованием РКА на стекле. В опытах применялись диагностикумы, приготовленные на основе Ви- и О- коммерческих Д-групп сальмонеллезных сывороток, а также специально приготовленной нами К-антисыворотки.В тест-системах коагглютинирующие диагностикумы выявляли гомологичные Ви-, К- и О-антигены до концентрации 10 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно. В комплексных препаратах разных серий определялись: Ви-антиген до концентрации 10-1 мкг/мл, К- и О-антигены - 10-1, 100 мкг/мл, соответственно.

Важно отметить, что использование различных методов - аналитического ИЭФ, ВИЭФ и РКА показало, наряду с небольшим количеством О-антигена, присутствие в изучаемом комплексном препарате Ви- и значительного количества К-антигена. На основании этих данных выделенный нами препарат был назван комплексом Ви- и К-антигенов.

Сравнительный анализ общего химического состава различных серий спиртового комплекса Ви- и К-антигенов показал повторяющиеся результаты. Разные серии препарата содержали от 12.6 до 17.3% протеинов и до 23-27% липо-полисахаридов.

Важным вопросом является выяснение токсичности новых препаратов. Е наших исследованиях определение токсических свойств комплексного г.ппрк..-вого препарата, содержащего Ви- и К-антигены, проводили на мышах при г\..-кожном, внутрибрюшинном и перорчльчом пряменеи.^' и на крс-. ,■ - ■ введении перорально. Токсичность г:а -и <ных серий прр:пг">''! •' ..-ктически одинаковой. При подкожной аппликзцп.' мышам их ДО* значительно превышали 2 мг, при внутрибрюшинном применении ЛД^о составляла 1.5-2 мг.

Многократное перорлльное введение мышам и кротик^м различных п гре^ратл не вызываю гибепи живот"ыл даже при ятикратном прими-

io

нении 5 мг мышам и двукратном по 100 мг - кроликам. Выживаемость животных составляла 100%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что одномоментно выделенный трихлоруксусной экстракцией из спиртовой реакторной массы комплекс Ви- и К-антигенов брюшнотифозных бактерий является нетоксичным препаратом при различных методах введения в опытах на экспериментальных животных.

Одним из основных критериев при оценке качества комплексных препаратов является определение удельного веса каждого из компонентов в формировании иммунного ответа. Иммуногенную активность спиртового комплекса Вии К-антигенов исследовали в опытах на кроликах при внутривенном применении. Препарат вводили в возрастающих дозах от 0.1 до 1 мг с пятидневными интервалами. Через 10 дней после окончания цикла иммунизации производили забор крови. Проводили 3 цикла вакцинации.

Исследования показали, что полученный нами препарат вызывал образование специфических антител ко всем входящим в его состав трем антигенам: Ви, К и О. Через 10 дней после первого цикла иммунизации титр Ви-антител составлял 1:64 - 1:128, К-антител - 1:1280 - 1:2560 и О-антител - 1:1280. Следует отметить высокую степень синтеза антител к поверхностному К-антигену.

Для изучения динамики антителообразования у кроликов брали кровь после каждой инъекции препарата и еженедельно до 28 дня после иммунизации. Максимальное накопление агглютининов отмечалось через 7 дней после 3-ей иммунизации и сохранялось на достаточно высоких уровнях в течение последующих 4 недель (срок наблюдения). Иммунофоретическое исследование антисывороток, полученных после внутривенного введения препарата, подтвердило наличие в них Ви-, К- и О-антител.

Комплексный Ви- и К-препарат обладал выраженной протективной активностью. Установлю!'.?, что ЕДзо различных серий препарата при однократном и-..л- ::»-.ном B8e,"."rv.ii r.ocvw.a О 19-0.049 мм при заражении 5-8 ЛДбо виру-•■•'!:..'пульп;'. :> i-f-) иммунитет с",хранится в течение 30 дней

(срок наблюдения). Препарат стимулировал развитие напряженного иммунитета и обеспечивал высокую выживаемость иммунизированных животных даже при заражении большими дозами вирулентной культуры - 18 ЛД50.

Высокая протективная эффективность комплекса Ви- и К-антигенов установлена при его пероральном применении. В опытах на мышах были ( ппытаны разные дозы и кратность введения препарата. Сравнительное изучение разных серий препарата показало, что в дозе 1 мг при трех- и пятикратном введении вакцина обеспечивала выживаемость животных в 80-100% случаев.

Таким образом, нами было установлено, что брюшнотифозный препарат, состоящий из комплекса Ви- и К-антигенов, характеризуется выраженными антигенными и протективными свойствами.

Как известно, в нашей стране с целью специфической профилактики брюшного тифа применяется спиртовая брюшнотифозная вакцина, обогащенная Ви-антигеном (Шатров И.И. с соавт., 1971). Полученные нами данные о протехтивной активности К-антигена явились основанием для изучения возможности использования комплекса Ви и К-антигена в качестве препарата обогащения сухой коммерческой спиртовой вакцины.

С этой целью были проведены специальные исследования по приготовлению стерильных растворов нового препарата. Оптимальной была стерилизация с применением отечественных комплектов для стерилизующей фильтрации УФС-142 или фильтрующих систем фирмы ММНрог. Проведенными исследованиями установлено, что фильтрация не влияла на протективную активность. Стерильные растворы комплекса Ви- и К-антигенов готовили в концентрации 400 мкг/мл и разливали по ампулам в количестве 5 мл на ампулу (также, как и коммерческий препарат Ви-антигена). Каждую серию ампулированного препарата контролировали на стерильность в ОБК института.

Нами было приготовлено 20 серий ампулированного комплекса Ви- и К-антигенов.

Изучение протективных свойств ампулированного в жидком виде препарата проводили путем однократной подкожной иммунизации мышей в дозах от 0.003

до 0.4 мкг. Через 10 дней после иммунизации животных заражали внутрибрю-шинно вирулентной культурой S.typhi Ту-2. Исследования показали, что доза комплекса Ви- и К-антигенов, обеспечивающая 50% защитный эффект при заражении мышей от 3.5 до 6 ЛД50 вирулентной культуры S.typhi, составляла 0.044 - 0.12 мкг (табл.1).

Таблица 1. Эффективные дозы препарата обогащения - комплекса Ви- и К-антигенов.

Серии препарата Количество опытов Доза заражения Ту-2 ЕД50 в мкг

6 3 3.5 - 6 ЛД50 0.054Ю.005

16 4 * 0.044±0.0004

36 3 0.086±0.057

37 4 н 0.12±0.062

39 з ^ 0.063±0.0067

Наблюдения, проведенные спустя 1. 6. 12 и 20 месяцев после приготовления ампулировэнного комплекса Ви- и К-антигенов показали стабильность про-тективной активности препарата в течение 20 месяцев (срок наблюдения) в условиях хранения при температуре +4°С.

При изучение протективных свойств спиртовой вакцины, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов, одну ампулу сухой коммерческой спиртовой вакцины, содержащую 2.5 млрд брюшнотифозных бактерий, растворяли в 5 мл (1 ампула) стерильного комплекса Ви- и К-антигенов, содержащих 2 мг антигенов. Конечная концентрация обогащенной вакцины составляла в 1 мл - 500 млн брюшнотифозных бактерий и 400 мкг комплекса Ви- и К-антигенов. Из этого исходного разведения готовили ряд пятикратных разведений.

Протективную активность обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакцины изучали в сравнении с про-тективными свойствами гретой корпускулярной брюшнотифозной референс-вэкцины ГИСК им.Л.А.Тарасевича; спиртовой вакцины без обогащения; комплекса Ви- и К-антигенов; а также спиртовой вакцины, обогащенной только Ви-антигеном.

Исследовали различные серии коммерческой спиртовой вакцины и приготовленного нами комплексного Ви- и К-препаратэ, Референс препарат и спиртовую вакцину без обогащения изучали в дозах от 0.5 до 62.5 млн микробных клеток. При обогащении спиртовую вакцину применяли в дозах от 0.2 до 2.5 млн микробных клеток и комплекс Ви- и К-антигенов или Ви-антиген - в дозах от 0.003 до 0 4 мкг. Через 10 дней после иммунизации животных заражали внутрибрюшинно не менее 3-5 ЛД50 вирулентной культурой 5дурЫ (табл.2).

Таблица 2. Протективные свойства вакцины брюшнотифозной спиртовой, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов.

Препарат Серия препарата Количество опытов ЕД50 (млн) Усиление протек-тивмсго эффекта обогащенной лк-цины

Референс-вакцнна ГИСК 2 2.3; 1.82

Вакцина сг.иртовля 74. 75 13 4.76±0.98

Вакцина спиртсыч. ооо-тащеннп Ви-антнгенсм 400 мкг 69, 74, 68 5 0.49±0.12 в 9.7 раза

Вакцина спиртовая, обогащенная комплексом Вии К-антигенов 400 мкг 69, 6 3 0.07±0.09 в 68 раз

1 69. 14 4 0.16±0.029 в 27.8 раз

74, 16 4 0.12±0.018 в 39.6 раз

и 74, 36 3 0.05±0.013 в 95 раз

| 74, 37 2 0.16±0.1 в 27.8 раз

74, 39 3 0.08±0.007 в 59 5 раз

Псказзнэ. что комплекс Ви- и К-антигенов уменьшает ЕДбо бргатнэтифоэ-||01) спиртовой доцины в несколько десятков раз. Обогащение спиртовой вакцины только Вн-ант/генсм (коммерческий препарат) уменьшало £Дг,э взкцины а 9 7 раза.

: г г:; :'.:-1!, о 1 ргпнс.нт-и сделать заклю-

-»он1ч\ чп т-у .и..-:.'« ,.з»:>1 химическил брюшнотифозный препарат, содержащий комплекс Ви- и К-антигенов, может быть использсзчм ^ -- (етре эффективного препарата с5эгащт« <"?гл—г ••>••• к<- • •• •. „ ¡э-гифээдсй /,/ сплавили пс^Д'.'.ог ■ :• .г'1 'у .¡.и.ч'н-г.

брюшного тифа" (положительное решение от 27 апреля 1990 г .на заявку N 4692768/13/069754).

Одну из наиболее сложных проблем кишечной инфекционной патологии представляет бактерионосительство. Как известно, при брюшном тифе бактерионосительство является основным источником инфекции. В связи с этим задачей наших следующих исследований являлась разработка моделей длительного сальмонеллезного бактерионосительства с применением как вирулентных, так и аттенуированных штаммов с целью дальнейшего использования этих моделей для определения иммунотерапевтической и иммунопрофилакти-ческой активности изучаемого нами комплексного брюшнотифозного препарата.

Изучение длительности сохранения брюшнотифозных бактерий в инфицированном организме проводили в опытах на нелинейных мышах. Животных заражали внутрибрюшинно вирулентной культурой S.typhi Ту-2 в дозах от 250 до 250000 микробных клеток. Еженедельно после заражения, начиная с 1-ой недели и в течение последующих 28 недель, по 2-3 мыши из каждой группы забивали и производили высевы на чашки со средой Эндо и МПА из селезенки и печени, а в более поздние сроки также из костного мозга и кишечника.

Выросшие на чашках с МПА колонии просматривали в пучке косопадающего света. Дальнейшую идентификацию проводили путем посева подозрительных колоний на среду Ресселя и агглютинации на стекле с монорецепторными 0:9, 0:12, Ви- и H:d антисыворотками.

Исследования показали, что независимо от дозы заражения брюшнотифозные микробы длительное время (170 суток, срок наблюдения) сохранялись в организме мышей и высевались из печени, селезенки, костного мозга и кишечника. Гибели .мышей при этом не наблюдали. В процессе персистенции. наряду с типичными по своим свойствам микробам, обнаруживались измененные по морфологическим, ферментативным и с .юлогическим свойствам формы.

Полученные нами данные согласуются с работами ряда других исследователей, отмечавших изменчивость брюшнотифозных бактерий и появление различных микробных вариантов и их L-форм при длительном пребывании

возбудителя в организме животных (Свиридова Т.А., Ягуд С.Л.).

Несмотря на то, что мыши не являются чувствительной моделью для S.typhi, модель продолжительного носительства дала возможность проследить судьбу этих бактерий в процессе длительной персистенции в организме инфицированных и иммунизированных животных.

Исследования по созданию модели хронического сальмонеллезного бактерионосительства проводили совместно с Б.Н.Маракушей и В.Г.Петровской (лаб. генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи) с использованием генетически охарактеризованных мутантов S.typhimurium NS-494-5 и NS-495-5. Мутанты имели оптимально сниженный стабильный уровень вирулентности, без изменения антигенной структуры, были маркированы по резистентности к неамину и стрептомицину, что позволяло дифференцировать их от культур естественного происхождения.

В опытах по изучению длительности персистенции этих мутантов животным перорально вводили в 0.2 мл физиологического раствора 18-часовые культуры в доз?* от 250 до 250000 микробных клеток. Однократное введение мутантов в указанных дозах вызывало единичную гибель животных в течение 195 дней (срок наблюдения).

В разные сроки, начиная с 1-ой недели после заражения, для выявления инфицирующего микроба производили высевы из различных органов на чашки со средой Эндо и МПА. На первых этапах работы высевы делали из крови, костного мозга, селезенки, печени и содержимого кишечника. В поздние сроки наблюдения исследовали только селезенку и кишечник.

Опыты показали, что через 7 дней после заражения и в более поздние сроки мутанты из крови не выделялись. Из желчного пузыря и костного мозга мутанты NS-41-26 и NS-494-5 были выделены на 47 и 69 день после заражения. Очень длительный период (до 195 дней, срок наблюдения), независимо от дозы заражения, эти бактерии выделялись из селезенки и кишечника.

Важно подчеркнуть, что выделенные в поздние сроки наблюдения - на 117, 138, 165 и 195 дни после заражения, штаммы сохраняли генетические

метки - резистентность к неамину и стрептомицину.

Разработка модели длительного бактерионосительства сальмонелл мышиного тифа защищена авторским свидетельством (АС N0 1412500).

Изучение иммунотерапевтического действия препарата Ви- и К-антигенов и спиртовой вакцины, обогащенной им, проведено на модели бактерионосительства ЭдурЫ в различно аранжированных опытах.

В первой серии опытов мышей заражали большой дозой брюшнотифозных бактерий - 25 тыс. микробных клеток. На 21 день после заражения мышам орально вводили комплексный Ви- и К-препарат в дозе 3 мг однократно или двукратно с недельным интервалом. Опыты показали, что на фоне интенсивного размножения и сохранения возбудителя в селезенке и печени мышей контрольной группы в течение 16 недель (срок наблюдения) однократное введение вакцины через 21 день после заражения приводило к резкому снижению количества выделенных бактерий, начиная с 11 недели, вплоть до единичных колоний на 13-15 неделях после заражения.

Более выраженный эффект имел место при двукратном применении комплекса Ви- и К-антигенов. В этом опыте выделение брюшнотифозных бактерий было значительно менее интенсивным по сравнению с контролем и предыдущим опытом с однократным введением препарата: число выделяемых бактерий уменьшалось начиная с 7 недели после заражения, к 12 недели из селезенки вы' совались единичные колонии.

В последующих опытах иммунотерэпеатическое действие комплекса Би- и К-аитигеноа изучали в более короткие сроки при применении его внутрибрю-шинно в меньших дозах. В этих опытах мышей заражали 1 тыс. микр. клеток брюшнотифозных бактерий. Лечение проводили через 21 и 14 дней после заражения в дозах 1 и 0.4 мг комплекса Ви- и К-антигенов.

Установлено, что более раннее применение препарата - чгоез 14 дней после заражения. 3-х кратно даже в дозе 0.4 мг приводило ► зсб-И'гс-.-.ному уменьшение количастьа бактерий и укорочению сроков выделения - спустя 6

Заражение Лечение

недели после заражения Рис.2. Иммунотерапевтический эффект вакцины брюшнотифозной

корпускулярной спиртовой, обогащенной комплексом Ви- К-антигенов.

Обозначения. Уровень выделения S.typhi:

— - у контрольных нелеченных мышей

I--- при введении обогащенной вакцины через 7 дней

после заражения, 3-х кратное

I I-----при введении обогащенной вакцины через 1 день

после заражения, 3-х кратное

II I----- при введении обогащенной вакцины через 1 день

после заражения, 4-х кратное

При изучении иммунотерапевтической активности коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакцины, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов, животных, как и в предыдущих опытах, заражали вирулентным штаммом S.typhi Ту-2 в дозе 1 тыс. микробных клеток, лечение проводили трех- или четырехкратно с интервалами в 7 или 3 дня, через 1 неделю или 1 день после заражения. Разовая доза каждого из препаратов составляла: для спиртовой вакцины - 1.2 млн микр. клеток, комплекса Ви- К-антигенов - 1 мкг. Результаты выделения бактерий из печени представлены на рис. 2.

Опыты показали, что при 4-х кратном введении ассоциированного препарата через 1 неделю после заражения брюшнотифозные микробы высевались в первые 2 недели после лечения вакциной только из печени и не выделялись из селезенки, причем большинство выделенных из печени колоний было в R-форме.

i8

После лечения к 6-ой неделе после заражения наступало очищение организма от бактерий (рис.2.1)

При трехкратном лечении, начатом через сутки после заражения, брюшнотифозные бактерии выделялись из печени и селезенки до 3-х недель после лечения. Затем их число снижалось до единичных колоний и через 5 недель после заражения бактерии не выделялись на протяжении последующих 9 недель наблюдения (рис.2.И)-

Четырехкратное лечение, начатое через 1 день после заражения, обеспечивало полное очищение организма от инфицирующих микроорганизмов непосредственно после окончания лечения. Высевы из селезенки и печени, проводимые в течение 13 последующих недель, были стерильными (рис.2.III).

Данные, полученные на модели S.typhi, нашли подтверждение на мышиной модели S.typhimurium. В этих исследованиях для заражения мышей использовали генетически охарактеризованный мутант" S.typhimurium NS-494-5 в дозе 1 тыс микробных клеток. Лечение проводили внутрибрюшинно 4-х кратно каждые 3 дня через 7 дней после заражения, в тех же дозах, что и при использовании модели S.typhi, тремя препаратами: комплексом Ви- и К-антигенов из брюшнотифозных бактерий; брюшнотифозной спиртовой вакциной и брюшнотифозной спиртовой вакциной, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов.

В этих экспериментах, наряду с серологической и биохимической идентификацией выросших колоний, определяли сохранность у выделяемых бактерий генетической метки - резистентности к неамину и стрептомицину.

Опытами было показано, что применение комплекса Ви- и К-антигенов или спиртовой брюшнотифозной вакцины, обогащенной этим комплексом, создавало развитие антимикробного иммунитета, обусловливающего снижение количества и сроков выделения возбудителя из паренхиматозных органов и приводило к ускоренной санации организма. Интенсивность выделения бактерий после однократного курса лечения резко снижалась в первые 4 недели наблюдения, по сравнению с контрольной группой мышей. К 7-ой неделе наступало очищение организма. В группе мышей, получивших только спиртовую брюшнотифозную

вакцину, снижения уровня выделения бактерий мутантного штамма БлурЫтиПит не наблюдалось (рис. 3. А.).

Повторное двукратное лечение указанными препаратами в тех же дозах, проведенное через 13 дней после окончания 1-го цикла лечения, еще более сокращало сроки персистенции сальмонелл мышиного тифа и обеспечивало освобождение организма от инфицирующих микробов к 6-8 неделе после заражения (рис. 3. Б).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный брюшнотифозный комплексный препарат, содержащий Ви- и К-ан-тигены, а также спиртовая брюшнотифозная вакцина, обогащенная этим комплексом, обладают иммунотерапевтической активностью.

вздел. Сектер*«

зара- лечение хение г 7». :

12 3 4 5 6 7 3 недели после заражения

I 2 3 4 56789 10 недели после заражен**

Рис.3. Иммунотерапевтический эффект К-антигена в опытах на мышиной модели ЗдурМтипит.

А - введение препарата через 7 дней после заражения, 4-х кратное Б - введение препарата через 7 дней после заражения, 4-х кратное;

повторное - через 13 дней, двукратное Обозначения, уровень выделения Б.турЫтигШт у мышей: - - контрольной нелеченной группы

---- получивших брюшнотифозный комплекс Ви- и К-антигенов

---- - получивших брюшнотифозную спиртовую вакцину

-----получивших брюшнотифозную спиртовую вакцину, обогащенную

комплексом Ви- и К-антигенов

э

2

Известно, что S.typhimurium (0:1, 4,5,12) и S.typhi (0:9,12) имеют различные специфические О-антигены (кроме 0:12 фактора), что исключает возможность перекрестных связей между этими сероварами по О-антигену. Коммерческая брюшнотифозная спиртовая вакцина, содержащая общий 0:12 фактор, не оказывала терапевтического действия. Наряду с этим, данные серовары обладают общим поверхностным протективным К-антигеном, что, очевидно, и обеспечивало развитие перекрестного иммунитета при применении брюшнотифозных препаратов с К-антигеном.

В испытанной, нами аранжировке опытов наиболее эффективным было применение ударных доз препаратов в ранние сроки после заражения (от 7 до 21 дня).

На чувствительной экспериментальной модели длительного бактерионосительства, обусловленного генетически охарактеризованным мутантом S.typhimurium, было показано, что ведущую роль в иммунных реакциях играет поверхностный К-антиген сальмонелл.

Важное значение К-антигена в процессах иммуногенеза нашло подтверждение в сравнительных исследованиях по изучению иммунопрофилактической активности брюшнотифозных препаратов различных методов приготовления и различных по антигенному составу.

В этих опытах были использованы: разработанные нами комплекс Ви- и К-антигенов; Ви-антиген; О-антиген, полученный водно-феноловым методом из S.typhi штамм 0-901; брюшнотифозная спиртовая вакцина, обогащенная комплексом Ви- и К-антигенов и брюшнотифозная спиртовая вакцина без обогащения.

Мышей иммунизировали внутрибрюшинно 3-х или 4-х кратно с семидневными интервалами. Препараты применяли в дозах: - комплекс Ви- и К-антигенов - 5 мкг; Ви-антиген - 2 мкг: О-антиген - 1 мкг; спиртовая вакцин - г 2 м.ч,| микр. к.пеюк.; спиртовая вакцина, обогащенная комплексом В и- и г.- I%ег м и дозах 3.1 млн микр. клеток и 2.5 мкг. соответствен1 э Примьмсч.:-: дуэльных О- и Ви-антигенов в указанных доза* было огнсвзно и.-. - . .

тельном содержании в комплексном Ви- и К-препарате. определенном методом ВИЭФ. Контролем яеились неиммунизированные мыши.

1

о

Рис. 4. Иммунопрофилактическая активность различных брюшнотифозных препаратов.

Обозначения. Выделение БгурЫ из селезенки мышей, иммунизированных:

- - контроль (неиммунизированные мыши)

--- спиртовой брюшнотифозной вакциной, обогащенной

комплексом Ви- и К-антигенов О—а - спиртовой брюшнотифозной вакциной

----комплексом Ви- и К-антигенов

о—о - Ви-антигеном й—й- О-антигеном

Через 10 дней после окончания цикла иммунизации мышей заражали внут-рибрюшинно вирулентной культурой штамма БлурЫ Ту-2 в дозе 1 тыс. микр.

клеток.

Сравнительные опыты показали, что 3-х и 4-х кратная иммунизация мышей индивидуальными Ви- и О-антигенами. а также корпускулярной спиртовой вакциной, имеющей в своем составе, в основном, О-антиген, не оказывала влияния на персистенцию возбудителя. Как и у мышей контрольной группы, брюшнотифозные микробы интенсивно размножались и в больших количествах высевались из паренхиматозных органов с первой недели после заражения. Применение комплекса Ви- и К-антигенов или корпускулярной вакцины, обогащенной этим

комплексом, обеспечивало полное и стойкое очищение организма от инфицирующих бактерий. Брюшнотифозные бактерии не высевались из печени и селезенки на протяжении всего срока наблюдения - 8 недель.

Таким образом, в проведенных исследованиях было установлено, что комплекс Ви- и К-антигенов, а также спиртовая брюшнотифозная вакцина, обогащенная этим комплексом, наряду с протективными и иммунотерапевтическими свойствами обладают выраженной профилактической антибактериальной активностью. В использованных нами схемах и сроках иммунизации мышей и последующем их заражении вирулентной культурой S.typhi препараты с К-антигеном обеспечивали высокий санирующий эффект, предотвращая формирование бактерионосительства брюшнотифозных бактерий у инфицированных животных.

Детальные исследования были проведены по оценке безвредности новых препаратов.

Сравнительное изучение иммунологической безвредности полученного комплекса Ви- и К-антигенов и спиртовой брюшнотифозной вакцины, обогащенной этим комплексом, проводилось в соответствии с требованиями, предъявляемым! к вновь разрабатываемым вакцинам.

В опытах на мышах и морских свинках была установлена безвредность изучаемых препаратов. Показано, что комплекс Ви- и К-антигенов не обладает выраженными пирогенными свойствами и не усиливает пирогенности спиртовой вакцины при ее обогащении. Препараты не оказывают аллергизирую'щего и ко-онкогенного действия.

С целью изучения иммунологической безвредности препаоата была дополнительно изучена ГЗТ. Установлено, что брюшнотифозная вакцина, обогащенная комплексом Ви- и К-антигенов. вызывала слабую реакцию ГЗТ с максимумом подьема на 7-е сутки и снижением к 14-ым суткам.

В опытах острой и хронической токсичности, проведенных совместно с А.М.Харитоновой, при гистоморфологическом исследовании органов и тканей животных (головного мозга, иммунокомпетентных и паренхиматозных органов)

было установлено, что комплексный Ви- и К-препарат и спиртовая брюшнотифозная вакцина, обогащенная этим, комплексом, в оптимально иммунизирующих дозах не оказывают токсического действия. Наряду с этим, препараты вызывают перестройку иммунной системы организма, выражающуюся в резкой гиперплазии лимфоидного аппарата в сочетании с усилением макрофагальной реакции в генеративных центрах. Эти реакции особенно выражены при применении спиртовой вакцины, обогащенной комплексом Ви- и -К-антигенов, что полностью коррелируют с результатами изучения протективной эффективности указанных препаратов.

Данные экспериментальных исследований послужили основанием для перехода к следующему этапу - клиническому испытанию"тгрепэратов. Составлена и утверждена комитетом медицинских и иммунологических препаратов МЗ СССР "Инструкция по изготовлению и контролю вакцины спиртовой, брюшнотифозной, обогащенной комплексом Ви- и К-антигенов". Серии препаратов прошли контроль в специализированных лабораториях ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Изучение безвредности и иммунологической эффективности нового комплексного брюшнотифозного препарата, содержащего Ви- и К-антигены, на людях, включено в проект "Целевой комплексной программы НИР по разработке новых и усовершенствованию имеющихся вакцин на 1990-1995 гг." МЗ и АМН СССР.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризован разработанный новый брюшнотифозный препарат, содержащий комплекс поверхностных протективных антигенов, полученных с использованием метода одномоментной щадящей экстракции из бактериальной клетки.

2. Показано методами иммунологического и иммунохимического анализа (ИЭФ, ВИЭФ, РКА и др), что новый брюшнотифозный препарат содержит поверхностный К-антиген наряду с Ви-антигеном.

3. Комплексный препарат нетоксичен при испытании на мышах и кроликах при подкожном, внутрибрюшинном и пероральном применении. ДССпри под-

кожном введении превышала 2 мг, при внутрибрюшинном составляла 1.5-2 мг, при пероральном - более 5 мг на мышах и 100 мг - на кроликах.

4. Установлена выраженная протективная эффективность разработанного препарата. ЕДбо различных серий препарата при однократной подкожной иммунизации составляла 0.17 - 0.032 мкг. Препарат стимулирует развитие напряженного иммунитета и обеспечивает высокую выживаемость животных при заражении большими дозами вирулентной культуры - до 18 ЛД50 S.typhi. Установлены стабильные протективные свойства в условиях хранения препарата в жидком виде в течение 2-х лет.

5. Разработанный препарат может быть использован для обогащения коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакцины, уменьшая иммунизирующую дозу спиртовой вакцины в несколько десятков раз, по сравнению с обогащением Ви-антигеном (в 7-9 раз).

6. В соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к новым профилактическим препаратам, установлена на различных экспериментальных моделях практическая безвредность и нетоксичность препарата (при мор-фогистологическом исследовании и постановке острой и хронической токсичности), отсутствие колейкемогенных и аллергизирующих свойств комплекса Вии К-антигенов, а также вакцины спиртовой брюшнотифозной, обогащенной этим комплексом.

7. На моделях длительного сальмонеллезного бактерионосительства при использовании разработанного нами препарата показана возможность создания антимикробного иммунитета, обусловливающего снижение количества и сроков выделения вирулентных возбудителей из внутренних органов организма.

Работы, опубликованные по материалам диссертации.

1, Поверхностный К-антиген сальмонелл, перспективы его использования при разработке диагностических и профилактических препаратов //Сб. "Ши-геллезы, сальмонеллезы",- Л., 1984.- С. 114-115. (Соавт. Степанова Л.К., Сергеева Н.С.).

2. Агеева В Л. Изучение длительного бактериовыделения в эксперименте.

// "Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии",- Тез. докл. 8-ой Мечниковской межобл. конф. молодых ученых-медиков - Одесса. 1985.

3. Перспективы разработки и использования новой комплексной химической брюшнотифозной вакцины.// Тез. Республ. конф. "Актуальные вопросы практической иммунологии",- Таллин, 1986.- С. 45-46. (Соавт. Степанова Л.К., Белая Ю.А., Сергеева Н.С.)

4. Оценка иммунологической безвредности новой брюшнотифозной вакцины, содержащей 0-, Ви- и К-антигены.// Тез. докл. V съезда гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиол., микробиол., инфекционистов Узбекистана.- Ташкент, 1987.- С. 124. (Соавт. Степанова Л.К., Петрухин В.Г., Сергеева Н.С., Николаева Т.Н.).

5. Иммуногь.гчость и безвредность брюшнотифозной химической вакцины.// Тез. докл. 2 Всесоюзн. конф. по инфекционной иммунологии- Саратов, 1987,- С.100-101.(Соавт.Степанова Л.К.,Белая Ю.А.,Сергеева Н.С., Петрухин В.Г.).

6. Безвредность и иммунологическая эффективность новой комплексной брюшнотифозной вакцины.// Тез. докл. научн. конф. Пермского ИВС "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бак. препаратов".- Пермь, 1988.- С. 55-56. (Соавт. Степанова Л.К., Белая Ю.А., Сергеева Н.С., Петрухин В.Г.).

7. Комплексная химическая брюшнотифозная вакцина.// Тез. докл. I Всесоюзн. иммунологического съезда,- Сочи-Москва, 1989- С. 175. (Соавт. Степанова Л.К., Сергеева Н.С., Петрухин В.Г., Харитонова A.M.).

8. Исследование иммунологической безвредности и эффективности вакцин против дизентерии и брюшного тифа.// Тез. докл. V Республ. съезда эпидемиол., микробиол., инфекционистов и гигиенистов Эстонской ССР,- Таллин, 1987.- С. 19-20. (Соавт. Белая Ю.А., Степанова Л.К., Николаева Т.Н., Кудрявцева Л.Ю., Снегирева А.Е., Шапошникова Г.М., Петрухин В.Г.).

9. Безвредность и эффективность комплексной брюшнотифозной вакцины.// Тез. докл. научн. конф. "Иммунокоррекция при инфекционной патологии",- Л., 1988- С. 86. (Соавт. Степанова Л.К., Белая Ю.А., Сергеева Н.С., Харитонова

A.M., Снегирева A.E., Шапошникова Г.М.).

10. Штамм бактерий Salmonella typhimurium, используемый для длительное персистенции сальмонелл. АС N 1412500 22.03.88. (Соавт. Маракуша Б.И., Сте панова Л.К., Петровская В.Г., Белая Ю.А.).

11. Способ профилактики брюшного тифа. Положит, решение 27.04.90 ( выдаче авторского свидетельства, заявка N 4692768/13 (Соавт. Степанова Л.К. Белая Ю.А., Сергеева Н.С., Петрухин В.Г.).