Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологическая и генетическая характеристика возбудителей брюшного тифа, выделенных в различных природно-климатических регионах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологическая и генетическая характеристика возбудителей брюшного тифа, выделенных в различных природно-климатических регионах"

ск

#

/

на правах рукописи

САТОРОВ САИДБЕГ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРЮШНОГО ТИФА, ВЫДЕЛЕННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ РЕГИОНАХ

специальность 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт -Петербург. 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН, Санкт - Петербург

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор В.В. Тец

доктор медицинских наук А.Н. Суворов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ф.С. Носков

доктор медицинских наук, профессор Е.П. Сиволодский

доктор медицинских наук, профессор Г.Е. Афиногенов

Ведущая организация: Санкт -Петербургская педиатрическая академия

Защита диссертации состоится " //д 19^ года в ¿^часов на заседании диссертационного совета Д 106.05.01 по присуждению ученой степени доктора наук при НИИ военной медицины МО РФ.(195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, 4).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке НИИ военной медицины.

Автореферат разослан Х^"" Диуо^л/

Ученый секретарь Л ____

Диссертационного совета, I '

д.м.н., профессор с Ц^""*'"'' ГольдинР.Б.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Несмотря на достигнутые успехи в области биологии и медицины, прогресса в молекулярной биологии и генетике, брюшной тиф остается серьезной проблемой для здравоохранения всего мира. По данным ВОЗ, только в развивающих странах ежегодно регистрируются более 33 млн. случаев этой инфекции, из которых около 500 тыс. заканчиваются смертельно. Эти же страны представляют эпидемиологическую опасность и для экономически развитых государств, так как являются потенциальными источниками "завоза" возбудителя заболеваний через туристов и эмигрантов (Guckel С., 1995).

Высокие показатели заболеваемости в экономически отсталых странах обусловлены осложненными социально-экономическими, экологическими и санитарно-эпидемиологическими факторами, оказывающими отрицательное воздействие на организм людей. К таким факторам относятся неудовлетворительные бытовые условия, широкое использование недоброкачественных в санитарном отношении продуктов и воды, содержащих многообразные химические соединения - нитраты и пестициды. Химические соединения, используемые в сельском хозяйстве, попадая во внешнюю среду, накапливаются в воде, почве, растениях, в организме человека и животных. Объектом их воздействия, наряду с микрофлорой почвы и воды, становятся и патогенные для человека микроорганизмы, в том числе возбудители кишечных инфекций. В этой связи практически важным является оценка действия на микробы химических соединений, оказывающих наибольшее влияние на экологическую обстановку в данной местности (Schoen S.R., at. al., 1987). Известно, что в защите энтеропатогенных бактерии от отрицательного воздействия неблагоприятных факторов участвуют многочисленные специфические белки. Например, устойчивость некоторых представителей семейства Enterobacteriacea к алкилирующим агентам обеспечивается двумя гуанин метилтрансферазами, кодируемыми генами ada и ogt, а устойчивость к УФ и большинству химически мутагенных факторов регулируется продуктами генов umuD и umuC (Репу K.L., at. al., 1985; Yamada М., at. al., 1995). Показано, что значение специфических белков, кодируемых вышеперечисленными генами, для бактерий конкретного вида или серотипа неодинаково. В этом плане из представителей семейства Enterobacteriacea наиболее изученными являются S.typhimurium и E.coli (Abril N., at., 1995). Вместе с тем, несмотря на широкое распространение возбудителей тифо-паратифозных заболеваний в окружающей среде, генетические механизмы, обеспечивающие их длительную жизнеспособность вне организма человека, практически не изучены.

Широкое распространение брюшного тифа в значительной мере связано и с низкой эффективностью существующих микробиологических методов лабораторной идентификация сальмонелл, которые не всегда позволяют выявлять различные измененные варианты возбудителя. Измененные варианты число которых постоянно увеличивается затрудняют не только микробиологическую диагностику, но и вызывают клинически атипичные формы брюшного тифа, что осложняет постановку предварительного диагноза, своевременность выявления и изоляцию источника инфекции (Морозова Н.С., 1982; НоГег Е., а1. а!., 1990). В последнее время отмечено накопление в человеческой популяции штаммов 8.1урЫ, резистентных к различным химиотерапевтическим препаратам. До недавнего времени, считалось, что брюшнотифозные сальмонеллы менее устойчивы к антибактериальным препаратам, чем другие представители семейства ЕШепоЬайепасеае, а главным препаратом для лечения брюшного тифа являлся хлорамфеникол. Однако, в последнее время сообщается о нарастании удельного веса полирезистентных, в том числе, устойчивых к хлорамфениколу штаммов БЛурЫ (ЗЬеогеу Н.Б., а! а1„ 1993;1ЫЬогеМ.К, п. а1., 1996).

Особенно остро на сегодня эта проблема стоит в Таджикистане. По данным Таджикского госсанэпидцентра, начиная с 1992 года в этом государстве наблюдается ежегодное повышение показателя заболеваемости, причем с большим количеством летальных исходов. Последняя эпидемия длится более 2-х лег, и показатели заболеваемости стабильно сохраняются на одном уровне.

Вышеизложенное повышает социальное и общемедицинское значение исследований Б^урЫ, как в плане необходимости улучшения диагностики тифо-паратифозных заболеваний, так и с точки зрения исследования молекулярных механизмов регуляции свойств данного паразита. Следовательно, комплексное изучение в^урЫ актуально не только с научной, но экономической к социальной точек зрения.

ЦЕЛЬ настоящей работы состояла в сравнительном анализе микробиологических и молекулярно-генетических методов идентификации штаммов ЗЛурЫ, а также осуществлении генетического анализа хромосомной ДНК и отдельных генов сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам и вариантам .

ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

1. Провести эпидемиологический и микробиологический анализ штаммов 8.1урЫ, выделенных от больных брюшным тифом и бактерионосителей, изолированных из различных материалов: кровь, желчь, испражнения, моча.

2. Определить биологические особенности штаммов БЛурЫ, циркулировавших в разных экологических и климатических регионах. Провести дифференциацию штаммов Б.1урЫ по комбинации их фенотипическнх признаков.

3. Подвергнуть молекулярно - генетическому анализу представителей различных ферментоваров, фаговаров, а также морфологически и биохимически измененных вариантов Я^урЫ, используя для этой цели полимеразную цепную реакцию и риботипирование

4. Сконструировать штамм 8.1урЫ, мутантный по о^ - гену. Провести молекулярно-эпидемиологическое исследование распространенности о^ гена в штаммах сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам и вариантам. Изучить воздействие на сконструированный мутантный штамм различных физических и химических факторов, а также антибактериальных препаратов.

5. Разработать современный ускоренный способ идентификации штаммов сальмонелл с использованием молекулярно-генетических методов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА работы состоит в том, что:

1. Впервые дана комплексная сравнительная характеристика биологических свойств возбудителей брюшного тифа, циркулировавших у людей, проживающих на территориях с различными природно-климатическими условиями. Предложен набор субстратов для тонкой дифференцировки ферментативной активности штаммов Б^урЫ.

2. Впервые проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ хромосомных ДНК штаммов 8.1урЫ, выделенных в разные годы, от больных и бактерионосителей, из различных материалов (кровь, желчь, моча, испражнения) в разных природно-климатических территориях.

3. Впервые разработан ускоренный молекулярно-генетический способ индикации и идентификации морфологически, биохимически и серологически типичных, а также измененных вариантов сальмонелл - возбудителей сальмонеллезных и тифо- паратифозных заболеваний посредством полимеразной цепной реакции.

4. Впервые сконструирован штамм 8.1урЫ, мутантный по о^ -гену и показано, что ген регулирует не только адаптивный ответ на алкильное повреждение, но и участвует в

формировании устойчивости к другим физическим и химическим мутагенным агентам, а также к различным антибактериальным препаратам.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

Путем интегративного мутагенеза создание штамма S.typhi, мутантного по ogt -гену позволило выяснить генетические механизмы, обеспечивающие резистентность данных бактерий к различным факторам окружающей среды. Показано, что штаммы S.typhi, дефектные по ogt - гену, приобретают гиперчувсгвительность к различным физическим и химическим факторам, в том числе к различным противомикробным препаратам. Установлено, что некоторые пестициды в субингибирующих концентрациях влияют на процесс взаимодействия штамма S.typhi, дефектного по ogt-гену с антибиотиками. Ключевая роль белка, кодируемого ogt - геном, в репарационных процессах S.typhi указывает на перспективность создания новых лекарственных препаратов, специфически ингибирующих данный бактериальный белок.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

Разработана ускоренная идентификация сальмонелл методом экспресс-ПЦР, который позволяет за достаточно короткий срок (3-4 часа) выявлять и дифференцировать как типичные, так и морфологически и биохимически измененные варианты сальмонелл. Ценность данного метода заключается в том, что наряду с типовой или внутрисеротиловой дифференцировкой, он дает возможность сравнения различных штаммов с целью выяснения их эпидемических и эволюционных связей. Усовершенствована схема биотипирования брюшнотифозных сальмонелл, в результате чего повышено качество внутрисеротиповой дифференцировки S.typhi. Полученные результаты могут быть использованы как в бактериологической, так и в эпидемиологической практике.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Сальмонеллы, циркулирующие в различных регионах Центральной Азии различаются по ряду биологических признаков, которые необходимо учитывать для повышения эффективности диагностических процедур и эпидемиологических исследований. Среди брюшнотифозных сальмонелл, изолированных в Таджикистане, Узбекистане и России, наблюдаются индивидуальные вариации чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Штаммы циркулирующие в Таджикистане характеризуются повышенной устойчивостью к антимикробным препаратам, в то время как в России распространены чувствительные биовары.

2. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК штаммов сальмонелл характеризуется специфичностью и повторяемостью для культур конкретного серовара или фаговара.

Хромосомная ДНК сальмонелл, как внутри одного серотипа, так и у штаммов различных серотипов, отличается по количеству образовавшихся ДНК фрагментов и паттернам их распределения, что указывает на диагностическую ценность экспресс-ПЦР.

3. Экспресс-ПЦР позволяет выявлять и дифференцировать не только характерные бактериальные штаммы, но морфологически и биохимически атипичные варианты, а также сальмонеллы, потерявшие антигенную специфичность, что указывает на преимущество ПНР диагностики перед существующими классическими методами.

4. Паттерны, полученные в результате риботипирования хромосомной ДНК тетрациклинустойчивых штаммов БфрЫ, выделенных из различных эпидочагов, принадлежащих одному фаговару и ферментовару, отличаются между собой по размерам гибридизующихся фрагментов. Возможность выявления различных риботипов у сальмонелл одного фаговара, ферментовара и антибиотиковара необходимо учитывать при проведении эпидемиологических исследований вспышек сальмонеллезных и тифо-паратифозных заболеваний.

5. Штамм 8.1урЫ, мутантный по гену о$г£ характеризуется повышенной чувствительностью к физическим и химическим агентам, а также к антибиотикам, т.е. метилтрансфераза, кодируемая этим геном, участвует не только в регуляции адаптивного ответа, но и способствует повышению устойчивости к антибактериальным препаратам. Субингибирующая концентрация отдельных пестицидов влияет на процесс взаимодействия штамма ЙЛурЫ, дефектного по ое^-гену с некоторыми антибактериальными препаратами. В присутствии субингибирующей концентрации пестицида возрастает чувствительность мутантного штамма к антимикробным препаратам.

ДОСТОВЕРНОСТЬ полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, классический метод фингерпринтирования, риботипирования, ДНК-ДНК гибридизация), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2. Проведением статистической обработки полученных данных, общепринятыми методами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции, посвященной )00-летию М.Улугбека "Проблемы медицины" (Самарканд, 1994), на международном

симпозиуме, посвященном памяти академика Баева (Пущино, 1996), на международном симпозиуме "Новые методы стандартизация в микробиологии" (Кощице, Словакия 1996), на "VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов" (Москва, 1997), научных конференциях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1996, 1997, 1998), на совместном заседании проблемной комиссии по микробиологии Санкт-Петербургского государственного медуниверситета имени акад. И.П.Павлова и отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1998).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 152 страницах машинописного текста, включающего введение, описание материалов и методов исследований, 4 главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов, заключение, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками, указатель литературы содержит 317 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использован 251 штамм S.typhi, выделенный в 1992 - 1995 гг., от больных брюшным тифом и бактерионосителей, бактериологическими лабораториями, на различных территориях Таджикистана, Узбекистана и России. Кроме того были использованы: 5 -музейных штаммов S.typhi; по 2 штамма Salmonella paratyphi A; Salmonella paratyphi В; Salmonella java; Salmonella infantis; штамм E.coli DHa5; мутантный штамм S.typhimurium YG7108; плазмида pUC18.

Музейные штаммы и морфологически атипичный вариант S.typhi, были предоставлены профессором Ю.П. Солодовниковым из Центрального института эпидемиологии МЗ РФ (г. Москва), мутантный штамм S.typhimurium предоставлен доктором T.Nohmi из национального института здравоохранения (Токио, Япония).

Сальмонеллы выращивали на МПБ, L-бульоне, 1% МПА, средах: Эндо, Левина и висмуг-сульфит агаре в течение 18-24 часов при 37° С. При культивировании в жидкой среде пробирки и колбы постоянно перемешивались за счет встряхивания.

Сахаролитические свойства бактерий оценивали на средах Гисса в отношении углеводов - глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, рамнозы, ксилозы, арабинозы; спиртов - манита,

сорбита, инозита, дульцита. Результаты учитывали ежедневно в течение 21 дня инкубации при 37° С.

Декарбоксилирование лизина оценивали на среде, предложенной Фальковым, утилизацию цитрата определяли по росту на цитратном агаре Симмонса. О способности расщеплять мочевину судили по росту на 1% мочевине с индикатором бромтимолблау.

Подвижность бактерий оценивали при культивировании на 0,3% агаре после засева в пробирку с полужидком агаре и инкубации при 37° С.

На разных этапах исследования проводили микроскопирование окрашенных по Граму препаратов, при увеличении х900. В мазках оценивали наличие характерных Грамотрицателъных палочек.

Антигенную характеристику культур устанавливали по общепринятой схеме агглютинации на стекле с соответствующими монорецепторными сыворотками к О, Н и Vi антигенам производства Санкт-Петербургского института вакцин и сывороток.

Фаготипирование культур проводили по международной схеме, разработанной в Тбилисском НИИВС (1974). Фаговар устанавливали по определенному рисунку лизиса культуры типовыми фагами. Определение фаговара проводили в соответствии с разработанными схемами ( Felix ЕД938).

Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли в соответствии с приложением 1 к приказу МЗ СССР № 250 "Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам" от 13 марта 1975 г. Использовали два метода: метод разведения в твердой питательной среде и метод диффузии в агаре с применением бумажных дисков.

Методом разведения в твердой питательной среде определяли МИК противомикробных препаратов: гентамицина (Gm), полимиксина (Рт), грамурина (Grm), палина (PI), рифампицина (Rm), нитроксолина (Nts), неомицина (Nm), вибромицина (Vm), цефамизина (Zm), тетрациклина (Тс), тобрамицина (Тт) ампициллина (Ар), фуразолидона (Phd), тримегоприма (Тшр) и сульфадиметоксина (Sdm).

Методом бумажных дисков, были определены чувствительность культур к 9 антибиотикам: гентамицину (Gm), хлорамфениколу (С1), мономицину (Mm), канамицину (Km), стрептомицину (Sm), тетрациклину (Тс), полимиксину (Рт), карбенициллину (Кс), ампициллину (Ар).

Чувствительность S.typhi к пестицидам определяли методом серийного разведении в МПБ. Изученные пестициды: децис (2,5% к.э.), талсгар (10% к.э.), кельтан (18% к.э.), рогор

(40% к.э.) и вертемекс (1,8% к.э.) предоставлены отделом государственных испытаний средств защиты растений Всероссийского института защиты растений (г. Санкт-Петербург).

Рутинные генно-инженерные процедуры, такие как выделение плазмидной и хромосомной ДНК, гидролиз ДНК рестрикционными ферментами, лигирование, трансформацию, гибридизация ДНК, перенесенной на нейлоновые фильтры из агарозного геля, осуществляли в соответствии с протоколами из руководства (Maniatis D., at. al., 1982; Sambrook J. at. al., 1989). Детекцию гибридизующихся ДНК фрагментов осуществляли с использованием ДНК - зондов, меченных дегоксигенином согласно протоколам к наборам фирмы Boehringer Manheim GeniusTM DNA Laelling and Hybridization kit или Multicolor DNA detection kit (Германия).

Электрофорез ДНК проводили в 1,2% агарозе фирмы Sigma (США) в горизонтальном пластинчатом аппарате с использованием TBE (трис-боратный) буфера. Время электрофореза и силу тока выбирали в зависимости от целей эксперимента. Для визуализации ДНК в УФ лучах гель после электрофореза окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в электродном буфере 30 минут. Фотографию проводили в УФ свете. Маркерами для расчета молекулярных весов исследуемых фрагментов ДНК служила ДНК фага лямбда.

Полимеразную цепную реакцию проводили по Суворову А.Н., и соавт., 1995. Суть метода заключалась в постановке ПЦР без предварительного выделения хромосомной ДНК бактерий. При этом бактериальную культуру, отмытую в физиологическом растворе суспендировали в буфере, содержащем 0,5% тритона Х-100 (Sigma, USA) и прогревали в течение 5 минут при температуре 93 С. По 5 микролитров прогретой бактериальной культуры добавляли к реактивам для ПЦР, после чего осуществляли амплификацию по программе, предлагающей 30 циклов (93° С -1мин„ 45° С-1миню., 72° С-2 мин.) на аппарате фирмы Techne (Великобритания). ПЦР проводилась с одним ДНК праймером: LPI или LE21.

Эпидемиологический анализ заболеваемости брюшным тифом бьщ проведен на основе эпидемиологической характеристики имеющихся в коллекции штаммов S.typhi.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась по К.Н. Бирюковой, 1962 (18) и П.Ф. Роюггскому, 1973 (83).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для решения задач, поставленных в данной диссертационной работе нами был проведено эпидемиологическое, микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование 251 штамма S.typhi, полученных от людей, больных брюшным тифом и бактерионосителей. Среди 251 изученных штаммов S.typhi -222 (86,8%) изолированы от больных и 29 (13,2%) от

бактерионосителей. Коллекция культур из Таджикистана состояла из штаммов, выделенных из спорадических и эпидемических случаев в г. Душанбе, Кургантюбинских и Кулябских областях, а также районов Гиссарской долины; из Узбекистана -штаммы, выделенные в Бухарских, Самаркандских и Сурхандарьяйнских областях. В Российскую коллекцию культур входили штаммы, выделенные во время спорадических случаев в Москве, Тульских и Ростовских областях.

Среди изученных штаммов, 173 (70%) составляли гемокультуры, 71 (28,3%) копрокультуры, 4 штамма были выделены из уринокультуры и 3 из биликультуры.

Распределение культур S.typhi в зависимости от даты выделения позволяет предполагать, что в условиях Таджикистана и Узбекистана брюшной тиф встречается круглогодично. Месяцами эпидемического подъёма являются март-сентябрь с пиком заболеваемости в июле и августе. В России эти показатели несколько отличаются от таковых в центральноазиатских странах. Данные, о дате выделении культур, позволяют предполагать, что месяцами эпидемического подъёма в России являются июль-ноябрь с пиком заболеваемости в октябре.

При анализе заболеваемости в различных возрастных группах, были выявлены определенные различия как в пределах одного региона, так и между регионами. Распределение культур в зависимости от возраста показало, что в Таджикистане и Узбекистане чаще болеют в возрасте 15-40 лет. В более старших возрастных группах и среди детей до 14 лет заболеваемость снижается. В России, все культуры принадлежали людям в возрасте 21-40 лет.

Наибольшее число штаммов, принадлежащих бактерионосителям, было изолировано в Таджикистане. Полученные данные свидетельствуют, что в Таджикистане бактерионосительство в основном формируется в возрасте 21-40 лет (64,0%), что значительно чаще, чем в возрасте до 20 лет (7,4%) и у лиц старше 50 лет (3,7%).

Распределение S.typhi в зависимости от пола показало, что в Таджикистане и Узбекистане брюшным тифом чаще поражаются мужчины (67% и 60% -соответственно). По России частота поражаемости брюшным тифом составляла среди мужчин (56,0%).

Результаты проведенного нами исследования позволяют заключить, что в структуре заболеваемости брюшным тифом в регионах с различными природно-климатическими и социально-бытовыми условиями прослеживается некоторые различий. Высокий уровень заболеваемости в течении нескольких месяцев в среднеазиатских регионах объясняется активизацией водного фактора передачи инфекции, реализуемого при массовом купании и употреблении для питья воды из открытых водоемов. Более высокая заболеваемость брюшным тифом среди лиц мужского пола, также объясняется доминирующим водным фактором

инфекции, так как основной контингент купающихся людей в водоемах в центральноазиатских республиках в жаркие месяцы года составляют именно мальчики и мужчины,

На сегодня показано, что ферментативная активность, антигенная структура, чувствительность к противобактериальным препаратам и некоторые другие свойства микроорганизмов зависят от ряда внутренних (защитных факторов макроорганизма) и внешних факторов. В частности, нами на предварительном этапе исследования был показан, что индивидуальный характер чувствительности стафилококков к антибиотикам и бактериофагам зависит от источника выделения и биотопа. Известно, что изменения биохимических свойств и антигенной структуры S.typhi затрудняют не только проведение микробиологической диагностики, но и вызывают клинически атипичные формы брюшного тифа. Соответственно, такие больные поздно распознаются и, выделяя возбудителей в больших количествах, представляют эпидемиологическую опасность для окружающих (Иванова И.П., 1988; Корвяков Е.Р., и соавт., 1990). В этой связи, чрезвычайно важным является оценка наиболее значимых биологических свойств штаммов S.typhi, изолированных в регионах с различными природно-климатическими условиями. Изучение биологических свойств состояло в сопоставлении их антигенной структуры и ферментативной активности исследуемых штаммов и их отношения к антибактериальным препаратам и международным наборам бактериофагов. Изучение антигенной структуры показало, что исследуемые штаммы не всегда обладают полным антигенным набором. Во всех регионах циркулируют О- и Vi- инагглютинабельные штаммы. Чаще встречаются S.typhi, потерявшие Vi антиген. Эти штаммы, в свою очередь характеризовались потерей чувствительности к международным наборам бактериофагов и наличием достаточно большого количества нетипирумых штаммов. Учитывая тот факт, что серотипирование и фаготипирование по прежнему остаются главными способами идентификации и вутрисеротиповой дифференцировки S.typhi в условиях практических лаборатории, данный факт еще раз констатирует недостаточную эффективность основных микробиологических методов диагностики брюшного тифа.

Для более детальной внутрисеротиповой дифференцировки штаммов S.typhi мы усовершенствовали общепринятую схему их биотипирования путем расширения набора углеводов (ксилоза, арабиноза) за счет дульцита и теста на сероводородообразование, с учетом времени проявления ферментативной активности. Так, по ферментации ксилозы и арабинозы с учетом срока проявлении ферментативной активности, штаммы, выделенные в Таджикистане, Узбекистане и России, подразделены на 8 ферментоваров.

Изучение ферментации ксилозы, арабинозы и дульцита с учетом срока проявлении ферментативной активности, позволило подразделить исследуемые штаммы на 14 ферментоваров. При таком способе классификации, штаммы, выделенные в Узбекистане и в Таджикистане, были отнесены преимущественно к ферментовару 1. Штаммы изолированные в России в основном характеризовались как ферментовар 9.

Использование набора, включающего 3 углевода (арабинозу, ксилозу и дульцит) и учет сероводородообразования, позволили подразделить штаммы, выделенные в различных регионах на еще большее количество ферментоваров- на 23, среди которых преобладали: 1-й, 14 -й, 7-й и 18 -й. В данном случае штаммы, изолированные в Узбекистане принадлежали к ферментоварам 1-10, в Таджикистане с 11 по 19, а в России только к четырем ферментоварам: 7-му, 21-му, 22-му и 23-му.

Таким образом, изучение биохимических свойств штаммов 8.1урЫ, циркулирующих в различных природно-климатических регионах, показало, что дифференциация штаммов по ферментации ксилозы, арабинозы, дульцита и пробе на сероводородообразование с учетом срока проявления ферментативной активности позволяет дифференцировать биовары, характерные для данного исследуемого региона более четко, чем при оценке ферментативной активности культур только по отношению к ксилозе и арабинозе.

С целью определения широты распространения устойчивости к микробным препаратам, штаммы были изучены методами серийных разведений.

При определении МИК антибиотиков обнаружено некоторое различие между штаммами в зависимости от мест (территории) выделения. Так, все штаммы, изолированные в России, были чувствительны ко всем использованным препаратам (МИК 1-8мкг/мл). Среди культур БЛурЫ, изолированных в Таджикистане и Узбекистане, встречались штаммы, для которых МИК отдельных антибиотиков (стрептомицина и тетрациклина) составляла 16-20 мкг/мл.

Результаты тестирования методом дисков, чувствительности брюшнотифозных культур изолированных в Таджикистане, показали, что среди изученных штаммов встречаются как устойчивые, так и чувствительные биовары. Штаммы, полученные от больных, несколько отличались от таковых, выделенных от бактерионосителей. Брюшнотифозные штаммы, выделенные от больных больше, чем в половине случаев (52,3%) были" устойчивы только к 1 антибиотику (рис. 1). Штаммы, полученные от бактерионосителей, были полирезистентными и более чем, в 50,% случаев проявляли устойчивость одновременно к 2 и 3 антибиотикам. Среди культур, полученных от бактерионосителей, встречались штаммы (7,4%) устойчивые

больные

бактерионосители

обозначение 0 стрептомицин 0 тетрациклин ЕЗполимиксин □ гентамицин Иампецилин Ыхлорамфеникол

Рис. 1. Чувствительность к антибактериальным препаратам штаммов 8.1урЫ, полученных от больных и бактерионосителей

одновременно к 4 антибиотикам, а среди штаммов, полученных от больных, таковые не обнаружены.

СЛеДУСТ ™ « полученных от больных брюшным тифом, штаммы

З-ЗДЬ устойчивые к ампициллину и хлорамфениколу не встречались. Здесь наши данные не совпадают с результатами, полученными другими авторами ( СотШа У.ш., * а] 1992- На55ап М„ 1995; ит80„ 8.М., 1995), которые сообщают о преобладании полирезис™ых штаммов среди сальмонелл полученных от больных. По - видимому, это является отлич1Гтельной особенностью популяции брюшнотифозных сальмонелл, изолированных в Таджикистане где в

последние годы, в связи со сложной экономической ситуации отражен широкий Доступ населения к антибиотикам.

Результаты изучения чУ«льнос™ брюшнотифозных сальмонелл к фапш, указывают на ТО что каждый регион характеризуй наличием специфического фаговара. Так, фаговары Е7, С и 40 встречались только среди культур, изолированных в Таджикистане ВЗ и 27 - в Узбекистане, а фаговар 48 только в России. В Таджикистане чаще острее фаг0Вары А и Е7 в Узбекистане преобладающим является только один фаГОваР - А. В России более половин^ брюшнотифозных культур характеризовались как ФаГОВар Е1 (51,6%) „ несколько реже встречался фаговар А (25,8%).

Среди штаммов, поденных от бактерионосителей, встречались фаговары ЕЗ и МЗ которые не были обнаружены среди культур, полученных от больны* ни в Таджикистане ни в' одном из других регионов. Эти штаммы, в 29,6% принадлежали к фаг0Еару Е]> тогда как'

культур, полученных от больных в Таджикистане, этот фаговар отсутствовал

В целом, резюмируя результаты изучения наиболее значимых биологических свойств брюшнотифозных сальмонелл, следует отметить, что несмотря на некоторое преимущество предложенной нами схемы дифференцировки штаммов БлурЫ - повышение процента типируемых (типируемости) штаммов, и существование различных высокочувствительных серологических методов, данные способы диагностики брюшного тифа не отвечает требованиям клиницистов и эпидемиологов. С одной стороны это связано со сроком необходимого для окончательной идентификации возбудителя - до 2-3 недель. Во вторых: существующие современные микробиологические и серологические методы трудоемки и требуют больших финансовых расходов.

В связи с этим, была проверена возможность использования экспресс-ПЦР и проведена оценка ее эффективности. Молекулярно - генетическому анализу были подвергнуты хромосомная ДНК сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам, фаговарам, ферментоварам и типам антибиотикорезистентносги. При этом, были использованы универсальные ДНК праймеры: 1Р1 или 1.Е21 с олигонуклеотидными последовательностями -5'ССССТСТАСАССЮСАА и 5'(Х}АТССОА(ХЮТСХК^СК}ТТСТ -соответственно. При способе постановки реакции с использованием одного универсального (случайного) праймера, размеры амплифицированных фрагментов ДНК зависят от расстояния между участками генома сальмонелл, гомологичными ДНК праймеру. В результате такой ПЦР в зависимости от применяемого праймера обычно образовывались от 1 до 5 и более фрагментов, легко выявляемых после гель-электрофореза в агаре.

Анализ электрофореграмм продуктов экспресс-ПЦР показал, что количество образовавшихся ДНК фрагментов является постоянным для культур конкретного серотипа или варианта, что позволяет дифференцировать штаммы сальмонелл разных серотипов и вариантов между собой. Результаты экспресс-ПЦР ДНК эпидемически несвязанных штаммов БЛурЫ одного фаговара (фаговар Е1), выделенных в разные годы, показали, что все штаммы одного фаговара вне зависимости от давности выделения образовывали одинаковые количества амплифицированных ДНК фрагментовов. Не отличались друг от друга и продуктов ПЦР ДНК штаммов сальмонелл одного фаговара (фаговар А), выделенные в разных природно-климатических регионах. Обращают на себя внимание различия в электрофореграммах продуктов ПЦР ДНК, штаммов относящихся к разным фаговарам. На представленной электрофореграмме (рис. 2) видно, что штаммы фаговаров 27, 43, 46, и МЗ (дор. 4,2, 3, 5 и 6, соответственно), по паттерну амплификации ДНК с использованием праймера ЬЕ21 четко различаются между собой. Наряду с общими амплификациоными бендами, нами наблюдались фрагменты,

различающиеся по элекгрофоретической подвижности. Наличие общих бендов возникающих при амплификации ДНК из различных штаммов, вероятно, обусловлено амплификацией наиболее консервативных участков геномов данных штаммов. Идентичными оказались результаты ПЦР ДНК штаммов ЕЗ, Е7 (дор. 8 и 9, соответственно). ДНК штаммов, лизирующихся только

Рис. 2. Элекфофореграмма продуктов ПЦР хромосомной ДНК штаммов S.typhi принадлежащих различным фаговарам, с использованием праимсра LE21.

поливалентным О-фагом (W-форма сальмонелл), полилизабельного штамма (Imperfekt) и паратифа В (дор. 1, 7 и 10, соответственно) с пранмером LE21 не амплифицировались.

Полученные результаты показывают, что применение одного праймера, в данном случае LE21, позволяет идентифицировать и различать штаммы S.typhi, принадлежащие к специфическим фаговарам: 43, Fl, МЗ и т.д. Дальнейшая дифференциация подфаговаров, в данном случае ЕЗ от Е7, а также штаммов, ДНК которых не амплифицируется, требует подбора дополнительных специфических праймеров. Идентичность электрофореграмм продуктов ПЦР хромосомных ДНК сальмонелл, принадлежащих подфаговарам, по-видимому, можно объяснить гомологичностью их ДНК использованному праймеру.

В результате постановки ПЦР хромосомных ДНК сальмонелл разных серотипов (рис. 3) было установлено, что использованные ДНК праймеры хорошо амплифицирует хромосомную ДНК штаммов S.typhi (дорожка 2) и" • S.paratyphi Л (дорожка-3), образовывая по несколько четких полос. При анализе обнаружено, что ДНК этих сальмонелл характеризуются строгой индивидуальной специфичностью. Они отличались количеством и электрофоретической мобильностью амплификационных ДНК фрагментов, что позволяло легко дифференцировать эти виды даже без предварительной серодиагностики. В отличие от этих видов сальмонелл, ДНК

S.infantis и S.paratyphi В с применением универсальных праймеров не амплифицировались, что позволяет рассматривать данный подход как перспективный способ групповой дифференцировки.

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ГЩР хромосомной ДНК сальмонелл различных серотипов с использованием праймера ЬЕ21.

Анализ результатов последующих исследований показал, что с помощью метода экспресс -ГЩР можно идентифицировать не только морфологически или биохимически характерные штаммы сальмонелл, но и выявлять штаммы, отклоняющиеся по биологическим свойствам от видовой характеристики, в том числе и бновары, не обладающие полным антигенным набором, идентификация которых необычайно сложна.

Учитывая тот факт, что некоторые свойства микроорганизмов, зависят от мест обитания т.е. -биотопа, нами были исследованы культуры S.typhi, выделенные из различных материалов. Полученные результаты, позволяют предполагать, что временное пребывание сальмонелл в макроорганизме не влияет на их генетическую организацию, т.к. нами не выявлены различия в электрофореграммах продуктов экспресс-ПЦР хромосомной ДНК штаммов, принадлежащих одному фаговару, выделенных из гемокультуры, копрокультуры, биликультуры и уринокультуры.

Анализ литературы, посвященной распространенности антибиотикоустойчивых штаммов сальмонелл, свидетельствует, что в Индии, где регистрируется высокая заболеваемость брюшным тифом, хлорамфениколустойчивые культуры S.typhi встречаются несколько чаще, чем в других государствах (Rodriques С., at. al., 1992; STaherhenval U., at. al., 1992). С целью обнаружения каких-либо генетических особенностей этих штаммов, нами были сопоставлены электрофореграммы продуктов экспресс-ПЦР хромосомной ДНК S.typhi; выделенных в Таджикистане устойчивых к одному (2 штамма) и к двум антибиотикам (1 штамм), а также

штамма, завезенного из Индии в Москву. Установлено, что ДНК штаммов, отличающихся по спектру устойчивости к антибиотикам, выделенных в Таджикистане и хлорамфениколустойчивого штамма, завезенного из Индии, принадлежащих к одному фаговару, дают сходные картины амплификации.

Таким образом, использованные при постановке экспресс-ПЦР, универсальные (случайные) праймеры, эффективно амплифцировали хромосомную ДНК S.paratyphi А и различных фаговаров S.typhi, не амплифицируя ДНК сальмонелл некоторых других серотипов. Применение универсальных праймеров, также не выявило каких-либо различий в электрофореграммах продуктов ПЦР хромосомной ДНК штаммов, принадлежащих одному фаговару, но с различными типами аш-ибиотикорезистентности. В высокой разрешающей способности ПЦР метода пег сомиешт м для получения положительных результатов во всех случаев необходим подбор дополнительных специфических праймеров, о чем свидетельствуют данные полученными исследователями (Суворов А.Н., 1997; Шагинян И.А., 1996; 1997; Song J.H., at. al., 1994; Sharma K.V.m at. al., 1995) при ПЦР-анализе ДНК различных патогенных и условпо-патогенпых бактерий. В связи с этим, на следующем этапе нами была проверена эффективность гибридизационного анализа при межсеротиповой идентификации сальмонелл и внутрисеротиповой дифференцировке штаммов S.typhi.

Следует отметить, что в отдельных случаях, данные экпспресс-ПЦР коррелировали с данными классического фингерпринтирования хромосомных ДНК и риботипирования. Так, отличающееся друг от друга электрофореграммы продуктов гидролиза хромосомной ДНК S.typhi и S.java, были сопоставлены с результатами их риботипирования (рис. 4. А и В), когда в

Рис. 4. Рестрикция хромосомной ДНК сальмонелл эндонуклеазой ЕсоШ (А). Схема гибридизации фрагментов рестрикции хромосомной ДНК с зондами на 238 РНК (В).

качестве зонда использовался фрагмент гена 23в РНК рибосомального оперона Е.соН, меченный дегоксигеннном. В результате обнаруживали гибридизующиеся ДНК фрагменты, соответствующие местам локализации генов, кодирующих синтез рибосомальной РНК. Так, ДНК штаммов 5.1урЫ, принадлежащих фаговару А (дор: 2 и 3), давали по 6 гибридизующихся фрагментов одинаковой элекгрофоретической подвижности, но отличающиеся от гибридизационной картины Б^ауа (дор.1).

Наибольший практический интерес представляют результаты риботипириования штаммов 8.1урЫ, принадлежащих одному фаговару и ферментовару, но устойчивых к разным антибиотикам -стрептомицину или тетрациклину. Стрептомицинустойчивые штаммы, были выделены из одного, а тетрациклинустойчивые из разных эпидемических очагов. При гибридизации ДНК у всех штаммов, нам удавалось увидеть по 6 гибридизующиеся фрагментов. ДНК всех трех устойчивых к стрептомицину штаммов, изолированных из одного эпидемического очага, характеризующиеся как фаговар Е7, ферментовару 1, давали гомологичные гибридизующиеся фрагменты. Вместе с тем, ДНК трех резистентных к тетрациклину эпидемически несвязанных штаммов, также принадлежащих к фаговару Е7 и ферментовару 1, давали гибридизующиеся фрагменты различных размеров, отличающиеся как между собой, так и от стрептомицинустойчивых образцов.

Таким образом, нами был осуществлен молекулярно-генетический анализ штаммов сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам, фаговарам, биоварам, а также морфологически и биохимически измененных вариантов 5лурЫ, с использованием в качестве основного подхода экспресс -ПЦР бактериальной ДНК. Данный подход к идентификации сальмонелл, в частности внутрисеротиповой дифференцировке Б^урЫ, характеризуется простотой и, в целом, коррелирует с результатами других диагностических подходов, таких как серодиагностика, ДНК фингерпршггирование и риботипирование. Результаты, полученные при использовании ПЦР и серологических реакции не всегда коррелировали между собой. Чаще наблюдалась корреляция между результатами ПЦР и фаготипированием. Сопоставляя данные ПЦР анализа с данными серодиагностики следует учитывать, что эти диагностические подходы характеризуют возбудитель заболевания с различных сторон: ПЦР-диагностика - по характеру специфических последовательностей ДНК, гомологичных праймеру, а серодиагностика опирается на анализ одного или, реже, нескольких антигенов, синтез которых обусловлен ограниченным количеством генов. В перспективе следует учесть, что ценность ПЦР -диагностики заключается не столько в возможности типовой и видовой идентификации, а в

сравнении различных штаммов с целью выяснения эпидемических и эволюционных связей между ними.

Преимуществом использованного нами метода экспресс-ПЦР также является быстрота межсеротиповой идентификации и внутрисеротиповой дифференцировки (3-4 ч.), включая индикацию морфологически и биохимически измененных вариантов. Такого рода диагностику можно осуществлять без больших материальных затрат, при наличии ПЦР -аппарата в любых практических лабораториях. Она не требует сложного обучения персонала, а все необходимые компоненты поставляются в виде коммерческих готовых наборов для ПЦР различными биотехнологическими компаниями.

¡ Наряду ■ с экспресс-ПЦР, немаловажное диагностическое значение имеет гибридизацнонный анализ хромосомной ДНК сальмонелл. Данный метод позволяет разделять штаммы конкретного фаговара на риботипы, которые можно рекомендовать как "генетические маркеры" в эпидемиологических исследованиях. Использование современных технологий, позволяющих избежать гибридизацнонный анализ при помощи неудобных для исследователя радиоактивных зондов, а также ускорить сам процесс гибридизации, позволяет рассматривать риботипирование наряду с экспресс-ПЦР как перспективный методологический прием в современной эпиддиагностике. Использование ПЦР анализа и риботипирования совместно с современным компьютерным анализом позволит в недалеком будущем создавать информационные банки данных, соответствующие компьютерным образам электрофоретического распределения ПЦР фрагментов, полученных в результате анализа бактериальных штаммов различных видов и серотипов. Такой подход позволит существенно упростить и ускорить существующую на сегодня эпиддиагностику.

Учитывая медицинскую важность исследовании возбудителей тифо-паратифозных заболеваний в цешгральноазиатских регионах, обусловленную неадвекатной санитарно-гигиенической обстановкой и высокой обсемененностью данными бактериями окружающей среды, чрезвычайно важным является выяснение генетических механизмов, обеспечивающих длительную жизнеспособность брюшнотифозных сальмонелл во внешней среде.

Одним из важных условий, выживания бактерий во внешней среде является их способность ликвидировать повреждения ДНК, возникающих при действии различных химических и физических факторов. В подержании постоянства нуклеотидной последовательности ДНК активное участие принимает система защиты от алкилирующих агентов. Существует несколько механизмов защиты от алкилирующих агентов, контролирующих различными генами. Одним из таких генов, участвующих в процессе репарации, является ген,

кодирующий метилтрансферазу. Однако, в литературе нет данных, о данном гене S.typhi и его значении в системе механизмов защиты бактерий от внешних факторов, таких как алкилирующие химические агенты, ультрафиолетовое облучение и т.д. Известно лишь, что ogt ген у S.tryphimurium, в отличие от E.coli. играет ключевую роль в репарационных процессах (Abril N., at. al., 1995; Yamada M., at. al., 1995). В связи с этим, отдельной задачей являлось изучение роли ogt гена S.typhi в процессах репарации и процессах, обеспечивающих устойчивость S.typhi к факторам окружающей среды. Для изучение функции ogt гена S.typhi была использована методика интеграционного мутагенеза. Донором дефектного ogt гена, служил штамм S.typhimurium.

На первом этапе работы, была сделана попытка получения мутантов S.typhi с использованием линейного фрагмента ДНК донор кого штамма S.typhimurium YG7108, содержащего ogt регион фланкирующий ген хлорамфениколрезистентносги (Ст1). Для этой цели, ДНК мутантного штамма S.typhimurium YG7108 гидролизовали ферментами HindlII или EcoRV, а полученные линейные фрагменты ДНК использовали для трансформации штамма -реципиента S.typhi в расчете на замещение ogt -участка аналогичнным участком мутантного штамма S.typhimurium YG7108, у которого центральный фрагмент данного гена был замещен геном Ст'. Несмотря на последовательное повышение количества рестрицированной ДНК для трансформации, хлорамфениколустойчивых клонов получить не удалось. Возможной причиной неудачи такой постановки эксперимента, являлась необходимость образования мутантов посредством двойного кроссинговера, что требует как высокой частоты трансформации, так и высокой степени гомологии между S.typhi и S.typhimurium YG7108 по обе стороны от вставки Стг гена. Исходя из этого аналогичный фрагмент мутантного штамма S.typhimurium YG7108, был проклонирован в плазмидном векторе pUC18 (рис. 5). С этой целью, очищенную хромосомную ДНК S.typhimurium YG7108 рестрицировали ферментом HindlII, в результате чего получили HindHI-HindlII фрагмент, содержащей Cní (ген фланкированный с обеих сторон участками ogt гена). Этой же рестриктазой расщепляли плазмиду pUC18, несущую маркер резистентности к ампициллину (Amr). После лигирования и постановки химической трансформации, компетентные клетки штамма E.coli DHa.5 культивировали в чашках с L -агаром содержащим Ар (50 мкг/мл), Ст (10 мкг/мл) и Ар+Ст. В результате были получены клоны S.typhi, устойчивые только к хлорамфениколу, клоны устойчивые к хлорамфениколу и к ампициллину, а также клоны устойчивые к ампициллину, но чувствительные к хлорамфениколу.

Полученные результаты позволили предположить, что клоны S.typhi, устойчивые к хлорамфениколу (мутантные штаммы тип А), образовывались вследствие замещения центрального фрагмента ogt локализованного на хромосомной ДНК, на аналогичный участок

-1 ВЛ/ры атгоо

А" 1 В"

—I РЩ^ и ЭЛурМ БТ201

; ;} Рис. Схема конструирования штамма БЛурЫ, мутантного по гену

¡: ..........Н-Ншс1111; АиВ-участки ogt-гeнaS.typllirauгiuraУG7108,• ' '

и А1 и - участки ^-гена БДурЫ 8Т200; А" и В"-места рекомбинации

|'1 ogt - генов БДурЫншгшт УС7108 и БДурЫ БТ200; Арг - ген ампицил-

Г> линрезистентности; Стг-ген хлорамфениколрезистентности.

S.typhumurium YG7108 с введенным в него Cm' геном. Наличие мутантов устойчивых к двум антибиотикам (тип В), свидетельствуют о трансформации штамма реципиента S.typhi полноразмерной плазмидой pSSl, вследствие ее неполного гидролиза. При этом, плазмида могла либо остаться в свободном состоянии, либо интегрировать в хромосому S.typhi в одном из двух участков гомологии.

Факт интеграции гена хлорамфениколрезистентности в ogt область природного штамма S.typhi, была подтверждена Саузерн гибридизацией с плазмидным зондом. Специфический ДНК зонд, был создан на основе плазмиды pSSl, которая содержит участки ogt гена. Хромосомные ДНК мутантных штаммов S.typhi и их родительского штамма, после гидролиза эндонуклеазой Hindni и электрофореза в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану по Southern. Так, при рестрикции хромосом эндонуклеазой Hmdlll с последующей гибридизацией с зондом, ДНК мутантного штамма ST201, несущим только ген устойчивости к хлорамфениколу (тип Л), образовала один гибридизующийся фрагмент высокой молекулярной массы. ДНК штамма ST207 (тип В), т.е. мутант, обладающий устойчивостью и к хлорамфениколу, и к ампициллину, проявила две гибридизующиеся полосы. Хромосомная ДНК родительского (природного) штамма в результате гибридизации с зондом, давала один гибридизующийся фрагмент, равный нижнему гибридизующему фрагменту ДНК мутантного штамма типа В.

Следующим этапом работы было изучение распространенности ogt гена в штаммах сальмонелл, принадлежащих к различным серотипам. Сравнительному анализу, были подвергнуты штаммы S.typhi, S.paratyphi A, S.paratyphi В, S.typhimurium и S.infantis. Методом гибридизации, выявлено, что все проанализированные штаммы содержат этот ген. Вместе с тем, гибридизующиеся фрагменты, отличались по своей электрофоретической подвижности. Полученные данные, позволяют заключить, что сальмонеллы, принадлежащие к различным серотипам, характеризуются полиморфизмом нуклеотидной последовательности в области ogt гена.

В связи, с отсутствием в литературе данных, касающихся свойств ogt -мутантов S.typhi, представляло интерес провести сравнительный анализ чувствительности мутантного и природного штаммов к различным мутагенным факторам и лекарственным препаратам. В начале, нами было проверено отношение исследуемых штаммов к УФ -облучению. Обнаружили, что штамм S.typhi, лишенный способности синтезировать ogt -зависимую гуанин метшггрансферазу, становится более чувствительным к УФ, чем его родительский (природный) штамм. Так, роста бактерий мутантного штамма не наблюдалось при облучении свыше 10 секунд УФ светом с

мощностью дозы 0,5 дж х сек/см. Клетки природного штамма в этих условиях сохраняли жизнеспособность в течение 30 сек.

Известно, что субингибирующая концентрация отдельных пестицидов (талстара, кельтана), при диффузном росте сальмонелл усиливает, а в составе колоний снижает эффект некоторых антибиотиков (Нарзиев Дж.У., 1995). В связи с этим, представлялось интересным определить ответную реакцию сконструированного мутантного штамма при воздействии на него пестицидов и некоторых антибиотиков. Результаты исследования показывают, что штамм 8.1урЫ дефектный по о^ гену проявил неодинаковую чувствительность к использованным в данной работе пестицидам. Так, МИК кельтана для мутантного штамма 8Т201, была в 40 раз меньше (25 мкг/мл), чем для природного штамма (1 мг/мл). Мутантный штамм, оказался пшерчувсгвительным и к химиотерапевтическим препаратам. Установлено, что мутантный штамм по гену, в присутствии субингибирующей концентрации пестицидов в питательной среде, проявляет еще большую чувствительность к антибиотикам, чем при постановке теста без пестицида. Обнаружено, что уровень МИК антибиотика для мутантного штамма завесит от вида пестицида и антибиотика. Например, если при росте в субингибирующей концентрации дециса, величина МИК для отдельных антибиотиков снижалась в 1-2 раза, то МИК химиопрепарата -фуразолидона почти не изменилась. В тоже время, субингибирующая концентрация талстара и вертимекса, повысила чувствительность штамма дефектного по о^ -гену к неомицину и гентамицину примерно в 10 раз.

Таким образом, в результате клонирования гена устойчивости к хлорамфениколу фланкированного краями о^ региона в плазмидном векторе рЦС18 и последующего инсерционного мутагенеза, нами были сконструированы штаммы БЛурЫ дефектные по о^ -гену. Установлено, что данный ген присутствует в ДНК сальмонелл большинства серотипов и при гибридизации со специфическим зондом образует гибридизующиеся фрагменты различной электрофоретической подвижности. Полученные данные указывают на практическую ценность изучения - гена с целью диагностики сальмонеллозов и тифо-паратифозных заболеваний. Изучение чувствительности мутантного и природного (дикого) штаммов З^урЫ к различным мутагенным факторам показало, что роль гена не ограничивается участием в процессах репарации ДНК при воздействии на них атсилирующих агентов, но и обеспечивает бактериям устойчивость к другим химическим агентам, УФ, а также ко многим антибактериальным препаратам. Сравнительный анализ результатов изучения чувствительности к антибиотикам мутантного штамма по -гену в присутствии субингибирующей концентрации пестицидов, указывает на возможное влияние некоторых нитратсодержащих препаратов на взаимодействии

микроорганизма с антибиотиками. Ключевая роль белка, кодируемого ogt геном, в репарационных процессах S.typhi, указывает на перспективность создания новых лекарственных препаратов, специфически ингибирующих данный бактериальный белок.

Проведенная работа создает методические предпосылки и закладывает теоретические основы для ряда исследований, эпидемиологического и молекулярно-генегического характера, направленных на изучение свойств сальмонелл, их точную идентификацию и, в конечном итоге, на эффективную профилактику и лечение тифо-паратифозных заболеваний.

ВЫВОДЫ.

1. Ферментативные свойства штаммов S.typhi, выделенных в Таджикистане, Узбекистане и России существенно отличаются. Наиболее полная дифференцировка штаммов достигается при анализе ферментативной активности по отношению к набору углеводов, включающему ксилозу, арабинозу, дульцит и учет сероводородообразования.

2. Изученные штаммы различаются по спектру антибиотикорезистентности в зависимости от объекта (больные, бактерионосители) и места выделения. Наибольшее число штаммов, обладающих множественной устойчивостью, обнаружено у бактерионосителей. Штаммы S.typhi, изолированные в Таджикистане, имеют повышенные значения минимальной ингибирующей концентрации для большинства использованных противобактериальных препаратов.

3. Фаговары S.typhi имеют характерное распространение в различных природно-климатических регионах. В условиях Российской Федерации преобладает фаговар Е, в Таджикистане и Узбекистане фаговары А и Е с преобладанием фаговара А. Различные фаговары S.typhi преобладают также у больных и бактерионосителей.

4. Результаты экспресс - ПЦР ДНК штаммов сальмонелл характеризуются специфичностью и повторяемостью для культур конкретного серотипа или фаговара и не различаются у штаммов, выделенных из различных источников (гемокультуры, копрокультуры, биликультуры и уринокультуры).

5. Экспресс - ПЦР позволяет выявлять и дифференцировать не только типичные бактериальные штаммы,, но и тифо-паратифозные сальмонеллы, потерявшие антигенную специфичность, биохимически атипичные, а также L - формы брюшнотифозных сальмонелл. Экспресс - ПЦР может быть использована как метод ускоренной идентификации сальмонелл.

6. Возбудители брюшного тифа одного биовара (фаговара, серовара, ферментовара) с идентичной чувствительностью к антимикробным препаратам имеют различные риботипы, которые можно использовать как "генетические маркеры" в эпидемиологических исследованиях.

7. Впервые сконструирован мутантный штамм 8.1урЫ, дефектный по о^ - гену и проведен сравнительный анализ локализации - гена на хромосомах сальмонелл различных серотипов.

8. Мутантный штамм Б.1урЫ (лишенный о0 - гена) в отличие от природного (дикого) штамма проявляет гиперчувствительность к УФ - лучам, антибактериальным препаратам и пестицидам, что позволяет предположить ключевую роль данного гена в процессах репарации у Б.1урЫ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саторов С., Нарзиев Дж.У., Ахтамов МА, Тец В.В. Сравнительная характеристика БДурЫ, изолированных В Таджикистане, Узбекистане и России. // "Проблемы медицины". Тезисы докл. научн. конф. посвященной 600 -летию Мирзо Улугбека, Самарканд, Узбекистан, 1994. С. 57-58.

2. Саторов С. Биологические характеристика стафилококков, выделенных от работников животноводческих ферм и обслуживаемых ими животных. // Тезисы докл. I съезда эпидем. микробиол. и гигиен. Таджикистана. 4.2. Душанбе, 1985. С7 182-183.

3. Саторов С., Суворов А.Н., Орзуев М.И. Молекулярно-генегическая характеристика брюшнотифозных сальмонелл. //Журн. Здравоохран. Таджикистана, 1995, N 6. С. 39-41.

4. Саторов С., Вайнтруб С.Н. Выделение от людей штаммов золотистого стафилококка животного происхождения. //Окружающая среда и здоровье населения. Тезисы докл. I Респ. научн. практ. конф., Самарканд, 1985. С. 77-78.

5. Саторов С. Применение экспресс-полимеразной цепной реакции для диагностики тифо-паратифозных и сальмонеллезпых инфекций. //Журн. Здравоохран. Таджикистана, 1995, N 6. С. 33-36.

6. Саторов С. Болтаева М.Р. Биологические свойства штаммов стафилококков человеческого и животного происхождения. //Тезисы докл. Респ. научно-пракг. конф. молод, учен, и специалист., Душанбе, 1986. С. 121-122.

7. Саторов С. Молекулярно-генетическое изучение брюшнотифозных сальмонелл и их идентификация. //Материалы международного симпозиума, посвященному году Пастера: Идеи

Пастера в борьбе с инфекциями, 6-10 июня 1995 г., Институт имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия. С. 70.

8. Орзуев М.И., Саторов С., и соавт. Частота выделения и сравнительная характеристика стафилококков, выделенных от людей и животных. //Проблема стафилококковых инфекций. 4.1: Тезисы докл. Всесозного симпозиума, Саратов, 1986. С. 54-55.

9. Satorov S., Suvorov A.N., Tez V.V. Diagnostocal and epidemiological use express-PCR and ribotiping in typhoid fever and Salmonella infections. // International symposium on novel methods and standartisation in microbiology, Kosice, 1996. P. 32.

10. Саторов С.. Суворов A.H. Использование молекулярно-генетического анализа в диагностике сальмонеллезных инфекций. //Тезисы докл. мемориальной конф. посвященной памяти акад. А.А.Баева, 20-22 мая 1996 г., Москва, Россия. С. 133.

11. Саторов С., Гуторова Л.Д., Вайнтруб С.Н. Биологические особенности стафилококков, выделенных из крови и инфицированных ран людей. //Тезисы докл.1 съезда эпидем. микробиол. инфекцион. и гигиенистов Туркменистана. 4.1, Ашхабад, 1986. С. 51.

12. Саторов С., Суворов А Н., Тец В В. Риботипирование штаммов сальмонелл различной серотиповой принадлежности и антибиотикорезистентности. //Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Том I. 28-31 января 1997 г., Москва, Россия, 1997. С. 49.

13. Саторов С. Антибиотикорезистентность и Фагочувствительность золотистого стафилококка, выделенных от животных. //Тезисы докл. теорет. конф. молод, учен, и специал. Таджикской ССР, Душанбе, 1987. С. 110-112.

14. Саторов С., Суворов А Н. Идентификация сальмонелл методом экспресс-полимеразной цепной реакции. //Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., 1997, N 1. С. 63-66.

15. Satorov S., Suvorov A.N., Tez V.V. Diagnostical and epidemiological use of express-PCR ind ribotyping in typhoid fever and Salmonella iunfections. //Folia veterinaria, 1998, V. 42, N 1. С. 2327.

16. Саторов С., Орзуев М.И. Частота выделения стафилококков у домашних животных и идентификация штаммов. //Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., 1987, N 12. С. 37-39.

17. Саторов С., Тец В.В. Характеристика брюшнотифозных сальмонелл, изолированных в различных природно-климатических территориях и их риботипирование. //Журн. микробиол. лтдемиол. и иммунобиол., 1997, N 2. С. 88-91.

18. Саторов С., Суворов А.Н., Тец В.В. Конструирование и изучение ogt -делеционного нутантного nrraMMaS.typhi. //Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., (принята в печать)

19. Саторов С., Суворов А.Н. Клонирование од^-подобного гена в плазмидном векторе и конструирование мутантного штамма БЛурЫ по о^ -гену. //Вторая международ. конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", посвящен. 75 -летию Спб института имени Пастера. 2-4 сентября 1988 г. (принята в печать).

20. Саторов С., Суворов А.Н., Тец В.В. Чувствительность дикого и мутантного штамма БЛурЫ по -гену к УФ и некоторым антибиотикам. //Вторая международ, конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", посвящен. 75 -летию Спб института имени Пастера. 2-4 сентября 1988 г. (пришгга в печать)