Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнология адаптагенных фармацевтических препаратов из растений семейства толстянковые (Crassulaceae DC. )

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология адаптагенных фармацевтических препаратов из растений семейства толстянковые (Crassulaceae DC. )"

На правах рукописи

МИЗИРЕВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЯ АДАПТАГЕННЫХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА ТОЛСТЯНКОВЫЕ ( СКА88иЬАСЕАЕ ВС.)

Специальность 03. 00. 23 - биотехнология Специальность 03.00.05 - ботаника

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь 1998

Работа выполнена в Ставропольском государственном университете

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, член - корреспондент Академии Естествознания, действительный член Нью - Йоркской Академии Наук Дударь Юрий Александрович, доктор химических наук, профессор Брыкалов Анатолий Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тюльпанов Вадим Иванович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Шевченко Галина Тимофеевна

Ведущая организация -

Ставропольский научно - исследовательский институт сельского хозяйства

Защита состоится 25 июня 1998 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного Совета К 120.53.05. Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 355017, Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан " . __ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

В. А. Погодаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важнейших направлений современной биотехнологии является получение из растений эффективных биологически активных препаратов, применяемых в лечебно - профилактических целях в фармакологии и медицине. Существующие при этом проблемы в основном связаны с выбором объектов (видового состава растений) по филогенетическому принципу, разработкой оптимальных параметров и условий их возделывания, рациональным использованием сырья, разработкой экологически чистых технологий получения биопрепаратов с направленной физиологической активностью, исключающих нежелательные побочные воздействия на организм человека. Хотя в настоящее время возросло число исследований по разработке биопрепаратов растительного происхождения, обладающих адаптагенным эффектом, однако общее их количество в целом сильно ограничено.

Направленность решения проблемы обусловлена так же тем, что большинство лекарственных препаратов, полученных химическим путем, отличаются токсичностью, вызывают аллергические реакции. В связи с этим актуальной представляется разработка биотехнологии фармацевтических препаратов из растительного сырья, с максимальным сохранением комплекса природных соединений,, обеспечивающих высокую эффективность при профилактике и лечении многих заболеваний.

Адаптагенные препараты обладают стимулирующим действием на организм человека и животных, повышают резистентность к неблагоприятным воздействиям, не вызывая нежелательных последствий. Стимулирующие и адаптагенные свойства растений семейства Толстянковые были установлены томской школой фармакологов. Северный Кавказ и Ставропольский край, в частности, в известной мере обладают достаточным разнообразием представителей этого семейства. Однако местная флора в этом направлении вообще не изучена или исследована в недостаточной степени.

Поэтому получение биологически активных веществ из автохтонных и аллохтонных растений семейства Толстянковые, этого региона представляется не только целесообразным, но и экономически выгодным. Их культивирование не требует больших затрат труда и материальных средств, они дают высокий выход весьма эффективных фармацевтических препаратов.

Цель работы. На основе комплексного изучения экобиологических особенностей разработать технологию возделывания и биотехнологию фармацевтического препарата адаптагенного действия из двух видов растений семейства Толстянковые. Исследовать их химический состав и биологическую активность.

Задачи.

- изучить в природных условиях Центрального Предкавказья и в культуре экологические, биологические, ресурсоведческие особенности очитника кавказского и очитка отогнутого;

- разработать технологические карты культивирования обоих видов в условиях открытого и закрытого грунта;

- разработать биотехнологию получения адаптогенных препаратов с высоким уровнем физиологической активности;

- системно исследовать химический состав препарата;

'- предложить схему монтажа технологической линии получения препаратов и аппаратурное оформление процесса для их промышленного производства;

- провести предклиническую апробацию их свойств на микробной культуре и на лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые дана эколого - ботаническая характеристика популяций очитника кавказского и очитка отогнутого, произрастающих в Центральном Предкавказье. На основании испытаний в условиях культуры разработана технология выращивания обоих видов для получения лекарственных субстанций в открытом, а также закрытом грунте. На этой основе составлены технологические схемы возделывания растений. Впервые разработана технология адаптагенных фармпрепаратов из двух видов растений семейства Толстянковые - очитника кавказского и очитка отогнутого, включающая стадии подготовки растительного сырья, его консервацию, очистку и высушивание, размельчение, стадии получения экстракта, его очистку от балластных примесей, стерилизующую фильтрацию. Выход препаратов составляет 80 -85 %, их адаптагенное действие обусловлено содержанием веществ стероидоподобного, флавоноидоподобного, алкалоидоподобного действия.

Методом газожидкостной хррматографии с уровнем чувствительности определения концентраций 10 г системно проведено количественное определение биологически активных веществ в двух препаратах растений из семейства Толстянковые. В препарате очитника кавказского идентифицировано 19 органических соединении, относящихся к гетероциклам, кислородсодержащим и азотсодержащим соединениям. В препарате из очитка отогнутого обнаружено 26 органических соединений, включающих гетероцик-лы, предельные и непредельные углеводороды, азот- и кислородсодержащие соединения.

Уровень биологической активности препаратов из очитника кавказского и очитка отогнутого при использовании метода дрожжевого тестирования соответствует уровню активности фармакологического препарата алоэ. Лабораторные испытания на животных выявили стимулирующий эффект препаратов, характеризующийся 15 - 20 % повышением их физиологической активности.

Практическая значимость. Разработанные технологические карты возделывания двух видов семейства Толстянковые (очитника кавказского и очитка отогнутого), рекомендованы для использования в производственных условиях региона и позволяют получать для фармацевтической промышленности около 7 - 9 и 3 - б т/га сырья соответственно.

На основе разработанной биотехнологии получены два препарата адаптивного и биостимулирующего действия "OYL - НС" и "OyL -SR", проверенные в лаборатории физиологии человека и животных СГУ на активность на предклиническом этапе и рекомендуются для клинических испытаний с последующим применением в фармакологических целях медицинскими учреждениями региона или за его пределами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно - практических конференциях Ставропольского государственного университета в 1993, 1995, 1996, 1997 годах, Всероссийской конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 1996), Всероссийской конференции «Проблемы сохранения культурного и природного наследия на Ставрополье» (Ставрополь, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 185 страницах маши нописного1чжст^^ из введения, литературного обзора, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы, насчитывающего 332 наименова-

ний, из них 269 отечественных и 63 зарубежных автора. Содержит 32 таблицы, 28 рисунков, 6 приложений.

Материалы и методы работы. В работе использовались растения двух видов семейства Толстянковые - очитник кавказский (Hylotelephium caucasicum (Grossh.) Н. Ohba) (рис. 2) и очиток отогнутый (Sedum reflexum L.) (рис. 3), встречающиеся в природных первичных (коренных) - первый вид и вторичных (антропогенных) сообществах - очиток отогнутый. Выбор объектов основан на опыте народной медицины и отчасти официальной фитотерапии.

Материал в природе был собран в ходе 22 экспедиций в 1993 - 1997 г.г. в количестве 102 образцов для обоих видов на территории Ставропольского края и КЧАР. Он выращивался в питомниках Ботанического сада СГУ и Ставропольского ботанического сада, где проводились стационарные наблю-я.

равнение климатических ресурсов и погодных условии за годы эксперимента показывают , что их среднегодовая температура была выше , за годы исследований ее абсолютный минимум не превышал -17,2° С. Абсолютный максимум был близок к многолетнему. Количество осадков за год было ниже многолетних показателей (в 1995, 1996 г.г.). Самым засушливым был 1996 г.

Методы. Про^амму работы осуществляли в единой системе исследований, включающей разработку технологии возделывания, биотехнологию получения препаратов и их апробацию на микробной культуре и животных (рис. 1). Для экспериментальных исследований применялись современные методики изучения морфологических признаков, анатомических особенностей, биологии роста в различных условиях, возрастные фазы онтогенеза, архитектурные модели, фенологические наблюдения. Осуществлялась систематическая гербаризация растений, сбор и фиксация отдельных органов растений. При изучении химического состава экспериментальных растений применяли методы фотометрии, спектрофотометрии, электрофотометрии, газожидкостной хроматографии, испытания биологической активности препаратов на микробной культуре и животных.

Морфологические и анатомические признаки растений изучались на живом, гербарном, фиксированном материале по общепринятым методикам (В. В. Скрипчинский и др., 1970; В. Г. Хржановский, С. Ф. Пономаренко, 1970; Р. П. Барыкина, 1979; В. X. Тутаюк, 1980).

При изучении онтогенеза, малого жизненного цикла пользовались методиками В. В. Работнова (1950), И. Г. Серебрякова (1952, 1964), В. В. Скрип-чинского, Ю. А. Дударя и др. (1970), Ю. А. Дударя (1976, 1990).

Вегетативные способы размножения изучались с учетом известных рекомендаций (Н. А. Базилезская, 1959; С. Г. Сааков, 1983).

Изучение качества семян и способов их хранения осуществляли согласно Международным правилам определения качества семян (1969).

Изучение жизненных форм растений, архитектурных моделей проводились по рекомендациям Т. И. Серебряковой (1981), М. В. Маркова (1990).

Рисунки отдельных растений, их органов, анатомического строения выполнены автором работы. 2

Продуктивность определяли методом пробных площадок 1v:1 м .

Элементный анализ препарата проводили согласно требованиям Международной фармакопеи (1983), Государственной фармакопеи (1987), The international Pharmacopoeia (1988) по рекомендуемым методикам (В. Б. Алес-ковский и др., 1971; И. А. Чернавина, 1978; В. Д. Пономарев и др.,1983). Для определения общего содержания минеральных веществ пользовались методом озоления растительного материала.

Рис. 1. Схема проведения исследований

Состав органических веществ изучался методом газо - жидкостной хроматографии согласно Международной Фармакопеи (19831, Государственной фармакопеи (1987), The International Pharmacopoia (1983). идентификация и количественное определение органических веществ препарата проводилась по базовой компьютерной программе MS:TOP IBC HP 480, по времени и объему удерживания веществ, по масс - спектру (отношение заряда частиц к атомной массе). Блок - прибор, который содержит масс - спектрометр и масс - селективный компьютерный детектор МСД производства фирмы " Hewlett Packard ".

При разработке биотехнологии препаратов основывались на методах В. П. Филатова (1940), применяемых для получения биогенных стимуляторов, а так же способе получения препарата "биосед" ( П. А. Гнедков, 1974).

Для определения активности биогенных стимуляторов использовался метод испытания на микробной культуре по подъемной силе дрожжей ( В. П. Филатов, 1961).

Апробацию адаптагенных препаратов на предклиническом этапе и моделирование тренировочного цикла животных проводили по общепринятым методикам.

Полученные данные исследований подвергались статистической обработке общепринятыми методами (Г. Н. Зайцев, 1991).

Результаты исследований

Разработка биотехнологии адаптагенных биопрепаратов из очигника кавказского и очитка отогнутого на начальном этапе включала выбор опти-

мальных условий возделывания, рационального использования природного сырья и для чего были проведены исследования по изучению экоморфоло-гических признаков, жизненных форм, онтогенеза, семенного и вегетативного размножения, сезонных ритмов развития, технологии возделывания в открытом и закрытом грунте и факторов, обусловливающих сбор растительного сырья.

ЭкоморФологические признаки, жизненные формы, архитектурные модели. Очитник кавказский (рис. 2,4) - травянистый корнеклубневой летнезеле-ный поликарпик, листо - стеблевой суккулент, петрофит, кальцефит, мезок-серофит, олиготроф, приурочен в основном к пяти группам природных ассоциаций (луговая степь, леса из граба на известняках, дубовое редколесье, известняковые плиты). Эндем Кавказа.

Рис.2. Очитник кавказский - Ну1о1е1е-рЫит саисавкит (СгоззИ.) Н. 011Ьа: 1-обчций вид; 2-многолистовка; 3-цветок; 4-ле-песток; 5-ча-шелистик; б-тычинка; 7-пло-долистик с нектарником; 8-видоизменен-ные корни

Рис. 3. Очиток отогнутый - 8ес1ит геЛехит I-.: 1-общий вид; 2-соцветие; 3-цветок; 4-мно-голистовка; 5-лепесток; 6-чашелистик; 7-тычин-ка; 8-плодолистик с нектарником; 9-высохший развернутый плодолистик; 10- семя

Очиток отогнутый (рис. 3,5) - травянистый корневищный вечнозеленый поликарпик, листо - стеблевой суккулент, псаммо- петрофит, мезоксеро-фит, адвент, олиготроф, приурочен к местам с сильно нарушенной растительностью. Архитектурная модель обоих видов- группа безрозеточных , подгруппа временнорозеточных растений.

Вышеприведенные признаки обоих видов позволили обосновать технологию возделывания, выбор участка, тип почвы и принципиальные особенности получения сырья.

Онтогенез, сезонный ритм развития как обоснование технологии заготовки и сроков сбора сырья. Исследования этих признаков (табл. 1. рис.4.5) показали,

что наиболее оптимальным способом получения массы сырья является выращивание рассады, поскольку при этом ускоряются сроки развития растений.

Рис. 4. Фазы онтогенеза очитника кав- Рис. 5. Фазы онтогенеза очитка отогну-

казского: 1-2 - всходы, 3- молодая особь, 4 - того (два года развития): вегететивная моло-незрелая особь, 5-6- генеративная взрослая дая 1-5 всходы; 6-молодая; 7 - вегетативная

взрослая; 8, 9 - генеративная молодая и средневозрастная

В защищенном грунте сохранение надземных органов в зимний период, увеличение периодов цветения (время, когда накапливается наибольшее количество биологически активных веществ) продляет время для сбора сырья.

Таблица 1

Изменение ритма генеративного развития очитника кавказского

Условия (грунт) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12

Открытый б нц-ц кц-зс

Закрытый нц ц-кц зс б нц-ц кц-зс 6

Примечание: б- бутонизация, нц - начало цветения, ц - цветение, кц - конец цветения, зс - зрелые семена

Таблица 2

Сезонная ритмика очитника кавказского и очитка отогнутого

Фенофазы Очитник Очиток

Вегетативная 3.03 - 20.06 20.07 - 10.05

Бутонизация ' 21.06-10.08 11.05 - 15.06

Цветение: начало 11.08 - 25.08 16.06 - 22.06

полное 26.08 - 05 .09 23.06 - 05.07

максимум 6.09 - 20.09 06.07 - 10.07

конец 21.09 - 30.09 11.07 - 15.07

Семена незрелые 01.10 - 15.10 16.07 - 25.08

зрелые = 16.10 =26.08

Новые розетки 05.10 - 15.10 20.07 - 10.10

г Рис. 6. Анатомическое 3 строение стебля: А - очитника кавказского: 1 - эпидерма, 2 - пробка, 3 -паренхима, 4-флоэма, 5 - камбий, 6 - ксилема, 7 - сердцевина; Б - очитка отогнутого: 1 - эпидерма, 2 - колленхима, 3 - зерна хлорофилла, 4 - паренхима, 5 -камбий, б - вторичная ксилема, 7 - флоэма, 8 - сердцевинные лучи, 9 - сердцевина

Анатомическое строение и локализация органических веществ в органах и тканях. Анатомическое строение очитника кавказского и очитка отогнутого типично для представителей класса двудольных (рис.6). Первый вид, в частности, характеризуется непучковым строением, а второй пучковым. Основным местом локализации активных веществ являются: основная водоносная паренхима стебля и листьев, занимающая в побегах более половины их объема. Оба вида имеют ограниченное количество анатомических элементов (перидерма, ксилема и другие), затрудняющих получение большого выхода качественного сока и препаратов.

Биологические особенности семян, интенсивные способы получения рассады. Для организации размножения изученных видов в промышленных целях семенами были изучены их физические параметры, особенности строения и прорастания.

По типу прорастания при оптимальной температуре (20 -25°) семена обоих видов относятся к группе типов с ускоренным прорастанием : к типу со взрывным характером прорастания (на 3-й день после посева). Эта биологическая особенность представляет важное технологическое преимущество при размножении с помощью рассады. Семена обоих видов можно хранить до четырех лет, когда их всхожесть с 80 - 95 % (первый год) понижается до 57 - 58 %.

Вегетативное размножение и интенсификация получения Фармацевтического сырья. Использовалось деление кустов в разные сроки (весна, осень), отводки, черенки разного возраста и положения в кусте , корнеклубни с участками каудекса, "детки". Лучшими оказались (очитник кавказский) варианты с делением кустов, отводки, участки каудекса (100 % приживаемость), стеблевые черенки (76 - 97 %), старые перезимовавшие стебли (50 %). Очиток отогнутый полностью возобновлялся при использовании вегетативных и генеративных побегов, "деток" (100 %), в т. ч. и при очень длительных сроках хранения (до полугода) без увлажнения.

Вегетативное размножение очитника кавказского и очитка отогнутого оказалось простым и выгодным способом, представленное широким спектром приемов и подходов и их культивирование с помощью таких методов высокоэффективно.

Почва, уход, борьба с сорняками, вредителями и болезнями.Оба вида хорошо развиваются на мощных плодородных почвах, но с учетом_экобио-логических особенностей, их можно рекомендовать и для неудобий. В последнем состоит большое технологическое преимущество изучаемых видов. В целом на Предкавказье складываются благоприятные условия для выбора ■мест культивирования этих растений.

Продуктивность, оптимальные условия заготовки хранения сырья. Для определения урожая зеленой массы были исследованы растения во взрос-лои генеративной жизненной фазе (табл. 3).

Таблица 3

Урожайность зеленой массы очитника кавказского и очитка отогнутого

( 1995 - 1997 гг.)

Месяц Количество побегов на особь, шт. Масса, кг/м 2

Очитник Очиток Очитник Очиток

V 15,2 ± 4,12 25,9 ± 0,97 1,50 ± 0,03 1,46 ± 0.25

VI 33, 8 ± 4,15 37,5 ± 0,71 3,48 ± 0,16 2.79 ± 0,29

VII 35, 9 ± 4,11 45,9 ± 0,87 5,78 ± 0,14 4,53 ± 0,41

VIII 37 , 5± 5,18 82,2 ± 0,51 8,91 ± 0,27 5,21 ± 0,50

IX | 40, 6 ± 5,51 101,3 ± 0.98 9,25 ± 0,50 6,47 ± 0,57

Нарастание вегетативной массы обоих видов продолжается до августа -сентября. Урожайность очитника кавказского выше по сравнению с очитком отогнутым, начиная с июня. И в августе - сентябре превышает второй вид на 2,8 - 3,7 кг/м2.

Технология выращивания растений в открытом и закрытом грунте. Общая площадь зарослей очитника кавказского в крае составляет около 18 га. Эксплуатационный запас его сырой массы в природе - почти 90 т, исходя из

среднего урожая 0,5 кг/м2, что равно урожаю, получаемому с одного гектара в культуре. А объем возможной заготовки еще меньше - около 30 т. Заготовка в природных условиях не желательна - можно подорвать ресурсы или экономически невыгодна из-за сильной дисперсности зарослей и особей. Поэтому единственным путем снабжения фармацевтической промышленности является его размножение в культуре, где резко повышается урожайность - в 10-20 и более раз и существенно облегчается заготовка. А учитывая, что очитник - эндем Кавказа, его разведение будет являться активным методом, содействующим сохранению растения в мировом генофонде.

Площадь зарослей очитка отогнутого не превосходит и 100 м2. Он еще в меньшей степени, чем очитник кавказский, может быть подвергнут заготовкам в природных условиях и, конечно же, требует введения в культуру с целью получения достаточных запасов фармсырья.

Предложенные нами технологические карты возделывания очитника кавказского и очитка отогнутого в открытом и защищенном грунте (табл.4) на полупроизводственных участках позволили получать здоровый посадочный материал, достаточно высокие урожаи с единицы площади, обеспечили долголетие плантации.

Таблица 4

Технологическая карта возделывания очитника кавказского и очитка отогнутого в открытом грунте

Операция Технологические параметры Сроки

1. Выбор площадей Сухие и освещенные места,открытые, не сырые, не заливаемые водой, возможно затенение ***

2. Почва, ТИП Любая окультуренная, предварительно удобренная внесением перегноя или компостной земли ***

3. Вспашка Глубина обработки - 20 см, культивация, боронование осень

4. Сбор семян для посева Подсохшие генеративные побеги срезают ножами, садовыми ножницами, серпами: длина - 10 - 15 см После завершения сушки семена извлекают, растирают, очищают от примесей. По мере созревания

5. Посев 1. В хорошо разделанную грядку:поверхностно, перемешизая с небольшим количеством песка, с присыпкой легкой почвой или песком на 0,5 см. апрель-июнь

а) открытый грунт

б) а рассадные ящики или горшки Лучший способ, присыпка почвой или песком. Вкапывание емкостей в почву. Полив из лейки с мелкой сеткой по мере подсыхания, накрытие полиэтиленом, пленкой для сокращения частоты полизов и защиты от неблагоприятных факторов апрель -июнь

в) пикировка Сеянцы извлекают деревянными колышками с V -образным вырезом на конце. При появлении 1-2 настоящих листьев - пикировка сеянцев в ящики или в подготовленную хорошо разделанную грядку (5x5 см). Повторные пикировки сеянцев на расстояние 10x10 см. июнь сентябрь

6. Пересадка С участка удаляют всю сорную растительность; рассаду извлекают деревянной лопаточкой, прищипывают, высаживают на постоянное место, тщательно поливают, в жаркую погоду притеняют весной, летом, осенью

7. Работы по уходу Борьба с сорной растительностью и рыхление почвы. Удаление отцветших соцветий Постоянно

8. Деление 9. Черенкование Старовозрастные растения выкапывают, делят руками или острым ножом на 15-25 частей с пересадкой Черенки длиной 10 см помещают в парник под стекло или высаживают на слегка затененные участки. Глубина 3 - 4 см . Полив в период укоренения ежедневный На 4-5 го,'.ах жизни апрель-июнь

10. Сбор сырья В первый срок : очитник в вегетативной фазе, подрезать стебли под нижние листья и оставляя один два нетронутых побега; второй срок: аналогичным способом в генеративной фазе. Очиток - верхушки 15 - 20 см длины в генеративной фазе • июль октябрь июль сентябрь

11. Борьба с вредителями Экологически чистые способы борьбы с тлей: настои ромашки, крапивы, календулы Механическая защита от грызунов по мере появления весной

Изучение биологических особенностей видов подтвердило возможность их культивирования в условиях защищенного грунта, где они оказались способными формировать второй урожай в зимний период.

Технологическая карта выращивания растений в закрытом грунте разработана на основе способа выявления «скрытого» онтогенеза, криптоонтоге-неза растений умеренной зоны путем многолетних наблюдений за ними в условиях оранжереи (Ю. А. Дударь,1984, 1988).

Технологическая карта культивирования очитника кавказского и очитка отогнутого в закрытом грунте включает следующие операции: выбор способов возделывания (горшки, стеллажи, ящики, под стеллажами), подготовка емкостей, подготовка семян, посев, пикировка, пересадка, черенкование, работы по уходу, сбор и подработка сырья, борьба с вредителями, деление, пересадка. Оптимальные параметры технологии выращивания растений позволяют достичь высокого уровня продуктивности зеленой массы.

Разработка биотехнологии получения препаратов из растений семейства Толстянковые. С учетом рекомендаций Международной фармакопеи (1983), Государственной фармакопеи (1987) и в качестве сырья для адаптогенных препаратов использовалась надземная часть растений - трава, которая состоит из стеблей с листьями и цветками, отчасти бутонами и незрелыми плодами. Разработана технология получения биопрепаратов, обладающих физиологической активностью ( рис. 7).Стадии 1-3 включают подготовку растительного сырья, его консервацию, очистку и высушивание. Стадия 4 - размельчение сырья, а стадия 5-8 получение экстракта, его консервацию и очистку от балластных примесей методами термоденатурации, фильтрации, осаждения. Стадии 9 и 10 - заключительные операции по стерилизующеи фильтрации, розливу и сЬасовке фармпрепарата (О. М. Мизирева, А. В. Брыкалов, Ю. А. Дударь, 1996) .

Элементный анализ сырья проведен согласно правилам Международной фармакопеи (1983), Государственной фармакопеи СССР (1987) для определения фармакологически важных элементов .входящих в структуру биологически активных субстанций, в значительной степени влияющих на ее актив-

ность и элементов примесей. А также с целью экологической оценки его загрязненности тяжелыми металлами. Результаты анализов показали, что их концентрации в сырье обоих видов не превышают ПДК.

Очитник кавказский (мг 1,07; Р 0,27; Б 0,44; К 2, 90; Са 26,00; Ре 0,71; Мд 3,31; Мп 1,83; РЬ 0,3; Си 1,31; Сс1 0,03; Тп 2,31; Со 0,67.

Очиток отогнутый (мг %):М 0,95; Р 0,20; Б 1,18; К 3,14; Са 0,5; Яе 4,1; Мд 2,81; Мп 4,01; РЬ 0,5; Си 0,61; Сс1 0,03; 1,57; Со 0,99.

Важными качественными показателями исходных сырьевых материалов для биотехнологии фармпрепаратов, подбора аппаратуры и оборудования производства, учета отходов и порядка их использования, является предварительное определение содержания влаги и золы общей. Содержание золы в сырье очитка отогнутого несколько выше, чем очитника кавказского (15, и 13,9 %), а в целом находится в пределах (3 - 25 %), установленных для лекарственных растений (М. А. Кузнецова, 1987; Д. А. Муравьева, 1991).

Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4 Стадия 5 Стадия 6 Стадия 7

Стадия 8 Стадия 9 Стадия 10

Рис. 7. Блок - схема получения растительных биопрепаратов

Поскольку оба вида содержат в своем составе большое количество влаги (90 - 91%), наиболее целесообразным методом при получении адаптогенных препаратов, в основе которых лежит принцип сохранения максимального количества действующих веществ, является приготовление сока.

Траву очитка консервировали в темноте при температуре 5-6° С в течение 1012 дней. По В. П. Филатову (1948), в растениях под влиянием таких факторов среды вырабатываются биогенные стимуляторы. Затем, свежий растительный материал обмывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре 18 - 20°С на стеллажах, в течение 4 часов. Сырье предварительно нарезали

до размеров 7 - 10 см, измельчали до мезги с размером частиц 2,0 мм.

Процесс дробления дополняли приемом, стимулирующим повышение клеточной проницаемости и способствующим сокоотделению, - замораживанием в холодильной камере при температуре - 20° С в течение суток.

Последующая стадия технологии включает отделение твердых растительных частиц от экстракта путем отжима и процеживания через бязь, а затем фильтрование.

Выход продукта на данной стадии составляет для очитника кавказского - 85 - 90 %, и очитка отогнутого - 80 - 85 %.

Для отделения растительных белков, инактивации ферментов и других балластных примесей на последующей стадии технологии проводили процесс термоденатурации экстракта , сопровождающийся образованием осадка при последующем охлаждении и затем его удалении центрифугированием.

В экстракт для предупреждения роста и уничтожения микрофлоры добавляли хлорбутанолгидрат (хлорэтон) до его конечной концентрации 0,28 - 0,3 %.

Заключительная стадия технологии включает стерилизующую фильтрацию через мембраны, преимущество которой состоит в удалении контами-нантов, которые не удаляются при центрифугировании: растительные клетки, бактерии, присутствующие при недостаточной очистки сырья, остаточные фрагменты белка, коллоидные вещества, агломерированные протеины. Для стерилизующей фильтрации препаратов использована установка «УСФ - 293», которая применяется и в промышленном производстве.

Оптимальные условия хранения препарата - применение стерильных склянок необходимого объема. Окончательный розлив - во флаконы объемом 100 мл, которые укупориваются резиновой пробкой и металлическим колпачком.

Разработанный технологический процесс получения биопрепаратов из очитника кавказского и очитка отогнутого характеризуется их высоким выходом - составляет 80 - 85% (И), показателем высокой степени ее правильности, и подтверждается расходным коэффициентом (К расх), который имеет значение выше единицы (табл. 5).

Таблица 5

Физические свойства и органолептические показатели биопрепаратов.

Наименование показателя Норма

Очитник кавказский Очиток отогнутый

Внешний вид и консистенция Прозрачная жидкость без мути и осадка

Вкус Кисловатый, чистый

Запах Медовый <арактерный для растения

Окраска Желтая Светло - коричневая

Плотность кг/м2 0,6 0,6

рН 4 4,5

Осуществлен конструкторско - графический монтаж технологической схемы получения биопрепаратов из растений очитника кавказского и очитка отогнутого и приведена спецификация технологического оборудования.

Химический состав фармацевтических препаратов. Использован современный и высокоэффективный метод газо - жидкостной хроматографии (ГЖХ) для определения органических веществ препаратов очитника кавказского и

очитка отогнутого, рекомендованный Международной Фармакопеей (The International Pharmacopoeia, 1988).

Газохроматографическое разделение и анализ компонентов проводился на хроматографе «Hewlett Packard 5890» (США) с масс-селективным детектором МСД. Хроматографический процесс разделения смеси осуществлялся при прохождении раствора исследуемого вещества через колонку HP - 5 из метил -силикона - MS - 5% 30 мм длина, 0,25 мм диаметр. Компоненты анализируемой смеси распределяются между двумя фазами: стационарной и подвижной. В качестве подвижной фазы использовался газ носитель - гелий. Неподвижная фаза -сорбент - силикагель. Работа проводилась при программированном режиме температуры от 50 до 280°С. Скорость программирования 10°С/мин. Проба вводилась в испаритель газового хроматографа объемом 0,1 мкл. В качестве растворителя использовался хлороформ. Условия анализа препаратов обоих видов одинаковы. Продолжительность - 30 минут. Скорость газа - носителя гелия - 1 мл/мин.

При таких условиях анализ препарата очитника кавказского продолжался 14 мин, очитка отогнутого -11 мин. По хроматограмме идентифицировано 19 органических соединений препарата очитника кавказского ( рис. 8): 1.

кислородсодержащие органические вещества, в которую вошли спирты, альдегиды, сложные эфи-ры; 2.гетероциклические соединения, 3. азотсодержащие органические соединения (табл.6).

Рис. 8. Хроматограмма препарата очитника кавказского "OYL - НС".

Следует отметить, что производные фурана из растительного сырья, обладают противоопухоле-

________,_________ вой и радиосенсибилизирующей

■ ' I.'oo «.-=0 £.00 s.oo ю-«г активностью (В. Г. Беликов, 1985).

I етероциклические соединения, содержащие^шестичленные гетероциклы с атомами азота обладают жаропонижающим действием ( П. А. Сенов, 1960).

В препарате очитника отогнутого по хроматограмме (рис. 9) идентифицировано 24 органических соединения, относящихся к четырем группам: 1)

кислородсодержащие - 7; 2) гетероциклические - 10; 3) предельные и непредельные углеводороды - 4 ; 4) - азотсодержащие - 3.

Рис. 9. Хроматограмма препарата очитка отогнутого "OYL - SR"

Кислородсодержащие органические вещества представлены спиртами, альдегидами, сложными эфирами. Гетероциклические соединения в основном - производные фенола, пиразола, оксазола. В отличие от препарата очитника кавказского в препарате очитка отогнутого содержатся предельные и непредельные углеводороды (35,75мг ) (табл. 7).

«500 ■ 40003500 3000-25С0 J0C0 1500 1000 500

,т ',

По химическому составу препараты очитника кавказского и очитка отогнутого количественно отличаются друг от друга. В препарате очитника кавказского преобладают гетероциклические соединения, в основном производные фурана, а препарат очитка отогнутого содержит их в меньшей степени, они представлены производными пирана, оксазола, фенола. В препарате из очитка отогнутого содержится больше кислородсодержащих соединений и присутствуют углеводороды. Азотсодержащие органические соединения обнаружены в обоих препаратах.

Таблица 6

Содержание некоторых органических веществ в препарате "ОУ1. - НС"

№ Название Химическая формула Концентрация, мг%

1. 2-метил - 2 оксиранил-циклобутанон х > / \ 0 СНз 4,60

2. 2-метил- З-бутен-2-ол ОН I СН,— с—сн = сн2 I сн, 1,70

3. Бензофуран 4,13

4. 1 - этилпи-ридинон- 2 СИ, / сн, I X) 31,18

5. Кротоновая кислота О сн СНз л/ч/ Т сн он 27,30

6. Амид уксусной кислоты О // сн3— с —киг 12,70

7. Диметил - амид пропионовой кислоты СН3 СН2 1 сн3 сн3 О 2,70

Действующими веществами препаратов являются природные соединения стероидного, алкалоидного, флавоноидного действия. Содержание в препаратах растительного происхождения природных соединений подобного дей-

ствия дают все основания предполагать, что они могут использоваться в качестве адаптагенных.

Официальной Фармакопеей разрешено использование в фармакологии очитка большого (Государственная фармакопея, 1987: Д. А. Муравьева, 1991), его химический состав аналогичен очитнику кавказскому, который используется для получения препаратов биогенных стимуляторов. Следовательно, после этапов, включающих клинические испытания, очитник кавказский может быть рекомендован для составления фармакопейной статьи и включения в Государственный реестр.

Таблица 7

Содержание некоторых органических веществ в препарате "ОУ1. - БЯ"

N Название Химическая формула Концентрация,мг%

1. 2-Метил-З-бутен-2-ол СН, сн|—с—сн — сн3 он 11,30

2. Гептанон-2 сн, сн2 сн2 о сн2 сн2 с снз 42,19

3. Диоксиэритро-пентоза он он / / он он он г~\ /—С 1 1 1 ИО—^У-СО—О—(^У-СК,—С— С— С—СИ,он \ \ н н к СН, СН, 12,10

4. Изофталевая кислота -у ио^б II о 8,85

5. 4-Амино-5- метилпиримидин югг Ъ n 45,60

6 3-амино, 2-метилфенол он ¿Г инз 38,10

7. • Амид пропиновой кислоты 0 // сн,— СН1—с \ х№12 12,70

Исследование стимулирующих свойств препаратов из очитника кавказского и очитка отогнутого. Испытания показали, что активность препаратов из обоих видов была одинаковой, в пределах 63 -64 % и соответствовала показателям для фармпрепаратов алоэ.

Испытание биологической активности препаратов на модельных животных

Стимулирующее влияние препаратов "ОУ1_- НС" и "ОУ1_- БИ" на физическую работоспособность определяли по увеличению продолжительности бега животных, их получавших.

Разовое введение препаратов сопровождалось увеличением работоспособности экспериментальных животных на 15% (очитник кавказский) и 25 % (очиток отогнутый).

Рекомендации производству

1. Для промышленного разведения очитника кавказского и очитка отогнутого в целях получения сырья для фармацевтической промышленности рекомендуем разработанные нами технологические карты для открытого и защищенного грунта, позволяющие обеспечить сбор урожая около 7-9 (очитник) и 3-6 (очиток) кг/м2 травы.

2. Наиболее подходящими агроклиматическими зонами для введения в культуру обоих видов следует считать центральную и предгорную (недостаточного и достаточного увлажнения), используя методы как семенного, так и вегетативного размножения.

3. С учетом эколого - биологических особенностей изученных видов растений, их возделывание можно осуществлять не только на глубоких плодородных почвах, но и на землях с низкой продуктивностью, включая неудобья.

4. Для получения препаратов из сырья растений семейства Толстянковые использовать предложенную схему, включающую 10 стадий от подготовки растительного сырья до розлива и фасовки биопрепаратов, обеспечивающую высокий выход (80-85%) препаратов с обязательным включением на заключительном этапе стерилизующей фильтрации, как необходимого условия высокой степени очистки от балластных веществ, подавляющей микробную активность и на фоне консервации сохраняющей высокий уровень содержания природных соединений.

5. Физиологическая активность препаратов "ОУ!_-НС" и "ОУЬ-Б!?" проверяется методом дрожжевой культуры (по В. П. Филатову), а так же с использованием животных (при их курсовом введении).

6. По аналогии с прототипом (очитник большой) полученные препараты рекомендуются для клинических испытаний в офтальмологической (ожог роговой оболочки), стоматологической (пародонтоз), хиррурги-ческой (для консолидации костных переломов), терапевтической прак-тике(язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, спортивной медицине (стимулирующее действие), косметике (регенерация кожных покровов).

выводы

1. Разработана технология возделывания двух видов лекарственных растений (очитника кавказского и очитка отогнутого) из семейства Тол-стянковые. Проведено ресурсно - товароведческое изучение, основанное на детальном эко - морфологическом описании обоих видов, биологических особенностей и приемов размножения, имеющих решающее значение для научного обоснования технологии их культивирования, позволяющее регламентировать заготовки и хранение сырья, определение его подлинности.

2. Очитник кавказский - травянистый корнеклубневой листо - стеблевой суккулент, петрофит, кальцефит, мезоксерофит, олиготроф. Очиток отогнутый - травянистый корневищный листо - стеблевой суккулент, псаммо - петрофит, мезоксерофит, адвент, олиготроф, приурочен к местам с сильно нарушенным природным ассоциациям. Архитектурная модель обоих видов -группа безрозеточных - временнорозеточных растений. Вышеприведенные признаки обоих видов позволили обосновать такие этапы технологии возделывания, как выбор участка, почвы и принципиальные особенности получения сырья.

3. Онтогенез очитника кавказского и очитка отогнутого состоит из следующих фаз: эмбриональная (проэмбрио, зародыш), вегетативная молодая (три подфазы - всходы, молодые особи, незрелые особи), вегетативная взрослая, генеративная взрослая (две подфазы -молодая, средневозрастная), сениль-ная. Общая продолжительность онтогенеза не менее 10 -15 лет. Начало заготовки сырья со второго года жизни в генеративной фазе вплоть до наступления сенильной.

4. Основным местом локализации активных веществ является основная паренхима стебля и листьев, занимающая в побегах более половины их объема. Изучение анатомического строения позволяет заключить, что оба вида имеют ограниченное количество анатомических элементов (перидерма, ксилема и другие), затрудняющих получение большего выхода качественного сока и препаратов.

5. Семена обоих видов характеризуются очень небольшими размерами (длина около 1 мм, ширина - 0,4 мм) и поэтому не могут быть высеяны с точней нормой высева с помощью сеялок. Для этого необходимо использовать ручной посев в грунт или рассадный способ размножения. Семена обоих видов относятся к группе со взрывным характером прорастания. Оптимальным сроком их хранения следует считать 1-2 года, удовлетворительным -3 - 4, а глубина заделки до 0, 3 мм, включая поверхностный способ. Лучшим сроком посева является поздневесенний. Урожай семян очитника кавказского и очитка отогнутого составляет около 40 - 50 г/ м2 соответственно.

6. Наиболее эффективным способом вегетативного размножения очитника :<а2казского является деление куста весной и осенью, использование от-водког, и зерхушек побегов. У очитка отогнутого для этих целей можно использовать все части растения: вегетативные и генеративные побеги, "детки", даже при длительных сроках хранения без почвы.

7. Очитник кавказский и очиток отогнутый отличаются уровнем продуктивности в условиях культуры до 8,9 - 9,3 и 5,2 - 6,5 кг/м2 сырого сырья. Максимальные его сборы приходятся на август - сентябрь. В закрытом грунте возможно получение сырья еще и в декабре - феврале с выходом зеленой массы около 5% от такового в открытом грунте.

8. Разработаны технологические карты возделывания очитника кавказского и очитка отогнутого в открытом и защищенном грунте, включающие все необходимые операции, начиная с выбора площадей, до сбора сырья включительно. Для увеличения продолжительности сроков заготовки свежего сырья (до полугода) и увеличения его сборов предложено культивировать параллельно оба вида в открытом и закрытом грунте.

9. В сырье очитника кавказского и очитка отогнутого определено 13 элементов ( N1, Р, Б, Са, Ре, Мд, Мп, Си, Zn, Со, РЬ, Сс1), содержание металлов значительно ниже предельно допустимых концентраций (ПДК), что позволяет считать его экологически чистым по этим показателям.

10. Разработана технология адаптагенных фармпрепаратов из двух видов семейства Толстянковые очитника кавказского "ОУ1. - НС" и очитка отогнутого "ОУ1_ - БР", включающая стадии подготовки растительного сырья, консервацию, очистку и высушивание, измельчение, стадии получения экстракта, консервацию, очистку от балластных примесей, стерилизующую фильтрацию, розлив и фасовку. Выход препаратов составляет 80 - 85 %. .Осуществлен конструкторско - графический монтаж схемы получения биопрепаратов из изученных видов и предложена спецификация технологического оборудования (аппаратурное оформление). Разработанная схема технологического процесса получения биопрепаратов характеризуется высокими показателями выхода (Ь - 80 - 85 %), расходного коэффициента (К расх. - 1,18 -1,25) и расходных норм ( N - 1 250 - 1 880 ).

11. Впервые методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) проведено определение органических веществ в препаратах очитника кавказского и очитка отогнутого,полученных по разработанной нами биотехнологии. Их адаптогенное действие обусловлено содержанием веществ стероидоподоб-ного, алкалоидоподобного, фенолоподобного действия. В препарате очитника кавказского

12. " ОУЬ- НС " идентифицировано 19 органических соединений, относящихся к трем группам - кислородсодержащие, гетероциклические, азотсодержащие. В препарате очитка отогнутого "ОУ1- - Б!3" идентифицировано 26 органических соединений, относящихся к четырем группам - кислородсодержащим, предельным и непредельным углеводородам, гетероциклическим и азотсодержащим соединениям. Токсичных соединений с обоих препаратах не обнаружено.

13. Испытание биологической активности препаратов методом дрожжевого тестирования показало, что данные показатели соответствуют препаратам алоэ, и была одинаковой применительно к каждому из исследованных видов растений. Испытание биологической активности препаратов при разовом введении лабораторным животным выявили повышение их работоспособности (на 15-20 %), и ярко выраженное проявление стимулирующего и адаптагенного эффекта.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.Мизирева О. М. К экологии популяции видов рода Sedum L. г. Горячей (г. Пятигорск) //Современные проблемы экологии и природопользования на Ставрополье. Матер, науч. - практ. конф. 28 - 29 декабря 1993 г. - Ставрополь, 1993. - С. 60 - 61.

2.Мизирева О. М. К распространению видов семейства Crassulaceae DC в Центральном Предкавказье //Вопросы экологии и охраны природы Ставропольского края и сопредельных территорий. Мат. науч. - практ. конф. (11 -12 декабря 1995 г. )- Ставрополь, 1995. - С. 92 - 93.

3.Мизирева О. М. Интродукция представителей семейства Толстянковые Ставропольского края, использующихся как источник биологически активных веществ. //Современные достижения биотехнологии. Матер. Всерос. конф. (Ставрополь, июль 1996 г. ).- Ставрополь, 1996. - С. 296.

4. Мизирева О. М. Сезонное развитие очитника кавказского Hylotelephium caucasicum (Grossh. ) Н. Ohba и разработка технологии его размножения и сбора сырья //Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем Кавказа. Тез. докл. межресп. науч. - практ. конф., посвящ. 150 - летию со дня рожд. Н. Я. Динника.- Ставрополь, 1997. - С. 97.

5. Мизирева О. М., Гудиев О. Ю. Сравнительное изучение биологической активности очитника кавказского и алоэ древовидного. //Проблемы развития биологии на Северном Кавказе. Матер, науч. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь, 1997. - С. 103 - 104.

6.Мизирева О. М., Дударь Ю. А. Лекарственные растения в комнатной культуре.- Ставрополь: ИРО, 1997. - 72 с.

7.Мизирева О. М., Брыкалов А. В., Дударь Ю. А. Биотехнология культивирования двух видов растений семейства Толстянковые // ИЛ, № 6. - Ставрополь: ЦНТИ, 1998. - 4с.

8. Мизирева О. М., Дударь Ю. А., Брыкалов А. В. Биотехнология адалта-генных фармацевтических препаратов двух видов растений семейства Толстянковые// ИЛ, № 6 - Ставрополь: ЦНТИ, 1998. - Зс.

Изд. лиц. № 020061 от 9.10.96 Подписано в печать 19.05.98

Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,39 Уч.-изд.л. 1,64

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 71

Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического комплекса Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.