Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические аспекты культивирования и цитофизиология гриба TRICHODERMA HARZIANUM-19-продуцента целлюлозолитических ферментов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты культивирования и цитофизиология гриба TRICHODERMA HARZIANUM-19-продуцента целлюлозолитических ферментов"

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

ХАМ ИДО ВА ХУРШЕДА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ЦИТОФИЗИОЛОГИЯ ГРИБА ТМСНООЕ1ША НА1ШАМиМ—19-ПРОДУЦЕНТА ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

(03.00.23 — Биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1991

Работа выполнена в Институте микробиологии АН УзССР.

Научные руководители:

доктор биологических наук Ж. ТАШПУЛАТОВ доктор биологических наук В. И. БИРЮЗОВА

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор М. В. ГЕРНЕТ кандидат биологических наук Л. М. КРАСНОПОЛЬСКАЯ

Ведущее учреждение: Московский Государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микологии и альгологии.

Защита состоится « » 1991 г. в час. на за-

седании специализированного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ (127253, Москва, ул. Псковская, д. 12, корп. 4).

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

С. А. МЕЛИКОВА

Актуальность проблемы. Одна из важнейших задач современной биотехнологии - использование лигноцеллюлозного сырья (древесины, соломы и других отходов сельского и лесного хозяйства, многих отраслей промышленности). В этой связи одно из главных мест занимает изучение и применение микроорганизмов, в особенности микроскопических грибов, продуцентов целлюлозолитических ферментов, катализирующих расщепление целлюлозы, которые в последнее время являются объектами многочисленных исследований.

Большое значение имеет использование целлюлазы при силосовании кормов, для обогащения их доступными формами углеводов, что исключает расходование муки,комбикорма и патоки в практике животноводства.

Интересным, как с теоретической, так и с практической точки зрения, являются исследования ультраструктуры органоидов продуцента, поскольку известно, что каждой фазе развития организма соответствует определенная структурная организация клеточных органелл. Исследования ультраструктурной организации микробной клетки позволяют наиболее полно раскрыть механизм накопления и место локализации ферментов. Однако данные о связи синтеза микробных целлюлаэ с определенными структурами клеток к настоящему времени весьма ограничены. Изучение роли мембранных структур, клеточной стенки и различных органелл клетки в процессе синтеза позволит не только подойти к расшифровке механизма образования ферментов микроорганизмами, но, в свою очередь, может быть использовано в тех или иных условиях при оценке метаболической активности продуцента в производстве.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было всестороннее изучение гриба Trichoderina harziarmm-19 продуцента целлюлозолитических ферментов для подбора оптимальных условий»биосинтеза внеклеточных целлюлаз и разработки биотехнологии получения целлюлоэо-литически активной биомассы.

В связи с этим в задачи исследований входило:

1. Изучение культуральных и физиологических свойств гриба Г.harz i anum-19.

2. Исследование тонкого строения клеток Т.harziarmm-19 и возможности использования цитологических данных для оценки целлюлоэо-1итической активности гриба.

а) конидий, хламидоспор и мицелия гриба при различных способах сул ьтивиров ания;

б) изучение ядерного аппарата гриба;

в) изучение локализации целлюлозолитического фермента цитохи-»ическим методом;

г) исследование запасных веществ гриба.

3. Подбор оптимальных условий биосинтеза целлюлозолитических >ерментов T.harzianum-19.

а) исследование влияния состава питательной среды на биосинтез |еллюлаэ;

б) изучение влияния условий культивирования на образование цел-юлаз (pH, температура, аэрация, длительность культивирования, по-евной материал).

4. Изучение совместного культивирования микроорганизмов, обеспе-

чивающих активное образование целлюлозолитических ферментов.

5. Внедрение полученных результатов.

Научная новизна работы. Разработаны научные основы и биотехнологические процессы полумения целлюлозолитических ферментов.

Впервые гузапая, являющаяся отходом сельского хозяйства, обработанная целлюлозолитически активной биомассой гриба, предловона как корм для животных.

Впервые детально изучена ультраструктура гриба Т.Ьаг21апшй-1Э продуцента внеклеточных целлюлаз в процессе роста на различных питательных средах.

Выявлена определенная зависимость накопления фермента с изменениями цитоморфологии, накопление« запасных веществ, ультраструктурой клеток Т.Ьагг1а1шт-19 в процессе его развития.

Практическая ценность работы заключается в создании эффективной технологии получения целлюлозолитически активной биомассы гриба Т-Ьагг1апит-19, что способствует, в частности, расширению сырьевой базы производства кормов для сельскохозяйственного животноводства. " Результаты работы приняты Госагропромом УзССР и внедрены в сельскохозяйственное производство. Разработанный регламент культивирования гриба, а также получение целлюлозолитически активной биомассы используется в ферментных цехах, организованных при Узбекском НИИ животноводства (Постановление Совета Министров УзССР Но 195 от 12.02.1982 г.).

С целью широкого внедрения в сельскохозяйственное производство (по заданию Института микробиологии АН УзССР Институтом "Узгипро-сельстрой") разработана проектно-сметная документация экспериментального ферментного цеха мощностью 1300 тонн в год, строительство которого начато в Самаркандской области.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на конференции молодых ученых (Ташкент, 1978), Всесоюзном совещании по ферментам (Минск, 1978), на VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1983), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 19В6).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Получено авторское свидетельство "Способ получения кормов".

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 1В6 стр. машинописного текста и состоит из введения, литературного фбзйра, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, СЛц^ка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 209 маименований. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками, 1 включая фотоснимки, содержит 18 таблиц и 3 приложения.

, , ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил микроскопический гриб Тг1сЪос1егта ' Ьагг1апит-19, выделенный в лаборатории микробиопрепаратов иэ почвы Академгородка г. Ташкента (Ташпулатов, Теслинова, 1974).

Для совместного выращивания использованы грибы родов Тг1сЬо<1ег—

Актуальность проблемы. Одна из важнейших задач современной биотехнологии - использование лигноцеллюлозного сырья (древесины, соломы и других отходов сельского и лесного хозяйства, многих отраслей промышленности). В этой связи одно ия главных мест занимает изучение и применение микроорганизмов, в особенности микроскопических грибов, продуцентов целлюлозолигических ферментов, катализирующих расщепление целлюлозы, которые в последнее время являются объектами многочисленных исследований.

Большое значение имеет использование целлюлазы при силосовании кормов, для обогащения их доступными формами углеводов, что исключает расходование муки,комбикорма и патоки в практике животноводства.

Интересным, как с теоретической, так и с практической точки зрения, являются исследования ультраструктуры органоидов продуцента, поскольку известно, что каждой фазе развития организма соответствует определенная структурная организация клеточных органелл. Исследования ультраструктурной организации микробной клетки позволяют наиболее полно раскрыть механизм накопления и место локализации ферментов. Однако данные о связи синтеза микробных целлюлаэ с определенными структурами клеток к настоящему времени весьма ограничены. Изучение роли мембранных структур, клеточной стенки и различных органелл клетки в процессе синтеза позволит не только подойти к расшифровке механизма образования ферментов микроорганизмами, но, в свою очередь, может быть использовано в тех или иных условиях при оценке метаболической активности продуцента в производстве.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было всестороннее изучение гриба Trichoderma harsiarmm-19 продуцента целлюлозоли-тических ферментов для подбора оптимальных условий«биосинтеза внеклеточных целлюлаз и разработки биотехнологии получения целлюлозо-литически активной биомассы..

В связи с этим в задачи исследований входило:

1. Изучение культуральных и физиологических свойств гриба Т. harz iamim-19.

2. Исследование тонкого строения клеток Т. harziarvum-19 и возможности использования цитологических данных для оценки целлюлозо-литической активности гриба.

а) конидий, хламидоспор и мицелия гриба при различных способах культивирования;

б) изучение ядерного аппарата гриба;

в) изучение локализации целлюлозолитического фермента цитохимическим методом;

г) исследование запасных веществ гриба.

3. Подбор оптимальных условий биосинтеза целлюлозолитических ферментов T.harzianum-19.

а) исследование влияния состава питательной среды на биосинтез целлюлаз;

б) изучение влияния условий культивирования на образование целлюлаэ (pH, температура, аэрация, длительность культивирования, посевной материал).

4. Изучение совместного культивирования микроорганизмов, обеспе-

чивающих актиьное образование целлюлозолитических ферментов.

5. Внедрение полученных результатов.

Научная новизна работы. Разработаны научные основы и биотехнологические процессы получения целлюлозолитических ферментов.

Впервые гузапая, являющаяся отходом сельского хозяйства, обработанная целлюяозолитичесии активной биомассой гриба, предлоиена как корн для животных.

Впервые детально изучена ультраструктура гриба T.harzianum-19 продуцента внеклеточных целлюлаз в процессе роста на различных питательных средах.

Выявлена определенная: зависимость накопления фермента с изменениями цитоморфологки, накоплением запасных веществ, ультраструктурой клеток Т.harzianua-19 в процессе его развития.

Практическая ценность работы заключается в создании эффзктивной технологии получения целлюлозолитически активной биомассы гриба Т.harziamm-19, что способствует, в частности, расширению сырьевой базы производства кормов для сельскохозяйственного животноводства. Результаты работы приняты Госагропромом УзССР и внедрены в сельскохозяйственное производство. Разработанный регламент культивирования гриба, а также получение целлюлозолитически активной биомассы используется в ферментных цехах, организованных при Узбекском НИИ животноводства (Постановление Совета Министров УзССР No 195 от 12.02.1982 г.).

С целью широкого внедрения в сельскохозяйственное производство (по заданию Института микробиологии АН УзССР Институтом "Узгипро-сельстрой") разработана проектно-сметная документация экспериментального ферментного цеха мощностью 1300 тонн в год, строительство которого начато в Самаркандской области.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на конференции молодых ученых (Ташкент, 197S), Всесоюзном совещании по ферментам (Минск, 1978), на VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1983), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 1^рработ. Получено авторское свидетельство "Способ получения кормов".

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 106 стр. машинописного текста и состоит из введения, литературного йбзо^а, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, CtyttjKa литературы и приложений. Список использованной литературы включает 209 наименований. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками, включая фотоснимки, содержит 18 таблиц и 3 приложения.

„, ^ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служил микроскопический гриб Trichoderma harzianum-19, выделенный в лаборатории микробиопрепаратов из почвы Академгородка г. Ташкента (Ташпулатов, Теслинова, 1974).

Для совместного выращивания использованы грибы родов Trichoder-

ma, Aspergillus, Penicillium, взятые из коллекции лаборатории микро-биоконверсии растительного сырья.

Гриб выращивали при глубинном культивировании в колбах Эрлен-мейера емкостью 500 мл со 100 мл питательной среды"на качалке (180-200 об/мин), при температуре 28-32°С в течение 60-72 часов на видоизмененной среде Mandels (среда No 1). Среда No 1 имела следующий состав, г/л; КНдР0^ - 1,0; (NH/, feHPO/, - 2,3; MgSCty - 0,5; CaCl^ ~ 0>3, раствор микроэлементов - 1 мл (Mandels et al, 1962). Гриб также выращивали на среде Чапека-Докса (среда No 2) следующего состава: КН2Р0« - 1,0; КС1 - о,5; NaN03 - 2,0; MgSOi, - 0,5; FeSO^ - 0,01. Вода водопроводная - 1 л.

В качестве источников углерода использовали отходы сельскохозяйственного производства; гузапаю, пшеничную и рисовую солому, отруби, свекловичный жом, рисовую шелуху, кукурузные стержни, газетную и фильтровальную бумагу (бытовые отходы). Указанные вещества вносили в количестве 20-30 г/л.

Посевным материалом служила суспензия конидий гриба, выращенного на скошенной агаризованной среде No 1 с осажденной целлюлозой.

Поверхностное выращивание гриба проводили в литровых конических колбах (лабораторные опыты) и металических кюветах размером 50x35x4 см (производственные опыты). В качестве основных компонентов питательной среды использовали измельченную солому, гузапаю, кукурузные стержни, рисовую шелуху, отруби, чингалак хлопчатника. Среду увлажняли водопроводной водой до 607», РН 5-5,5. Активность целлюлозолитических ферментов определяли в 10%-ной водной вытяжке поверхностной культуры гриба.

Культуральные признаки гриба изучали в процессе роста гигантских колоний в чашках Петри. Фотографировали с помощью аппарата Зенит и насадочных колец.

Прижизненные наблюдения за развитием гриба проводили в Ш-об-раэной камере Пешкова (Пешков,1966) в фазово-контрастном микроскопе.

Для окраски клеточной стенки мицелий фиксировали в смеси Буэн и окрашивали фуксином Циля (Эпштейн Г.В., 1940).

При окраске волютина фиксацию клеток осуществляли в жидкости Карнуа,окрашивали синькой Лефлера (Пешков, 1966).

Для определения жира препарат фиксировали над пламенем горелки и окрашивали Суданом черным (Пешков, 1966).

При окраске ядер мицелий фиксировали в жидкости Карнуа. Кислотный гидролиз проводили в 1Н НС1, окрашивали по методу Рома-новского-Гимэа в модификации Пекарского (Пешков, 1955). Для мик-роскопирования живых и окрашенных препаратов использовали оптический микроскоп марки Эргавал (Цейс), с фотоокулярами х16, иммерсионным объективом хЮО. Микрофотографирование производили с помощью фотонасадки (Цейс) на негативной пленке Микрат-300.

Для электронно-микроскопических исследований применялась двойная глутаральдегид-осмиевая или KMnCty - осмиевая фиксация (Бирюзова и др., 1963). Ультратонкие срезы получали на .ультратоме LKB, окрашивали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитрата свинца. Срезы просматривали, и фотографировали в электронном

микроскопе JEM-100 при ускоряющем напряжении 80 kV.

Локализацию целлюлазы изучали цитохимическим методом (Nolan, Boll, 1974).

Для определения фермента, действующего на Na ТШЦ (Na-карбокси-метилцеллюлоза, степень замещения 36, степень полимеризации 400) использовали методику Mandela, Weber (1969). Активность фермента, действующего на На КМЦ определяли по количеству образовавшихся редуцирующих Сахаров при гидролизе 1%-ного раствора Na КМЦ в ацетатном буфере, pH 5,5, температуре 50°С. К 0,5 мл субстрата добавляли 0,5 мл культуральной жидкости и инкубировали в ультратермостате при 50°С в течение 30 мин, после чего определяли редуцирующие сахара. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое за 30 минут действия на субстрат присланных условиях образовывает 1 мг глюкозы.

Для определения активности фермента, действующего на хлопковое волокно, использовали методику, описанную Mandéis, Weber (1969) с некоторыми модификациями. Субстратом служило предобработанное (обезвощенное) хлопковое волокно. Реакционную смесь, содержащую 50 мг субстрата, 2 мл культуральной жидкости инкубировали на качалке при температуре 50° С в течение 1 часа. По истечении времени инкубации жидкость фильтровали через стеклянный фильтр No 3. В 1 мл субстрата определяли содержание редуцирующих Сахаров по методу So-roogi (1945) и Нельсона (1944)_. За единицу активности фермента, действующего на хлопковое волокно принимали такое количество ферментов, которое за 1 час действия на субстрат при заданных условиях образует 1 мг глюкозы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Культуральные и морфологические свойства штамма

Грибы рода Trichoderma - продуценты целлюлозолитических ферментов обладают больиоя вариабельностью.

Было показано, что гигантские колонии гриба T.harzianum-19 на различных питательных средах резко отличаются по скорости роста, внешним признакам колоний, внешнему виду спороношения, срокам его появления и по окраске. Образование зональности наблюдается на всех средах на четвертые сутки роста.

Для гриба характерна фенотипическая изменчивость, природа кото-с до сих пор не установлена. Согласно нашим данным, у исследуемого гриба наблюдаются явления гетерокариотичности.

2- Микроскопическое изучение развития гриба T.harzianum-19 ■ Прижизненные наблюдения с момента набухания спор до образования микроколоний показали, что среда культивирования значительно влияет на скорость и характер прорастания конидий, причем морфологические особенности прорастания конидий коррелируют с биосинтетической активностью гриба. Конидии гриба T.harzianum-19 округлой формы, глад-костенны, размер их 2,2-2,7 мкм. На сусло агаре конидии прорастают одной неветвящейся ростовой трубкой, а на среде No 1 одной-тремя трубками, которые достигая определенной длины начинают быстро ветвиться. Микроколонии образуются на сусле по истечении 4 часов, а

ma, Aspergillus, Pénicillium, взятые из коллекции лаборатории микро-биоконверсии растительного сырья.

Гриб выращивали при глубинном культивировании в колбах Эрлен-мейера емкостью 500 мл со 100 мл питательной среды'на качалке (180-200 об/мин), при температуре 28-32°С в течение 60-72 часов на видоизмененной среде Mandels (среда No 1). Среда No 1 имела следующий состав, г/л; КНдРО* - 1,0; (NHi,)aHP0^ - 2,3; MgSOz, - 0,5; CaCl2 - 0,3, раствор микроэлементов - 1 мл (Mandels et al, 1962). Гриб также выращивали на среде Чапека-Докса (среда No 2) следующего состава: КН2РСк, - 1,0; КС1 - о,5; NaN03 - 2,0; MgSOi^ - 0,5; FeSO*/ - 0,01. Вода водопроводная - 1 л.

В качестве источников углерода использовали отходы сельскохозяйственного производства; гузапаю, пшеничную и рисовую солому, отруби, свекловичный жом, рисовую шелуху, кукурузные стержни, газетную и фильтровальную бумагу (бытовые отходы). Указанные вещества вносили в количестве 20-30 г/л.

Посевным материалом служила суспензия конидий гриба, выращенного на скошенной агаризованной среде No 1 с осажденной целлюлозой.

Поверхностное выращивание гриба проводили в литровых конических колбах (лабораторные опыты) и металических кюветах размером 50x35x4 см (производственные опыты). В качестве основных компонентов питательной среды использовали измельченную солому, гузапаю, кукурузные стержни, рисовую шелуху, отруби, чингалак хлопчатника. Среду увлажняли водопроводной водой до 60%, рН 5-5,5. Активность целлюлозолитических ферментов определяли в 10%-ной водной вытяжке поверхностной культуры гриба.

Культуральные признаки гриба изучали в процессе роста гигантских колоний в чашках Петри. Фотографировали с помощью аппарата Зенит и насадочных колец.

Прижизненные наблюдения за развитием гриба проводили в Ш-об-разной камере Пешкова (Пешков,1966) в фазово-контрастном микроскопе.

Для окраски клеточной стенки мицелий фиксировали в смеси Буэн и окрашивали фуксином Циля (Эпштейн Г.В., 1940).

При окраске волютина фиксацию клеток,осуществляли в жидкости. Карнуа,окрашивали синькой Лефлера (Пешков. 1966).

Для определения жира препарат фиксировали над пламенем горелки и окрашивали Суданом черным (Пешков. 1966).

При окраске ядер мицелий фиксировали в жидкости Карнуа. Кислотный гидролиз проводили в 1Н НС1,.окрашивали по методу Рома-новского-Гимэа в модификации Пекарского (Пешков, 1955). Для мик-роскопирования живых и окрашенных препаратов- использовали оптический микроскоп марки Эргавал (Цейс), с фотоокулярами х16, иммерсионным объективом хЮО. Микрофотографирование производили с помощью фотонасадки (Цейс) на негативной,пленке Микрат-300.

Для электронно-микроскопических исследований применялась двойная глутаральдегид-ос-миевая • или КМпО^- осмиевая фиксация (Бирюзова и др.. 1963). Ультратонкие срезы получали на .ультратоме LKB, окрашивали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитрата свинца. Срезы просматривали,-.и фотографировали в электронном

микроскопе JEM-100 при ускоряющем напряжении 80 kV.

Локализацию целлюлазы изучали цитохимическим методом (Nolan, Boll, 1974). .

Для определения фермента, действующего на Na''ÇMH (Na-карбокси-метилцеллюлоза, степень замещения 36, степень полимеризации 400) использовали методику Mandela, Weber (1969). Активность фермента, действующего на Na КМЦ определяли по количеству образовавшихся редуцирующих Сахаров при гидролизе 1%-ного раствора Na КМЦ в ацетатном буфере, pH 5,5, температуре 50°С. К 0,5 мл субстрата добавляли 0,5 мл культуральной жидкости и инкубировали в ультратермостате при 50°С в течение 30 мин, после чего определяли редуцирующие сахара. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое за 30 минут действия на субстрат при данных условиях образовывает 1 мг глюкозы.

Для определения активности фермента, действующего на хлопковое волокно, использовали методику, описанную Mandela, Weber (1969) с некоторыми модификациями. Субстратом служило предобработанное (обезвощенное) хлопковое волокно. Реакционную смесь, содержащую 50 мг субстрата, 2 мл культуральной жидкости инкубировали на качалке при температуре 50° С в течение 1 часа. По истечении времени инкубации жидкость фильтровали через стеклянный фильтр No 3. В 1 мл субстрата определяли содержание редуцирующих Сахаров по методу So-mogi (1945) и Нельсона (1944). За единицу активности фермента, действующего на хлопковое волокно приникали такое количество ферментов, которое за 1 час действия на субстрат при заданных условиях образует 1 мг глюкозы.

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Культуральные и морфологические свойства штамма

Грибы рода Trichoderma. - продуценты целлюлозолитических ферментов обладают большой вариабельностью.

Было показано, что гигантские колонии гриба T.harzianum-19 на различных питательных средах резко отличаются по скорости роста, внешним признакам колоний, внешнему виду спороношения, срокам его появления и по окраске. Образование зональности наблюдается на всех средах на четвертые сутки роста.

Для гриба характерна фенотипическая изменчивость, природа кото-с", до сих пор не установлена. Согласно нашим данным, у исследуемого гриба наблюдаются явления гетерокариотичности.

2. Микроскопическое изучение развития гриба T.harzlanum-19

- Прижизненные наблюдения с момента набухания спор до образования микроколоний показали, что среда культивирования значительно влияет на скорость и характер прорастания конидий, причем морфологические особенности прорастания конидий коррелируют с биосинтетической активностью гриба. Конидии гриба T.harzianum-19 округлой формы, глад-костенны, размер их 2,2-2,7 мкм. На сусло агаре конидии прорастают одной неветвящейся ростовой трубкой, а на среде Mo 1 одной-тремя трубками, которые достигая определенной длины начинают быстро ветвиться. Микроколонии образуются на сусле по истечении 4 часов, а

4.4. Локализация целлюлазы в клетках Т.ЬаГ21апит-1Э Показано, что строение клеточной стенки гриба, выращенного на среде Во 1 с гузапаей претерпевает значительные измененеия по сравнению со строением клеточной стенки на сусле. На среде N0 10 гуза-паей, способствующей максимальному синтезу целлюлозолитических ферментов, наблюдается увеличение складчатости долевой части клеточной стенки мицелиальных гиф. А на растущих кончиках гиф наблюдаются впя-чиЕания.

При изучении локализации целлюлазы цитохимическим методом установлено, что фермент расположен в цитоплазме, мембранах эндоплазмати-ческого ретикулума, в периплазме, но наибольшее его количество сконцентрировано в наружном слое клеточной стенки гриба, особенно на полюсах. Вероятно, основной синтез целлюлозолитических ферментов происходит в растущих участках гифы. Это дает основание предположить, измененное строение оболочки на среде Но 1 с гузапаей связано с активацией в растущих участках ферментообразования.

Следует отметить, что при просмотре большого числа контрольных вариантов (среда N0 1 без субстрата) обнаруживался электронноплотный осадок СиО. Мы полагаем, что это так называемая базальная активность, то есть та целлюлоза, которая всегда присутствует в клетках в следовых количествах.

5. Внедрение полученных результатов На основе выращивания гриба Т.Ьаг21апиш-19 разработан регламент получения ферментного препарата "Целлолигнорин Пх", защищенный авторским свидетельством, который применяется при силосовании кормов. В Ташкенте и Самаркандской области при Узбекском НИИ животноводства созданы опытно-промышленные ферментные цеха по накоплению целлюло-золитически активной биомассы, используемой для получения силоса из отходов растениеводства.

Экономическая эффективность от использования 3,0 тонн силоса в Хорезмской области составил 120 тыс. рублей. Аналогичные результаты были получены от внедрения способа ферментативной обработки и силосования отходов растениеводства в Ташкентской, Бухарской, Самаркандской, Джизакской и Ферганской областях УзССР.

На основании полученных результатов опытно-промышленных испытаний с целью широкого внедрения в сельскохозяйственное производство (по заданию Института микробиологии АН УзССР Институтом Узгипросель-строй) разработана проектно-сметная документация экспериментального ферментного цеха мощностью в 300 тонн в год, строительство которого начато в Самаркандской области.

ВЫВОДЫ

1. Изучены морофолого-культуральныа признаки гриба Т.Ьагг1апиш-19 продуцента целлюлозолитических ферментов. Выявлена фенотипическая изменчивость гриба, показана вариабельность его морфологических и биосинтетических свойств.

2. Изучена взаимосвязь образования целлюлозолитических ферментов с особенностями цитоморфологического строения мицелия, конидиогенеэа, накопления запасных веществ, локализации в клетках гриба;

а) выявлена определенная зависимость накопления ферментов с изменениями цитоморфологии, накоплением запасных веществ в процессе развития гриба. Характер локализации и величина гранул волютина и жира могут служить тестом при микроскопической оценке ферментативной активности продуцента.

б) изучены структурные особенности спор различных типов. Показано преобладание конидий (энтеробластических), образуемых при поверхностном культивировании и хламидоспор (таллических) при глубинном выращивании. В момент массового конидиеобразования, по-видимому, происходит максимальный выброс ферментов в окружающую среду.

в) показано, что экзоферменг-целлюлаза, в основном, локализована на внешней поверхности клеточной стенки. Центрами наибольшей локализации фермента являются. растущие части мицелия (кончики гиф). Однако, в молодой растущей культуре (12 часовая) ферменты используются в метаболизме самих клеток и в окружающей среде целлюлазы присутствуют в сравнительно небольших количествах. Наличие целлюлазы в периплазмати-ческом пространстве, вакуолях и на мембранах эндоплазматического ре-тикулума клеток свидетельствует о синтезе фермента в их цитоплазме. Синтез протекает на мембранах эндоплазматического ретикулума с участием рибосом. Обсужден возможный механизм транспорта целлюлазы из

клетки с помощью экскреторных пузырьков.

г) установлено, что ядра в различных клетках имеют разный механизм деления. В конидиях им свойственен, в основном, митоз, в хла-мидоспорах и гифах: митоз, атипичный митоз, деление по типу сборных хромосом.

3. Максимальный синтез целлюлозолитических ферментоБ грибом

Т. 1гаг21апшп-19 происходит В присутствии специфического индуктора -целлюлозы или целлюлозоеодержащих субстратов:

а) исследовано, что дополнительное внесение твинов значительно усиливает биосинтез целлюлаз. Внесение твина 60 в концентрации 0,27а приводит к увеличению синтеза фермента, гидролизующего Ыа КМ,Т на 92 , а хлопкового волокна на 70 .

б) биосинтез целлюлаз увеличивается при внесении растительных масел.

4. Активация синтеза целлюлаз происходит при использовании им как минеральных (Шу^НРО^, (НН^)НгР0^, , так и органических (пептон, казеин, гидролизат казеина) источников азота. Показано стимулир>ующее действие аспарагина, валина и глутаминовой кислоты.

5. Подобраны оптимальные (температура, рН, аэрация, длительность выращивания, посевной материал) условия поверхностного и глубинного культивирования гриба. Установлено, что оптимум температур для обоих способов выращивания находится в пределах 28-32°С, исходной рН среды для биосинтеза фермента, гидролизующего На КМЦ 5,0-5,5, а для фермента, действующего на хлопковое волокно 4,5-5,0. Длительность культивирования при глубинном способе 60-72 часа, а при поверхностном 4448 часов.

6. Показано, что совместное культивирование грибов Г.Ьагг1апит-19 и А.1еггеие-18 усиливает биосинтез целлюлозолитических ферментов.

7. На основе полученных результатов отработан регламент получения ферментного препарата "Целлолигнорин Пх" с помощью целлюлозоли-тически активной биомассы гриба Т.Ьагг1агшт-19 в ферментных цехах.

4.4. Локализация целлюлазы в клетках Т.Ьагг1апит-19 Показано, что строение клеточной стенки гриба, выращенного на среде N0 1 с гузапаей претерпевает значительные измененеия по сравнению со строением клеточной стенки на сусле. На среде N0 1 с гузапаей, способствующей максимальному синтезу целлюлозолитических ферментов, наблюдается увеличение складчатости долевой части клеточной стенки мицелиальных гиф. А на растущих кончиках гиф наблюдаются впя-чивания.

При изучении локализации целлюлазы цитохимическим методом установлено, что фермент расположен в цитоплазме, мембранах эндоплазмати-ческого ретикулума, в периплазме, но наибольшее его количество сконцентрировано в наружном слое клеточной стенки гриба, особенно на полюсах. Вероятно, основной синтез целлюлозолитических ферментов проис-" ходит в растущих участках гифы. Это дает основание предположить, измененное строение оболочки на среде N0 1 с гузапаей связано с активацией в растущих участках ферментообразования.

Следует отметить, что при просмотре большого числа контрольных вариантов (среда Ыо 1 без субстрата) обнаруживался электронноплотный осадок СиО. Мы полагаем, что это так называемая базальная активность, то есть та целлюлоза, которая всегда присутствует в клетках в следовых количествах.

5. Внедрение полученных результатов На основе выращивания гриба Т.Ьагг1апит-19 разработан регламент получения ферментного препарата "Целлолигнорин Пх", защищенный авторским свидетельством, который применяется при силосовании кормов. В Ташкенте и Самаркандской области при Узбекском НИИ животноводства созданы опытно-промышленные ферментные цеха по накоплению целлюлоз эолитически активной биомассы, используемой для получения силоса из отходов растениеводства.'

Экономическая эффективность от использования 3,0 тонн силоса в Хорезмской области составил 120 тыс. рублей. Аналогичные результаты были получены от внедрения способа ферментативной обработки и силосования отходов растениеводства в Ташкентской, Бухарской, Самаркандской, Джизакской и Ферганской областях УзССР.

На основании полученных результатов опытно-промышленных испытаний с целью широкого внедрения в сельскохозяйственное производство (по заданию Института микробиологии АН УзССР Институтом Узгипросель-строй) разработана проектно-сметная документация экспериментального ферментного цеха мощностью в 300 тонн в год, строительство которого начато в Самаркандской области.

ВЫВОДЫ

1- Изучены морофолого-культуральные признаки гриба T.harziarmm-19 продуцента целлюлозолитических ферментов. Выявлена фенотипическая изменчивость гриба, показана вариабельность его морфологических и биосинтетических свойств.

2. Изучена взаимосвязь образования целлюлозолитических ферментов с особенностями цитоморфологического строения мицелия, конидиогенеза, накопления запасных веществ, локализации в клетках гриба;

а) выявлена определенная зависимость накопления ферментов с изменениями цитоморфологии, накоплением запасных веществ в процессе развития гриба. Характер локализации и величина гранул волютина и жира могут служить гестом при микроскопической оценке ферментативной активности продуцента.

б) изучены структурные особенности спор различных типое. Показано преобладание конидий (энтеробластических), образуемых при поверхностном культивировании и хламидоспор (таллических) при глубинном выращивании. В момент массового конидиеобразования, по-видимому, происходит максимальный выброс ферментов в окружающую среду.

в) показано, что экзофермент-целлюлаза, в основном, локализована на внешней поверхности клеточной стенки. Центрами наибольшей локализации фермента являются растущие части мицелия (кончики гнф). Однако, в молодой растущей культуре (12 часовая) ферменты используются в метаболизме самих клеток и в окружающей среде целлюлазы присутствуют в сравнительно небольших количествах. Наличие целлюлазы в периплазмати-ческом пространстве, вакуолях и на мембранах эндоплазматического ре-тикулума клеток свидетельствует о синтезе фермента в их цитоплазме. Синтез протекает на мембранах эндоплазматического ретикулума с участием рибосом- Обсужден возможный механизм транспорта целлюлазы из

клетки с помощью экскреторных пузырьков.

г) установлено, что ядра в различных клетках имеют разный механизм деления. В конидиях им свойственен, в основном, митоз, в хла-мидоспорах и гифах: митоз, атипичный митоз, деление по типу сборных хромосом.

3. Максимальный синтез целлюлозолитических ферментов грибом Т.Ьага1апит-19 происходит в присутствии специфического индуктора -целлюлозы или целлюлозосодержащих субстратов:

а) исследовано, что дополнительное внесение твинов значительно усиливает биосинтез целлюлаз. Внесение ТБИна 60 в концентрации 0,2/а приводит к увеличению синтеза фермента, гидролизующего Иа КМ" на 92 , а хлопкового волокна на 70 .

б) биосинтез целлюлаз увеличивается при внесении растительных масел.

4. Активация синтеза целлюлаз происходит при использовании им как минеральных ( ЫН^ )г НР0,у, ( )Н.гР0</, (МН^, так и органических (пептон, казеин, гидролизат казеина) источников азота. Показано стимулирующее действие аспарагина, валина и глутаминовой кислоты.

5. Подобраны оптимальные (температура, рН, аэрация, длительность выращивания, посевной материал) условия поверхностного и глубинного культивирювания гриба. Установлено, что оптимум температур для обоих способов выращивания находится в пределах 28-32°С, исходной рН среды для биосинтеза фермента, гидролизующего №а КМЦ 5,0-5,5, а для фермента, действующего на хлопковое волокно 4,5-5,0. Длительность культивирования при глубинном способе 60-72 часа, а при поверхностном 4448 часов.

6. Показано, что совместное культивирование грибов Т.Ьагг1апиш-19 и А.Ъеггеиз-18 усиливает биосинтез целлюлозолитических ферментов.

7. На основе полученных результатов отработан регламент получения ферментного препарата "Целлолигнорин Пх" с помощью целлюлозоли-тически активной биомассы гриба Т.Ьагг1агшт-19 в ферментных цехах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ташпулатов Ж., Юсупова И.Х., Джалалова X. (Хамидова X.), Лб-дуллаев Т. Влияние некоторых аминокислот и ригаминов на целлюлоли-тическую активность Г.lignorum-19 // Узб.биол.журн. - 1977. - Но 3 - С. 13-15.

2. Ташпулатов Ж., Джалалова X. Изучение влияния состава среды

на целлюлозолитическую активность поверхностной культуры T.lignorum-19 // Узб.биол.журн. - 1977. - Но 4. - С. 72-73.

3. Ташпулатов Ж., Джалалова X. Изучение влияния условий поверхностного культивирования на целлюлозолитическую активность T.ligno-гщп-19 // Узб.биол.журн. - 1978. - Но 2.

4. Ташпулатов Ж., Абдуллаев Т., Джалалова X., Юсупова И.Х., Ионов Ю.Г. // Способ получения кормов. - Авт. свид. No 704588 от 7.07.78.

5. Ташпулатов Ж., Джалалова X. Условия образования целлюлаз у Г.lignorum-19 // Втор. Всес. сов. по ферментам. - Минск. - 1978. -С. 75.

6. Хамидова X., Мирзарахимова М. Влияние различных компонентов среды Чапека и Мендельса на образование целлюлолитических ферментов // II Республ. конф. мол. ученых. - Ташкент.- 1978. - С. 4243.

7. Ташпулатов Ж., Юсупова И.Х., Джалалова X., Мирзарахимова М. Влияние некоторых органических азотсодержащих веществ на биосинтез целлюлазы Т.lignorum-19 // В сб.: Биология и селекция микроорганизмов. - ФАН. - Ташкент. - 1980. - С. 63-67.

8. Ташпулатов Ж., Хамидова X-, Абдуллаев Т., Мирзарахимова М. Целлюлазы Т.lignorum-19 // В сб.: Целлюлазы микроорганизмов. - Наука. - 1981. - С. 114-125.

9. Хамидова X., Ташпулатов Ж. Влияние твинов на биосинтез целлюлаз // Уэб.биол.журн. - 1984. - No 4. - С. 63-65.

10. Хамидова X., Ташпулатов Ж. Влияние ионов металлов на активность целлюлаз Т.lignorum-19 // VII Всес. съезд микробиол. общества. - Алма-Ата. - 1985. - С. 156.

11. Хамидова X., Ташпулатов Ж. Влияние поверхностно-активных веществ на биосинтез целлюлазы Т.lignorum-19 // В сб.: Мицелиаль-ные грибы. - Всес. конф. - Пущино. - 1983. С. 154.

12. Ташпулатов Ж., Хамидова X., Шадрина И.А., Машковцева A.B. Кариологические особенности гриба Т.lignorum-19 // Узб.биол.журн. -

No 2. - 1935. - С. 12-17.

13. Хамидова X., Ташпулатов Ж., Шадрина H.A., Машковцева A.B. Изучение конидиогенеза и тонкой структуры спор целлюлолитического гриба // Уэб.биол.журн. - No 5. - 1985. С. 11-18.

14. Хамидова X., Ташпулатов Ж., Шадрина И.А., Машковцева A.B., Кострикина H.A., Бирюзова В.И. Динамика накопления запасных веществ в процессе развития Т. ligriorum-19 // Уэб.биол.журн. - Ко 1. - 1986. - С.

15. Хамидова X., Юсупова И.Х., Ташпулатов Ж. Совместное культивирование грибов - продуцентов целлюлаз и белка // В сб.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. - IV Всес. конф. - 1988. - С. 160.

Подписано в печать — Формат бумаги 60Х84У16- Бумага типографская № 1. Печать «РОТАПРИНТ».- Объем Тираж экз. Заказ /Л

Типография издательства «Фан» АН УзССР. 700170. Ташкент, пр. М. Горького, 79.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ташпулатов Ж., Юсупова И.Х., Джалалова X. (Хамидова X.), Аб-дуллаев Т. Влияние некоторых аминокислот и витаминов на целлюлоли-тическую активность Т.lignorum-19 // Узб.биол.журн. - 1977. - Но 3 - С. 13-15.

2. Ташпулатов Ж., Джалалова X. Изучение влияния состава среды

на целлюлозолитическую активность поверхностной культуры Т.lignorum-19 // Узб.биол.журн. - 1977. - Ко 4. - С. 72-73.

31 Ташпулатов Ж., Джалалова X. Изучение влияния условий поверхностного культивирования на целлюлозолитическую активность T.ligno-rum-19 // Узб.биол.журн. - 1978. - No 2.

4. Ташпулатов Ж., Абдуллаев Т., Джалалова X., Юсупова И.Х., Ионов Ю.Г. // Способ получения кормов. - Авт. свид. No 704588 от 7.07.78.

5. Ташпулатов Ж., Джалалова X. Условия образования целлюлаз у Т.lignorum-19 // Втор. Всес. сов. по ферментам. - Минск. - 1978. -С. 75.

6. Хамидова X-, Мирзарахимова М. Влияние различных компонентов среды Чапека и Мендельса на образование целлюлолитических ферментов // II Республ. конф. мол. ученых. - Ташкент.- 1978. - С. 4243.

7. Ташпулатов Ж., Юсупова И.Х., Джалалова X., Мирзарахимова М. Влияние некоторых органических азотсодержащих веществ на биосинтез целлюлазы Т.lignorum-19 // В сб.: Биология и селекция микроорганизмов. - ФАН. - Ташкент. - 1980. - С. 63-67.

8. Ташпулатов Ж., Хамидова X., Абдуллаев Т., Мирзарахимова М. Целлюлазы Г,lignorum-19 //.В сб.: Целлюлазы микроорганизмов. - Наука. - 1981. - С. 114-125.

9. Хамидова X., Ташпулатов Ж. Влияние твинов на биосинтез целлюлаз // Узб.биол.журн. - 1984. - No 4. - С. 63-65.

10. Хамидова X., Ташпулатов Ж. Влияние ионов металлов на активность целлюлаз Т. lignor-um-19 // VII Всес. съезд микробиол. общества. - Алма-Ата. - 1985. - С. 156.

11. Хамидова X., Ташпулатов Ж,-Влияние поверхностно-активных веществ на биосинтез целлюлазы Т.lignorum-19 // В сб.: Мицелиаль-ные грибы. - Всес. конф. - Пущино. - 1983. С. 154.

12. Ташпулатов Ж., Хамидова X., Шадрина И.А., Машковцева A.B. Кариологические особенности гриба Т.lignorum-19 // Узб.биол.журн. -

No 2. - 1985. - С. 12-17.

13. Хамидова X., Ташпулатов Ж., Шадрина H.A., Машковцева A.B. Изучение конидиогенеза и тонкой структуры спор целлюлолитического гриба // Узб.биол.журн. - No 5. - 1985. С. 11-18.

14. Хамидова X., Ташпулатов Ж., Шадрина И.А., Машковцева A.B., Кострикина H.A., Бирюзова В.И. Динамика накопления запасных веществ в процессе развития Т. lignor-um-19 // Узб.биол.журн. - No 1. - 1986. - С.

15. Хамидова X., Юсупова И.Х., Ташпулатов Ж. Совместное культивирование грибов - продуцентов целлюлаз и белка // В сб.: Биосинтез ферментов микроорганизмами. - IV Всес. конф. - 1988. - С. 160.

Подписано в печать — -4^06 Формат бумаги 60Х84'/|в. Бумага типографская № 1. Печать «РОТАПРИНТ».- Объем Тираж /РР экз. Заказ

Типография издательства «Фан» АН УзССР. 700170. Ташкент, пр. М. Горького, 79.