Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические аспекты исследования вирусоустойчивости растений и отбора устойчивых форм

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты исследования вирусоустойчивости растений и отбора устойчивых форм"

нацюнальна академ 1я наук укра'{ни шститут м1кр0бюл0гп' i Bipycononï ím.д.к.заб0л0тн0г0

РГБ ОД

¿ 5 H'Jil i-^û на правах руколису

щербатенко 1ван Степанович

бютехнолопчн1 аспекти досл1дження в1русоот1йкост1 рослйн i добору си mix iüfm

03.00.06 - Bipycojorifl

Автореферат диоертацП на здобуття вченого ступеня доктора б!олог1чних наук

kh'íb - 1996

Дисертацхя е рукопио

Робота виконака у е1дд1Л1 фхтопатогенних в!рус1в 1нституту м1кроб!ологп 1 в1руоопог11 1м.Д.К.Заболотного НАН Укра'Иш

0ф1ц1ЙН1 опоненти:

доктор б1олог!чних наук, доктор ОЮлоПчних наук, доктор 61олог1чнж наук, академхк УААН

професор Менджул М.I. професор Кунах В.А. професор,

Кирик М.М.

Провхдна оргаш.зацхя: Нац1ональний ун1верситет

1мен1 Тараса Шевченка

Захист вЦбудеться "18 " 1995 р. о 10 год.

на зас!даннх спецхалхзозано! ради Д 01.81,01 по захисту ди-сертацхй на здобуття вченого ступаня доктора б1олог1чних наук при ¡нстктутх м!кр0б10Л0гП 1 в1руоологП хм.Д.К.Заболот-ного НАН Украхни за адресою:

252143, ки1в, вул.Заболотного, 154. 3 дисертащею можна ознакомится у бхбл1отевд ¡нотитуту мхкробхолагП 1 в1русолегII 1м.Д.К.Заболотного НАН Украхни

Автореферат дисертацП роз1слано " Ч "ЛисюооО'Ьхшь р.

Вченш секретар спецхал1зовако1 вченоТ ради

кандидат б!олог1чних наук •— Л.М.Пур1ш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТЙ

Актуальность пробдеми. BipycHi хвороби с1льськогоспо-дарських культур спричинггють значне зниження продуктивное^ рослинництва, погчршення якост! продукцН, а також швидке виродження copTiB (Шмидт и Кляйнхемпель, 1386; Власов, 1992).

Традицией методи боротьби з в1русними 1нфекц1ями, зас-нован1 на використанна оздоровленого нас!нневого або посад-кового матер1алу, ослаблених шгам1в, а також р1зноман1тних агротехн1чних та ф1тосан1тарних заход1в4 над1йного аахисту рослин не вабезпечують, а застооування пестицид1в для зни-щення nepeHOCHHKiB BipyciB поряд з низькою ефективн1стга сут-тбво загострюе проблему довюлля (Помазков, 1987; Хромова, 1980; Криволапова и Манивчук, 1982; Greenough & Black, 1990).

Найб1лып BaroMi результата в боротьб! з в!русними хворобами рослин отриман! галяхом селекцП ст1йких coptíb тради-щйним методом м1жвидово! г!бридизацП, однак бар'ери стате-boí HecyMicHOOTl культурних сортiв з дикими видами духе уск-ладнюють використання даного методу, а необх1дн1сть позбав-лення г!бридних рослин в!д небажаних ген1в дикого виду зат-ртуе селекщйнш процес до 10 - 15 pokíb (Терновский, 1971; Склярова, 1972; Расселл, 1982; Касьяненко, 1983).

Принципово новий напрямок у вир1шенн! проблеми в1русних хвороб започаткував бурхливий розвиток к1лькох галузей б1о-технологн вищих рослин, аокрема, технолог^ культивування In vitro 1зольованих оргаьйв, тканин, клхтин i протопласт!в, кл1тинно! селекцП, соматично! г1бридизацП та перенесения

1вдив1дуальних ген!в за допомогою плазм!дних вектор1в (Пла-щев и Гусева, 198S; Бутенко, 1987; Г артель к Мелик-Саркисов, 1988; Larkin et ai., 1989; Van den Elzen et al., 1989).

Сучасн1 6iOTexHcmori4Hi методи дають мошшасть вивчати механ1зми 1нфекц1йного процвсу i аахиояих реагацй рослин на молекулярному, шатанному i тканинноыу р1внях, конструювати модельн! штамп BipyciB i клони рослин, а тачок швидко отри-мувати BipycocTiÔKi сорти, використовуючи нетрадищйн! дже-рела ст1йкост1 га систеыи клИинноЧ селекцП (Wenzel, 1985; Webb, 1988; Гусева и др., 1990; Сидоров, 1390).

Мета та задач1 доол!дження. S метою досшдження меха-

HÏSMiB BipyCOCTlHKOOTi РОСЛИН 1 ОТршаННЯ OTiHKHX клон 1в

культурник сортîe методами бютехкологп передбачалось вир1-шення таких задач:

1. Провести пор!вняльн1 досл!дження ctIhkoctî до ХВК та ВТМ у селекц1йник форм картопд! на модел! рослин, 1вольоЕа-них протопластов 1 трансгенних л:н!й.

2. Вивчити прояв набуто'1 ст1йкост1 до ВТМ, ВБТ, ХЗК та УВК у звичайних рослин, трансгенних лШй, сомаклон!в, про-TOKHOHiB, андраклон!в i прямих регэнерантхв тютюну.

3. Визначити к1льк1оний виххд та характер спадкування CTiKKOCTi до ВБТ у сомаклональних BapiaHTiB сприйнятливих сортов тютюну.

4. Отримати CTiäKi до ВБТ рослини тютюну методами подо-лання м1жввдово! неоум1сност1 та добору ст!йких зраэк1в на гапло:дному piBHl.

Наукова новизна. Вперше огриман! трансгенн! л!нп тютюну, щр екопресують ген (2'-5')ол1гоаден1лзтсинтетаэи mmüI i проявляют OTiüKiCTb до pisHHX труп BipyciB: tobamovirus

(ВТМ), potexvirus (ХВК), potyvirus (YBK) та tomato spotted wiit virus (ВБТ).

Вперше виязлено:

- здатн!сть антисыислового гена 61лка оболонки ХВК за-хшцати трансгеяк1 рослини в!д уранення даним в!русом при ви-сошк 1нфекц!йних навалтаженнях;

- принципов! BiAMiHHocTl у взаемов1днооинах ХВК i ВШ з еисгремадьно спйккми формами картошп: блокування X-Bipyc-ко'2 1нфвкц15 на кл!тинному р!вн1, а ВТМ - на тканинному;

- широке вар^юваяня piasiB 1ндуковано2 сг^йксет!, кек-рогизацП тканин i лскал!зац!1 BipycKO'i 1нфекцП у надчутли-вих до ВТМ рослин тютюну та !х протокдон!в;

- спонтакну ел!тнац1Ю ВБТ з 1нф!кованих калусних культур в npoyeoi ix пасажування i регенерацП сомаклслив;

- високу ефективн!сть передач! прямим регенерантам тютюну CTiKKC-CTi до ВТМ, 1ндуковано] у рослик;

- загабелъ Bcix хнфхкоЕаних ВТМ протопласт!в надчутли-вих рослин тютюну на рзнн!х стад1ях регенерацП протоклок!в.

На основ! анал1зу результат!в доол!джень ! данкх л!те-ратури вксунута концепция кл1тинно-!нженернсЛ технолог!i от-ршання в!русоот!йких рослин.

Практичне значения. 0тримак1 результата сприявть бшш глибокому poayMiHHK) процес!в становления i nepefliry Bip'/снкх !нфекц!й та захисних реакц!й рослин, що s необх!дною перэду-мовои для розробки ефективних заходis боротьби в в!русними хворобами с!льськогосподарських культур.

Безпосередне практичне значения маить:

- розроСлбкий cnociC добору спйких до ХВК селегацйаих зравк1в картспл!;

- передан! Кримськ1к дослхдн1й станцН тютюнництва GTiKKi до ВБТ сомаклональнх варианта культурних сортхв та фертильнх формм мхжвидових riöpiifliB тютюну;

- отримаш от1йк1 до ХВК траногенн! л1нП районованих copriB картошп, а також трансгешп клони тютюну з в1днооною от1йк!стю до комплексу BipyciB.

В лабораторий пратаищ можуть бути використанх оптимх-эован! умови вид!лення та 1нфхкування ХВК та ВТМ 1эольованих протоплас?1в тютюну i картоял!, а також nifliöpaHi живилънх середовища, умови генетично! трансформаци рослин i регеке-рацП сомаклонхв, протоклон1Е та андроклонхв.

Апро5ац1я робота. Матерхали дисертащ 'i допов1дадись i обговорювапксь на м1жнародних сишюз1умах в проблем ctíükoc-Ti рослин до хвороб та шк!днкк1в (Halle, 1982), з Хмуногене-тики рослин (Sofia, 1986), а фундаментальна i прикладних проблем ф1гов1русологх! (Yalta, 1994), з екологП BipyciB (Shatzk, 1995); Всесоюзних нарадах з 1мун1тету схльськогос-подарських культур до вхрусних хвороб та шкхдникхв (ВХльнюс, 1984; Рига, 1986), Ехрусних хвороб рослин (Лен1нград, 1978; Вхльнюс, 1984), проблем ф1тонцид1в (Кихв, 1979, 1981); Всесоюзна науков!й конференци, присвячен!й 100-р1ччкз вхдкриття BipyciB Д.I.1вановським (Ростов-на-Дону, 1992); Республ1-KSHCbKiH нарад! з п1двищення продуктивност! картоплярства (НоЕа Каховка, 1990); 3''i здах Всесоюзного (Алма-Ата, 1385) та Укра'1нсъкого м!кроб1олог1чного товариотва (Днхпропет-РОЕСЬК, 1980; Донецьк, 1984-, ЧернХвиД, 1989; Одеса, 1393); засхданнях вхдд1лу ф1топатогенних BipyciB та секци Вчено'х ради з проблеми "Молекулярка б1олог!я" 1нотитуту míkpoSíojo-ri'i i вхрусологП HAH Укра'1'ни.

- Б -

Публ!кац!1. Sa матер1алами дисертацп опублжовано 29 poßir, у тому числ! 17 статей, 3 огляди та практичн! реко-мендацП.

Структура та об'ем роботи. Дисертац!я викладена в одно-, му том! i мае так! складов! частини: Вступ, Огляд л1тератури (2 глаз;:), ,\!зтс-р!2ли i методи, Результати експррим^нталъних дослдаень (4 глави), Обговорення результат, Висновки, Пркштки, Список цитовано! л1терзтури (554 джерела) та Дода-ток (матер! али Бпровадження). Текст займаэ 272 стор. машино-пису, !люстративний матер!ал включае 33 таблиц! та 35 рисун-

KiB.

Конкретна особиста участь автора. Робота виконана автором особисто i в!дпов!днс до тематичних план1в НДР в!дд!лу ф!топатогенних BipyciB 1нституту м^робюлогП i в!русологП HAH Укра"1ни та конкурсных проект1в науково-досл1дних роб!т ДКНТ. Дисертантом поставлен! задач! роботи, запланован! ета-пи и виконання, BiiöpaHi шдельн1 об'екти i методи досл!д-жень, узагадьнен! 1 проаная!зован1 отриман! результати. До проведения досл!дхень були залученх 1нженери та лзборанти в1дд!лу, а такси студента п!д безпооередн!м кер1вництвом автора. Ссновна частина роботи виконана за участи !нжекер1в Л.Т. Олещенко та З.М. Олев!нськоь Окремг досл!ди проведен! сШлько з науковцями IMB HAH Украши О.Г. Коваленком (вив-чення екстремально! ст!йкост! та надчутливост!) та В.М. Ро-маненком (прикр!плення агробактер1й до хзольоваяих протоп-ласт!в), а також з !нженерами 1нсти?уту кл!тинно! б!ологП та 1нженерП HAH Укра'хни Т.Ц. Глагоцькою (генетична транс-формацзя культурних copTiE каргспл!) та I.A. Сакченко (отри-мання трансгенних л!н!й тютюну).

- 6 -

На захист вгаюсяться так! положения:

1. Екстремальна ст1гойсть до ВТМ у С1янця картопл! 1БВА 41356 та оорт!в Сако, Анет 1 Сафхр являв собою гостро ви-ражену форму реакцН надчутливосП до в1русу.

2. Локал1зац1Я в1русу, некротизац!я тканин а розвиток 1нду-ковако! ст1йкост1 у надчутливих до ВТМ рослин тютюну ма-ють сшльний механизм активацН, але функщонують як са-мост!йн! процеси.

3. Ген (2'-5')сшгоаден1латсинтетази, який кодуе ключовий фермент з.нду ковано! интерфероном системи захисних реакций в кл1тинах хребетних, мае здатн!сть пригн1чувати вхрусну !нфекщю в трансгенних рослинах тютюну.

4. Генно- та кл1тинно-1нженерн1 технологи дають мояшшоть отворювати зручн! модельнх об'екти для вивчення мехарлз-м1в 1нфекц1йного процесу та захисних реакщй рослин.

II. ОБ'БКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ

Моделью об'екти. В робот1 були використан1 найб!лыл розповсюджен! ф1топатогенн! в!руси та селекц1йн1 форми (видя, л1н11, сорти та гЮриди) важливих сальськогосподарських культур:

- звичайний шгам (III) вирусу тютиново'1 моза!ки (ВТМ); вид1лений нами польовий !золят У-в1русу картопл! (УВК); су-ворий итам вхрусу 0ронзовост1 томатов (ВБТ, Щербатенко и др., 1991); суворий (Хс), розлитий (Хр) 1 КШВСЬККЙ (Хк) штами (Шелудько 1 Козар, 1967), а таксик вид!лен1 нами !голя-ти Хд, Хт та Х*25 Х-в1русу картопл! (ХВК);

- селекц1йт фарш картогш S. acaule f. schreiter: Buk. (ciHHiU 7K154 та N4), 5. demissum Redick! (лШя 521), S. chacoense Bitt. (лШ1 8к1659, 126/70-5 та 47/74), S. pin-natiscetum Dun. (лШя 54/79-1) та S. . tuberosum L. (ссрти Привкульський paHHiä, Зарево, Cbítskok, Темп, Льв!е'янка, Оако, Ане1?, СяфЗр. 1нцухтована Л1н1я сорту Ерлайн (125), ci-янець USDA 41S56 та г1брид Рання posa х Ерлайн (1126-6);

- дик! види тютюну (N. alata, N. glauca, N..,sanderae, N. didebta), с.орти N. tabacum - Американ 3, Американ 3»., Американ Бж, Американ 307, Дюбек 50, Любек новий, 1мунний 580, Кримський степовий, Крупнолистой БЗ, Мамонт, Остролист, Переможець 83, Пбрид Американ 5 х Американ 19, а також mík-видов! г!бриди - Американ 351 х N. ssnderae (Асан), Курчавий 73 х N. sanderae '(КС), Харманл! х N. glauca (XT), Курчавий 140 х N. glauca (КГ), Трапезонд 19 х N. glauca (TT) та N. tabacum N10 х N. glauca (ЮГ).

Методи доол1дження. Штами та 1золяти BipyclB п1дтриму-вади i накопичували на спркйнятливих рослинах картошй, тютюну або дурману. Очищен! препараги Bipyoy вщцдяли методом диференц!иного центрифугування (Коваленко и др., 1985), ф1льтрували через мембранн1 ф1льтри i söepiram в задаяних ампулах у холодильнику (Щербатенко и др., 1988).

Чистоту 1 концентрате отримаких в1русних препарат!в визначали спектрофотометричним методом (Stevens, 1983) на рееструючому спектрофотометр! Specord UV VIS (ФРН), !нфек-ц!йн!сть Bipycy - на рослинах-!ндикаторах, як! реагують ч!т-кими локальними некрозами на ВТМ (дурман Datura stramonium), ХВК (гомфрена Gomphrena globosa), ВБТ (петун1я Petunia hybrida) та УВК ( г1брид Solanum demissum А6).

Для виявлення BipycHoí iH$es4i"i в рослинних тканинах та протопластах використовували методи хмуноферментного ана-л1зу (Clark 8r Adams, 1972), флуореоц!шчкх антит1л (Takebe, 1975; Sarkar, 1977), а також аглютияацП хлороплаоив, та прецип1тацП (Matthews, 1957).

Вих1дн1 досл1дн1 рослини, а також отриманх клони виро-зцували в теплиц або вегетац!йному будиночку на сум1ш! лхсо-вого грунту, р!чкового nicsy та перегною (2:1:1). Для постановки досл1д1в, що потребують певних умов ссвз.тлення, температуря та Бологом!, рослини культивували в юйматичних камерах Feutron 3001 (ФРН), KTLK 1260 (ФРН) або ВКШ-73 (Ужгорода» кий машинобуд!внкй завод).

Культурк 1зольованих органов, протоплаот1в, калусу, а також ексоданти лиохк1в та стебел отримували а поверхнево стерил!эованаго росдшшого матер1аду (Сидоров и др., 1985), який висадаували на живильн1 середовища в ламшарному бокс! УО-БВ (Ужгородський малкнобуд!вний завод) 1 культивувзли в асептичних умовах в клхматичних камерах при оптимальних режимах температуря, ехдносно! вологост!, осв!тлення та фото-пер!оду.

1зольован1 протопласта мезоф1льних ¡штин тютюну i кар-топл! вид!ляли ензимзтичним методом (Takebe et al., 1968), використовуючи сум!mi мацерозиму та целюлази (Muhlbach, 1982; Коваленко и др., 1985). Концентрацию протопластов виз-начали за допомогою камери Фукса-Розенталя, життездатн!сть -методом Eiтальних барвник1в (Maule et al., 1980), В залеж-hocti Bifl комб!над!й Bipyc-рослина для !нф1кування протопласт викорисговували так! методики: ВТМ-тютюн (Otsuki et

с

al., 1972), ВТМ-картопля (Коваленко и др., 1985), ХВК-кар-

топля (Щербатенко и др., 1984), ХВК-ткзтюн (Otsukl et al., 1974).

Трансгенн! рослини отркмували шшхом .генетичнз! транс-формацП сегмвнг!в стебел картопл! смисловим та эятисмксло-вим генами С1лка оболонки ХВК та трэнсформацП листкових дис.нав тютюну смисловим геном (2'-5')ол1гоаденхлатсинтетази мишх. Експресуючх плазмХдн! вектори з генами б!лка оболонки ХВК (Шульга, 1991) були отриман! з центру "Б1о1нженер1я" АН Pocl'i, а вектор з геном (2'-5')ол1гоаден1латсинтетази (Ichil et al., 1986) - в1д доктора Т. Тер! (Е!отехнологхчний !нсти-тут Хельсхнського ун1верситету). Трансформацию проводили методом агробзктер1альнох 1нфекцП (Horsch et0.-al., 1985; De Block, 198В), регенерацз.ю та BiflCip трансформантiв - на жи-вильних середовшцах з канамхцкном (Глагоцька та 1н., 1990; Сайченко та хн., 1992). Транскришдю !нтегрованого гена ви-являли методом Нозерн-блот-гхбридизацП росликних РНК з плазм1дним ДНК-зондом до вхдпов1дного гена (Маниатис и др., 1984), транслящго - методом Вестерн-блот-г1бридизацП з ви-користакням тшклональнз! кролячо: антисироватки до бз.лка оболонки sipусу (Hoeksma et al., 19Э9).

Кл1тинн1 клсни рослин регенерували з калусних культур (сомаклони, SCO), мезофхльних протопласт!в (протокдони, РО), пилкових зерен (андроклони, АО) та клз.ткн листкових екоплан-т1в (прям! регенеранти, R0).

Процедура регенерацП сомаклонхв включала: 1н!ц!ац1ю калусу на живильнему середовищ1 MSK, 2-3 пасазхування культу-ри на даному середсвиш з тритижневим 1нтервалом, 1ндукуван-кя морфогенезу i вирощування пат он i в на середозия! MSP, уко-р!нення пагон1в на середовшцх iviSO 4 висадку регенеракт!в у

сгерильний грунт у золог1 камери i пересадку рослин у зви-чайнгй грунт (Щербатенко и др,, 1939).

3«рший етап регенерац1'1 прстоклон1в (до стад!: видимих м!крокоЛинiй) проводили в р!дкшу живилънсму середовищ КзШ (Nsgy & Ma'.iga, 1976) за Сидоровим (Сидоров и др., 1985). Суспбнз1в м' кроколон1й р!вном!рно розподхляли на поверхн! агаризованого живильнсгс- середовица MSK i стримували роолини за ыэтодикои ре^нерацП сомаклон!в.

Прям! регенерсиТк ш отримувади безпосередньо г юйтин листковик eKciuiaKTiB vstolarz et al., 1991) шляхом ¿ндуку-вання органогенезу на живкз^^му середовищ! MSP14. Зачатки naroHiB, огриманих на даному седловину., вирошували, ущл-нювали i висаджували в грунт.у такий же опос15, як ! пагони сомаклон1в.

Андроклони регенерувади з пилкових зерен мсгпдих пиля-KiB, вилучених з кв!ткових бутон1в на одноядерн!й стадП розвитку м!кроспор (Hefcerle-Bors, 1985). Ем5р!о!ди отрямува-ли на живиль ному середовищ! LSU, зачатки пагон!в - на середовищ! MS42. Пагони вирсщували на живильному середовища MSP, укоргнювали на середовищ! MSG ! висадяували в грунт (Щербатенко, Олещенкг, 1093).

Для отримання подвоених гашкидхв використовували явище спонтанно! пол1пло!дизац1Ч кл!тин в калусних культурах (Kssperbauer & Collins, 1972), а також методи калх1цинування калуоу, обробки рослин-perенерант!в парою аценафтену та кол-хщшування верх1вкових меристем гапло'!дних андроклон!з (Chen, 1979; Абрамова и Карлинокий, 1979; Wong, 1983). Fi-вень luioi'fiHOCTi рослин назначали ва кЫькютю хлоропласт!в у замикаючих кл!тинах дихалэць (Frandsen, 1968) або за к!ль-

Шстю хромосом у метафазних пластинках клхтин первинних ко-р1нц1в (Сидоров и др., 1985).

Тестування вихЦного матер!алу та отриманих клонхв на ст1йкхсть до вхрус1в проводили через 20 - 40 дн!в п1сля п1-к!рування розсад'и або висадки в грунт первинних регенерант!в (у фаз! 5 - 7-ми справжн1х листк1в) за умов мелан1чно1 Оскуляцию рослин скляним шпателем, змоченим вхруским 1нокули-мом (досл!д) або вх.дпов1дшш буфером (контроль). Типи та р!вн1 в1руссог1йкост1 визначали за такими основними показни-ками: динашка розвитку 1 характер симптомов в1русного ура-жеяня; розмхр 1 швидк!сть росту локальних некроз!в; накопи-чення в1русу в тканинах 1 к1льк1сть уражених кл!тин.

Ст1йкх до ЗБТ клони тютюну выбирали в посл!довних покол1ннях потомства первинних сомаклонхв, протокгон!в та аядрокяон1в, як1 не уражувались данкм в!русом теля 4-х пос-лхдовних: 1нокуляц1й рослин з Ю-денннш интервалом. В кожному покол1нн1 вхдбирали клони з найменшою кхлькхстю уражених рослин, серед яких добирали стз.йк1 зразки з найбхлып вираже-ними сорговими властивостями та хнтенсивн1стю росту. У по-дхбний сяосхб сомаклонального добору отримували тавож клони надчутливих до ВТМ рослин тютюну з контраотними типами реак-цП на ВТМ: моза"1ка, системний некроз, др1бН1, середн! чи зелши локальн! некрози.

Статис-тичну обробку експериментальних даних проводили за парзметричкими критер1ями нормального розподхлу Еар1ант (Урбах, 1985) методами попарного П0р1вняння (Маслов, 1958) та трансформацП даних (К1ес2ко№з1а, 1958). Статистичн1 по-казники: середне арифметичне (я), середню квадратичку пехкб-ку (б), стандартну похибку (т) та дов1рчий 1нтервач при р!в-

Hi значущост1 0,05 (s ± б x t) вираховували на комп'ютер! sa статистичними функц!ями программ Supercalc. На граф1ках, представлених у дисертацИ, навэден1 аереднх арифметичн1 та довхрч! ¿нтервали, у таблицях - эередн! арифметичн! та стандарты! похибки. Без статистичних показник!в у дисертацП подана деяк! демонстрации! рисунки та узагальнзоюч1 таблиЩ.

III. СПЙКГСТЬ КАРТОШП ДО ХВК ТА ВТМ

8 метсю з'яоуваяня р!вня специф1чност! цодо sipycy та особливостей функц1онування захисних механ1зм1в рослин, hkí эабезпечують р!эн1 типи ctíhkdctí до ХВК та ВТМ у картопл! (Склярова, 1972; Hansen, I960; Horvath, 1968; Chrzanowska et al., 1973;"Ларина, 1978), нами проведен! пор1вняльн1 достижения ctíhkoctí селекц!йних форм картопл1 до даних BipyciB на piBHi рослин, 1зольованих лротопласт1в та трансгенних л1~

híh.

Прояв от1икоот1 на píbhí рослин. За умов механ1чно1 шокуляцП рослин встаноБлено, щр спршнятлив!. до ХВК селек-щйн! зразки картошй мають р!знг типи ст1йкост1 до ВТМ. Вони реатують на хнокуляц1ю даниы BipycoM безсимптомною системною 1нфекц1вю (сорт Ердайн), шеидкою некротизац1ею i вхд-миранням Шкульованих листк!в (S. demissum), системною мозаикою (лiнiя S. acaule М4) або др!бними локальними некрозами (сорт ПриБкульський ранн!й та гибрид Рання роза х Ерлайн).

Екотремально ст1йка до Х-в1русу лШя 5. acaule 7к154 легко уражуеться ВТМ, однак оорти Анет i Сафхр, як! отримали ген cTiÜKQOTi до ХВК в1д S. acaule, проявляють екотремальну CTiHKioTb i ¡цодо ВТМ. В той же час екстремально ст!йкий до

ХВК С1янэць USDA 41356 1 сорт Сако, hkí мають ген cxíiikoctI S. andigenum, реагують на ВТМ локальними некрозами (с1янець 41956) аОо др1бними хлоротичними ураженнями (сорт Сако).

При iнокуляцх i рослин ayuímatm ХВК i ВТМ у екстрвмально ст1йких до ХВК форм картопл! споотйрггякться нменшення нако-пичення ВТМ у тканинах пропорц!йно зб1льшенню кснцентрацзл X-Bipycy в 1нокулюм1, а у сприйнятливих зразк1в з'являються локальн! некрози, hkí не викликають hí ХВК, н! ВТМ окремо. Некротична реакщя проявляемся в широкому д1апагсн1 кон-центрад!й Bípycia у змгшаному 1нокулюм1 (табл. 1) i прита-

Таблиця 1

Некротична реакгЦя сприйнятливо! до ХВК л!нП картопл1 S. acaule на 1нокуляц1ю рослин сум1шами ХВК 1 ВТМ

Концентращя BipyciB Середня к1льк1сть локальних

в 1нокулкш, мкг/мл некрозiв на 1 листок

ХВК ВТМ

0 100 О

1 100 2,1 ± 0,7 10 100 19,4 ± 2,0

100 100 47,7 +7,4

100 10 29,7 ± 3,4

100 1 6,9 ± 1,4

100 О О

манна р!знкм л!н!ям 1 сортам, сприйнятдивим до ХВК. Де явище було покладене в основу розробленого наш способу добору ст1йких до ХВК селекц!йних зразк!в картошл ( Коваленко и ДР., 1084).

Таким чином, на р1вн1 рослин у екстремалънс ст!йких до ХВК селекщйних форм картоша проявляются спхльн! чи по-д!бн! захиснх механ!зми, яга. забевпечують висску спйкЛсть IX до ХЕК 1 ВТМ, а також суттвву в!дм!шпсть екстремально ст1йких вразк!в в1д сприйнятливих за реагацею на сум1ш в1ру-

с1в. ■

Прояв от1йкоот1 в 1вольованих протопластах. В1русоло-гачн1 досл!дження на модел! !зольованих протопласт1в картоп-л1 зперше проведен! нами. В зв'язку з цим виникла необх!д-н^сть роаробки методик 1х вид1лення та !нф!кування.

Нами п1д1бран! концентрац!': ман1толу, мацерозиму та це-люлази, а також умови мацерацП тканин, як1 забезпечують стаб1льний 1 високий вих1д !нтактних мезоф1льних протоплас-т!в в листкових експлант1в доса&дних сорт1в картошп. За сп-тимальких умов вщцлення протопласти мають сферичну форму, ч1тку плазматичну мембрану, р!вном!рний розпод!л хлороплас-т!в навколо центрально: вакуол! (рис. 1), !нтеноивний циклов цитоплазми, а також здагн!сть зв!льнятись в1д в:тальних барвнкк!в, шр св1дчить про :х високу життЕздатн1сть.

Шляхом оптим1зац!1 концентрацН в!русу, под!-1_-орн1тину та рН !нскулюму, п!д1браних для !нф!кування протопласт!в тютюну Х-в!русом (ОЬэик! а1., 1974) та ВТМ (ОЬзик! ©I а1., 1972) наш розроблен1 методики !нокуляцП, що забеэпечують !нф1кування даними в!русами до 40 - 60% протопластхе картоп-л! (рис. 2).

Рас. 1. МезофШн1 протопласта картошп, видз-ден! одноступе-невим методом за допомогсю мацероаиму i целалазк

Рис. 2. Флуоресценция 1нф1кованих ХВК дзольованих протоплас-TiB KapxoijLSi (сорт Приекудьський pSHHilï)

- le -

Пор1вняння накопичення ХВК i ВТМ в 1нокудьованих протопластах тютюну i картоши показали, щр в протопластах сприйнятливо! до ВТМ лШ1 картопл! S. acaule N4 i надчутли-вого сорту Приекульоький ранн!й накапичубться однакова к!ль-к1сть Bipycy (табл. 2). У пор!вняюй з цими рослинами у екс-

Таблиця 2

Накопичення ХЕК i ВТМ в протопластах тютюну í картоши в за-лежноот! в!д типу ctíükootí росдик до Bipycy

Досл1дн1 Тип ctíüko- Накопичен- Тип ст1йк0- Накопичен-

рослини otí до ВТМ* ня ВТМ** ctí до ХВК ня ХВК**

Картопля

S.acaule N4 с 505 ± 141 С 37+9

Привкульсь-

кий рашпй н 510 ± 97 С .107 + 20

Сако Е 7Б5 ± 103 Е 3+2

Caáiip Е 720 + 108 Е 4+1

Анет Е 397 ± 82 Е 7+2

Тютюн

Самсун С 1560 + 497 С 380 + 127

1мунний 580 Н ^870 + 150 С 24 ± 5

N. glutinosa Н 3020 ± 632 С -

Самсун 27 Н - С 92 ± 19

*С - сприйняиашсть, Н - надчутлив1оть, Е - екстремальна

от1йк1оть; **К1льк1сть некроз!в/лист на рослинах-1нджато-рах, 1нокульованих екстракташ з протопласт1в (100000/мл)

тремально стхйких сортхв Сзко та Саф1р к!льк1сть ВТМ в протопластах дешо бШша, ала у сорту Анет мента. В протопластах надчутливого виду тютюну И. glutinosa р!вень накопичення ВТМ у два рази б1льший, нхж у спркйнятливого сорту Самсун 1 в три рази п?р?вищув р1вень накопичення Bipycy в протопластах надчутливого сорту 1мунний 580. В протопластах тютюну, яккй не в природним хазя5ном ХВК, даний aipyo репродукувться меяш 1нтенсивно у порхвнянк! з ВТМ, однак i в протопластах природного хазя!на (картоплх) рхвень накопичення ХВК значно менший, нхж ВТМ.

Отже надчутливютз та ексгремальна ст1ккхсть до ВТМ у дослхджених форм тютюну i картоплх не проявляемся на катанному píbhí: хзольованх протопласти цих рослин здатк! п1дтримувати 1нтеноизну репродукцхю sipycy. Виявлен! в1дмхн-ност! у накспиченн1 ВТМ, очевидно, пов'язакх з ткм, що для р1зних систем в!рус-рослина потр!бн! piaHi умови видхлення та 1нф1кування протопласт!в (Muhibach, 1982; Sander & Merts, 1984 ). Цхлком природньо, цо умови поставлеких досл1д1в вия-вились б1лъш придатними для одних ком51нацхй в1рус-роолина, нхж ДЛЯ З.НШИХ.

Екстремальна сййшсть до ХВК у ссртхв картопл! Сако та Анет на в!дм!ну в1д ctíhkoctí до ВТМ проявлявться на юйтин-ному р1вн1: накопичення sipycy в протопластах не перевицуз 3 - 7 некрозiв на 1 листск гомфрани.

Прояв ст1йкостх до ХВК у трансгенних кдон!в. На моделх трансгенних рослин була дослхджена ст!йк1сть до ХВК, до вик-ликавться за рахунок експреси гена бхлка оболонки даного sipycy в сшюлозт та ангисмисловхй орхвнтацхях вхдносно промотора.

- 18 -

Анал1з транскрипци 1нтегрованого генз показав, що смисловий ген транскрибувться значно 1нтенсивнше .(рис. 3, доршка 3), н1ж антисмисловий (дорхжки 1,2). а С1лок оболон-ки сиктезуеться лише в тих рослинах, як1 мають смиолову орЗ.-бнтащго гена (рис. 4, дорхжка 1).

12 3 4

Рис. 3. Аналхз транскрипц!"1 гена б1лка оболонки ХВК у трансгенних л!н1й картопл1. 1,2- сумарн! РНК л1-н!й Л6/15 та Л7/15 (сорт- Льв1в'янка, антисмисловий ген); 3 - РНК л1нП 31/1 (сорт Зарево, смисловий ген); 4 - РНК нетрансформованих рос-лин сорту Льв1в'янка (контроль)

При механ1чн1й 1кокуляц11 трансгенних лШй К-в1русом (2 мкг/мл) встановлено, що як смисловий, так 1 антисмисловий гени проявляють виразкении захисний ефект (рис. 5). У пор!в-нянн! з контролем какопичення в!русу в 1нокульованих листках

зменшуеться на S0-1Q0£, а в EepxHix листках - на 70-95%.

Рис. 4. Синтез б!лка оболонки ХВК в трансгенних монах картопл1. 1 - л!н1Я 31/1 (сорт Зарево, смис-ловий ген); 2 - лШя Л6/15 (сорт Льв1в'янка, аятисмксловий ген); 3 - лШя Т1/15 (сорт Темп, антисмисловий гев); 4 - нетраноформована рослина сорту Зарево; 5-26 кДа фракц1я бхлка оболонки ХВК; 6 - б!лок оболонки ХВК

0триман1 нами траксгекя! клони становлять 1нтерес як ви-х1дний матер1ал для селекцп картопл! на ст!йк1сть до ХВК, а також як модельн1 об'вкти для доол1дження механ1зм1в 1ндуко-вано! BlpycoOTiiíKOCTi рослин.

Подальше досл!дкення Ьчдуксвано'! ctííikoctí та зв'язку Ti з локал1защ5ю Blpycy i некротизахЦею тканин проводили на

«"«¡а» «ЯМ»

1

3 4 5 6

моделях прямих регенеранИв, сомаклошв, протоптан is та трансгенних лШй тютюну.

Рис. 5. Накопичення iF-фекц! иного ХВК у тканинах трансгенних рослин картоплй через 10 (A) i 30 (Б) дн1в п!сля 1нокуляц11. 1 - контроль; 2 - 8 - трансгенн! aiHi'i: 2 - Л1/15; 3 - Л7/15; 4 - Лб/1; 5 - ЛВ/15; 6 - Л6/15; 7 - 31/1; 8 - Т1/15

iy. сийкють тютюну до втм, вбт, хвк та увк

Локал1зад1я BipyoHO'i 1нфекц11 i розвиток 1ндуковано1 cTiHKocTi у рослин. На моделi рослин досл!джуЕали динам!ку росту локальних некроз!в i роавитку !ндуковано! ст!йкост! до ВТМ у 4-х форм тютюну: сортiв Самсун 27, Самсун 158-7, 1мун-ний 580 та амф1дипло!да N. didebta.

Встановлено, що у сорту 1мунний 580 !ндукована стай-

* 188

Й □

1 2345 6 78 Трамсгенн! рос ливни

кЮть з'являвться nlSHime, н1к y N. didebta, але розвивзвть-ся швидше i досягае С1лып високого р1вня (табл. 3). Тобто, в даному випадку cnocrepirasibca пряма залелнпсть mîm локалЬ

Таблиця з

Розвиток локальних некрсэ!з та 1ндуковано'1 ст!йкоот1 до ВТМ у надчутливих рослия тютюну

Тютвн Локальн! некрози 1ндукована стптасть

д!аметр швщщсть через 8 npiîpiCT,

через 8 росту, мм дк!з, % S /день

днхв, мм за день

N. didebta 5,7 1,20 55 7,3

Самсун 158-7 5,1 0,94 54 6,3

Самсун 27 3,8 0,94 43 2,5

1мунний 580 3,7 0,75 73 15,0

saaisK 1нфекцП i розвитком набуто"! от!йкост1. В той же час сорти тютюну Самсун 158-7 та Самсун ?7, ят. значно в!др1зня-ютьоя за розм1ром некроз1в та швидк1стю ïx росту як м!ж собою, так i в!д N. didebta, за проявом набуто! CTiiiKocTi по-дабю до N. didebta. Близью за ефективн!стю локал!зацП 1н-фекцП сорти 1мунний 580 га Самсун 27, навпаки, значно в1д-р!зняютьоя тк собою як за максимальною величиною 1ндукова-hoï ст!йкост1, так i за динам!кою И розвитку.

Отриман! результата св1дчать про те, що суперечлив!сть

даних лiГератури пра взаемозв'язок м!ж локал1эац!бю Bipy-су, некротизац1ею тканин та !ндукованою ст!йк!с?ю (Ross, 1966; Roberts, 1982; Wu b Dimitmann, 1970; Loebenstsin, 1972; Chessin, 1S81) мозкуть бути насл!дкоы використання р!э-них copTiB рослин в роботах р1зних автор1в. В зв'язку з цим подалып! досл!дження буди проведен! на моделях сомакдск!в, протоклон!в i пряшх регенерачтгв надчутливого сорту тютюну 1мунний 580.

Прояв реакц11 надчутливост! у кл!тинних клон!в. Досд1д-Hi прям! регенеранти (Ri), сомаклони (SCi), та протоклони (Pi) отримували з рослин з одукованою ctíékícth, а е1дпо-BiflHi кантрольк1 зразки: (Rk), (SCk) та (Pk) - з 1нтактних рослик.

Встанавлекс, цо bcí прям! регенеранти рослин з !ндукова-ною CTiímiciB реагують на ВТМ лише дрхбними некрозами, в той час як сом&члони, протоклони i контрольн! Еар!анти мають fiPi6Hi, cepeflHi i ведик1 некротичн1 ураження у сшвв1дношен-hí близькому до 20:60:20 в1дсотк!в (табл. 4).

В потомства первинних протоклон1в РкО, що реагують на ВТМ др1бними некрозами проявляемся висока м!нлив!сть за к!льк1стю та розм!ром локальних некроз!в, а також вищеплю-ються зразки з розпливчастими некротичними ураженнями, сис-темним некрозом або MoaáiKoso (рис. 5). Незваэкаючи на це, в потомств! Pkl був в!д!браний клон 6, у якого рослини з древними некрозами складали 40?., в поколхнн! Рк2 - клон 10 (18,47. рослин э дрЮнши некрозами в1д загально'1 к!лькост1 i 47,4?. в1д некротичних форм). Клон 35, в1д!браний в 3-му по-nmíHHi, реагуе на ВГМ лише дрхбкими некрозами з середн!м д!-аметром 0,56 ± 0,18 мм. Аналогiчнкм способом був вЩбраний

клон 29, який pearys на (3,44 ± 0,40 мм).

РТМ перезажно великими некрозами

Таблица 4

Розпод!л рослин-perенерант!в кадчутливого до ВТМ сорту тютюну 1мунний 580 за розм1ром локальних некров!в

В1дсоток рослин, що мзють:

Досл1дн1 вразки Bapi-анти досаду*

Прям! регекэ-ранти (R)

Соманлони (SO) Протоклони (Р)

РЛ Rk

SCi SCk

Pi Pk

др1бн! некрози

100 18

15 13

24 17

сэредн! некрози

О БО

62 58

53 50

велик! некрози

О

23 29

20 33

*! - регенеранти рослин з !ндукованою ст1йк!стю; к - регенеранти !нтактних рослин (контроль)

Отриман! результати п1дтверджувть данх про в1дсугн1сть т1снсго зв'язку М1ж локал!зац!ев sipycy, некротизащею тканин 1 резвктком 1ндуковано1 criÄKocTi, оск1льки ц! оэнаки у piöKHx кл1тинко-1нженерних клон!в одного сорту тютюну (1мун-ний 580) проявляються 1 сладкуються незалежно одна в1д од-

160 п " 75 .

с

I т .

Н * *

•в«'

д 25 _

0 .

Ркс. 6. До51р протсклон!в тютюну, яр реагують ка ВТМ др!б~ нкки негфозамн. РкО, Рк1, Рк2, РкЗ - поса!довя1 покагиння протсклошв. 1 - др!бв!, 2 - середн!, 3 - велик!, 4 - ровплкзчаст! некроги-, 5 - шваДка

но!. Це дае мойлиб1сть добирати клони рослин г рханими типами реакцП на в1рус 1 використовуватк 1х як генетично 1 б!о~ х!м1чно однор1дний експериментальний матерХал для вивчення мехаи1гм!в природно! та !ндуковано1 стхйкосП рослин до ва-русхв.

Враховуши численн! дан! про шдукування в1русост1йкос-т! рослин ол!гоаден!латами (2-5,)А, нами досл!джена ст!й-кють до ВТМ, ХВК, УВК та ВБТ у трансгенних клон!в сприйнят-ливого тютюну, здо експресують ген (2'-5')ол!гоаден1латсикте-тавк мка!.

Ст1йк1сть до в!рус!в у трансгенних клон!в. У п'яти трансгенних рослин сорту Мамонт, в!д!бранкх на селективному

ИЛ РИ РкЗ

середовкзЦ з кангайцкнсм, зиязяена тракскритйя 1ягегрсвано-го гена (рис. 7). На enfoîicïb до Bipycis були перев:рек1 3

Рис. 7, Нсзерн-блот-г1еридизац1я РНК траксгеяних рсолин тютюну, трансфсрмованкх геном (2~5)А-скктетази. 1-5 препарата сумарнэ? РКК трансгенних л1н1й. 6 - кРК гена (2-5)а-оштетази ыиш! (контроль). 1 - дШя Л12, 2 - ЛИ, 3 - ДЮ, 4 - Л5, 5 - Л1

траясгвня! клони з рхзнсэ 1нгэзсивн1сио траногяцН введеного гена - первинн! регезераяти R0 трансгенних лШй ЛЮ та Л12, а також потомство F:l дШй ЛИ та Л13. Контролем Сули в!дао-з!дн1 потайная нбтрансфсрмовазкх регеяераят1з.

Теотуваная ctíhkdctí до BÎM показало, щр за ннгьжл кокцэнтрзцП Bipycy в 1кс:-г/лем1 (0,1 мкг/мл) у транегеявкх роолин сшсхерхгазгься затрнжа sßo з1дсутн1сть оимпчМа системного уражеяжг i значка зниягнння р!зня язкопкченяя Bipycy в тканинах (рис. 8). xí©kíotj> 1н$екц1йного Bipycy в

* 18В _

х <5 X

¡2 «

С О р,

э

со

к

X

01 у

г

л X

75

50 Л

25

2 ^ 4 Транегемт рос лини

Я □ Б Ш

Рис. 8. Вм1сг ВТМ у листках трансгенних рослик тютюку через 15 (А) та 30 днхе Шсля 1нокуляцп (В). 1- контрольна рсслини, 2 - лШя Л10, 3 - Л12, 4 - ЛИ/3, 5 - Л11/4, 6 - л11/5

1нокульоЕаких листках через 15 дн1в пз.сля 1нокуляцГ! стано-ВИТЬ В1Д 2-х до 15-ти в1дсотк1в в!д контролю, а в молодих листках верхнього ярусу через 30 днхв июля хнокуляци - в1д 0,2 до 85%. Найнижчий р1вень накшичення ВТМ виявлено в по-томотв1 трансгенного клону ЛИ (лхнП ЛИ/3, ЛИ/4). Ц1 рослини не мали симптомгв ураження 1 вм1щу2али менше 1% хн-фекц!йного ВТМ у пор!внянн1 з контролем. У 1нших трансгенних лШй симптоми системного ураження (моза'1'ка) з'являлись на 20 - 40 дн1в п1зн1ше, н!ж у контроле

При п1двщенн1 концентраци вхрусу в 1нокулюм1 до 2-х мкг/мл стшкють до ВТМ у трансгенних лШй ЛИ та Л13 пов-Н1стю втрачалась, однак ст1йк1сть до ХВК. проявлялась досить

ч!тко (табл. 5). Во! рослини, 1нокульован1 Х-в1русом, були

Таблица б

Прояз ст!йкост1 до ВТМ, ХВК га ВВТ у трансгенних рослин тютюну при нисокому 1нфекц!иному навантнженк!

Трансгенн! В1руои* К1льк1сть трансгенних роолин

л1нП -

всього безсимптомних безв1русних

ЛИ ВТМ 10 0 0

ХВК 12 12 7

ВБТ 10 3** 0

Л13 вта э 0 0

ХВК и и 3

ВБТ 10 2 2

*Рослини 1нокульоЕБн1 очищбниыи препарата)« ВТМ чи ХВК (2 мкг/мл) або 1нфекц1йнкм соком тютюну, ураленого ВБТ, у розведенн! 1:10 **3атримка симптом1в ураження до трьох тюшгв

безсимптомниш 1 в багатьох випадках (7 1з 12-ти 1 3 гз 11-ти) не вм!щували варусу в тканинах за даними тестування на гомфрен1. В шокульсваних рослинах л1нП ЛИ вм1ст ХВК вар!ював в!д 0,12 до 11,3 некроз1в на 1 листок гомфрени, а в рослинах л1н11 Л13 - в1д 0,25 до 38,7.

При високому 1нфекщйному навантаженн! (1нфекц1йний

юИтинний ciK у разведеныi 1:10) трансгенн! рослини проявляли СТ1ЙК1СТЬ ТЕКСЖ i ДО БЕТ. У 3-х is 10-ти рослин Л1нН ЛИ спостер1галаоь затримка скмптом13 ураження до трьох ткжшв, а дв1 рослини л!нП Л13 sosciM не уразились даним BipycoM.

Порхвняння BMicry Bipycy в тканинах i юлькост! SesEi-русних зразк!в показуе, що лШя ЛИ е б!лыл стипсою до ХВК i ВТМ, але менш ст1йкою до ВБТ, Hi« л1н!я Л13. Це узгоджу-вться з даиими про значке вараювання sipycocTiftKocTi, обу-швлено! геном (2'-5')сл!гоаден!латсиктетаги, в залежност1 В1Д досл1дних BipyciB, шташв та лШй рослин (Saaruia et al., 1934), однак така ст!йк1сть проявляв-ться лише за низь-KO'i кокцентрацП Bipycy в 1нокулюм1.

Отме, ст!йк!сть до ВБТ при висскому 1нфекц1йнсму назан-таженн1, виявлена у окремих рослин ланП Л13, але не знайде-на у б1льш ст!йко"1 до ВТЫ i ХВК л!нП ЛИ, може бути насл!д-ком спонтанно! сомаклонально! м1нлизост! регенерованих трансгенних клон!е. Враховуючи це, наступний етап наше! ро-боти був присвячений досл1дженнзо сомаклонально"! ь^нлизост! за ст!йк!стю до ВБТ у сприйнятливих COpTiB тютюну.

Y. СТ1ЙК1СТБ ДО ВБТ У СОМАКЛОНАЛЬНИХ BAPIAHTIB СПРИЙНЯТЛИВИХ COPTIB ТЮТЮНУ

Спонтанна ед!м1иац1я ВБТ а кадусних культур. Враховув-чи дан1 про мсжливЮть регенерацП BipycocTifinHX сомаклошв з експлант1в !нф!кованих рослин (Shepard, 1975, 1977; Murakishi & Carlson, 1976, 1S82; Saha & Gupta, 1989; Toyoda et al., 1989), ми спробували отримаги у такий cnoci6 cTiHKi до' ВБТ сомаклональн! вар1анти сприйнятливих сорт1в тютюну.

Достижения були започатковач! на моделi сорту 1мунний 580 (хмуннмй до переноспорозу).

Пор1вняння 1н!ц!ацП та росту калусу на р!зних живиль-них середовшцах показало, шо переважна бШпасть (90 - ioox) листков1.« експлант!в як здорових, так 1 1нф1ков511их рссл;;к дають калус на оередовищ MSK. Отриман: калусн! культури не в!др!зняються м1ж собою за зовн1шн!м виглядом, консистенц!-его, швидк1стю росту та морфогенетичною здатн1стю, однак у пробах кулусу з уражених роолин (табл. 6) виявляеться 1нфек-

Таблиця 6

1нфекц1йн1сть ВБТ в п'яти пробах калусу, отриманого 1з лист-кових експлант!в !нф1Кованих рослин тютюну 1мунний 5S0

Час культи- К1льк1сть Проби калусу* вуванкя ка- пасачувань -

лусу, тижн! 12 3 4 5

9 3 2,4 1,3 4,7 2,3 7,0

12 4 5,0 8,0 8,0 62,0 9,6

15 5 0 0 0 5,0 0,5

18 6 ООО 0 0

*1 г калусно! тканини гомоген!зували в 10 мл GSM-буфэра i тестували на листках Petunia hybrids. В таблиц! подана серэдня кШкють некроз!в на 1 листок петунП

щйний в!рус . У во1х досл1джених зразк1в калусу ¿нфекщй-н1сть ВБТ Д6Щ0 Зб 1 ль шуб ть ся В1Д 9-го до 12-го тшня культи-вування, а пот1м зменшуеться. Через 18 тижн!в п!сля 1н1ц1а-ц!1 калусу присутн1сть у кьому ВБТ не виявлявться (самооэдо-ровлення культури).

Приблизно 70 - 80% калуоних експланйв здорових, 1нф1-кованих 1 сзмооздоровлених культур утворюють патоки на живишь ному середовищ МБР, як! легко укор1нюються на середови-щ1 М50. У чаотини укорхнених пагон!в (до 20 - 50%) спостер1-гаютьоя деформацП листк1в чи стебел, роздвозння верххвки, затримка росту або 1нш1 дефекти. Оскхльки так1 ростами нэп-ридатн1 для практичного використакнч, вони вибраковувались на стадП висадки регенерант!в у грунт. Переважна б!льш1сть морфолог1чно нормальних регенерант1в (49 13 57) мали вксоку сприйнятлив1сть до в1русу, 6 рослин проявляли в1дносну ст1й-к1сть (уражувались лише п!сля двох - чотирьох послхдовних Хнокулящй) 1 2 сомаклони - були зовс1м несприйнятлив! до ВБТ. Зважаючк на велике практкчне значекня таких клокхв, по-дапьша робота була присвячена 1х отриманню 1 вивченню влас-тивостей.

К1льк1сний вих1д ст1йких сомаклон1в у р!зних сорт!в тютюну. Умови регенерацП сомаклон!в з листкових експлант1в 1нфхкованих рослин, п1д1бран1 на модел! сорту тютюну и^унний 580, виявились придатними 1 для ¿нших сорт1в (табл. 7). Най-б1льш високу регенераЩину здатнють за цих умов мали сорти 1мунний 580, Американ 5ж, Остролист та Американ 3, децо мен-пгу - сорти Американ Зж, Кримський степовий, Переможець 83, Любек 50 та Американ 351. Низький бих!д морфолог!чно нор-

мзльних регенерант1в у сорту Американ 207 та гибрида Американ 19 х Американ 5 св1дчить про те, шр для даних рослин пстр1бн1 1нш1 умови регенерацП сомаклон!з.

Таблиця 7

Ст1йк1сть до ВБГ 1 ф9ртшгьн1сть сомаклон1в, регенерованих э листкових експлант!в 1нф1коваких рослин р1зних сорт!в тютюну

Вих1дн1 рослини К1ЛЬК1СТЬ сомаклсн1в

вгаро- В1ДН0СН0 СТ1ЙККХ СТ1ЙКИХ 1

бувано СТ1ЙКИХ фертильних

Американ 3 39 6 3 3

Американ Зх 29 2 0 0

Американ 5ж 75 10 4 2

Американ 19 х

Американ 5 8 1 0 0

Американ 307 2 0 0 0

Американ 361 18 1 •1 1

Дюбек 50 23 0 0 0

1мунний 580 99 15 5 3

Кримський степовий 25 2 7 4

Крупнолистий БЗ 14 3 2 0

Остролист 42 5 0 0

Переможець 83 23 2 4 4

- 32 -

На В1дтну вад високо! сприйнятливост! до ВБТ у вих!д-них сорт!в (Коваленко к др., 1987), серед стркманих оомакло-HiE SCO вияЕлена значка к!льк!сть вхдносно стьйких та стойких зразк!в. OTiiiKi сомаклони, то не уражуюгься siрусом на-в!ть пЮля 4-х поел!давних !нокуляц1й, знайден! у 7-мк з 12-ти досддаених copTiB, причому переважна бгльппсть ix дала нас1ння при самозапилекрл. Отриманг фертяльк1 рослинк Сули виксриотзн! для досл!дження спадкування CTifetooTi та добору спйких зразкхв в послхдовних покол!ннях потомства.

Прояв 1 спадкування ст1йкост1 до ВБТ у сомаклон!в тютюну. Встановлено, ¡до в потомсте! морфолог1чш нормальних 1 фертильних оомаклонхв SCO, вЩСранкх на orifeiCTb до БВТ, вицеплюються сгерильн1 та морфолог1чно дефектн! рослини. Чаот1ше бсього зустрхчаються р1зноман1тн1 деформацП листко-во'1 пластинки, карликовicTb, в1дсзм1ни або редукц!я kbItok, вымирания кедогрхлого пилку тощо.

Вих1д 0Т1ЙКИХ форм в популящях первинних сомаклон1в SCO-окладае 5,3 - 28,ОХ в1д загально! к!лькост! морфолог1чно нормальних регенерантхв (табл. 8). В потомств! в1д1браних ст1йких клон!в спостер!гаеться р!зке зменшення к!льк!ст1 cTiraoix рослин в поколгшп SC1 у порхвнянн! з SCO, eaiMiHa-цхя ст!йких зрагкхв деяккх сорт!в у покол1ННЯх SCI - SC4, отаб!л!ззц!я виходу ст!йких ферм на р!вн! 10 - 15Х в 5-ому - 8-ому покол!ннях (сорт Кримський отеповий), а такая збхль-шення виходу ст!йких зразк!в у посл!довних пскол!ннях (сорт Американ 5ж).

Аназоггчн! результата отримана на мэдел! прстоклон!в чотирьох сортis тютюну.

Тагам чином, сомачлони та протоклони сдрийнятлквих до

Таблица 8

Спадкування ст1йкост1 до ББТ у сомаклон1в тютюну, регенеро-ваних з листкових експлант1в хшЗпкованих рослин

ССрТИ ТЮТЮпУ КЛОНИ К1ЛЬК1С'жЬ Бих1д СТ1ЙКИХ

рослин зразк1в, %

1мунний 580 500 99 6,1

БС1 391 0,0 - 8,1

502 179 0

Переможець 83 5С0 23 17,4

БС1-БСЗ 566 0,3 - 5,9

5С4 90 0

Кримський степовий 5СО 99 28,1

5С1-БС4 1248 0,0 - 11,8

БС5 51 9,8

гсб 76 11,1 - 15,4

Американ 361 500 18 5,6

372 0,8

БС2-5СЗ 544 1.3 - 4,3

гс4 368 0

Американ 3 5С0 39 7,7

5С1 60 3,3

БС2 51 0

Американ Бж 500 75 5,3

501 111 20,7 - 51,7

5С2 293 2,4 - 50,0

ЕБТ соргХв чжшу каюгь дужэ весок-/ süBBKBicrb га ст!йк!схю до дзногс е i рус/, $epfK»HiOEO та исрфзлег!чккмн сзнакзж. ВюсЛд мсрфзлогхчзк) нормальных, фе?ткл>вк i оййках зргзк1в, sp не уражуються ВЕХ нав1ть гпсля 4-х еюсдйдовних 1нокуля-ы!й, складаз калька е!дсотк!в в!д Батально! к!льшст! пер-вййних регенерант!в, с?!йк!оть росляш значке® mipcs обумоЕ-лена еп1гвЕ8ткчшши факторам, в вв'явку з ш вона оладку-зться як пол!гэнна к!льк1сна оэнака, raposo вар!вз за прся-3gm у pí3hkx k30híb, частково прсазляеться щодо 1КШИХ Bipy-с!в (ВШ, ХБК, УВК) i з багатьох випадках зтрзчазхься s пер-зих иошйвнях шгшотва через зкаэллення спркйняглаших, корфслогхчно дефзкгник -та стерилъних spssKis. Зважззочи на да, в назтупних досПдах були гроблен! спробк отримати ст!й-kí до ВБТ росяяни тютюну 1яшаш мэтодша, гокрема, вияхсы подолання 6ap*spiB мгкзидово! кесумЮност! та доберу на CTíáKiCTb на галло'1дному pisEi.

YI, ОТРЙМАНКЯ СТ1ЙККХ.Д0 ВБТ КЛОНIВ ТЮТЮНУ ШЛЯКОМ

подашшня шжвидово! неоумюносп та добору

на ГАШЮ1ДН01£у pibhi

На першсму впал! робота дсхШджувалй ефвктинн1сть вико-риотання егагаккшапьно! м!нлязос™1 для подолзння статэво! HecyuiCHOCTi м!ж куяьтурнши ссртао: i ст!йккми до ВБТ дики-ш видами твявку А/, sanderse, ti, glauca та //. alata (Тар-новекий, 1971; Bajos, 1931; ГребенкйЯ и др., 1334; Шмидт к Кляйнхемпель» 1885), на другому - мо$лнв1сть змэншнкя píbeh роззцесяення е?1йких зразк!в за рахунок викзристання гомози-

- 35 -

готного гапло!дного матер1алу.

Подолання м!жвидово'1 несум1сност!. Встановдено, що cTiüKi до ВБТ фзртильн! г!бриди тютюну можна отркмати такими методами подолання м1жвидово! несум1Сноот1: регенерация со-маклон1в з листкових експланив стерильних г!брид1в; г!бри-дизац!я ссмаклоюв культурных coptíb з дикими видами; схре-цування сомашктв культурких copiiB з сомаклонэми мхжвидо-вих гЮрид1в та регенеращя рослин з ироростк!в насхння стерильних г1брид!в, одержаних на живильних середовищах in vitro (табл. 9).

Незалежно в1д використаного методу подолання HecyMic-hoctí, гЮриди тюяону з N. sanderae (КС, Американ 361 SCO х N. sandsrs та Асан) мають бiльи висский вкх1д отi¡жих форм, але значно меншу к1дьк1сть фертильних spassiB, Hi ж гЮркди з N. в'lauca та N. alata (кг, тг, Американ 19 SCO х N. glauca, Американ 3 SCI х N. alata, Американ Зж к N. alata). Поряд з повнокз фертильн!стю (здатн1отю до самозалилення) у деяких 0т1йкж г1брвдних сомаклон!в проявлявться також часткова (чо-лов1ча або ж!ноча) фертильн!сть, Зокрема, сомаклояи ^брида Аоан легко зализюються пнлком одного з його батькав (//. sanderae) i здатн1 запилювати рослини 1ншо"1 батьк1всько'1 форми (Америкам 361), а також деяк1 сомаклони г1брид1в ТГ та КС.

Зважаючи на високий вих1д ст1йких рослин у ri6p^iB тютюну з N. sanderae, нами зроблен1 спроби отримати фертильну форму гхбрида Асан шляхом колх1цинування верх1вок регенеро-ваних ссмаклон!в. У такий cnoci6 буди отриман1 2 рослини, як1 дали поодинок! коробочки з к1лькома насаннинами. Bci 20 1з 20-ти вирощених рослин були повн!отю ст!йкими до ВБТ i дв! з них дали нао!ння. Наступив покол1ння даного г!брида

Таблица 9

Одержання стхйких до ВБТ рослин тютюну, методами подолання

М1ЖВВД0В01 HeoyMiCHDCTi

MiJSBHfiOBi Пбриди К1лькз.сть одержаних рослин

ВСЬОГО CTiH- СТ1ЙКИХ i

ких фертильних

Регенеращя соыаклон1в стерильних гхбрид1в

Американ 361 х N. sanderae САсан) 102 84 1

Курчавий 73 х /V. sanderae (КС) 3 3 0

Курчавий 140 х N. glauca (КГ) 79 28 12

Тралезонд 19 х N. glauca (IT) 15 1 1

Пбридизащя сомаклон!в культурних сортiв з дикими видами

Американ 361 SCO х N. sanderae 25 26 2

Американ 19 SCO х N. glauca 4 1 1

Американ 3 SCI х N. alata 189 8 7

Схрещування двох сомакжшв (Пбрид х сорт)

ТГ SCO X 1мунний 580 SC0 • 8 2 1

КГ SC0 х 1мунний 580 SC0 12 4 2

Американ 361 SC2 х Асан SC0 15 2 0

Регекерац1я рослин в проросткхв стерильного нао!ння Американ Зж х N. alata 10 7 2

Американ 5ж х N. alata 8 8 0

- 37 -

також було ст1йким до ВБТ, аде повн1стю стерильним.

У пор!внянн! з сомаклонами та протоклонами звичайних рослин у г1брвдних сомаклон!з проявляешься значно б1дыпа м1нлив!сть за морфолог!чними ознаками, фертильшстю та ст!й-кютю до ВБТ, а також б1лыл швидка ел1м!нац!я от!йких зраз-к1в у потомств!. Нашб!лып швидко ст1йк! форми втрачаоться у гетерогенних г1брщЦв, що мають гени к!лькох видхв титану. Отже, низька ефективн1сть сомаклональнсго добору рослин на ст!йк1сть до В1русу зумовлена високога генетичною гетерогек-Н1стю, яка виникав в результат! сомаклонально! м1нливост! 1 додатково зб1лыпуеться при г!Сридизац!! сомаклональних варх-ант1в. Враховуши це, для подальшого добору ст3.йких клон!в нами використат гомозиготих гапло!дн1 рослини.

Отримання гашклдних ачдроклон1в та подвоених гаплоЩв. Первинн1 андроклони АО регенерували з пиляк!в сомаклонгв, протоклон1в та м1жвидових г!Срид!в тютюну, вШбраких на ст1йк!сть до ВБТ протягом 2-х - 4-х погешнь. В результат! випробування рхзних живильнкх сёредовищ та умов регенерацП рослин вдалося !ндукувати утворення ембрю'Щв у 20,5 -48,3% пиляк!в досл!дних сорт1в та МбрщЦв ! досягти високо-го виходу гапло"1дних андроклонхв (табл. 10).

Гахшлдн! рослини !нф1куЕали ВБТ, в!дбирали ст1йк1 форми ! переводили зх на джшЯдний р!вень шляхом регенерацП сомаклон1в з листкових експлант!в (спонтанна пол!пло1ДизаЩя кл!тин в калусних культурах) або методами подвоэння хромосом верх!вкових меристем за допомогою колх1цину та ацензфтену. 0триман1 дишюхдн! рослини (подвовн! гапло!ди) мали дуже ви-сокий вих1д ст1йких зразк!в у г.ор!внянн1 э виулдними ссмак-лонами, протоклонами га андроклонами (табл. И).

Таблиця 10

Вих1д гагшлдних андроклон1в у pismix copTiB та гхбрщцв тютюну.

EiixiflHi рослини К1льк1сть андраклон1в

отршано перев!рено гапло1дних, на piBeHb %

ПЛ01ДН00Т1

Американ 3 5С1 47 10 90,0

Американ 3 х N. alata F1 68 44 100

Американ 3 к N. alata F2 95 25 95,0

Американ 5ж SC1 454 101 85,4

Американ 361 х Асан 24 17 91,7

1мунний 580 Р2 136 51 94,4

Кримський степовий SC3 102 37 93,5

Кримський степовий SC4 191 22 81,8

Отже, до01р ст1йких до ВБТ гаплоЗдних андроклоя!в 1 переведения IX в дипл01дну форму забезпечують значно б1дыпий вих1д

0Т1ЙКИХ роодин, н1ж ПОСД!ДОВНИЙ ДОб1р на СТ1:1К1СТЬ В К1ДЬК0Х

погатннях сомзклон1в чи прогоклонхв.

Таблиця 11

Вих1д рослин.. сг1йких до ВБГ, в популяц1ях сомакдон!в, анд-роклон!в та подвоених гапло'1д1в тютюну

Вих1дн1 сорти В1ДООТОК СТ1ЙКИХ рослин

та клони -

вих1днх гапло'!дн! ПОДВОЗИ! клони андроклони гапло!ди

Американ 3 БС1 3,3 19,1 83,3

Американ Зж Р1 18,0 16,7 46,7 - 100

Американ 5ж 5С1 56,6 7,7 83,3 - 100

Кримоький сте-повий 5СЗ 1,7 - 8,5 2,6 - 3,2 71,9 - 78,3

Таким чином, результата проведения досл!джень 1 дан! л!тератури св1дчать про те, що застосування б!отехнолог!чних (генно- та кл!тинно-!нженерних) метод1в в1дкривае широк! можливост! як для прискорбного отримання в!русост1йкого се-лекщйнсго матер1алу, так ! для отворення'зручних експери-ментальних об'ект!в, адеквзтних задачам конкретного досл!ду.

Основна увага на сьогодн1 прид1лябться генно-!нженерним

методам конструювакня в!русост!йких рослин, якх базуються на единому принцип! траногенезу: виб!р 1 кпонування гена ст!й~ кост!; конструювання експресуючого вектора; трансформац!я рослин; доб1р трансформант!в за допомогою селективного маркера; виявлення експресН чузшр1дного гена 1 тестування в!~ русоот!Йкост1 трансгенних клон1в. Через в!дсутн!сть под!бно~ го принципу щодо кл1тинно-хнженерних метод!в нами висуваеть-ся концепц!я истинно-!нженерно1 технолог!! отримання в!ру-сост1жих рослин, яка передбзчав так! етали роботи:

1. Виб!р модедьних о5'ект!в. Для отримання в!русост!й-ких рослин кл!ткнно-!нженерниш методами доц!льно використо-вувати вксокопатогенн! штами найб1льш розповсюджених в!руо!в ! сорти (види) ваоивих с!льськогооподароьких культур, у яких проявляються або сувор! симптоми ураження, або екстре-мальна от!йк1сть до модельного в!руоу.

Суворе ураження кульг/рних сорт1в зумовлюе важлив!сть отримання ст!йких форм, високопатогенний штам вирусу може виконувати роль селективного фактора в шитинних культурах, а гени екстреманьно! спйкост! диких вид!в можяа передати культурним рослинам кл!тинно-!нженерниш методами.

2. Отримання вих!дних кл!тинних клон1в. Ст1йк1 до вару-с!в юйтишп клони сприйнятливих рослин можна отримати, ви-корштовуючи так! нетрадицхйн! джерела ст!йкост!: сомакло-нальна м!нлив!сть_ (регенеравдя сомаклон!в та протоклон!в здорових рослин); !ндукована ст1йк!сть (отримання прямих ре-генерант!в з лизтксвих експлант1в рослин, як! мають !ндуко-вану ст1йк!сть до модельного в!русу); селективне размножения ст!йких кд1тинних колон!й в !кф1каванкх культурах за рахунок в1дмирання або пригн!чення росту уражених кл!тин (регенерз-

Ц1Я сомаклон1в та протоклон1в !нф1кованих рослин); мутацп з генах сприйкятливсст1 хазя!ка, !ндукезан1 на раннхх стад1ях з!русно'1 1нфекц1'1 з !зольоваякх протопластах (регенеращя протоклонхв з 1нф1кованих протопласта, оброблених мутагенами); гени ст1йкост! диких ввд!в, (отримання ст1йких г15рид!в шляхом подолання миквидово! несум!сноет! - соматично'! г!бри-дизацП ( зливання протопласт 1в), гЮридизацП сомаклон!в культурник оорт1в з дикими видами або регенерацП рослин з листкових експлант1в стерильнкх г15рид1в чи прсрсстк!з стерильного нас!ння, отриманих на живильних середовищах).

Джерела стхйкост! та спссоби отримання вих1дних кл1тин-них клон!в, придатн! для вибраяих модельних об'ект1в, п!дби-раються експершентально. Кри?ер!ем придатност1 в наявн1сть к1льксх вхдсотк!в ст1йких регенерант1в, як1 не уражуються модэльним в1русом при високому !нфекщйному назантаженн! (3-4 послхдовн! 1нокуляц21 з 1нтервалом 7-10 дн!в).

3. Дсбхр морфолог!чно Еормадьних, о?1йких 1 фертильних зразк!в серед первинних регенбрант!в. 3 метою позбаьлення в!д еп!генетично'! (неспадково!) ст!йкост1, а також дом!нант-них мутащй, що спричиняюгь морфолог!чн1 аномал!! та сте-рильнасть кл!тинних клон1в, серед первинних регенерантхз 1, принайми! в 3-х поколхннях IX потомства вхд самозапилення, проводять в!дб!р клон!в з найбхлып високим виходом СТ1ЙКИХ, морфолог!чно нормальних 1 фертильних рослин. Найб!лып ст!йк1 зразки, з!д!бран! в третьому покол!нн! таких кжшв, вико-ристовують для добору на гаплоидному р1вн1 з метою позбав-лення в!д рецесивних ыутац!й, що спричиняють вищеплення сприйнятливих, мсрфолог!чно дефектних ! стерильних рослин в потомств! ст!йких клок!в.

- 42 -

4. До51.р на гаплоидному piBHi включав: регенеращю андроклон!в з ембрюЩв пилкових зерен ст1йких рослин, вх-д!браних в потоыств! первинних клхтинних клонхв; в!дбхр гап-ло1Дних андроклон!в; тестування от1йкост1 гапло1дних рослин до модельного Bipycy (3-4 посл1довнх шокуляцП) i Biflöip морфолог1чно нормальних ст!йких зразкхв для отримання дипло-}дних рослин (подвоених гапло!д!в).

5. Отримання подвобних гапло!д1в. Для забезпечення ге-нетично'1 стабхдьност! дипло1дних кл!тинно-1нженерних клонхв хромоооми стхйких г алло1Дних рослин ол1д подвоювати не эа рахунок спонтанно! пол1пло1дизадП кл1тин в калусних культурах (регенерацхя сомаклон!в), а методом колх1цинування вер-х1вкових меристем. Використання в робот1 гапло!дних андрок-лон!в, отриманих з пилкового калусу, а також регенеращя со-маклон!в з калусних культур призводять до високого р1вня MiHJIHBOCTi 0Т1ЙКИХ дишю'1дних рослин.

висновки

1. Екстремальна ст!йк1сть до ХВК i ВТМ, виявлена у дея-ких вид1в та сорт!в картоша, забезпечуеться принщшово pia-ними механ!змами: блокування репродукцП ХВК в кл!тинах та обмеження розповаодження ВТМ на тканинному piBHi.

2. Характер взазмодП Mi« ХВК i ВТМ в рослинах картоплх суттэво залежить в1д 'ix CTiüKQCTi до ХВК: у ст1йких форм проявляемся захисний ефект X-Bipycy щодо ураження рослин ВТМ, у сприйнятливих - одукувться некроткчна реакц!я, яка не викликаеться н! ХВК, н1 ВТМ окремо.

3. Прояв ст1йкост! до ХВК у трансгенних роолик картоп-

- 43 -

що експресують ген б!лка оболонки даного aipycy, зале-жить в!д конструкцП експресуючого вектора,' аскрема, довжини 5'-нетрансляц1йних поол1довноотей 1нтегрованого гена та його opiBHTaiü'i в!днооно промотора.

4. Експрео1я гена (2'-5')ол1гоаден1латсинтетази мшй в шйтинах тютюну забезпечуБ ст!йк1сть траногенних рослин до ВТМ, ХВК, YBK та ЕЕГ. Пригн1чення BipycHO'i ¿нфекцГ! проявляемся за низько! концентрацП Bipyoy в ¡.нокулхш (до 2 мкг/мл) i значно sapiios в залежност: в!д модельно! систе-ми: Bipyo-трансгенна лШя-1ндив1дуальна роолина.

5. Локалхгзщя Bipycy, некротизац1я тканин i розвиток 1ндуковано1 cTifecocTi у надчутливих до ВТМ форм тютюну функц1онують як в1дносно незалежн1 процеси: у р!зних зразк!в рослин вони в1др1зняються як за динам!коа переб1гу так i за характером кореляци иЫ собою; у протоклон!в - спадкуються як незалежн1 оэнаки. У прямих регенерант!в проявляешься GTiHKicTb до ВТМ, iндукована у рослин.

6. 1нф1кован1 ВБТ калусн1 - культури тютюну спонтанно зв!льняються в!д Bipycy в npoueci 'ix пасажування та регене-рацИ ссмаклон1в. 51льш1сть огриманих регенер~акт1в мають ви-соку сприйнятлив!сть до ВБТ, значна к!льк1сть клон!в проявляясь BiflHOCHy ст!йк1сть (уражуються лише п1сля двох-чотирь-OX ПОСЛ1ДОВНИХ 1Н0КУЛЯЦ1Й) i KiJEbKa BiflCOTKiB рослин 30BCÍM не уражуються даним BipycoM (ctíhkí сомаклони).

7. Ctíükí до ВБТ г1бриди тютюну можна отримати такими методами подолання м1жвидово'1 несум1сност1: г!бридизац1я со-маклсн1в культурних сорт1в з дикими видами N. sanderae, N. glauca та N. alata-, регенеращя сомаклон!в з листкових експлант!в стерильних г1брид1в; схрещування сомаклон1в куль-

турних сорив з сомаклонами мйквадових г!брид!в та регенера-ц!я рослин з npopocTKiB нас!ння стерильних гхбридхв, одержа-них на живильних середовилщх in vitro.

8. В похомсгв! сомаклон!в культурних copTiB i мхжвидо-вих Пбрид!в тютюну, вШбранкх серед морфолог!чно нормальних, фвртильних i CTifciHX до ВБТ первинних регенерант!в, ви-щеплюеться значка к1ль клеть сприйнятливих, морфолог!чно де-фектних та стерильних зразкхв, а також проявляемся обернена кореляц!я Mi« cTiüKicTio i фертильнлегю рослин.

9. CTifociCTb до ВВТ у KJliTKHHHX клонiв тютюну значною Mipoio зумовлена малоопециф!чниш генетичними та еп1гекетич-ними факторами, в результат! чого вона спадкуеться як пол1-гекна к!льк1сна оэнака, чаотково проявлязться щодо 1нших Bi-pyciB (ВТМ, ХВК, YBK) 2 в багатьох випадках втрачаеться в перших покслХннях потомства.

10. Основною причиною 2ШИДК01 втрати CTiHKOCTi до ВБТ в noTDMCTBi сомакжшв та протоклонхв s висока генетична гете-рогенн!сть первинних регенерант!в. Позбавлення в1д гетеро-генност! шляхом регенерацп андроклошв з пилякхв ст1йких сомаклональних sapiaHriB, добору CTiröcnx гашгсндних зразк1в i подвовння 'ix хромосом за допомагою тшацину забезпечув високий вих1д генетично стаб1льних сийких рослин.

OßHQBHi робот, в яких викладеш матер!али дисертащi

1. Щербагенко И.О. Виотехнологические методы конструирования и отбора вирусоустойчивых форм растений // Микроби-Ол. журн,- 1993.- 55, N 1.- С. 89-101.

2. Щербатенко I.e. Ст1йкасть рослин до BipyciB // Микроби-

- 45 -

од. жури.- 1SS3.- 53, N 2.- С. 81-101.

3. Shcherbatenko LS., Oleshchenko L.Т. ТоЬзссо somaclones resistant to tomato spotted wilt virus // Biotechnology in Agriculture and Forestry.- Heidelberg: Springer-Verlag, 1996.- 36.- P.294-303.

4..Щербатенко И.С., Коваленко А.Г.-, Олещенко Л.Т. Взаимосвязь между инфицированием изолированных протопластов картофеля Х-вирусом и увеличением оптической плотности инокулюма /У Микробиол. журн.- 1984.- 46, N 2.- С.57-62.

5. Щербатенко И.О., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г. Увеличение оптической плотности инокулюма как критерий оптимизации условий заражения изолированных протопластов растений Х-вирусом картофеля // Микробиол. журн.- 1987.49, N 4.- С. 76-80.

6. Щербатенко И.С., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г. Сохранение инфекционности очищенных препаратов Х-вируса картофеля в асептических условиях // Микробиол. журн.- 1988.50, N 4.- С.67-71.

7. Щербатенко И.С., Коваленко А.Г., Олещенко Л.Т. и др. Получение соматических клонов табака, устойчивых к вирусу бронзовости томатов // Биол. науки.- ' 1989.- N 6.-С.24-27.

8. Щербатенко И.О., Коваленко А.Г., Олещенко Л.Т. и др. Устойчивость сомаклонов'табэка к вирусу бронзовости томатов // Микробиол. журн.- 1991.- 53, N 3,- С. 75-80.

9. Щербатенко И.С., Олещенко Л.Т., Олевинская З.М. Проявление сверхчувствительности и приобретенной устойчивости к ВТМ у растений-регенерантов табака // Микробиол. журн.-1991.- 53, N 3.- С. 69-75.

10. Щербатенко I.С., Олещенко Л.Т. Одержання андрогенних рослин тютюну, ст1йких до Eipycy бронзовост! томатÍE // Цитология и генетика.- 1993.- 27, N 3.- С. 48-52.

И. Щербатенко I.C., Олещенко Л.Т. Сомаклональна.м1нлив1сть реакци надчутливоси до ВТМ у протоклон1в тютюну // микробиол. журн." 1994.- 56, N 6,- С. 25-40.

12. Щербатенко 1.0., Олещенко Л.Т. Прояв високо! ctíhkootí до Bipycy бронзовост! томатiв кл!тинних клон1в та г1бри-д!в тютюну // Микробиол. журн.- 1995,- 57, N 3.-С. 65-71.

13. Коваленко А.Г., Щербатенко И.О., Лебедева H.A. Различия в устойчивости двух линий Solanum acaule Bitt. к Х-виру-су картофеля и вирусу табачной мозаики // Микробиол. журн.- 1984.- 46, N 6.- С. 52-58.

14. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Бобырь А.Д. Взаимоотношения между Х-вирусом картофеля и вирусом табачной мозаики в растениях картофеля, устойчивых и восприимчивых к Х-вирусу // Микробиол. журн.-. 1984.- 46, N 6.- С.58-64.

15. Коваленко А.Г., Бобырь А.Д., Щербатенко И.О. Вирус табачной мозаики в селекции картофеля на устойчивость к вирусным болезням. Рекомендации.- Киев.: АН УССР, Мин-во с/х УССР, 1984.- 23 с.

16. Коваленко А.Г., Щербатенко И.О., Олещенко Л.Т. Инфицирование протопластов мезофилла картофеля вирусом табачной мозаики // Биологические науки.- 1985.- N 2.- С. 42-47.

17. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С. Локализация инфекции и развитие индуцированной устойчивости к ВТМ у Nicotians didebta Tsrnov. и Nicotiana tabacum L. // Микробиол. журн.- 1986.- 48, N 4,- С. 51-55.

18. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Олещенко Л.Т. и др. Получение фертильных сомаклснов межвидовых гибридов табака, обладающих.высокой устойчивостью к вирусу 6ронзоеос-ти томатов // Цитология и генетика.- 1989.- 24, N 4.- С. 59-65.

19. Рсманенко В,м., Гвоздяк Р.И., Щербатенко И.С. О прикреплении вирулентных клеток АдгоЬасЬегыт tumвfacieгls к протопластам растения // Микробиол. журн.- 1989.- 51, N2.- С. 56-59.

20. Глагоцька Т.Д., Цербагенко 1.С., Сидоров В,А. та 1н. Трансгенн! рослини картогш, що мають сИйк1сть до в1русно'1 1нфекцП // Доп. АН УРСР. Сер. Б.- 1990.- N10.-С. 56-59.

21. Сайченко Т.А., Щербатенко 1.С., Трубе Е. та 1н. Ст1й-к!сть до в1русу тютюново"! мозаЗки трансгенних рослин тютюну, що експресують ген (2'-5')ол1гоаден1латсинтетази миш1 // Доп. АН УкраХни.- 1992.- N9.-0. 141-144.

22. Щербатенко И.О., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г., Бо-бырь А. Д. Поражаемооть вирусом табачной мозаики изолированных протопластов устойчивых форм картофеля // Теория и практика использования иммунитета с-х культур к вирусным болезням: Тез. докл. 8-го Всесоюзного соведщия.-Вильнюс: Ин-т ботаники АН Лит. ССР, 1984.- С.266-268.

23. Щербатенко К.С., БобырьА.Д., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г. Гипотеза с детерминировании крайней устойчивости к Х-вирусу у картофеля доминантным аллелем гена восприимчивости // Доклады на Първата национальна конф. по км-муноген. на растенията.- София: Институт по генетике към БАН, 1988.- 1.- С. 251-254.

24. Щербатенко И.С., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г., Бобырь А.Д. Вариабельность некротической реакции к ВТМ у про-токлонов табака // 7-й съезд Укр. микробиол. общества: Тез. докл. Часть 2.- Киев-Черновцы, 1989.- С. 185.

25. Щербатенко И.О., Олещенко Л.Т. Изменчивость симптомов поражения, вызываемых ВТМ у протоклонов сверхчувствительного сорта табака // Материалы науч. конф,, посвященной 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским.- Рос-тов-на-Доку: РГУ, ВИЗР, С-КНЦВШ, 1992.- С. 31-32.

25. Щербатенко I.e., Олещенко Л.Т. Пор1вняння cTifeiocTi кл1-тинних клон!в тютюну до чотирьох BlpyclB // Микробиол. журн.- 1994.- 56, N 5.- С. 110.

27. Shcherbatenko I.S., Oleshchenko L.T. Tomato spotted wilt virus-resistance in tobacco somaclones // Fundamental and Applied Problems in Phytoviroiogy: Abstracts of International Conference (Yalta, 22-26 may, 1994).-Ukraine: Ukrtipprojekt, 1994,- P. 27.

28. Бобырь А.Д., Коваленко А.Г. Щербатенко К.С. Взаимоотношения Х-вируса с крайне устойчивыми формами картофеля // Достижения микробиологии - практике: Тез. докл. 7-го съезда Бсесоюз. микробиол. общества.- Алма-Ата: Наука, 1985.- 5.- С.6.

29. Олещенко Л.Т., Щербатенко И.С., Бобырь А.Д., Коваленко А. Г. Получение сомаклональных вариантов табака, устойчивых к вирусу бронзовости томатов /V 8-е Всесоюзное совещание по иммунитету с-х растений к болезням и вредителям: Тез. докл.- Рига, 1986.- С.58.

Shcherbatenko I.S. Biotechnological aspects of virus-resistance investigations and breading of resistant plants. Doctor of Sciences Dissertation (manuscript), speciality 03.00.05 - virology, Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1998. The material of 29 scientific publications on the investigation of natural and induced virus-resistance in tobacco and potato species, lines, hybrids, cultivars, somaclcnal variants and transgenic clones is defended, On the basis of experimental results and literature the conception of cell ingineering of virus resistant plants was formulated.

Щербатенко И.О. Биотехнологитческие аспекты исследования ви-русоустойчивости растении и отбора устойчивых форм. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология, Кнтитут микробиологии и вирусологии HAH Украины, Киаз, 1935. Защищается 29 научных работ, которые содержат результаты экспериментальных исследований • природной и индуцированной устойчивости к вирусам у диких видов, линий, гибридов, сортов, сомаклональных вариантов и трансгенных клонов табака и картофеля. На оснсве полученных результатов и данных литературы сформулирована концепция клеточно-инженерной технологии получения вируооуотайодвых растений нетрадиционными методами генерации и отбора устойчивых форм.

КЛЮЧ0В1 слова: sipycn рослин, механхами вхрусссПйкост: рос-лин, бхотехнолоПл, геана 1клбнер1н, шитинна хнжвнерхя