Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез, выделение и некоторые свойства протеиназы Arthrobacter luteus 21605

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез, выделение и некоторые свойства протеиназы Arthrobacter luteus 21605"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ЛЕНИНГРАДСКИЕ ХНИИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИИ ИНСТИТУТ

Для служебного пользования

экз. н оси

СОКОЛОВА Ирина Гелиевна

УДК 57.083.1.

БИОСИНТЕЗ, ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗЫ АКТНТОВАСТЕ!? ЬУТЕиЗ 21606 03.00.07.- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД - 1991

Работа выполнена на каФедре микробиологии Ленинградского химико-Фармацевтического института.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор н.а.заикина

доктор химических наук, ведуший научный сотрудник Л.К.ШАТАЕВЛ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук а.а.селезнева кандидат биологических наук т.ф.рахманина

Ведущая организация: всесоюзный научный центр антибиотиков (ВНЦА-ВНИИА)

Зашита состоится 1992г. в / ? ^У часов

на заседании специализированного совета К 09S.02.02. по биологическим наукам ленинградского химико-Фармацевтического института по адресу: 197376. Ленинград, ул. проф. Попова, д.н.

с диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "¿2" Л^-ОСЬА^ 199 с, г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

н.б.кириллова

оееая характеристика раготц

Актуальность темы. Ферменты микробного происхождения приобретают все большее значение в различных областях народного хозяйства, они имеет ряд преимуществ по сравнению с Ферментными препаратами, которые могут быть получены из животного и растительного сырья. Высокая скорость роста и способность к усвоению широкого круга субстратов аелает микроорганизмы пенным объектом для исследований. направленных на получение высокоактивных Ферментных препаратов. Р настоящее Егемя многие бактериальные и грибные культуры хороыо известны 1сак активные продуценты Ферментов и применяются для их получения в промышленном масштабе. Постоянная потребность промышленности и медицины в Ферментных препаратах требует проведения исследований, направленных на поиск ноеых продуцентов Ферментов среди микроорганизмов. а такхе на еоЕРРЕРКств'.'Рание методов их выделения и очистки.

сапрофитные бактегии рода актировастек привлекает внн.мание исследователей в связи со способностью усваивать еирокип круг субстратов и нетребовательностью к условиям культивирования. Б иастояшее время эти микроорганизмы широко используются для получения биологически активных веяеетв. стереоселективнол трансформации органических соединенна, а также для биологической очистки сточных вод и контроля их загрязненности отходами химических производств. Особенный интерес Еызывают исследования, направленные на получение лейрамиии-дазы с помоиью артробактерий- поскольку в настсяаее время в нашей стране для получения этого перспективного для ыедииинн н биохимии Фермента используются патогенные и условнопатогенные культуры.

Микроорганизмы Рода Артробактер избраны нами а качестве объекта исследования в связи с тем. что они недостаточно изучены в отношении синтеза гидролитических Ферментов при выроди вании на разбавленной молочной сыЕоготке- отходе сыродельной промляленности. известно, что молочная сыворотка содержит комплекс ценных биологически активных весе'.те. которые при Рациональней использования могут служить инлук-тораии биосинтеза ьиогих Ферментов. Однако, в настоящее время при централизованной переработке молока большие количества сыворотки сбрасываются в каналнзашю. нанося большой вред водоемам, изыскание новых путей утилизации молочной сыворотки является вахт;и экологическим аспектам современных исследования, в том числе и предлагаемой работы. данная работа выполнена по коорскнаиноннкы планчм научно-исследовательских работ АН СССг "Хроматограгил. электрсФо! ез"

О

и "Микробиология" (И госрегистралии работ 0168. 053943).

пели и задачи исследования

- изучить возможности биосинтеза артробактериями внеклеточных гидролаз при культивировании на разбавленной подсырной молочной сыворотке;

- определить условия культивирования продуцентов, приводящие к максимальном!* накоплению гидролаз в культуральной жидкости, и оптимизировать минеральный состав питательной среды;

- изучить возможность выделения Ферментов из культуральной жидкости методами ионообменной хроматографии;

- определить основные Физико-химические характеристики выделенных Ферментов, а также исследовать их действие на различные субстраты с целью выяснения перспектив практического использования.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований установлено, что сапрофитные бактерии рода дртробактер при культивн-роваии на среде, приготовленной на основе разбавленной подсырной молочной сыворотки, синтезируют внеклеточную протеиназу. Изучено влияние условий культивирования на биосинтез протеиназы. -и оптимизирован минеральный состав питательной среды.

протекназа. синтезируемая культурой Аги1Т0Ьас1ег ипеиз 21606. выделена из нативного раствора методом препаративной ионообменной хроматографии, определен^ ее основные Физико-химические характеристики. Изучено действие протеиназы на Фибгиллярные белки животного происхождения.

Изучена возможность биосинтеза нейраминидазы артробактериями при культивировании на среде, содержащей индуктор ее биосинтеза -гликомакропептид «£-казеина. Показано, что высокая протеолитичес-кая готовность артробактерий не позволяет определить активность других гидролаз. синтезируемых культурой.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в результате исследования данные дополняют имевшиеся сведения о способностях микроорганизмов рода дртробактер к снтезу гидролитически Ферментов. Показано, что для получения протеолитических Фегмегггон с помощью

агтробактерий может быть использована разбавленная молочная сыворотка. что является одним из путей утилизации этого eme недостаточно используемого биологически пенного побочного продукта сыродельной промышленности. Разработан сорбиионный метод выделения из подсыгной молочной сыворотки сиалсодержашего компонента - гликомакропептида "У--казеина, защищенный авторским свидетельством, показано, что про-теиназа. синтезируемая культурой Arthrobacter luteus 21606. обладает Фибркнолитической активностыз. сравнимой с активностью трипсина.

Апробация работы, материалы исследования были доложены на конференции молодых ученых "Творчество молодых - научно-техническому пгогрессу" (Ленинград. 1968), на Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов" <ео-логда. 1939) и на всесоюзной конференции "Молекулярная сорбция биологически активных вешеств" (Пенза. 1990).

Публикации. По материалам диссертации имеется 5 публикаций и авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, списка цитированной литега-т'/оы. Работа изложена на 123 стр. машинописного текста, содержит 12 рисунков и 18 таблиц, список литературы включает 131 источник.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил штамм А1ЧПгоЬас1ег )Шеиз 21606, полученный из НЛО "Фериент". а также штамм Art.tirobact.er зр. 68/8. имеющийся в коллекпин культур каФедры микробиологии ЛХФИ. Для хранения культур и .вырашивания посевного материала использовали ыясо-пептонкый агар и сгеду с 1* пептона и 0.5* дрожжевого экстракта '.Пазппег П., 1977). Культуры выращивали пги26вС. хранили при комнатной температуре, в качестве Ферментационной использовали среду,

приготовленную на основе разбавленной подсырной молочной сыворотки (содержание сухого вещества 0,65« ). Ферментацию проводили в качало-чных колбах объемом 750 мл, содержащих 50 мл питательной среды, на круговой качалке со скоростью врашения ротора 220 об/мин. Состав питательной среды оптимизирован по методу ортогональных латинских прямоугольников (Бирюков. 1968).

протеолитическую активность культурэльной жидкости определяли по модифицированному методу Ансона (Грачева и др.,1986), используя в качестве субстрата 1% раствор казеина в V/, ФосФатном буфере рн7,5. В пробу брали равные объемы растворов субстрата и Ферментного препарата. После инкубашга при 37°с в течение 15 шн реакцию останавливали введением в реакционную смесь равного объема 5% раствора три-хлоруксусной кислоты (ТХУ). Количество ТХУ-неосаждаемых продуктов гидролиза казеина определяли, окрашивая их с помоаью реактива Фолина и измеряя интенсивность окраски на спектрофотометре при длине волны 670 нм против контрольной пробы, в которую растворр ТХУ вводили перед внесением Ферментного препарата. Калибровочный граФик строили по тирозину. За единицу протеолитической активности принимали такое количество Феррита, которое отщепляет от субстрата 1 мкдаль тирозина при 37°с за 1 чин. Расчет протеолитической активности проводили

где - общий объем реакционной снеся после остановки

реакции, мл,

У^н- объем раствора Ферментного препарата, ил Ай - оптическая плотность раствора продуктов гидролиза казеина, окрашенных с реактивом Фолина. тэ - тирозиноеый эквивалент, т. е. оптическая плотность 1 ш гастЕора тирозина, определенная из калиброЕочного графика. ^ - время реакции, мин 1000 - коэФЫшиент пересчета концентрации продуктов

Содержание белка определяли по методу Лоуги (Ьоугу, 1951). из культурэльной жидкости, полученной при вынашивании продуцента на оптимизированной питательной среде, выделяли протеиназу ме-

по Формуле

ТЭ . г

ПА :

реакции в мочь

€

тояом препаратвной ионообменной хроматографии на гетегопористом карбоксильном катионите Ki.IT. Сорбент ИЛ" является сополимером метак-риловой кислоты и 1.3, 5-гексапшРотриалкилтшазина и синтезирован в ИБС АН СССР целенаправленно для сорбшш белков, использовали сорбент в К - Форме, отмытый до рН 4.5. Сорбаию белков культурэлыгой глд-кости вели на холоду со скоростью 60 un • ч / см1, при РН 5.0. После окончания сорбции колонку промывали водой в количестве 2 объемов сорбента. Элюшш протеиназы осуиествляли 0.5 ц раствором ацетата аммония при рН 9,0 со скоростью б мл ч/ см*при комнатной температуре, сорбент регеьерировали 1 и раствором HaOH.

Элюаты. содержащие протенназу. концентрировали обратный диализом через иеллоФан, используя Фиколл в качестве Еодопоглотителя. Полученный концентрат анализировали на колонке с сеФадексом G-200 (размеры колонки 2 х 42 см, злюенг 0,01 М ФосФатный бУФер РН 7,5, скорость элюпии б ш1-ч / см 2 ).

молекулярную массу протеиназы определяли по методу ондрю (Andrews. 1965), используя в качестве маркеров цитохром с (м. и. 12.3 кЛ), гемоглобин (м. ы. б? кд) и голубой декстран (м. м. 2000 кД).

Фибринолитическую активность Ферментных препаратов оценивали по величине, обратной времени полного лизиса молельных троибов (Заи-кина, Иатаева, 1973). модельные тромбы готовили, смешивая а пробирке равные объемы растворов Фибриногена с концентрацией 12 мг/нл и тромбина с концентрацией 1'Л. Образование тромбов происходило через 30 мин. к полученным модельным тромбам приливали раствор Ферментного препарата в различных разведениях, встряхивали и помешали з ультратермостат при 37 ' с. отмечали время, прошедшее от начала опыта до полного растворения тромбов.строили графики зависимости величины, обратной времени лизиса тромбов, от концентрации Ферментного препарата.

Нейраминидазную активность Ферментных препаратов определяли тиобаРбитуроЕым (Методом дммнова (Amlnoff. 1961), используя в качестве субстрата сиалсодержаший гликомакропептия -казенна (ГШ). В пробу брали о, 1 Ш1 раствора с/бстгата' и 0. 1 мл раствора Ферментного препарата. лккубиговали смесь 20 мин при 37'с. количество от-шепленных нейраминилазой сьгловых кислот определяли по интенсивности окраски продуктов их взаимпдействгм с тиобагбитуратом натгая. измеренной при длине вол}щ 549 км. калибровочный граФик строили по H-aue-тилнейраминовоп кислоте (KANA). За едипшу активности нейраминиялзи

пригашали такое количество Фермента, которое отшепляет от субстрата

1 мкмоль сиаловых кислот за 1 мин при 37 С.

Гликомакропептид X-казеина (ГМП), использовавшийся нами в качестве индуктора биосинтеза нейрашнидазы и субстрата для определения ее активности, выделяли из подсырной молочной сыворотки по разработанной нами оригинальной методике, способ выделения ГШ включал шкрофильтрашш сыворотки на полых волокнах, соРбшга белков на карбоксильном катионите и выделение целевого продукта на сильноосновном ашюните. Полученный нами продукт гельхроматограФически однороден, о чем свидетельствует наличие одного симметричного пика содержания сиаловых кислот, соответствующего молекулярной массе 5 кД (рис. 1).

Рис. 1. Гельхроматография диализованной подсырной сыворотки

и гликошкропептида, выделенного из нее, на сеФадексе с-50

1.2 - белковые компоненты сыворотки и ГМП. соответственно.

3 - содержание сиаловых кислот в ГМП.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с ГОСТ 11. 004.-74.

о

ипг мл

30

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ БИОСИНТЕЗА НЕИРАМИШШЛЗЫ ЛРТРОБАКТЕРИЯЫИ

Известно, что среди артробактерия есть активные лродтпенты нейгамкиидазк (Flaschner et. al.,1977, Uchida et al.. 1977, Велчева и лр. . 1979, Eifler, Richter, 1981). ш испытывали имёюсиеея в налей распоряжении штаммы на способность к индуцированному синтезу этого Фермента, при проверке активности вариантов, полученных при рассеве исходных культур, обнаружено (табл. 1). что некоторые из них кЕШва-

Табл. 1

НЕИРАЬИНИЛЛЗНАП АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ВАРИАНТОВ HTAlfiiA ARTHROHACTEK SP. 60/8

I! варианта тип госта Е

E+S К

е 28 31 32 1 слизистые, плоские, слегка вдавленный центр 0, 07 0, 14 0, 11 0, 11 0, 05Ь 0, 120 0.09 0. 09

12 ' 0, 17 0. 13

16 33 2S 27 2 матовые. концентрически исчерченные с валиком ПО ОКРУЖНОСТИ 0, 05 0, 12 0, 10 0, 09 0, 00 0. 09 0, 10 0,07

*У И 56 о плоские, бугристые. влажные 0, ОС-0, 09 0. 12 0, 11 0.08 0, 10

ст увеличение количества свободных опаловых кислот в культур&ль-ной жидкости, такии образен, в процессе развития агтробактернч выае-лякт неярашшидазу. которая отшепляет опаловые кислоте "зт србстрата. однако, при расчете неяраминилазноя активности урсейкь этого экзо-

Фермента в культуральнсй жидкости был на порядок ниже известных из литературы результатов- полученных при использовании А. ßloblformls. A. ureafaciens, A.sialofulus и A. nlcotlanae. Это можно объяснить преимущественным синтезом протеиназы, которая гидролизует другие Ферменты, в частности, нейраминилазу, и не позволяет определить их активность без предварительной очистки и концентрирования. Кроме того, возможно образование прочного комплекса нейгашшнлазы с Н-ацетиянеп-гаминовоп кислотой в культугальной жидкости. Известно, что нейгаш-нилаза мотет прикрепляться к субстрату и оставаться с ним связанной (Седлачск, 1974?. Поэтому, при добавлении нового количества сг&стгата он y.v.e не нохет быть растеплен Ферментом, иаходяшшся в составе комплекса.

7. БИОСИНТЕЗ ПРОТЕЙНАЯ I КУЛЬТУРОЙ АЕТШОВгСТЕП LUTEUS 2iC0C Ш: РАЗБЛВЯЕННОЛ ЮЛ9ЧН0П СЫВОРОТКЕ

Использованные в пав'ей работе штампы Arthrobacter luteus üieos и Arthrobacter sp. 00/8 синтезировали внеклеточную цротеиназу при культнвигоганкн на тазоаилеппоп полочной сиеороткс. К;л; азкосию, лочнаг. сыворотка солср:пгг бслькое количество кешакг ихта.тод.шп во- • шеста, таких, isue лаг.тоза, белкк и витавши, а одхс до 30 разллпкж шкго- и гапюэле-^нтоз (Коваленко. 19G5: Лавров, Taßnrap. 1971). это не лает мслсчига сиеоротку весы«, легаши. компонентой питатслыгс: сред для шкрооного синтеза биологически активных, весе ста. Нам обнаружено, что при сиггтсш; й± разбавленкоя полотой cvaosonzc культуры Arthrobacter sp.' Cö/e и Arthrobacter luteus 2ICC6 «srrenu-рувт шюкксто'кшс протоь'нг'ха. изучено влияние условий культшзкгова-юи ка биосинтез протеинази культурой Arthrobacter luteus zicoz. црн изучении накопления протгоднтнческой активности культурой л. luteus на разбавленной ь:олоч:;оп сыворотке обг. jpyseiio. что цакскиальная активность культуралькоя жидкости наблюдается на 93 часов культивирования (рис. 2). снесение в сыворотку дополнительного количества некоторых минеральных солей изменяет характер, накопления Сегмента.

При введении в разбавленную сыворотку 0.1" i^SO,, накопление протеина:;« 1шет более интенсивно и достигает максимума к 72 . часап роста. Известно, что ионы магния игравт важну» роль а жизнедеятельности ыиг-роорганизмов. Они участвуют в пропессах активного транспорта через мембрану (Скулачев,1989). а также как кофакторы Ферментов

в процессах синтеза белка и метаболизме азота (Бохински.1987). возмогло. что стимуляция накопления протеиназы и увеличение продолжительности ез активного синтеза в присутствии ионов магния связано с активацией энергетического обмена в клетках продуцента, однако, увеличение активности культуральной .чашкости в этом случае не является следствием повшешш активности самого Фермента, поскольку введение ионов магния в реакционную смесь очинённой протеиназы с субстратом не приводило к увеличению количества продуктов реакции. При использовании солей цинка и жельиа отмечено снижение уровня протеолитиче-скоа активности. которое, вероятно, связано с замедлением роста культуги при снжетш интенсивности дыхательных процессов.

?нс. 2. Динашжа накоплешш пготеииазн культурой а. ипеиз 21606 на разбавленной молочной сыворотке (1), и на сыворотке с добавкой 0. (2), О. 01» ¿»¿О^-гн^О (3),

0.001% ГеМу-(4).

При изучении влияния рн на биосинтез протегашы обнаружено, что максимальная активность культуральной жидкости наблюдается при 8.5 рн (табл.2), очевидно. при такой кислотности среды белка сыеорот ки наиболее доступны для культуры, кроыэ того, нижа показано, что

Табл. 2

влияние гн питательноп среды на протеолитическую активность актиковасте*? штецз

РН питательной среды до автоклаЕИРОвания протеолитическая активность, ед/мл, через 72 часа роста

6.8 12

7, 5 42

8,0 40

б. 5 46

активность очищенной пготеинази А. пиеаз несколько повышается в слабощелочной зоне гн. однако, пг повышении рн сгелы с б, е до 6, 5 активность культугальной жидкости увеличивается в 4 газа, в то время ка : активность очгасеннсго Фермента при такой же изменении гн увеличи вается только на 10». Таким образом, повышение, активности культу сальной жидкости при повышении рн среды следует считать следствием стимуляции роста культуры и биосинтеза Фермента.

Температура (табл.3) оказывает существенное влияние на биосинтез

Табл.3

ВЛИЯНИЕ ТЕШЕРАТУГЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ ПГОТЕИНАЗЫ АЯТНЕОВЛСТЕК ШТЕИБ 21606

Темпегатура куль- Протеолитическая актив-

тивирования, ° С ность. ел/мл. на 72

часа роста

24 43

28 47

35 21

пготеиназы. при увеличении температуры культивирования с 23 до 35 " с активность культурэльиой жидкости падает в 2 раза, из литературы известно. что для роста большинства артробактерий наиболее благоприятна температура 28 - 300 с (Квасников и др., 1900». поэтому резкое падение активности культурэльной жидкости с повышением температуры вполне объяснимо, кроме того нами обнаружено, что активность очищенной пготеиназы возрастает с повышением температуры Поэтону снижение •л/скости культуральной жидкости с повышением температуры ножно сбъ-

яснить также усилением автолитических процессов.

При изучении влияния возраста (табл. 4 > и количества (табл. 5) посевного материала обнаружено, что наилучшие результаты обеспечивает использование 48-часового посеЕНого материала в количестве 3 '1 о'клеток в 1 мл питательной среди, в это время культура находится в логарифмической Фазе роста. Активно растущие клетки интенсивно утилизируют белки питательной среды, поэтому потребность культуры в протеиназе высока. Г.ри увеличении количества посевного материала- более 3-ю7клеток в 1 ш среды дальнейшего повышения актив-

табл. 4

ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА НА БИОСИНТЕЗ ПРОТЕИНАЗЫ ARTHEOBACTES LUTEU3 21606

Возгаст посевного материала, сут Пготеолитическая активность, ед/мл. на 72 часа госта

1 26

2 50

4 ie

7 12

10 3

14 3

табл. Б

ВЛИЯНИЕ КОЛИЧЕСТВА ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ЧЛ БИОСИНТЕЗ ПРОТЕИНАЗЫ КУЛЬТУРОЙ ARTHEOR'.CTER LUTEU3 21606

количе ство посев- Количество жизне- пготеолитическая

ного материала, способных клеток активность куль-

кл 'кл в 1мл куль туг'чль- ту рал ь ной ш-

ней жидкое тн на ксл.1, ед.'мл

72 часа роста

1, 7 ю' 2 • ю' r

3. 5 ю7 3 • 1с9 23

1, 7 • 10' 3 ■ 1qs 28

кости не наблюдается, еднта/ из Факторог вызь агишх это явление, мо -

у.ет служить недостаточное снабжение кислородом, поскольку для обеспечения продуктивности большего числа' клеток необходима более высокая скорость его абсогбшш.

Кроме того, высевы культуральной жидкости в конце Ферментации показали,что количество жизнеспособных клеток во всех случаях одинаково, несмотря на разное количество инокулума (табл. 4). Таким образом. при возможном замедлении обменных процессов (в том числе дыхательных) клетки остаются жизнеспособными, что характерно для арт-робахтерий (Нестеренко и др., 1985).Проведенные для проверки этого предположения эксперимента показали, что уровень протеолитической активности культуры мало зависит от скорости абсорбции кислорода. Однако, проведение Ферментации в статических условиях приводило к резкому падении активности.

Минеральный состав питательной среды был оптимизирован накн со методу ортогональных латинских прямоугольников (Бирюков. 1568). Оптимизированная питательная среда имеет следующий состав:

(КН,)гНР0<,'2Нг0 0. 2 г

П83О,-7НгО 0. 05 Г

беб0^5нг0 0,005 г

Разбавленная молочная сыворотка (содержание сухого веиества о, 65Х) до 100 мл •

Сравниаали (рис. 3) рост культуры л. ипеиз и динамику протеина-зы в культуральной жидкости, полученной при вырашиванш продуцента на Разбавленной сыворотке и оптимизированной питательней среде. Обнаружено. что использование оптимизированной среды позволяет повысить активность культуральной жидкости в 2 раза (в логарифмической Фазе госта культугш. Однако, по достижении культурой стационарной •газы развития количество пготеиназы в культуральной жидкости быстро снижается до уровня, достигнутого к этому времени на разбавленной сыворотке. Возможно, к этому времени на оптимизированной среде исчерпываются доступные культуре белки, и в связи с недостатком субстрата длл протекнази усиливаются процессы самопереваривания Фермента. Ранее

па,

ед

/

\ 2 3 Т" 5" . < ^ 7 I 5 'О

е. - о. Рост, и /и'лзагта'л пготешгазы на разбавленной супоротко и на опткмизкговшшой сгеле

1.3 - кгиспе роста ллшеиз на сыворотке ч

на оптимизированной сгеяе. соответственно

3.4 - пРот2олит1пеская активность культугальноп

жидкости

сличали. что. несмотря на присутствие опаловых кислот (продукта гидролиза сналсозегггап-зго субстрата пеЛгамшшлазош .'сам Фермент а культугглыга: .тияксстп сбиаютить не удается. Очевидно, здесь сталкиваоися со сходнш пвле1шен: на беднеп белками среде, исполь-сспг.пноП наш для изучения биосинтеза нейраккшшазн. таг~т.е имеется недостаточное количество субстрата для пготеолитического Фегнеьта. Рследстап отого пготеш1аза может гидролизовать другие Фермент и кееать их определенно в культуральноа жидкости.

ГсльхроютоггаФнческиа анализ культуро-льнсй яидкости а. ипе~ из 21005-на сеФадексе а-200 показал значительное изменение белкого-го состава среды,- вызванное Ростои культуры (гис. 4).

3. ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕКНАЗЦ АЯТНР.ОВАСТЕК ИЛЕУЗ 21506

Рис. 1. гельхрсматогратмя подсырноЯ сыворотки и культу-ргльноя жидкости А. 1игеиз на ееФадексе С-200

1,2 - белки сывоготки и культугальной жидкости. ■

соотеотстеенно

3- пготеолитическая активность

Стрелками обозначены объемы злюции калибровочных вепеств

Белки сыворотки, выходящие о объемом задержки колонки, частично усваиваются продуцентом, о чем свидетельствует меньшая величина соответствующего им пика. В то же время в культуральной жидкости по-пояБляется белковая Фракция. обладающая протеолитическоя активностью. Оиекка молекулярной массы этого Фермента дает величину 24 кл.

для оценки основных Физико-химических и биохимических характеристик г.готеиназы А. И^гин нами разработан способ ее препаративного выделения из культуральноп жидкости. Лля согбиионного выделения белков средних молекулярных масс успешно лгименяптся гетеропористые карбоксильные катионитн. структура этих катионитов такова, что бла-глааря многочисленным порам и каналам обеспечивает доступность ссрб-ш<.ом;<>к центров лля относительно крупных белковых молекул (Катаева, Са.^сское, 1Р77; пирогов и др., 1966'. выходные кривые ссрбиии-лесор-6цй1' г.ротеимазы .«и (ц'.еиз на карбоксильном катиони^е ЮТ представлены на р:'.с. г>. бглнэ, что при промыгке сосбента еодоя после сорбции по-

тери протеолнтической активности не происходит. очевидно, белок-полимерные' комплексы, .образующиеся при сорбшш, диссоциируют только при дальнейшем повышении рн элюируюпхего буфера, максимум на кривой протеолнтической активности не совпадает с максимумом на кривой содержания белка, это говорит о различной прочности комплексов, образуемых белками культурэльной жидкости с катионитом. Белок, обладающий протеолнтической активностью, связан с катионитом менее прочно, чем балластные белки ктаьтуральной жидкости, таким образом, очистка про-теолитического Фермента от примесей достигается за счет различной степени связывания белков с матрицей сорбента при данном значении РН. При использовании карбоксильных катионитов можно применять достаточно мягкие условия, позволяющие избежать потеги активности Фер-

из культурэльной жидкости на карбоксильном катионите кьгг

1- протеолитическая активность, ед/мл,

2- белок, мг/мл,

3- РН

А. и Св - активность и содержание белка в исходно*, культурэльной жидкости

95%, что свидетельствует об отсутствии инактивации ее в выбранных

условиях. Карбоксильные катиониты типа Еиокарб, целенаправленно созданные для сорбиии белков и не выпускаемые в настоящее время в промышленном масштабе, имеют аналог, производство которого в ссср освоено- карбоксильный катионит сгк-7. этот сорбент имеет сходные с характеристиками Биокарбов свойства, и может быть использован для масштабирования процессов, разработанных на лабораторном уровне для этого класса сорбентов.

протеиназа а. инеиг, синтезируемая при культивировании продуцента на молочной сыворотке, имеет широкий диапазон рн, в котором она не ".оряет сЕоей активности. Это является весьма ценным ее свой-стеом, поскольку позволяет ее выделять и исгользовать в различных режимах, не опасаясь инактивации.

Таким же ценным свойством Фегмет1 является и его высокая тер-мостабилыюсть(рис. б).которая позволяет рекомендовать ее для применения там, где следует опасаться развития посторонней микрофлоры.

§ -

I * $ I

I! -!

ч о

!

Й

г. -I

<<(7

5о 5о То во

?ис.б. зависимость активности протеиназы АгиггоЪас1ег ИНеиз от температуры

Нами било показано, что выделенная из культуральной жидкости протеиназа обладает способностью расщеплять белки молока (казеин и «¿-лакгоальбушм). Константа (.¡ихаэлиса для реакции гидролиза «¿-лактоальб>млна составляет 1.25 ммоль/мл (Рис. 7). Способность про-

5

тенназы А, 1и1еиз гидгслизовать молочные белки в сочетании с термостабильностью позволяет рекомендовать ее для получения диетических молочных продуктов. содержащих легкоусвояемые пептиды.

Рис. 7. определение константы михаэлнса для реакции гидролиза «¿-лактоальбушна протенназоп а. теиэ методом двойных обратных величин

Фибгиллягные белки животного происхождения '.эластин, пгоксл-лаген и Фибрин) в разной степени подвержены расшепленкв пгстеиназой А. пнеиз. Известно, что эти белки различаются аминокислотным составом и пространственным расположением субъединиц. Обнаружено, что из испытанных белков Фибрин наиболее доступен действию прстеиназы. При изучении кинетики растворения модельных Фибриновых тромбоз про-протеиназой А. шгеиз и трипсином обнаружено '.рис. 8). что оба препарата сравнимы по своей тромболитической активности в интервале концентраций з - 4 ■ 10*гмкмоль/мл. полученные для трипсина и протеина-зы а. Х^еиэ результаты сравнивали также с литературными данными для пготеиназы грибного происхождения - террилитина. из сопоставления кривых рис. в видно, что выделенная наш протеиназа обладает наибольшей продолжительность» действия на Фибрин, возможно, это связано с более широкой субстратной специфичностью выделенного Фермента, а также его меньшей чувствительностью к естественным ингибиторам про-тенназ. входящим в систему свертывания крови. Широкая субстратная

' г з 4 Г е 7 #

Рис. д. Раствогение модельных тгомбов некоторыми пгетеиназами

1- пготеиназа А. 1Шеиз

2- тгипснн

3- тергилитин 'литературные данные, заикн-на. Шатаева. 1973)

специфичность и продолжительность действия, обеспечивавшая глубокую деструкцию белкового сгустка, позволяет рекомендовать выделенный Фермент для прошеки медицинского оборудования, используемого при экстгакорпогальной обработке крови.

выводы

1. Бактегия АПКгоьасгег инеиз 21605 может быть использована для синтеза пготеелитических Фегыентов.

2. В качестве основного компонента питательной среды целесообразна использовать разбавленную полсырнуп молочную сыворотку с содержанием сухого ве-ества 0,5-0,7« в качестве единственного источ-

ника углерода. оптимизированная питатель; ая срела дополнительно включает следующие компоненты: 0. 2% нр0'- 2йг° , о, 05% 7Nt° , 0,005» FeSC4-fUzO .

3. время культивирования А.luteus 21606 составляет 72 часа, количество посевного материала 3 • 10 7 клеток в 1 мл питательной егеды. в Еоэрасте 48 ч.

4. протеиназа из культурэльной жидкости а. luteus может быть выделена с "омогсью препаративной сорбпионно-вытеснителыюн хромато-гравии на катионите кит в к * -Форме. при этом достигается концентрирование Фермента в элюате в 7 раз по сравнению с культуральной жидкостью, и повышение удельной активности Фермента в 5 раз.

5. Основные Физико-химические характеристики протеиназы A. luteus 21606: молекулярная масса 24 кл, pH-оптимум 8.0. константа ыихаэлиса по «¿-лактоальбумину 1,25 ммоль/мл. температурный оптимум 65 ® С. Стимулирующее действие на активность протеиназы оказывают ионы мели и кальиия. Гидролиз пептидов этой протеиназой осуществляется преимущественно по связям с участием гистилина (с N- и с- концов), и гидроеобцых аминокислот аланина и норлейшша.

6. протеиназа а. luteus 21605 обладает Фибркнолитической активностью. сравнимой с активностью трипсина.

7. разработан способ выделения из полсырной молочной сыворотки сиалсолержашего компонента - гликомакропептида "^-казеина с молекулярной массой 5 кд методой препаративной ионообменной хроматограФии.

f>

8. Изучена возможность биосинтеза нейгаминидазы артробактерия-ми на среде, содержащей в качестве индуктора гликомакропептид #-казеина. показано, что высокая протеолитическад активность изученных штаммов затрудняет определение и не позволяет провести очистку нейга-минилаз. присутствуълих в культурэльной жидкости в минорных количествах.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соколова И.г. Артробактерии как продуценты нейраминида-зы//тоз.докл. конференции молодых ученых"ТвоРч~ггво молодых-научно-техническому прогрессу".- Ленинград, 1988.- С.9.

2. и.в.солниева. Д.С.Лнкоеский, И.Г.Соколова. И.А.Чернова, Л.К.Шатаева. препаративное выделение гликомак.ропептида

X-казеина// Тез. докл. Всесоюзного Симпозиума "Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов".- Вологда. 1989.- С.43-44.

3. и.г.соколова. Л.К.Шатаева. н.а.Заикина. Псдсырная ыолочная сызоротка как питательная среда для продуцентов рода арт-робактер//Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов",- Еологда, 1989.- С. со-62.

4. И.Г.Соколова, Л.К.Шатаева, Н.А.Заикина. Выделение Фибрино-литического комплекса артробактерий на карбоксильном ка-тиоките КМТ// Тез.локл. Всесоюзной конференции "Молекулярная сороиия биологически активных вешеств".- Пенза. 1990.-

С. 57-53.

5. Чернова H.A., Солнцева и.В., Янковский Д.С., Соколова и.г., Иатаева л.к. Способ выделения гликомакропептида из подсырной молочной сызоготки. А.С.СССР н 1617914, приор.06.03.89 (без права публикации в открытой печати ).

0. И.Г.Соколова. л.к.Еатаева, Н.а.Заикина. протеиназа артробак-терий и ее действие на ©ибриновые тромоы// прикладная биохимия и микробиология (в печати).