Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Давлетбаев, Игорь Маратович

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.2. Биологические функции и области применения арахидоновой кислоты

1.2.L Области применения арахидоновой кислоты.

1.3. Распространение и получение арахидоновой кислоты

1.3.1. Основные промышленные источники получения арахидоновой кислоты .^.

1.3.2. Альтернативные источники получения арахидоновой кислоты

1.3.3. Получение арахидоновой кислоты с помощью генетически модифицированных растений

1.4. Обработка полиненасыщенных жирных кислот микробного происхождения.

1.4.1. Стабильность полиненасыщенных жирных кислот.

1.4.2. Методы разделения полиненасыщенных жирных кислот

1.4.4. Концентрирование полиненасыщенных жирных кислот и их разделение

1.4.5. Другие потенциально полезные методы концентрирования и очистки полиненасыщенных жирных кислот

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных"

Полиненасыщенные жирные кислоты представляют собой уникальный класс органических веществ, играющих важную роль в биологических системах. Исследования последних трех десятилетий вскрыли широкий спектр их функций в живых организмах. ПНЖК подвергаются биотрансформации липоксигеназами или циклооксигеназами, что приводит к образованию многочисленных низкомолекулярных регуляторов процессов, протекающих в клетках, тканях и организме в целом. Одной из самых важных ПНЖК является АК, которая выступает в роли непосредственного предшественника серии простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Основными областями применения АК являются: фармакология (предшественник различных лекарственных и профилактических препаратов применяемых при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени и др.); косметическая промышленность (средства по уходу за кожей); пищевая промышленность (обогащение различных продуктов питания, в том числе искусственных детских молочных смесей и др.); сельское хозяйство (высокоэффективный стимулятор роста и защитных реакций растений) и др. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК оставляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу). В течение последних двадцати лет значительные успехи были достигнуты в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей, которые в ряде случаев позволили осуществить ее промышленное производство. Однако существующие на сегодняшний день биотехнологии получения АК далеки от совершенства, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-10 г/л (Россия, США, Польша и др.). В связи с этим актуальным является поиск и создание отечественных продуцентов АК и эффективных биотехнологий ее получения на их основе.

Данная работа была выполнена по планам важнейших НИР Уфимского государственного нефтяного технического университета (УГНТУ) в соответствии с федеральной целевой программой "Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки" на 1997-2001 гг. и 20022006 гг.

Целью данной работы являлось получение новых высокоэффективных продуцентов АК, поиск условий их эффективного культивирования с целью повышения выхода целевого продукта. Совершенствование биотехнологии получения АК. Создание методов биосинтеза практически важных веществ на ее основе.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов потенциальных продуцентов АК;

- исследование морфологических, физиолого-биохимических и патогенных свойств найденных перспективных продуцентов;

- исследование влияния условий культивирования перспективных штаммов на выход биомассы, липидов и АК;

- поиск условий биосинтеза сложных эфиров АК и глицерина с помощью липолитических микроорганизмов;

- обоснование принципиальной схемы получения АК с использованием найденных перспективных штаммов.

В результате выполненных исследований при проведении скрининга микроорганизмов, был выделен и идентифицирован новый высокоэффективный штамм - продуцент АК - Mortierella alpina 18-1. Исследовано влияние условий его культивирования на скорость и селективность биосинтеза АК. Найдены параметры осуществления эффективного биосинтеза АК с выходом 10,8 г/кг среды при температуре 20-25 °С, рНнач.^6,5-7,0 и времени культивирования 19 суток на базе штамма Mortierella alpina 18-1. На основе исследования промежуточных метаболитов, зависимости их выхода от условий культивирования предложена гипотетическая схема биосинтеза ПНЖК у исследуемой культуры гриба Mortierella alpina 18-1. Установлены условия синтеза сложного эфира АК и глицерина с помощью липолитических микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан высокоэффективный метод получения АК с помощью выделенного продуцента Mortierella alpina 18-1 и научно обоснована биотехнология ее получения. Доказана эффективность разработанной биотехнологии, обеспечивающей возможность получения АК с выходом до 10,8 г/кг среды. Разработан метод биосинтеза сложного эфира АК и глицерина, используемого в фармакологии, косметике. Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе подготовки специалистов по специальности "Биотехнология" (прил. А).

Диссертация включает введение, обзор литературы (глава 1), описание объектов и методов исследования (глава 2), экспериментальную часть и обсуждение результатов (глава 3), выводы и список цитируемой литературы, содержащий 128 наименований. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит 29 рисунков и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Давлетбаев, Игорь Маратович

выводы

1. В результате обширного скрининга микроорганизмов, способных синтезировать АК, выделен и охарактеризован штамм Mortierella alpina 18-1, являющийся эффективным продуцентом АК.

2. Осуществлена оптимизация основных параметров биосинтеза АК и найдены условия: температура, рНнач., продолжительность культивирования, позволяющие осуществить эффективный рост Mortierella alpina 18-1 при поверхностном культивировании на глюкозо-картофельной среде.

3. Показано, что биостимуляторы кинетин, индолилуксусная кислота и эргостерин позволяют увеличить выход АК в расчете на единицу объема питательной среды при поверхностном культивировании. При этом наибольший эффект оказывает кинетин.

4. Показано, что при выращивании на обогащенной источником углерода среде (картофель - 600 г/л, глюкоза - 6%) с отношением площади поверхности к объему питательной среды равной 12 обеспечивается максимальный выход АК на уровне 10,8 г/кг среды.

5. Идентифицированы промежуточные метаболиты (олеиновая, линолевая, у-линоленовая и дигомо-у-линоленовая кислоты) на пути превращения стеариновой кислоты в АК. Предложена гипотетическая схема биосинтеза основных полиненасыщенных жирных кислот у гриба Mortierella alpina 18-1.

6. Установлено влияние вида и количества инокулята на рост и синтез липидов штамма Mortierella alpina 18-1. Показано, что оптимальным видом инокулята является мицелий, вносимый в количестве 2,5% от объема питательной среды.

7. Показана возможность получения практически важного сложного эфира АК и глицерина с помощью липолитических микроорганизмов.

8. На основе проведенных исследований предложена принципиальная технологическая схема биосинтеза и выделения АК с использованием найденного штамма Mortierella alpina 18-1.

Заключение

Увеличение спроса на АК а также другие ПНЖК привело к разрыву между текущим уровнем их производства из традиционных источников (растения, рыбы, млекопитающие) и потребностью в них рынка. Подобная ситуация стимулировала поиск альтернативных источников их получения, таких как водоросли, грибы и бактерии.

Наиболее перспективным источником АК на сегодняшний день являются грибы рода Mortierella. Однако, несмотря на значительные успехи в области получения АК с помощью различных штаммов Mortierella alpina приведшие в ряде случаев к промышленному их использованию и ненасыщенности рынка этим продуктом весьма актуальным является поиск способов понижения стоимости липидов содержащих АК получаемых биотехнологическими путем и популяризация продуктов обогащенных ею. Основными направлениями в этой области являются: поиск новых штаммов продуцентов и создание мутантов на основе уже имеющихся синтетиков АК, поиск дешевых субстратов и оптимизация условий культивирования найденных продуцентов, поиск активаторов и ингибиторов десатураз, сокращение этапов и совершенствование обработки микробных липидов.

Настоящая работа была направлена на получение новых высокоэффективных продуцентов АК, поиск условий их эффективного культивирования с целью повышения выхода целевого продукта, совершенствование биотехнологии получения АК, создание методов биосинтеза практически важных веществ на ее основе путем: скрининга микроорганизмов потенциальных продуцентов АК; исследования морфологических, физиолого-биохимических и патогенных свойств найденных перспективных продуцентов; исследования

46 влияния условий культивирования перспективных штаммов на выход биомассы, липидов и АК; поиска условий биосинтеза сложных эфиров АК и глицерина с помощью липолитических микроорганизмов для обоснования принципиальной технологической схемы получения АК с использованием найденных перспективных штаммов.

2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данном разделе рассмотрены основные объекты, материалы и методы, а также физико-химические и спектральные характеристики (масс и ЯМР-13С спектры) соединений используемых или полученных в ходе выполнения экспериментальных исследований. Приведены результаты математической оценки качества проведенных экспериментов.

2.1. Объекты исследования

Объектом исследования служили выделенные штаммы низших почвенных грибов, полученные в результате многократных пассажей на агаризо-ванном сусле и/или картофельной среде при пониженной и/или комнатной температуре и отобранные из них 22 штамма обладающих высокой чувствительностью к ацетилсалициловой кислоте - необратимому ингибитору цик-лооксигеназы (рис. 1.2).

2.2. Материалы исследования

Материалами исследования служили чистые реактивы российского и зарубежного производства (табл. 2.1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Давлетбаев, Игорь Маратович, Уфа

1. German J.B., Dillard С. J., Whelan J. Symposium: Biological Effects of Dietary Arachidonic Acid—Introduction//!. Nutr. 1996. - Vol. 126. - P. 1076-1080.

2. Гуннько В., Андреева С. Биологически активные вещества в косметических средствах по уходу за кожей лица// Провизор. 2002. - №12. -С.65-72.

3. Кульнев А.И., Соколова Е. А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций, роста и развития растений. Пущино// ОНТИ ПНЦ РАН. -1997. 100с.

4. Eroshin V. К. and Dedyukhina Е. G. Effect of lipids from Mortierella hygrophila on plant resistance to phytopathogens// World J. of Microbiol. & Biotechnol. 2002. - Vol. 18. - P. 165-167.

5. Igbal Gill and Rao Valivety. Polyunsaturated fatty acids, part 1: Occurrence, biological activities and applications// Tibtech October. 1997. - Vol. 15.-P. 401-409.

6. Ratledge C. Single cell oils—have they a biotechnological future?// Trends Biotechnol. 1993. - Vol. 11. - P. 278-284.

7. Bajpai P., Bajpai P.K., Arachidonic acid production by microorganisms// Biotechnol. Appl. Biochem. 1992. - Vol. 15. - P. 1-10.

8. Shimizu S., Shinmen Y., Kawashima H., Akimoto K., Yamada H. Production of C-20 polyunsaturated fatty acids by fungi// Proceeding of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oils Industry. 1987. - AOCS, Champaign, IL. - P. 1000-1006.

9. Milan Certik, Eiji Sakuradani and Sakayu Shimizu. Desaturase-defective fungal mutants: useful tools for the regulation and overproduction ofpolyunsaturated fatty acids// Tibtech December. 1998. - Vol. 16. - P.500-505.

10. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhina E. G., Chistyakova T. I. Arachidonic acid production by Mortierella alpina with grown-coupled lipid synthesis// Proc. Biochem. 2000. - Vol. 35. - P. 1171-1175.

11. Hugo Streekstra. On the safety of Mortierella alpina for the production of food ingredients, such as arachidonic acid// J. Biotechnology. 1997. -Vol. 56.-P. 153-165.

12. Singh A., Ward O. P. Production of high yields of arachidonic in a fed-batch system by Mortierella alpina ATCC 32222// Appl. Vicrob. Biotechnol. 1997. - Vol. 48. - P. 1-5.

13. Hung-Der Jang, Yuh-Yih Lin and Shang-Shyng Yang. Polyunsaturated fatty acid production with Mortierella alpina by solid substrate fermentation. Bot. Bull. Acad. Sin. 2000, №41, p.41-48.

14. Желифонова В. П., Зинченко Г. А., Белов А. П., Дедюхина Э. Г., Ерошин В. К. Исследование состава липидов Mortierella hygrophila продуцента арахидоновой кислоты// Прикл. биохим. и микробиол. - 1994. - Т. 30. -Вып. 4-5.-С. 610-616.

15. Yasushi Kamisaka; Naomi Noda, Tatsuya Sakai, Kazunori Kawasaki. Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus, Mortierella ra-manniana var. angulispora// Biochim. Et. Biophys. Acta. 1998. -Vol. 1438. - P. 185-198.

16. Eroshin V.K., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Zhelifonova V.P., Kurtzman C.P., Bothast R.J. Arachidonic-acid production by species of Mortierella!! World J. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 12. - P. 91-96.

17. Totani N., Watanabe A., Oba K. An improved method of arachidonic acid production by Mortierella alpinall J. Jpn. Oil Chem. Soc. 1987. - Vol. 36. -328-331.

18. Ward O. Microbial production of long-chain PUFAs// INFORM. Vol. 6.- 1995.-P. 683-688.

19. Bigelis R. Fungal metabolites in food processing// Arora, D.K., Mukerji, K.G., Marth, E.H. (Eds.). 1991, Handbook Applied Mycology Vol. 3:

20. Foods and Feeds. Marcel Dekker, New York, P. 426-428.

21. Martek Corporation. World Patent No. W09212711-A1 1992. (www.martekbio.com)

22. Rjbles Medina A., Molina Grima E., Gimenez Gimenez A. and Ibanez Gonzales M. J. Downstream processing of algal polyunsaturated fatty acids// Bio-technol. Advances. 1998. - Vol. 16. - №3. - P. 517-580.

23. Smith W. L. and Borgeat P. Biochemistry of Lipids and Membranes (Vance D. E and Vance J. E., eds.).// Benjamin Cummings, Redwood City, CA, USA.-1985.-P. 325-360.

24. Grammatikos S.I, Subbaiah P.V., Victor T.A., Miller W.M. Diverse effects of essential (n-6 and n-3) fatty acids on cultured cells// Cytotechnology. -1994.-Vol. 15.-P. 31-50.

25. German J. В., Dillard C. J. and Whelan J. Biological effects of dietary arachidonic acid. Introduction// J. Nutr. Apr. 1996. - №126:4. - P. 1076-1080.

26. Sardesai V. M. The essential fatty acids// J. Nutr. Biochem. 1992. -№7:3.-P. 562-579.

27. Lands W. E. M. Eicosanoids and health// Ann NY Acad. Sci. 1993. -Mar., Vol. 15.-P. 46-59.

28. Fletcher J. R. Eicosanoids. Critical agents in the physiological process and cellular injury// Arch. Surg. 1993. - Nov., - №128:11. - P. 1192-1196.

29. Simopoulos A. P. Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development// Am. J. Clin. Nutr. 1991, Sep., №54:3. - P.438^163.

30. Fernandes G. and Venkatraman J. T. Role of Omega-3 Fatty Acids in Health and Disease// Nutr. Res. 1991. - Vol. 13. - P.19-45.

31. Dyerberg J. and Bang H. O. Haemostatic function and platelet polyunsaturated fatty acids in Eskimos// Lancet. 1979. - Vol. 11. - P. 433-440.

32. Chow C.K. ed. Fatty acids in meats and meat products. Fatty acids in foods and their health implications// New York: Marcel Dekker, Inc. 1992. - P. 65-93.

33. Hummel D. S. Dietary Lipids and Immune Functions Prog// Food. Nutr. Sci. 1993. - Vol. 17. - P. 327-329.

34. Efamol Holdings pic European Patent No. EP490561-A2, 1992.

35. Scotia Holdings pic European Patent No. EP609001-A2, 1994.

36. Agostoni C., Verduci E. Die Rolle der ungesattigten Fettsauren bei der Diat im Sauglings- und Kindesalter// J. ERNAHRUNGSMED. Vol. 1. - 1999. -P. 17-21.

37. Igbal Gill and Rao Valivety. Polyunsaturated fatty acids, part 2: biotransformations and biotechnological applications// Tibtech October. 1997. -Vol. 15.-P. 470-478.

38. Владимиров В. А. свободные радикалы и антиоксиданты// Вестник Рос. Академии мед. Наук. 1998 . - №7. - С. 43-51.

39. Gunstone F. D., Harwood J. L. and Padley F. B. Occurrence and characteristics of oils and fats// The Lipid Handbook (Editors, F D Gunstone, J L Harwood and F В Padley), Chapman and Hall, London. 1994. - P. 47-223. - ISBN 0412^13320 6.

40. Van der Westhuizen J.P.J., Kock J.L.F., Botha A. and Botes P J. The distribution of the w3 and w6 series of cellular long - chain fatty acids in fungi// Systematic and Appl. Microbiol. - 1994. - Vol. 17. - P. 327-345.

41. Ahlgren G., Gustafsson I. B. and Boberg M. Fatty acid content and chemical composition of freshwater microalgae// J. Phycol. 1992. - Vol. 28. -P.37-50.

42. Blomquist G. J., Borgeson С. E. and Vundla M. Polyunsaturated fatty acids and eicosanoids in insects// Insect Biochem. 1991. - Vol. 21. - P.99 - 106.

43. Allman M. A. Plant sources of n-3 fatty acids// J. Food. 1995. -Aust., Vol. 47. - P. 14-17.

44. Yongmanitchai W. and Ward O. P. Omega-3 fatty acids: Alternative sources of production// Proc. Biochem. 1989. - Vol. 9. - P. 117 -125

45. Ratledge С. Technological Advances in Improved and Alternative Sources of Lipids (Kamel B. S. and Kakuda Y. eds)// Blackie Acad. 1994. - P. 235-291.

46. Панькина И. О., Конова И. В. Жирные кислоты фитофторовых грибов при их росте на различных средах// Микробиол. 1996. - Т.65, №2. -С. 177-181.

47. Chini Zittelli G., Lavista F., Bastianini A., Rodolfi L., Vincenzini M., Tredici M. R. Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp. Cultures on outdoor tubular photobioreactors// J. Biotechnol. 1999. -Vol. 70. - P. 299-312.

48. Tadao Y., ed. Advances in Polyunsaturated Fatty// Acids Reserch. -1993. Vol. 1025. - International Congress Series, Excerpta Medica, Tokyo.

49. Ohlrogge J. B. Design of new plant products: engineering of fatty acid metabolism// J. Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P.821-826.

50. Reddy A. S. and Thomas T. L. Expression of a cyanobacterial delta6-desaturase gene results in gamma-linolenic acid production in transgenic plants// J. Nat. Biotechnol. 1996. - Vol. 14. - P. 639-642.

51. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in industrial Applications of Single Cell Oils (Kyle D.J. and Ratledge C., eds)// American Oil Chemists Society, Champaign, IL, USA. 1992. - P. 1 - 15.

52. Folch J., Lees М. and Stanley G. M. A simple method for the isolation and purifications of total lipids from animal tissues// J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 226.-P. 497-509.

53. Галанина Jl. А., Соловьева H. JI., Конова И. В. Образование эйко-заполиеновых кислот Pythium debarianum при культивировании на различных средах//Микробиол. 1999. - Т. 68, №4. - С. 473-479.

54. Budziszewski G. J., Croft К. Р. С. and Hildebrand D. F. Uses of biotechnology in modifying plant lipids// J. Am. Oil Chem. Soc. 1996. - Vol. 31. -P. 557 -569

55. Yamada H., Shimizu H., Shinmen Y., Akimoto K., Kawashima H. and Jareonkitmongkol S. Industrial Applications of Single Cell Oils (Kyle D. J. and Ratledge C., eds)// American Oil Chem. Society, Champaing, IL, USA. 1992. -P. 118-138.

56. Панькина И. О., Конова И. В. Липидные характеристики Phy-tophthora cryptogeall Микробиол. 1996. - Т.65, №2. - С. 182-188.

57. Gertik М., Sereke Berhan S., Sajbidor J. Lipid production and fatty acid composition of select strain belonging to Mucoralesll Acta Biotechnol. -1993.-Vol. 13.-P.193-196.

58. Cohen Z., Didi S. and Heimer Y. M. Overproduction of y-linolenic and eicosapentaenoic acids by algae// J. Plant Physiol. 1992. - Vol. 98. - P. 569572.

59. Kyle D., Behrens P., Bingham S., Arnett K. and Leibennan D. Biotechnology for the Fats and Oils Industry// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA. (Applewhite Т. H., ed.). 1988. - P. 117-121.

60. Kyle D. J., Sicotte V. J. and Reeb S. E. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds). -1992. P. 287-300.

61. Yazawa K., Watanabe K., Ishikawa C., Kondo K. and Kimura S. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds).- 1992. P. 29-51.

62. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in Microbial Lipids// Academic Press (Ratledge C. and Wilkinson S. G., eds). 1992. - Vol. 2. - P. 567 -668.

63. Certik M. and Shimizu S. Recent Research Developments in Oil Chemistry// Transworld Research Network, Trivandrum, India. (Pandalai, S. G., ed.)- 1998. Vol. 2. - P. 89-103.

64. Shimizu S. and Jareonkitmongkol S. Biotechnology in Agriculture and Forestry// Springer-Verlag (Bajaj, Y. P. S., ed.). 1995. - Vol. 33. - P. 308-325.

65. Napier J. A., Hey S. J., Lacey D. J. and Shewry P. R. Identification of a Caenorhabditis elegans D6 fatty acid desaturase by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiaell J. Biochem. 1998. -Vol. 330. - P. 611-614.

66. Shimizu S., Akimoto K., Sugano M. and Yamada H. Essential Fatty Acids and Eicosanoids// AOCS Press, Champaign, USA (Sinclair, A. and Gibson, R, eds).- 1993.-P. 31-41.

67. Napier J.A. Transgenic plants for the production of pharmaceutical fatty acids// Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz. -2000.-Vol. 43.-P. 99-103.

68. Mehlenbacher V. C., Analisis de Grasas у Aceites. Estabilization de aceite de perscado con propoleo// Bilbao: Editorial Urmo, Spain. 1970. - P.538-543.

69. Lundberg W. O. and Jarvi P. Peroxidation of polyunsaturated fatty compounds// Progress in the Fats and Other Lipids. London: Pergamon Press. -1966.-Vol. 9.-P. 265-275.

70. Holman R. T. General introduction to polyunsaturated acids// Progress in the Fats and Other Lipids. London: Pergamon Press. 1966. - Vol. 9. - P. 1-11.

71. Hara A. and Radin N.S., (1978) Lipid extraction of tissues with a lowtoxicity solvent// Anal. Biochem. Vol. 90. - P. 420-426.

72. Ito N., Hirose M., Fukushima S., Tsuda,H., Tatematsu M., and Asamoto M., Modifying Effects of Antioxidants on Chemical Carcinogenesis// FoodChem. Toxicol. 1986-Vol. 14.-№. 3.-P. 315-323.

73. Humeau C., Girardin M., Rovel В., Miclo A. Enzymatic synthesis of fatty acid ascorbyl esters/ J. of Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1998. - Vol. 5. - P. 19-33.

74. Kates M,. Techniques of Lipidology: Isolation, Analysis and Identification of Lipids// Separation of lipid mixtures, Amsterdam: Elsivier. 1988. -2nd edition, - pp. 186-278.

75. Zhukov A. V. and Vereshchagin A. G. Current techniques of extraction, purification and preliminary fractionation of polar lipids of natural origin// Adv. in Lipid Reserch. 1981. -Vol. 18. -P. 247-282.

76. Cohen Z. and Cohen S. Preparation of eicosapentenoic acid (EPA) concentrate from Porphyridium cruentumll J. Am. Oil Chem. Soc. 1991. - Vol. 68.-P. 16-19.

77. Domart C., Miyauchi D.T., Sumerwell W.N. The fractionation of marine-oil fatty acids with urea// J. Am. Oil Chem. Soc. 1955. Vol. 32. -P. 481483.

78. Bligh E. G. and Dyer W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification// Can. J. Biochem. Physiol. -1959. Vol. 37. -P. 911-917.

79. Molina Grima E., Robles Medina A., Gimenez Gimenez A., Sanchez Perez, J.A., Garcia Camacho, F. and Garcia Sanchez, J.L., Comparison between extraction of lipids and fatty acids from microalgal biomass// J. Am. Oil Chem. Soc. 1994. -Vol. 71. -P. 955-959

80. Ibanez Gonzalez M.J., Robles Medina A., Molina Grima E. and Gimenez Gimenez A., Method purifications oil from Phaeodactylum tricornutum!'/ J. Am. Oil Chem. Soc. 1997. Vol. 86. - P. 145-151.

81. Cartens M., Molina Grima E., Robles Medina A., Gimenez Gimenez A. and Ibanez Gonzalez M.J.// Eicosapentaenoic acid (20:5n-3) from the marine microalga Phaeodactylum tncornulum. J. Am. Oil Chem. Soc. - 1996. -Vol. 72.-P. 1-7.

82. Belter P. A., Cussler E. L. and Hu W. S.// Bioseparation: Downstream Processing for Biotechnology. New York: John Wiley. -1988. -P. 209-213.

83. Hara A. and Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent// Anal. Biochem. 1978. - Vol. 90. -P. 420-426.

84. Ahlgren G. and Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: A method study// Arch. Hydrobwi. 1991. - Vol. 121. -P. 295-306.

85. Nagle, N. and Lemke, P., (1990) Appl. Biochem. Bioiechnol. 24/25, 355-361 Production of methyl ester fuel from microalgae.

86. Schlenk H. Urea inclusion compounds of fatty acids// Progress in the Fats and other Lipids. -1954. Vol. 2. - P. 243-267.

87. Swern, D, Fatty Acids. Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, К S (ed.). New York: Interscience Publishers Techniques of separation. Urea complexes. -1964. Part 3. - 2nd edition. - P. 2309-2358.

88. Smith A.E. The crystal structure of the urea-hydrocarbon complexes// Acta Crysl. -1952. Vol. 5. P. 224-235.

89. Abu-Nasr A.M. and Holman R.T., J. Highly unsaturated fatty acids. II Fractionation by urea inclusion compounds// Am. Oil Chem. .Sue. 1954. Vol. 31. P. 16-31.

90. Ratnayake W.M.N., Olsson В., Matthews D. and Ackman R.G., Preparation of omega-3 PUFA concentrates from fish oils via urea complexation// Fat Sci. Technol. 1988. - Vol. 10. P. 381-386.

91. Gruger E.H. Jr., Methods of separation of fatty acids from fish oils with emphasis on industrial applications// 11th Annual Conference of Pacific Fisheries Technologists, Gerhart, OR, March. 1960. - Vol. 27-28. - P. 31-40.

92. Robles Medina A., Gimenez Gimenez A., Molina Grima E. and Garcia Sanchez, J.L., Obtencion de concentrados de acidos grasos poliinsaturados porel metodo de los compuestos de inclusion de urea// Grasas у Aceiles- 1995. Vol. 42. P. 174-182.

93. Iverson J.L., Weik R-W., Correlation of fatty acid structure with preferential order of urea complex formation// J. Am. Oil Chem. Soc. 1967. Vol. 50. P. 1111-1118.

94. Haagsma N., Van Gent C.M., Luten J.B., De Jong R.W. and van Doom E. Preparation of an co-3 fatty acid concentrate from cod liver oil// J. Am. Oil Chem. Soc. 1988. -Vol. 59. P. 117-118.

95. Traitler H., Wille H.J. and Studer A. Fractionation of blackcurrant seed oil// J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988/-Vol. 65.-P. 755-760.

96. Wille H.J., Traitler H. and Kelly M. Production of polyenoic fish oil fatty acids by combined urea fractionation and industrial scale preparative HPLC// Revue Francaise des corps gran. 1987. - Vol. 34. - P. 69-73.

97. Domart C., Miyauchi D.T. and Sumerwell W.N. The fractionation of marine-oil fatty acids with urea// J. Am. Oil Chem. Soc. 1955. - Vol. 32. - P. 481-483.

98. Shukla V. Recent advances in the high performance liquid chromatography of lipids// Prog. Lipid Res. 1988. - Vol. 27. - P. 5-38.

99. Scholfield C.R. Silver nitrate-high performance liquid chromatography of fatty methyl esters// J. Am. Oil Chem. Soc. 1979. - April. - P. 510-511.

100. Ozcimder M. and Hammers W.E. Fractionation of fish oil fatty acid methyl esters by means of argentation and reverse-phase high-performance liquid chromatography, and its utility in total fatty acid analysis// J. Chromatog. 1980. -Vol. 187.-P. 307-317.

101. Hartley F.R Thermodynamic data for olefin and acetylene complexes of transition metals// Chem. Rev. 1973. - Vol. 73. - P. 163-190.

102. Aveldano M.I., van Roollins M. and Horrocks L.A. Separation and quantitation of free fatly acids and fatty acid methyl esters by reverse phase high pressure liquid chromatography // J. Lipid Res. 1983. - Vol. 24. - P. 83-93.

103. Henke H. and Schubert J. HPLC of fatty acid esters of mono- and polyhydric alcohols, part 1: Analytical separation// .J. High Resol. Chromat. &

104. Chromat. Comm. -1980. Vol. 3. -P. 69-78.

105. Privett O.S. Preparation of polyunsaturated fatty acids from natural sources // Progress in the Chemistry of bats and Other Lipids. Holmnan R.T. (ed.). - 1968. - Vol. 9, Chapter 11, part 3, Pergamon Press. - P. 409-452.

106. Schlenk H. Crystallization of fatty acids// J. Am. Oil Chem. Soc. -1961.-Vol. 38.-P. 728-736.

107. Shinowara G.Y. and Brown J.B. Studies on the chemistry of the fatty acids. VI The application of crystallization methods to the isolation of arachidonic acid, with a comparison of the properties// J. Biol. Chem. 1940. -Vol. 134. - P. 331-340.

108. Markley K.S. Interscience Publishers Technique of separation A Distillation, salt solubility, low-temperature crystallization// Fatty Acids, Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, KS (ed.), 2nd edition. Part 3, 1964.-P. 1983-2123.

109. Teramoto M., Matsuyama H., Ohnishi N., Uwagawa S. and Nakai K. Extraction of ethyl and methyl esters of polyunsaturated fatty acids with aqueous silver nitrate solutions.// Ind. Eng. Chem. Res. 1994. -Vol. 33. -P. 341-345.

110. Shantha N.C and Ackman R.G. Silica gel thin-layer chromatographic method for concentration of longer-chain polyunsaturated fatty acids from food and marine lipids// Can. Inst. Sci. Technol. J. 1991. - Vol. 24. - P. 156-160.

111. Hardy R. and Keay J.N. The isolation of the polyunsaturated acids of the fish oils as their methyl esters by preparative scale gas chromatography// J. Chormatog. 1967. - Vol. 27. -P. 474^179.

112. Wrigth S.W., Kuo E.Y., Corey E.J. An effective process for the isolation of docosahexaenoic acid in quantity from cod liver oil// J. Org. Chem. 1987. -Vol. 52.-P. 4399-4401.

113. Corey EJ. and Wright S.W. Convenient method for the recovery of ei-cosapentaenoic acid from cod liver oil// J. Org. Chem. 1988. - Vol. 53. - P. 5980-5981.

114. Gaiday N.V., Imbs A.B., Kuklev D.V. and Latyshev N.A. Separation of natural polyunsaturated fatty acids be means of iodolactonization.// J. Am. Oil.