Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состав жирных масел плодов бересклетов

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Состав жирных масел плодов бересклетов"

На правах рукописи

Сидоров Роман Александрович

СОСТАВ ЖИРНЫХ МАСЕЛ ПЛОДОВ БЕРЕСКЛЕТОВ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва- 2013

005531819

Работа выполнена в лаборатории липидного обмена Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Цыдендамбаев Владимир Дылыкович

Официальные оппоненты: Соловченко Алексей Евгеньевич

доктор биологических наук, кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, г. Москва, ведущий научный сотрудник

Загоскина Наталья Викторовна

доктор биологических наук, ИФР РАН, г. Москва, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, г. Казань

Защита состоится 20 июня 2013 г. в 15.00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, д. 35. Факс: +7 (499) 977-80-18, e-mail: m-azarkovich@ippras.ru: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук.

Автореферат разослан «19» мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Род Бересклет (Euonymus L.) составляют кустарниковые или древесные растения, распространённые в основном в Северном полушарии, в том числе в нашей стране [Леонова, 1974]. Он включает 129 [Ма, 2001] или даже 220 видов [Zhu, 2012], которые, подразделяются на два подрода - Euonymus и Kalonymus [Blakelock, 1951; Ma, 2001], а также ряд секций [Леонова, 1974].

Фотохимические исследования растений рода Euonymus проводились до сих пор главным образом для обнаружения биологически активных веществ. Многие его виды используются в китайской народной медицине, поскольку они содержат вещества, обладающие противоопухолевой, противомикробной, антидиабетической и инсектицидной активностью [Zhu, 2012]. К настоящему времени из этих видов было выделено и идентифицировано свыше 200 различных соединений [Zhu, 2012].

Кроме того, в плодах отдельных видов этих растений уже давно было найдено жирное масло [Blakelock, 1951], которое накапливается не только в семенах, но и в ариллусах плодов [Corner, 1976; Меликян, Савинов, 2000]. Таким образом, можно заключить, что виды рода Euonymus принадлежат к группе растений с сочными масличными плодами [Трусов, Созонова, 2012], накапливающих масло не только в высыхающих при созревании семенах, но и в водонасыщенных внесеменных частях плода (гипантиях, мезокарпах и др.). При этом масла, запасаемые в разных частях их плодов, резко различаются по ЖК-составу.

В семенах исследованных ранее видов бересклетов резервные нейтральные ацилгли-церины (НАГ) масла на 80-98% состояли из ацЦАГ ($л-1,2-диацил-3-ацетилглицеринов -аналогов триацилглицеринов (ТАГ), у которых s/7-З-положение ^тарифицировано остатком уксусной кислоты) и лишь на 2-15% - из ТАГ обычного состава В то же время, в НАГ ариллусов Е. alatus [Durrett et al., 2010] содержались преимущественно ТАГ, наряду с которыми в небольшом количестве присутствовали и а^ДАГ [Milcamps et al., 2005]. И ТАГ, и от-1,2-положения ацДАГ включали главным образом остатки высших Ci6-Cis-Hacbi-щенных и -ненасыщенных ЖК [Kleiman et al., 1967; Milcamps et al., 2005], однако то, что остаток уксусной кислоты ацилирует именно ул-З-положение молекулы ацДАГ, достоверно доказано не было. Кроме того, динамика накопления сухой массы, а также содержания и состава обоих классов НАГ в ходе развития плодов бересклетов также никем не изучались. Наконец, качественный и количественный состав резервных НАГ семян и ариллусов был до сих пор в той или иной степени изучен лишь у нескольких видов рода Euonymus, причём ни в одном случае не исследовались НАГ обеих частей одних и тех же плодов.

Учитывая это, а также то, что разные представители этого рода очень сильно отличаются друг от друга по морфологии и окраске плодов и семян, представляло интерес исследовать особенности состава и содержания НАГ в плодах ряда бересклетов, принадлежащих к различным систематическим подразделениям рода Еиопутиз.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — изучить особенности количественного и качественного состава НАГ ариллусов и семян зрелых плодов 14 видов бересклетов, относящихся к обоим подродам рода Еиопутш.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить качественный и количественный состав НАГ в маслах ариллусов и семян зрелых плодов 14 видов бересклетов, а также ЖК-состав обоих классов НАГ;

• Доказать, что остаток уксусной кислоты в молекуле ацДАГ этерифицирует исключительно уи-3-положение глицеринового остатка;

• Исследовать особенности формирования морфологической и анатомической структуры созревающих плодов трёх модельных видов бересклетов, относящихся к разным подродам и секциям рода Еиопутиз;

• Установить особенности накопления НАГ в ариллусах и семенах отдельных видов бересклетов в ходе созревания плодов, а также изменения их ЖК-состава.

Научная новизна работы. С помощью двумерной ЯМР-спектроскопии впервые было доказано, что остаток уксусной кислоты этерифицирует исключительно $л-3-положе-ние в молекуле а г;ДАГ, выделенных из семян бересклетовых растений. Тем самым получено первое строгое экспериментальное доказательство того, что в семенах бересклетов наряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, содержится ДАГАТ, строго специфичная как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к яя-З-положению глицеринового остатка, результатом действия которой является образование ацЦАГ. Установлено, что при ЯМР-спектро-скопии остаток уксусной кислоты при -положении влияет на химические сдвиги протонов при 577-1- и $л-3-углеродных атомах глицеринового остатка ацДАГ, что позволило исправить имевшееся ранее в литературе некорректное представление о соотнесении сигналов от этих протонов с их положением в молекуле ацДАТ.

Охарактеризован качественный и количественный состав НАГ ариллусов и семян как зрелых, так и созревающих плодов бересклетов, а также изучен их ЖК-состав; для 11 видов состав НАГ определён впервые. Кроме того, в ТАГ ариллусов некоторых видов бересклетов были обнаружены в значительных количествах (до 7.8%) необычные для высших

~ 4 ~

растений Д8-16:1 и Д10-18:1 ЖК, структура которых была доказана с помощью масс-спектрометрии их ОМОХ-производных; эти жирные кислоты в растениях обнаружены впервые. Показано, что ЖК-состав ТАГ ариллусов является хемотаксономическим признаком, характеризующим тот или иной вид бересклета на уровне подрода. Установлено, что ариллусы по абсолютному и относительному содержанию НАГ превосходят семена.

Впервые в составе жирных масел ариллусов 12 видов и семян 4 видов бересклетов были обнаружены и детально изучены низшие алкиловые эфиры ЖК (НАЭЖК), состоящие из метиловых, этиловых, иго-пропиловых и н-бутиловых эфиров. Показано, что разные фракции НАЭЖК могли образовываться за счёт различных пулов ЖК.

Практическая значимость. Экспериментальные результаты и теоретические обобщения диссертационной работы могут быть использованы для разработки программ научных исследований по изучению диетической и энергетической ценности ог^ДАГ природного происхождения, а также особенностей их метаболизма в организме животных; при планировании исследований, направленных на получение генетически модифицированных линий различных масличных культур, продуцирующих ацДАГ, которые могут быть использованы для синтеза биодизеля или как пищевая добавка в диетическом питании. Совокупность экспериментальных данных может быть использована при чтении курсов лекций для студентов биологических специальностей вузов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII съезде Общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011); на конференциях (Москва, 2011 и 2012) и семинаре молодых учёных ИФР РАН (Москва, 2010); на IX Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2011); на Международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск, 2013); на XIX и XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2012 и 2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, из которых 2 являются статьями в рецензируемых изданиях.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста, содержат 15 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 330 источников, в том числе 315 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал. Зрелые плоды бересклетов (стадия III) собирали на стадии вскрывшейся коробочки в течение 2010 и 2011 годов в дендрарии Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. Было исследовано 14 видов, относящихся к двум подродам и 4 секциям рода Euonymus L. Помимо зрелых плодов, также были выбраны три модельных вида, относящихся к секциям Euonymus (Е. europaeus) и Pseudovyenomus (Е. verrucosus) подрода Euonymus, и к одноимённой секции подрода Kalonymus (Е. maximoviczianus). Их плоды собирали в процессе развития: на стадии глобулярного зародыша (стадия I), на стадии зрелого плода - раскрывшейся коробочки (стадия III) и между этими сроками, когда зародыш был вполне сформирован (стадия II). •

Экстракция липидов. Семена в ариллусах фиксировали в течение 1 мин в кипящей воде, после чего разделяли на ариллусы и семена. Полученный материал гомогенизировали и липиды экстрагировали как описано ранее [Пчёлкин и др, 2006].

Тонкослойная хроматография экстрактов. Аналитическую ТСХ экстрактов ариллусов и семян проводили на пластинках Silufol (40><100 мм), используя смесь н-гексан : ди-этиловый эфир : СНзСООН (70:30:1) в качестве подвижной фазы. Фракционирование экстрактов выполняли на пластинках Merck Kieselgel 60F (200x200 мм), предварительно промытых смесью ацетон : хлороформ (1:1), пропитанных 0.001%-ным раствором 2',7'-ди-хлорфлюоресцеина в метаноле.

ЯМР-спектрокопия ацДАГ растительного происхождения. Выделенные ацДАГ (-50 мг) растворяли в 500 мкл CDCI3 и переносили в 5-мм ампулу для ЯМР спектрометра. Одномерные 'Н и 13С, двумерные гомоядерные WH спектры COSY, TOCSY, ROESY и двумерные гетероядерные 'Н/13С спектры НМВС, HSQC и HSQC-TOCSY регистрировали на приборе AV-600 Bruker по стандартным методикам. Химические сдвиги в |3С спектрах (ррт) регистрировали относительно сигнала |3С растворителя CDCI3 (8с 77.0 ррт) и остаточного сигнала 'Н СНСЬ (5н 7.27 ррт).

ГЖХ-анализ ЖК-состава НАГ и идентификация необычных ЖК. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) ацЦАГ или ТАГ получали прямой переэтерификацией в метаноле, содержавшем 10% ацетилхлорида по методу [Zhukov, Vereshchagin, 1970]. Синтез DMOX-производных ЖК для установления точного положения двойной связи проводили по методу Куклева-Смита [Kuklev, Smith, 2003]. Состав МЭЖК и DMOX определяли с помощью ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890А с капиллярной колонкой DB-23 (60 м х 0.25 мм х 0.25 мкм). Анализ и интерпретацию масс-спектров DMOX производных ЖК проводили на ос-

~6~

нове эмпирических правил и таблиц диагностических фрагментарных ионов [Zhang et al., 1998; Spitzer, 1997]. Количественное содержание ТАГ и ацДАГ определяли с помощью ГЖХ с внутренним стандартом (17:0) как описано ранее [Zhukov, Vereshchagin, 1970].

Статистическая обработка экспериментальных данных. Все вычисления производили в программе STATISTICA. Все данные были проверены на нормальность распределения с помощью теста Шапиро-Уилка (0.72 < W < 1.00, 0.31 <р < 0.84) [Shapiro, Wilk, 1965]. Достоверность различий между анализируемыми выборками определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия Фишера. Степень возможного родства исследованных видов бересклетов, основанная на сходстве ЖК-состава запасных ТАГ ариллусов зрелых плодов, была изучена с помощью метода кластерного UPGMA-анализа (метод невзвешенного арифметического среднего) [Sneath, Sokal, 1973], а также с помощью кластеризации методом k-средних [MacQueen, 1967]. В таблицах представлены средние арифметические трёх аналитических определений трёх биологических повторностей.

Установление стереоспецифичности строения молекул аиДАГ растительного происхождения с помощью ЯМР-спектроскопии

В настоящее время известно лишь три статьи, в которых одДАГ растительного или животного происхождения были изучены с помощью ЯМР-спектроскопии, однако достоверного доказательства того, что остаток уксусной кислоты этерифицирует исключительно £и-3-положение авторам получить не удалось по причине недостаточного разрешения применяемых приборов [Kleiman et al, 1967], либо из-за ошибочного соотнесения сигналов от атомов [Limb et al, 1999], или по причине того, что исследователи не применяли методы 2Б-ЯМР [Durrett et al, 2010].

А А' В, В'

4.310 4.290 4.160

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. 1. Область 4.1-4.4 ррш 'Н-ЯМР спектра (600 МГц) агуДАГ из семян бересклета Максимовича

4.34 ' 4.30 ' Í26~ ' 4.22 ТпГ ' 4Л4 РР™

На рис. 1 приведена часть 'Н-ЯМР спектра ацДАГ из семян бересклета Максимовича. Можно видеть, что в области 4.3 ррт имеет место выраженная асимметричность двойного дублета. Опираясь на известные данные [Lie Ken Jie, Lam, 1995], мы предположили, что химические сдвиги протонов На и На- 5н 4.31 и 4.29 соответственно, обусловлены влиянием ацильных остатков разной длины при sw-l- и sn-З-положениях глицеринового остатка. Для проверки этой гипотезы, мы записали спектры 'Н/13С НМВС (рис. 2 и 3) и HSQC-TOCSY этих ацЦАГ.

На рис. 2 видно, что протон На' коррелирует с углеродным атомом глицеринового остатка (5с 170.37), в то время как протоны На, Нв и Нв1- с углеродным атомом 5с 173.20 и 173.16. Это расщепление сигнала от углеродного атома карбоксильной группы R-0-C=0 обусловлено различными остатками насыщенных и ненасыщенных ЖК при in-1-положении глицеринового остатка. Также видно, что ни один из этих четырёх протонов не коррелирует с углеродным атомом (5с 172.78) при £и-2-положении.

В,В'

Рис. 2. Фрагмент 'Н-13С НМВС спектра ацДАГ из семян Е. maximovic-zianus

sn-ї

ІЯ-І

169.5 170.5 171.5 172.5 173.5 174.5

4.34

4.30

4.26

4.22

4.18

4.14 Pi™

Также нами впервые было установлено, что синглет от протонов остатка уксусной кислоты (5н 2.07 ррт) даёт единственную корреляцию с углеродным атомом карбоксильной группы (5с 170.37 ррт). Два перекрывающихся триплета от протонов углеродного атома, связанного с углеродным атомом карбоксильной группы (5н 2.331 и 2.318 ррт), напротив, дают чёткие корреляции с углеродными атомами карбоксильных групп - 5с 172.78 и 173.16 ррт соответственно (рис. 3).

■Он

п

В/о

169

170

171

172

173

174

175

Рис. 3. Фрагмент 'Н-13С НМВС спектра ацДАГ из семян Е. тахточк-г1апи$

Таким образом, было показано, что протон Ш' (8н 4.29) при углеродном атоме 8с 62.32 остатка глицерина коррелирует с углеродным атомом 5с 170.37 карбоксильной группы, которая также коррелирует с протонами ацетатного остатка (8н 2.07). Это означает, что остаток уксусной кислоты связан с углеродным атомом 8с 62.32, который, согласно данным Дарретта с соавт. [ИиггеИ е/ а/, 2010], представляет собой углеродный атом в хл-3-положении глицеринового остатка молекулы ацДАГ. То есть, нами получено строгое инструментальное подтверждение стереоспецифичности строения ацЦАГ, а значит, и присутствия в семенах бересклетов наряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, другой ДА-ГАТ, строго специфичной как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к от-3-положению глицеринового остатка.

Содержание сухого вещества и НАГ в зрелых плодах бересклетов

В ходе проведённых исследований было установлено, что семена достоверно превосходили ариллусы по абсолютному и относительному (рис. 4 А) содержанию сухой массы в среднем в 2.6 и 1.6 раза, соответственно.

У всех изученных видов ТАГ в том или ином количестве присутствовали в обеих частях плода. В то же время, ац ДАГ всегда обнаруживались только в семенах, а в ариллусах четырёх видов они содержались лишь в следовых количествах. Абсолютное содержание НАГ в ариллусах в мг/г сухой массы было в среднем вдвое выше, чем в семенах (23.6 и 11.3 %) (рис. 4 Б); в расчёте на сухую массу 1 органа, ариллусы также обнаруживают повышенную масличность (рис. 4 В). Доля ТАГ в семенах изученных нами бересклетов составляла 4-5%, а в ариллусах —98% от суммы НАГ, что было несколько выше, чем обна-

руженное ранее в семенах (3.3 и 91.7% от суммы липидов) и ариллусах (91.2 и 0.5%, соответственно) £. а1Шш [Ииггеи е> а1, 2009].

Рис. 4. Дисперсионный анализ достоверности различий некоторых признаков в наблюдаемых выборках (N=14)

А: ^-1=38.2, р=0.001%; Б: Ра/ы=15.8, р=0.006%; В: Ра/-1=7.2!р=1.3%

Таким образом, у бересклетов, как и у других растений с сочными масличными плодами, разные части плода резко различались по составу резервных НАГ - в ариллусах, обладающих только материнским генотипом, содержались преимущественно ТАГ, а в семенах, обладающих генами обоих родителей, присутствовали почти исключительно ацЦАГ. Ранее было показано, что семена и гипантии плода облепихи, НАГ которых состояли только из ТАГ, также резко различались между собой по составу ЖК. Так, в гипантиях содержалось высоконасыщенное масло с преобладанием С16-ЖК - 16:0 и Д9-16:1 и/или октаде-ценовых кислот, в то время как в семенах тех же плодов накапливаются ТАГ, богатые С18-полиненасыщенными ЖК. [Пчёлкии и др., 2006].

ЖК-состав НАГ из плодов бересклетов

В НАГ плодов было обнаружено (наряду с минорными ЖК) 14 видов ЖК, среди которых всегда преобладали пальмитиновая, олеиновая, линолевая и а-линоленовая кислоты (табл. 1 и 2). В более или менее заметных количествах (3-12%) могли содержаться 12:0, 14:0, 18:0, 9-16:1, 9,12-16:2 и 11-18:1, а также необычные Д8-16:1- и Д10-18:1-ЖК, структура которых была установлена нами с помощью масс- спектрометрии их ИМОХ-производных (рис. 5, Табл. 3). Д8-16:1- и Д10-18:1-ЖК в липидах растений обнаружены впервые.

Таблица 1. Жирнокислотный состав ТАГ и яг/ДАГ из ариллусов зрелых плодов 14 видов бересклетов

Жирные кислоты, мае. %

Вид НА1 16:0 9-16:1 18:0 9-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18:3 Прочие' ПП

Е. Ьи^еапиз ТАГ2 29.3 3.9 1.4 11.2 3.0 39.7 1.2 10.3 1.109

ацДАГ 20.5 1.5 1.5 10.9 2.2 53.6 2.7 7.1 1.351

Е. выгорает ТАГ 23.0 3.8 1.7 17.8 4.6 41.4 2.3 5.4 1.147

ац ДАГ 21.3 2.6 1.6 10.0 4.0 52.7 2.7 5.1 1.340

ТАГ 30.8 1.8 2.2 15.3 1.7 45.0 1.6 1.6 1.142

Е. ИатШотапиз ац ДАГ 19.9 0.7 1.8 7.4 1.5 64.9 2.4 1.4 1.468

Е. рИеПотапш ТАГ 32.9 1.2 4.7 16.6 1.0 39.5 1.7 2.4 1.037

Е. ьет^ехзеПиз ТАГ 29.4 3.8 1.4 11.4 4.0 46.5 1.1 2.4 1.179

ш/ДАГ 20.7 1.3 1.6 5.7 3.5 63.2 1.8 2.2 1.451

Е. 31еЬо1сИапш ТАГ3 21.7 12.6 1.7 13.2 10.7 34.5 1.0 4.6 1.137

яуДАГ 15.9 7.1 1.2 4.5 8.8 53.5 2.3 6.7 1.425

ТАГ 26.3 0.4 1.8 21.4 1.5 45.2 2.7 0.7 1.219

Е. а/айи а^ДАГ 23.0 0.3 2.4 19.8 1.6 47.0 3.3 2.6 1.261

Е. яасгозапсШ ТАГ 23.5 0.9 1.8 25.3 2.1 43.1 2.8 0.5 1.231

ацД АГ 17.6 0.6 2.3 15.2 1.7 43.8 14.3 4.5 1.495

Е. раисфогш ТАГ 27.9 0.9 4.9 36.8 1.4 25.6 1.0 1.5 0.933

ацДАГ 18.4 0.4 3.4 30.4 0.9 40.0 2.5 4.0 1.202

Е. \errucosus ТАГ4 11.0 2.6 2.6 38.5 3.5 26.0 3.8 12.0 1.095

Е. 1аИ}о1ш$ ТАГ 21.6 1.4 1.9 52.3 1.0 18.1 2.7 1.0 0.994

ш;ДАГ 17.2 0.7 2.9 42.2 0.9 25.6 8.0 2.5 1.197

Е. тасгор1егш ТАГ 41.8 0.4 2.8 18.9 1.7 31.1 2.7 0.6 0.915

ацДАГ 22.5 0.7 3.1 19.2 1.4 32.3 17.3 3.5 1.384

Е. тахто\1С21апи$ ТАГ 39.0 0.8 3.2 27.5 0.7 26.9 1.0 0.9 0.862

Е. засНа/тею^я ТАГ 35.6 0.4 5.5 44.5 1.5 11.4 0.7 0.4 0.713

1 сумма остальных ЖК, каждой из которых содержалось менее 1.0% (10:0, 12:0, 14:0, 15:0, 7-16:1, 11-16:1,7,10-16:2, 9,12-16:2, 17:0, 20:0, 11-20:1, 22:0, 24:0);2 содержали также 8-16:1 (6.7%) и 10-18:1 (2.2%) ЖК;3 содержали 2,3% 8-16:1 ЖК;4 содержали 12:0 (4.8%), 14.0 (3.1%) ЖК.

Таблица 2. Жирнокислотный состав ТАГ и яг/ДАГ из семян зрелых плодов 14 видов бересклетов

Жирные кислоты, мае. %

оид иереиклета г и\ 1 16:0 9-16:1 18:0 9-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18:3 Прочие1 Г1Г1

Е. Ьищеапиэ ТАГ 23.0 1.4 4.1 31.5 1.4 32.6 2.8 3.2 1.097

яцДАГ 15.6 0.2 1.8 38.4 1.2 34.6 7.6 0.6 1.320

Е. еигорает ТАГ 22.4 2.3 4.0 31.9 2.8 25.9 4.4 6.3 0.912

ац ДАГ 18.1 0.2 2.0 43.8 1.1 24.6 9.3 0.9 0.951

Е. Ьат^Нотапиз ТАГ 22.5 0.7 3.2 33.0 1.1 33.4 4.3 1.8 1.153

ац ДАГ 16.3 0.1 2.7 52.5 1.1 19.6 7.0 0.7 1.141

Е. рЬеИотапиз ТАГ 23.6 0.4 4.9 31.9 0.9 32.0 4.9 1.4 1.121

аг/ДАГ 19.1 0.1 2.3 47.4 1.2 21.2 8.1 0.6 1.154

Е. ветгехзегШз ТАГ 22.4 1.5 2.8 29.9 1.9 34.9 4.6 2.0 1.181

ацЛАТ 16.4 0.1 2.2 50.6 1.0 20.5 8.7 0.5 1.189

Е. 31еЬо1сИапи5 ТАГ 20.8 8.0 2.4 23.7 7.2 32.3 2.4 3.2 1.135

ш/ДАГ 15.4 0.1 2.0 54.8 1.2 19.2 6.8 0.5 1.152

Е. а1аШ ТАГ 24.8 0.2 6.3 31.0 1.0 32.9 1.8 2.0 1.035

ачДАГ 20.2 0.1 2.9 25.7 0.9 47.9 1.7 0.6 1.279

Е. яасгозапМт ТАГ 18.6 0.3 4.9 36.8 1.1 35.5 1.8 1.0 1.147

ацДАГ 18.7 0.2 2.3 27.0 1.0 48.8 1.7 0.3 1.309

Е. раиыАогж ТАГ 15.6 0.3 5.3 36.5 0.8 36.9 2.3 2.3 1.186

а^ДАГ 15.5 0.1 3.5 29.4 0.7 48.7 1.4 0.7 1.320

Е. уеггисоэш ТАГ 16.7 0.2 4.8 48.6 0.8 25.1 1.8 2.0 1.057

ацДАГ 17.3 0.1 3.6 44.0 0.7 31.0 2.0 1.3 1.133

Е. \atifolius ТАГ 16.6 0.2 5.8 52.0 1.1 16.3 6.0 2.0 1.044

ац ДАГ 17.7 0.1 2.6 46.1 1.2 25.4 6.0 0.9 1.167

Е. тасгор1егиз ТАГ 22.2 0.5 3.9 42.2 1.4 25.3 2.9 1.6 1.039

от;ДАГ 18.6 0.2 2.5 43.8 1.1 26.1 7.2 0.6 1.191

ТАГ 21.9 0.3 5.3 43.9 1.2 22.9 3.1 1.4 1.008

Е. тахтоук^апиз ог;ДАГ 19.4 0.2 4.3 36.8 1.0 31.2 6.9 0.2 1.199

Е. ¡аскаЧпеит ТАГ 28.0 0.3 4.4 44.1 1.1 14.8 5.3 2.0 0.917

ацДАГ 20.9 0.0 3.2 54.1 1.1 14.1 6.0 0.5 1.014

Сумма ЖК, каждой из которых содержалось < 1.0% (10:0, 12:0, 14:0, 15:0, 7-16:1, 11-16:1, 7,10- и 9,12-16:2, 17:0, 20:0, 11-20:1, 22:0).

II , i i_ J

"X

Рис. 5. Масс-спектр ОМОХ-производного необычной А8-гекса-деценовой кислоты из ТАГ зрелых ариллусов Е. вшЬоШапт

'И 2,08

1V4

II. .а

292

278

I.

1\Г

307

150 175

m/z

Таблица 3. Массовые числа молекулярных и диагностических фрагментарных ионов необычных ЖК

Отношение массы к заряду, а.е.м

ЖК Ионы с Ионы с Д=12 Молекуляр- Положение

Д=54 а.е.м а.е.м ный ион двойной связи

Х-16:1 168/222 182/194 307 Д8

9-16:1 182/236 196/208 307 Д9

9-18:1 182/236 196/208 335 Д9

Хг-18.1 196/250 210/222 335 Д10

11-18:1 210/264 224/236 335 Д11

По-видимому, Д10-18:1 ЖК образуется посредством Сг-удлинения её предшественника- Д8-16:1, за синтез которой может отвечать специфическая десатураза, как это было показано ранее для растений, способных накапливать ЖК с необычным положением двойной связи [Suh, Schütz, Ohlrogge, 1999]. Эти две кислоты обнаруживались только в ТАГ ариллусов бересклетов, относящихся к подроду Euonymus (см. ниже). Каких-либо упоминаний в литературе об этих необычных ЖК в составе липидов растений и животных нам обнаружить не удалось.

Ранее было показано, что в 5«-1,2-положениях о^ДАГ семян Е. verrucosus содержание 16:0, 18:0, 9-18:1, 9,12-18:2 и 9,12,15-18:3 составляло 14, 4, 40, 40 и 2% [Kleiman et al, 1967], а для трёх видов растений Maytenus sp., также принадлежащих к сем. Celastraceae, соответствующие величины составляли 13.0-15.2, 3.0-6.0, 36.8-58.7, 21.0-44.5 и 0.2-0.6% [Spitzer, Aichholz, 1996]. Приведённые данные указывают на определённое сходство между отдельными видами бересклетовых растений по составу главных ЖК в НАГ плодов.

Во всех пробах НАГ (табл. 1 и 2), за исключением НАГ семян Е. hamiltonianus, по величине ИН ТАГ в той или иной степени уступали аг/ДАГ (табл. 2). По-видимому, это различие вызывалось, прежде всего, тем, что молекула ТАГ содержит два положения остатка глицерина (s/j-1 и sn-Ъ), включающие преимущественно более насыщенные высшие ЖК [Пчёлкин и др., 2006], тогда как в ацДАГ имеется только одно такое положение - sn-1 (см. выше). Обнаруженное различие было гораздо сильнее выражено в ариллусах, где средние величины ИН в ТАГ и ai/ДАГ составляли 1.051 и 1.357, чем в семенах (1.074 и 1.180, соотв.), что связано с намного более высоким уровнем линолеата в агуДАГ ариллусов, чем в ацДАГ семян.

Хемотаксономический анализ возможного родства изученных видов бересклетов

Чтобы проверить наше предположение о связи ЖК-состава НАГ зрелых плодов 13 различных видов бересклетов с их систематическим положением внутри рода, мы применили иерархический кластерный анализ. Е. verrucosus был исключён из анализа, как вид, практически не накапливающий жирное масло в ариллусах (0.02-0.1% от сухой массы).

Рис. 6. Дендрограмма объединения видов бересклетов в кластеры по сходству ЖК-составов запасных ТАГ ариллусов зрелых плодов (невзвешенное арифметическое среднее, метрика Че-бышева)

3

2 "-1 >1-

■ Е. bungeanus

■ Е. hamiltonianus

■ Е. semiexsertus

■ Е. phellomanus

• Е. europaeus

■ Е. alatus

■ Е. sacrosanctus

■ Е. sieboldianus

■ Е. pauciflorus

• Е. macropterus

■ Е. maximoviczianus

■ Е. latifolius

■ Е. sachalinensis

30

25

10

0

Расстояние объединения На рис. 6 представлен результат иерархической кластеризации изученных видов рода Еиопутиз на основе данных ЖК-состава ТАГ ариллусов их плодов (см. табл. 1). Можно видеть, что изученные виды группируются в три кластера: кластеры 1 и 2 включают в себя виды, относящиеся, за исключением Е. раис^огш, к секции Ка1опутш одноимённого подрода, а кластер 3 объединил виды, принадлежащие к подроду Еиопутиз, который в этом исследовании был представлен тремя секциями: Еиопутш, Ме1апосагуа и Рвеиск)-ууепотиБ [Леонова, 1974]. Группировка отдельных видов в менее крупные кластеры внутри кластера 3 не отражает их принадлежности к различным секциям подрода Еиопутиз.

Таким образом, ЖК-состав ТАГ ариллусов исследованных видов бересклетов достоверно характеризует только относительно крупные таксономические единицы - подроды.

В то же время сама по себе иерархическая кластеризация не позволяет определить факторы, которые оказывают влияние на формирование того или иного кластера. Поэтому для того чтобы определить, какими различиями в ЖК-составе ТАГ характеризуются подроды Еиопутиз и Каїопутт, которые обусловливают состав кластеров, был применён дополнительный анализ ЖК-состава ТАГ ариллусов изученных видов бересклетов с помощью метода к-средних.

При кластеризации методом к-средних и количестве кластеров к=2 (по числу подро-дов) исследуемые виды группируются практически в полном соответствии с их систематическим положением внутри рода. Из данных, представленных на рис. 7, видно, что значимыми факторами при формировании кластеров являются средние концентрации олеиновой (р=0.01%, Г=32.9) и линолевой кислот (р=0.01%, Р=33.8) в ТАГ ариллусов. Виды из подро-да Еиопутиз, формирующие кластер 3 (рис. 6), достоверно отличаются более высоким содержанием линолевой кислоты по сравнению с олеиновой, а для видов из кластеров 1 и 2, к которым относятся представители подрода Ка1опутиз, наблюдается обратное соотношение между концентрациями этих ЖК в ТАГ.

Виды, относящиеся к кластеру 3, также отличаются несколько повышенным содержанием 9-16:1- и 11-18:1-ЖК, хотя это различие статистически недостоверно; также в них

Рис. 7. Величины к-средних значений содержания /'-тых ЖК для двух кластеров

1-19 - обозначения ЖК: 1 - 10:0, 2 - 12:0, 3 - 14:0, 4 - 16:0, 5-716:1, б - 8-16:1, 7 - 9-16:1, 8 -7,10-16:2, Р-9,12-16:2,10- 18:0, 11 - 9-18:1, 12- 10-18:1,13- 1118:1, 14 - 9,12-18:2, 15 - 9,12,1518:3, 16 - 20:0, 17- 11-20:1, 1811,14-20:2,19- 22:0)

123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Жирные кислоты

присутствуют необычные 8-16:1 и 10-18:1 ЖК. Что же касается насыщенных кислот, 16:0 и 18:0, то значимые различия между видами из разных подродов отсутствуют.

Вместе с тем, на рис. 6 можно видеть, что К pauciflorus, по классификации [Леонова, 1974] относящийся к секции Pseudovyenomus подрода Euonymus, по ЖК-составу запасных ТАГ ариллусов оказывается в одном кластере с представителями подрода Kalonymus, что возможно свидетельствует в пользу необходимости уточнения его систематической принадлежности. К тому же недавно было показано, что анатомическое строение ариллусов К pauciflorus сходно с таковым у представителей подрода Kalonymus и отличается от других представителей подрода Euonymus наличием у зрелых ариллусов между эпидермами нескольких слоев паренхимных клеток, которые не разрушаются в процессе развития плода [Трусов, 2010].

Что же касается ai/ДАГ семян зрелых плодов бересклетов, то кластерный анализ их ЖК-состава не выявил никакой связи с их систематическим положением не только на уровне секции, но и подрода.

Накопление сухой массы и НАГ в развивающихся плодах бересклетов

После изучения особенностей качественного и количественного состава НАГ ариллусов и семян зрелых плодов бересклетов, было выбрано три модельных вида, относящихся к разным подродам и секциям рода Euonymus L. - Е. europaeus, Е. verrucosus и Е. maximowiczianus.

У изученных видов на всех стадиях созревания семена по сухой массе органа в несколько раз превосходили ариллусы, и лишь у Е. europaeus на стадии I наблюдалась обратная картина. У Е. maximowiczianus и Е. verrucosus накопление сухой массы семян и особенно ариллусов происходило значительно медленнее, чем у Е. europaeus. Если у первых двух видов на стадии I (глобулярного зародыша) сухая масса семени составляла лишь 5.5 и 9% массы зрелого семени и 13 и 7.7% массы зрелого ариллуса, соответственно, а на стадии II (зрелого зародыша) накапливалось только 23 и 31.6% массы зрелого семени и 32.7 и 20.5% конечной сухой массы зрелого ариллуса, то у Е. europaeus эта доля, составлявшая 4.2 и 57.3% на стадии I, на стадии II достигала уже 47.6 и 66% сухой массы соответствующей части плода, соотв. В ходе созревания от стадии I до стадии III сухая масса одного семени у Е. maximowiczianus и Е. verrucosus возрастала в 18 и 11 раз, а у К europaeus - в 23.6 раза. Между тем, для ариллусов прирост сухой массы у этих видов не был столь значительным. Относительный уровень массы ариллусов в ходе роста изменялся мало, а у £ verrucosus он был намного ниже, чем у двух других видов.

~16~

Также нами было исследовано накопление НАГ в ходе созревания плодов, которое у бересклетов ранее не изучалось. В семенах всех изученных видов главным классом НАГ на каждой стадии созревания были а г/ДА Г (92-100% от суммы НАГ), которые по абсолютному содержанию на полтора порядка величин превышали ТАГ. На стадии I в семенах обнаруживалось лишь малое количество НАГ (не более 100-200 мкг/плод), которое на дальнейших стадиях созревания непрерывно возрастало. В ходе этого процесса Е. verrucosus всегда значительно превосходил Е. europaeus и Е. maximowiczianus по интенсивности образования каждого из классов НАГ. На стадии III (полной зрелости) эти два вида обычно также были ближе друг к другу по абсолютному содержанию НАГ и заметно уступали Е. verrucosus по величине данного параметра. Так, в зрелых семенах Е. europaeus и Е. maximowiczianus абсолютное содержание НАГ в расчёте на одно семя было лишь в 5.8 и 6.8 раза выше, чем на стадии I, тогда как у Е. verrucosus уровень НАГ к концу созревания возрастал, главным образом за счёт аг/ДАГ, почти в 42 раза. Наблюдавшееся накопление НАГ в ходе созревания плодов обусловливало рост числа олеосом в клетках семян и ариллусов.

В созревающих и зрелых ариллусах Е. verrucosus НАГ - как ТАГ, так и ацДАГ -практически полностью отсутствовали, а динамика накопления ТАГ у двух других видов была сходна с наблюдавшейся в семенах. По содержанию ТАГ в зрелых ариллусах Е. maximowiczianus в 1.6 раза превосходил другой вид - Е. europaeus. В последнем случае оно было во много раз выше, чем содержание ацДАГ. Наконец, совершенно необычной была динамика абсолютного содержания ацДАГ в созревающих ариллусах Е. maximowiczianus: эта величина была максимальной на стадии I, затем резко снижалась, а при наступлении полной зрелости плода и вовсе падала до нуля.

Таким образом, обмен веществ в плодах бересклетов при созревании характеризовался более интенсивным накоплением сухой массы у семян, чем у ариллусов. У семян Е. europaeus он был более интенсивным, чем у семян Е. maximowiczianus и Е. verrucosus; напротив, по скорости образования сухого вещества в ариллусах Е. europaeus значительно уступал двум другим исследованным видам.

В семенах ацДАГ синтезировались во много раз активнее, чем ТАГ, а Е. europaeus и Е. maximowiczianus по интенсивности биосинтеза каждого из классов НАГ заметно уступали Е. verrucosus. В ариллусах, в отличие от семян, образовывались преимущественно ТАГ, а по характеру обмена НАГ в ариллусах имели место резкие межвидовые различия. Так, в ариллусах Е. verrucosus НАГ практически не обнаруживались, а в ариллусах плодов Е.

maximowiczianus уровень а г/ДА Г достигал максимума в начале созревания, а в зрелом плоде снижался до нуля.

Динамика ЖК-состава НАГ созревающих плодов бересклетов

В составе НАГ созревающих плодов бересклетов было обнаружено 29 индивидуальных ЖК, главными из которых (до 29-51% от суммы ЖК) были пальмитиновая, олеиновая, линолевая и а-линоленовая кислоты. В значительно меньших количествах содержались 12:0 (до 4.8%), 14:0 (до 1.1-3.1%), 7-16:1 (до 1.0-3.9%), 8-16:1 (до 1.3-7.6%), 9-16:1 (до 1.2-3.7%), 17:0 (до 1.6-2.1%), 18:0 (до 1.0-5.3%), 10-18:1 (2.8-3.2%), 11-18:1 (до 1.0-4.6%), 20:0 (до 1.8%) и 22:0 (до 1.4%) ЖК. Качественный состав главных ЖК НАГ в ходе созревания плодов почти не изменялся. Динамика их количественного содержания в ТАГ и аг/ДАГ семян и ариллусов приведена в таблицах 4 и 5.

Можно видеть, что в этих классах НАГ на разных стадиях созревания плода доминировали 9,12-18:2 и 9-18:1 ЖК — на долю каждой из них могло приходиться до половины от суммы ЖК, и их содержание отличалось наибольшей изменчивостью в зависимости от вида растения, части плода, стадии созревания и класса НАГ. Так, в семенах в ходе созревания плодов доля 9-18:1 как в ТАГ, так и в агуДАГ, возрастала в 1.5-2.5 раза, а в ариллусах Е. europaeus и Е. verrucosus - в 2.5 и 4 раза, соответственно, в то время как в ТАГ Е. maximowiczianus и ai/ДАГ К europaeus она снижалась в >1.3 раза. Эти изменения концентрации олеата в НАГ сопровождались соответствующим ростом или снижением относительного содержания линолеата.

Пальмитиновая кислота в наиболее высокой концентрации (40-47% от суммы ЖК) содержалась в ТАГ ариллусов К maximowiczianus, а в остальных пробах её уровень обычно не превышал 15-25% и относительно мало возрастал в ходе созревания. Наконец, а-линоленовая кислота была главной ЖК только в ацДАГ наименее зрелых семян Е. europaeus. Её концентрация в НАГ по мере их накопления в плоде обычно падала. Наиболее резкое снижение (с 26-28 до 3-8%) наблюдалось в отдельных пробах ТАГ и ацЦАГ из семян и ариллусов К europaeus и Е. maximowiczianus (с 20 до 4-7%). В других пробах НАГ из ариллусов этих видов, а также из семян и ариллусов Е. verrucosus это снижение было менее значительным (с 3-10 до 2—4%).

Таблица 4. ЖК-состав ТАГ и ауДАГ ариллусов созревающих плодов трёх видов бересклетов

АРИЛЛУСЫ

Жирные кислоты, мас.%

Вид Стадия НАГ 16:0 7-16:1 8-16:1 9-16:1 18:0 9-18:1 10-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18:3 ИН

1 ТАГ 23.9 7.6 2.4 2.3 7.2 3.2 3.2 42.0 4.7 1.226

ъ ш/ДАГ 20.5 1.3 1.1 2.1 13.4 1.8 30.2 28.3 1.629

а §- ТАГ 23.3 6.9 2.7 2.1 8.1 2.8 3.7 43.7 4.1 1.248

§ ац ДАГ 26.7 3.2 1.4 2.7 12.6 2.6 39.6 7.5 1.214

кі ТАГ 23.0 3.9 Следы 3.8 1.7 17.8 Следы 4.6 41.4 2.3 1.147

ацДАГ 21.3 2.9 2.6 1.6 10.0 4.0 52.7 2.7 1.340

3 ТАГ Т На данной стадии отсутствуют

с .о о^ДАГ 29.2 0.2 0.6 1.0 36.70 1.3 25.8 3.1 1.007

,у > о ТАГ 47.1 0.6 0.7 1.2 35.6 1.1 13.2 Следы 0.643

.5 * очДАГ 23.3 0.8 1.2 1.2 41.6 1.8 27.2 2.2 1.063

а е ТАГ 39.0 0.3 0.8 3.2 27.5 0.7 26.9 1.0 0.862

ачДАГ На данной стадии отсутствуют

ТАГ 18.8 0.6 1.1 1.1 9.9 3.3 50.6 10.4 1.473 ■

§ «О акДАГ Отсутствуют у этого вида

О 3 ТАГ 21.0 1.0 0.3 3.4 24.0 4.1 29.6 7.2 1.125

Н > ауДАГ Отсутствуют у этого вида

ТАГ 11.0 1.4 2.6 2.6 38.5 3.5 26.0 3.8 1.095

ацДАГ Отсутствуют у этого вида

Таблица 5. ЖК-Состав ТАГ и ацДАГ созревающих семян трёх видов бересклетов

СЕМЕНА

Вид Стадия НАГ Жирные кислоты, мас.% ИН

16:0 7-16:1 8-16:1 9-16:1 18:0 9-18:1 10-18:1 11-18:1 9,12-18:2 9,12,15-18:3

I ТАГ 18.9 0.2 1.5 2.2 1.9 13.1 2.5 30.8 26.5 1.610

<и*ДАГ 22.6 0.1 0.2 2.9 23.7 1.3 22.4 25.5 1.471

с» <3 II ТАГ 19.9 0.1 1.7 1.4 2.2 23.3 2.1 32.3 15.4 1.393

1 «у акДАГ 19.9 0.1 0.2 2.8 33.4 1.2 23.5 17.6 1.347

III ТАГ 22.4 0.3 0.7 2.3 4.0 31.9 2.8 25.9 4.4 0.912

ац ДАГ 18.1 0.1 0.2 2.0 43.8 1.1 24.6 9.3 0.951

§ I ТАГ 19.6 0.2 0.3 3.3 19.3 Следы 35.2 19.9 1.497

С .д ш/ДАГ 14.4 0.1 0.2 2.9 16.0 Следы 45.2 20.7 1.690

.у 11 ТАГ 14.6 0.3 0.2 3.1 40.6 1.1 29.9 9.3 1.299

1 § очДАГ 14.6 0.1 0.1 2.6 25.5 0.1 40.1 16.4 1.555

III ТАГ 21.9 0.2 0.3 5.3 43.9 1.2 22.9 3.1 1.008

Ь) оуДАГ 19.4 0.1 0.2 4.3 36.8 1.0 30.5 6.9 1.199

I ТАГ На данной стадии отсутствуют

§ ачДЛ Г 17.0 0.1 0.3 2.3 28.8 Следы 43.9 6.8 1.369

II ТАГ 18.1 0.7 2.8 32.1 2.6 38.2 3.3 1.219

ъ» > ац ДАГ 18.6 2.8 36.7 1.0 36.8 3.1 1.208

И III ТАГ 16.7 0.1 0.2 4.8 48.5 0.8 25.1 1.8 1.054

йп/ДАГ 17.3 0.1 0.1 3.6 44.0 0.7 31.0 2.0 1.133

Присутствие низших алкиловых эфиров ЖК в плодах растений рода Euonymus

Исследуя состав нейтральных липидов в зрелых масличных плодах бересклетов, мы нашли в них неидентифицированный компонент ("компонент X"). В условиях ТСХ на си-ликагеле в системе н-гексан : диэтиловый эфир зона этого компонента совпадала по величине подвижности с зоной стандартных метиловых эфиров ЖК (МЭЖК). Методом капиллярной ГЖХ-МС мы установили, что эта фракция наряду с МЭЖК содержала также эфиры этилового и других низших спиртов и, следовательно, компонент X представлял собой смесь низших алкиловых эфиров ЖК (НАЭЖК). Из 14 исследованных нами видов бересклетов НАЭЖК в плодах содержали только 10 видов, причём у 4 видов бересклетов, входящих в секции Euonymus и Melanocarya подрода Euonymus, НАЭЖК присутствовали не только в ариллусах, но и в семенах.

В плодах изученных бересклетов были идентифицированы 32 индивидуальных вида НАЭЖК: 16 видов МЭЖК, девять видов этиловых (ЭЭЖК), пять видов изо-пропиловых (ИПЭЖК), а также два вида н-бутиловых эфиров ЖК. В ЖК-составе НАЭЖК нашли (с учётом минорных ЖК) 16 индивидуальных видов С14-С24-ЖК, включавших насыщенные (8 видов), -моно- (6 видов), -ди- (1 вид) и -триненасыщенные ЖК (1 вид). В НАЭЖК ариллусов всегда присутствовали МЭЖК, которые обычно превосходили по концентрации другие фракции. У Е. maximowiczianus и у Е. latifolius этиловые эфиры ЖК (ЭЭЖК) были в значительной степени сходны с МЭЖК по ЖК-составу. Существование такого сходства позволяет предположить, что в ариллусах этих видов биосинтез МЭЖК и ЭЭЖК осуществлялся за счёт одного и того же, свойственного данному виду растений, пула ЖК.

ИПЭЖК содержались в ариллусах девяти видов бересклетов и обычно несколько уступали МЭЖК по концентрации в сумме НАЭЖК. Исключением здесь был только вид Е. alatus, в НАЭЖК которого ИПЭЖК составляли 86.4% и состояли почти полностью из изопропилмиристата. Очень близкая по составу смесь ИПЭЖК присутствовала и в семенах этого вида, где соответствующая величина достигала 94.6%. В ИПЭЖК ариллусов у всех видов, кроме Е. maximowiczianus и Е. europaeus, содержалась только 14:0 ЖК, которая, в свою очередь, почти никогда не обнаруживалась в других фракциях НАЭЖК. Наконец, ИПЭЖК семян Е. phellomanus и Е. alatus представляли собой чистый изопропилмиристат. Весьма ограниченным набором ЖК отличались также н-бутиловые эфиры, содержавшие или только линолевую кислоту (в семенах Е. sacrosanctus) или её смесь (7:3) с олеиновой (в ариллусах К europaeus).

Найденные особенности ЖК-состава ИПЭЖК и н-бутиловых эфиров ЖК позволяют предположить, что эти эфиры по механизму биосинтеза значительно отличаются от МЭЖК и ЭЭЖК. Действительно, у МЭЖК и ЭЭЖК набор ЖК был много шире, а жёсткая избирательность по отношению к тому или иному виду низшего спирта или виду ЖК при этерификации отмечалась лишь у Е. bungeanus.

Результаты настоящей работы показывают, что у растений рода Еиопутш НАЭЖК образовывались преимущественно в ариллусах, которые к тому же значительно превосходили семена по числу видов ЖК в НАЭЖК. Следовательно, ариллусы намного более активны в биосинтезе НАЭЖК, чем семена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами установлено, что изученные представители рода Еиопутм (за исключением Е. хеггизсовиз), как и другие растения с сочными масличными плодами, накапливают жирные масла, как в семенах, так и во внесеменной части плода - ариллусах. Запасаемые в семенах и ариллусах масла, состоят из нейтральных ацилглицеринов - ТАГ и ДА Г, однако у разных видов бересклетов эти масла различаются не только ЖК-составом, но и соотношением между классами составляющих их запасных НАГ. В ариллусах всегда доминируют ТАГ, а в семенах - ацДАГ, причём несмотря на пониженное по сравнению с семенами содержание сухой массы, ариллусы характеризовались ббльшей, чем семена масличностью как в абсолютном (мг/г сухой массы), так и в относительном выражении (% от сухой массы). Доля ТАГ в семенах составила 4-5%, а в ариллусах --98% от суммы НАГ.

Поскольку до начала нашей работы было известно, что остаток ацетата в ацДАГ может быть связан с углеродным атомом либо в 5И-1-, либо в «г-З-положении глицеринового остатка [ИиггеП е/ о/, 2010], было необходимо выяснить какие из этих положений он может ацилировать. Методом двумерной ЯМР-спектроскопии нами впервые было доказано, что в семенах бересклетов остаток уксусной кислоты в молекуле а г/ДАГ этерифицирует исключительно ял-З-положение. Отсюда следует, что в семенах бересклетов наряду с обычной ДАГАТ, катализирующей синтез ТАГ из обычных ацил-КоА, содержится и ДАГАТ, строго специфичная как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и к $л-3-положению глицеринового остатка, результатом действия которой и является образование ацДАГ. В ходе нашего исследования было также показано, что при ЯМР-спектроскопии остаток уксусной кислоты при 5и-3-положении влияет на химические сдвиги протонов при 5/7-1- И 5П-3-

углеродных атомах глицеринового остатка ац ДАГ, что позволило исправить имевшееся

~ 22 ~

ранее в литературе некорректное представление о соотнесении сигналов от этих протонов с их положением в молекуле ог/ДАГ.

У 14 видов, относящихся к двум подродам и четырём секциям рода Euonymus, был охарактеризован качественный и количественный состав НАГ ариллусов и семян как зрелых, так и созревающих плодов бересклетов, а также изучен их ЖК-состав; для 11 видов состав НАГ определён впервые. В НАГ плодов было обнаружено (наряду с минорными ЖК) 14 видов ЖК, главными из которых всегда были линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты. У всех изученных видов бересклетов ТАГ ариллусов, по сравнению с ацДАГ семян, всегда отличались большим разнообразием состава ЖК. Для ТАГ и ацДАГ ариллусов была характерна достоверно более высокая концентрация пальмитиновой и олеиновой кислот, в то время как в ЖК-составе НАГ семян преобладала линолевая кислота. Помимо обычных ЖК в ТАГ ариллусов некоторых видов бересклетов были обнаружены в значительных количествах (до 7.8%) необычные ЖК, идентифицированные как Д8-гексаде-ценовая и Д10-октадеценовая кислоты; эти ЖК в растениях обнаружены впервые. Кроме того, с помощью метода кластерного UPGMA-анализа, а также с помощью кластеризации методом k-средних нами было показано, что ЖК-состав ТАГ ариллусов является хемотак-сономическим признаком, характеризующим тот или вид бересклета на уровне подрода.

У трёх модельных видов, относящихся к секциям Euonymus (Е. europaeus) и Pseudovyenomus (Е. verrucosus) подрода Euonymus, и к одноимённой секции подрода Kalonymus (Е. maximoviczianus) было изучено формирование морфолого-анатомической структуры семян и ариллусов плода в ходе созревания. Изученные виды бересклетов значительно различаются по характеру роста и накопления НАГ в семенах и ариллусах. В ходе созревания плодов как в клетках эндосперма и семядолей, так и в клетках ариллусов у всех изученных бересклетов формируются мелкие олеосомы одинакового размера, а у Е. europaeus и Е. maximowiczianus, наряду с ними - также крупные олеосомы разной величины. Количество жировых включений в клетках ариллусов у всех изученных видов в ходе созревания увеличивается. В ходе созревания в семенах агуДАГ синтезируются во много раз активнее, чем ТАГ, а в ариллусах, наоборот, образуются преимущественно ТАГ. При этом если при созревании плодов качественный состав главных ЖК в обоих классах НАГ почти не изменялся, то значения индекса ненасыщенности ЖК и в ТАГ, и в а ¡у ДА Г, всегда снижались вследствие резкого падения уровня а-линолената, уменьшения концентрации линолеата и соответствующего роста содержания олеата.

Помимо НАГ, в составе жирных масел ариллусов большинства исследованных бересклетов в небольшом количестве (0.03-0.05% от сырой массы) содержатся необычные компоненты - низшие алкиловые эфиры ЖК, представляющие собой смеси метиловых, этиловых, ¡¿зо-пропиловых и н-бутиловых эфиров С14-С24-ЖК. Семена некоторых видов бересклетов также содержат НАЭЖК. Как и в ТАГ, в МЭЖК и ЭЭЖК обеих частей плода преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты. Метиловые и этиловые эфиры ЖК могут образовываться за счёт того же пула ЖК, что и НАГ, в то время как изо-пропиловые и н-бутиловые эфиры ЖК по-видимому синтезируются за счёт иного, чем НАГ пула ЖК.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные представители рода Еиопутю (за исключением Е. уеггихсозш) накапливают жирные масла, как в семенах, так и во внесеменной части плода - ариллусах. Запасаемые в семенах и ариллусах масла, различаются не только ЖК-составом, но и соотношением между классами запасных НАГ: ТАГ и йг/ДАГ. В ариллусах всегда доминируют ТАГ, а в семенах - ацДАГ, причём ариллусы по абсолютному и относительному содержанию НАГ превосходят семена.

2. Методом двумерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения впервые достоверно установлено, что в а г/ДАГ остаток уксусной кислоты ацилирует только хл-З-положение остатка глицерина. Это указывает на присутствие в семенах бересклетов наряду с обычной диацилглицерин-3-ацилтрансферазой (ДАГАТ), специфичной к обычным ацил-КоА и катализирующей синтез ТАГ, другой ДАГАТ, строго специфичной как к ацетил-КоА в качестве субстрата, так и ют-З-положению глицеринового остатка.

3. Изученные виды бересклетов значительно различаются по характеру роста и накопления НАГ в семенах и ариллусах. В ходе созревания плодов как в клетках эндосперма и семядолей, так и в клетках ариллусов формируются мелкие олеосомы одинакового размера, а у К выгораем и Е. тахтоу/кхгапиз, наряду с ними — также крупные олеосомы разной величины; в процессе созревания их количество клетках возрастает.

4. В ходе созревания в семенах ац ДАГ синтезируются во много раз активнее, чем ТАГ, а в ариллусах, наоборот, образуются преимущественно ТАГ. При этом если при созревании плодов качественный состав главных ЖК в обоих классах НАГ почти не изменялся, то значения индекса ненасыщенности ЖК и в ТАГ, и в аг^ДАГ, всегда снижались вследствие резкого падения уровня а-линолената, уменьшения концентрации линолеата и соответствующего роста содержания олеата.

~ 24 ~

У всех изученных видов бересклетов ТАГ ариллусов, по сравнению с ягуДАГ семян, всегда отличались большим разнообразием состава ЖК. Для ТАГ, и ai/ДАГ ариллусов было характерно достоверно более высокое относительное содержание пальмитиновой и олеиновой кислот, в то время как в ЖК-составе НАГ семян преобладала линолевая кислота. Помимо обычных ЖК в ТАГ ариллусов некоторых видов бересклетов были обнаружены необычные ЖК, идентифицированные как Д8-гексадеценовая и Д10-октадеценовая кислоты; эти ЖК в растениях обнаружены впервые. Установлено, что особенности ЖК-состава ТАГ ариллусов являются хемотаксономи-ческим признаком, характеризующим тот или иной вид бересклетов на уровне подро-да. В частности, для видов, относящихся к подроду Euonymus, в ТАГ ариллусов характерен более высокий уровень линолевой кислоты по сравнению с олеиновой; для видов из подрода Kalonymus в ТАГ наблюдается обратное соотношение между этими ЖК. Обнаруженная особенность ЖК-состава ТАГ ариллусов видов, относящихся к разным подродам, наблюдается даже на самых ранних этапах развития плодов. Помимо НАГ, в составе жирных масел ариллусов большинства исследованных бересклетов в небольшом количестве (0.03-0.05% от сырой массы) содержатся необычные компоненты - низшие алкиловые эфиры ЖК, представляющие собой смеси метиловых, ЭТИЛОВЫХ, МЗО-ПрОПИЛОВЫХ И н-бутиловых эфиров С14-С24-ЖК. Семена некоторых видов бересклетов также содержат НАЭЖК. Как и в ТАГ, в МЭЖК и ЭЭЖК обеих частей плода преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты. Метиловые и этиловые эфиры ЖК могут образовываться за счёт того же пула ЖК, что и НАГ, в то время как ызо-пропиловые и н-бутиловые эфиры ЖК по-видимому синтезируются за счёт иного, чем НАГ пула ЖК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Сидоров P.A.. Трусов H.A., Цыдендамбаев В.Д (2011). Анатомическое строение семян и присемянников бересклета Максимовича (Euonymus maximowiczianus) и состав их жирных масел // В сб. Древесные растения: фундаментальные и прикладные исследования, М.: ООО «Астра-Полиграфия», 2011, Вып. 1, с. 108-114.

Сидоров P.A.. Трусов H.A., Цыдендамбаев В.Д (2011). Бересклеты как перспективный источник сырья для биодизеля. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их

использования: Материалы IX международного симпозиума. Т. III. - M.: РУДН, с. 206209.

3. Сидоров P.A.. Жуков A.B., Пчёлкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. (2011) Позиционный состав триацилглицеринов из масла присемянников плодов двух видов бересклетов. // Тез. докладов VII съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород, 4.2, с. 634.

4. Сидоров P.A.. Трусов H.A., Цыдендамбаев В.Д. (2011) Липидный состав масел присемянников и семян бересклета Максимовича (Euonymus maximowiczianus) II Тез. докладов VII съезда Общества физиологов растений России. Нижний Новгород, ч.2, с. 635.

5. Сидоров P.A., Жуков A.B., Верещагин А.Г., Цыдендамбаев В.Д (2012). Низшие алки-ловые эфиры жирных кислот из плодов бересклетов. Физиология растений, 59: 362368.

6. Сидоров P.A.. Трусов H.A. (2012). Строение присемянников и семян Euonymus euro-paeus L. (Celastraceae) и состав их жирных масел в ходе созревания плодов. XIX международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов — 2012», тезисы докладов. М: МАКС-пресс, с. 239-240.

7. Sidorov R.A., Zhukov A.V., Pchelkin V.P., Vereshchagin A.G., Tsydendambaev V.D. (2013). Occurrence of fatty acid short-chain-alkyl esters in fruits of Celastraceae plants. Chemistry and Biodiversity, doi: 10.1002/cbdv.201200329

8. Сидоров P.A.. Фоменков A.A. (2013). Особенности биосинтеза запасных триацилглицеринов и низших алкиловых эфиров жирных кислот клетками суспензионной культуры бересклета Максимовича. XX международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов — 2013», тезисы докладов. М: МАКС-пресс, с. 308-309.

9. Сидоров P.A., Фоменков A.A., Носов A.B. (2013) Суспензионная культура клеток Euonymus maximowiczianus — новый объект в исследованиях биосинтеза низших алкиловых эфиров жирных кислот. Международная научно-практическая конференция «Клеточная биология и биотехнология растений», тезисы докладов. Минск: Издательский центр БГУ, с. 61.

Подписано в печать: 17.05.2013 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 870 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясницкие Ворота д. 1, стр.3 (495) 971-22-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сидоров, Роман Александрович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Ордена Трудового Красного Знамени Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

На правах рукописи

04201359244

СИДОРОВ Роман Александрович

Состав жирных масел плодов бересклетов (03.01.05 - физиология и биохимия растений)

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыдендамбаев Владимир Дылыкович

Москва-2013

Оглавление

Список сокращений......................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................6

ГЛАВА I. Обзор литературы........................................................................................................9

1.1. Жирные кислоты высших растений.................................................................11

1.2. Биосинтез жирных кислот у высших растений..............................................12

1.2.1. Биосинтез необычных мононенасыщенных ЖК.....................................13

1.2.2. Биосинтез окси-, эпокси- и ацетиленовых ЖК у высших растений......14

1.3. Механизмы биосинтеза ТАГ у высших растений..........................................15

1.3.1. Ацил-КоА-зависимый путь биосинтеза ТАГ в растениях......................16

1.3.2. Независимый от ацил-КоА биосинтез ТАГ.............................................20

1.4. Регуляция биосинтеза ТАГ и накопления масла в растениях.......................22

1.4.1. Накопление необычных ЖК в составе ТАГ.............................................23

1.5. «Жировые включения» высших растений......................................................25

1.5.1. Олеозины.....................................................................................................26

1.5.2. Калеозины....................................................................................................27

1.5.3. Стеролезины................................................................................................29

1.5.4. Другие белки олеосом растений................................................................30

1.5.5. Особенности олеосом плодов растений с сочными масличными плодами ......................................................................................................................31

1.5.6. Биогенез олеосом у растений....................................................................31

1.6. Физиологический контроль накопления ТАГ при созревании семян..........32

1.6.1. Энергетика биосинтеза ЖК и ТАГ............................................................32

1.6.2. Кислород как фактор, лимитирующий накопление масел в семенах.... 33

1.6.3. Влияние света и фотосинтеза в тканях зародыша на метаболизм запасных веществ............................................................................................................34

1.6.4. Влияние температурных условий на биосинтез масел в семенах..........36

1.7. Необычные оптически активные 5и-1,2-диацил-3-ацетил глицерины растений .............................................................................................................................37

ГЛАВА 2. Материалы и методы................................................................................................41

2.1. Растительный материал..................................................................................................41

2.2. Световая микроскопия срезов плодов развивающихся плодов бересклетов............41

2.3. Экстракция липидов из ариллусов и семян..................................................................42

2.4. Аналитическая тонкослойная хроматография экстрактов ариллусов и семян.........42

2.5. Препаративная ТСХ экстрактов семян и ариллусов....................................................43

3.5.3 Присутствие НАЭЖК в растениях и грибах........................................................93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................................95

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................97

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................99

Список сокращений

БМОХ - 4'4'-диметил-2-оксизолиновые

производные ЖК ЯШ; - относительное время удерживания АКК - ацетил-КоА карбоксилаза АМП - 2-амино-2-метил-пропанол АПБ - ацилпереносящий белок АСФТ - аминоспиртовая

фосфотрансфераза АТЛФК - ацилтрансфераза

лизофосфатидной кислоты БЭЖК - н-бутиловые эфиры ЖК ГЗФ - ягс-глицерин-З-фосфат ГЗФ-ДГ - 5«-глицерин-3-фосфат

дегидрогеназа ГЗФ-АТ - ¿?г-глицерин-3-фосфат

ацилтрансфераза ДАГ - 5«-1,2-диацилглицерин ацДАГ - яи-1,2-диацил-3-ацетил-глицерин ДАГАТ - диацилглицерин

ацилтрансфераза ЖК - жирные кислоты ИН - индекс ненасыщенности КАС - кетоацилсинтаза ЛФК - лизофосфатидная кислота МАГ - моноацилглицерин МЭЖК - метиловые эфиры ЖК НАГ - нейтральные ацилглицерины НАЭЖК - низшие алкиловые эфиры ЖК ПНЖК - полиненасыщенные ЖК ИПЭЖК - шо-пропиловые эфиры ЖК РМО - растения с масличным

околоплодником СМП - сочные масличные плоды ТАГ - триацилглицерины ТСХ - тонкослойная хроматография ТФ - транскрипционный фактор ТФУ - трифторуксусный ангидрид

ФК - фосфатидная кислота ФФК - фосфатаза фосфатидной кислоты ФЛ-ДАГАТ - фосфолипид : диацилглицерин ацилтрансфераза ФХ - фосфатидилхолин ФЭ - фосфатидилэтаноламин ХФТ - холин фосфотрансфераза ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЭР - эндоплазматический ретикулум ЭДЦ - эквивалентная длина цепи ЯМР - спектроскопия ядерного

магнитного резонанса Обозначения жирных кислот: 10:0 - каприновая 12:0 - лауриновая 14:0 - миристиновая 15:0 - пентадекановая 16:0 - пальмитиновая Д7-16:1 - 7-гексадеценовая Д8-16:1 - 8-гексадеценовая Д9-16:1 - пальмитолеиновая Д 11-16:1 - пальмитовакценовая Д7,10-16:2 - 7,10-гексадекадиеновая Д9,12-16:2 - пальмитолинолевая 17:0 - маргариновая 18:0 - стеариновая Д9-18:1 - олеиновая Д10-18:1 - 10-октадеценовая Д11-18:1 - г/ис-вакценовая Д9,12-18:2 -линолевая Д9,12,15-18:3 - а-линоленовая 20:0 - арахиновая 11-20:1 - гадолеиновая 21:0- генейкозановая 22:0 - бегеновая 23:0 - трикозановая 24:0 - лигноцериновая

ВВЕДЕНИЕ

Род Бересклет (Euonymus L.) составляют кустарниковые или древесные растения. Этот род, наиболее многочисленный в сем. Celastraceae, распространен главным образом в Северном полушарии Земли, в том числе в нашей стране (Леонова, 1974). По разным данным, он включает 129 (Ма, 2001), 176 (Blakelock, 1951) или даже 220 видов (Zhu, 2012), которые, в соответствии с наиболее современной классификацией {Blakelock, 1951, Ма, 2001), подразделяются на два подрода - Euonymus и Kalonymus - и ряд секций. Наибольшее число видов Euonymus встречается в Азии (115 видов, ~ 88,5%), а в Европе и Центральной Америке произрастают по четыре вида (Ма, 2001); свыше 40 видов бересклетов выращивают в Европе и Северной Америке в качестве декоративных растений и живых изгородей (Simmons et al., 2012).

Фитохимические исследования растений рода Euonymus проводились до сих пор главным образом для обнаружения биологически активных веществ. Многие его виды используются в китайской народной медицине, поскольку они содержат вещества, обладающие противоопухолевой, противомикробной, антидиабетической и инсектицидной активностью (Zhu, 2012). К настоящему времени из этих видов было выделено и идентифицировано свыше 200 различных соединений - 43 тритерпеноида, 82 сесквитерпена, 22 флавоноида, 11 алифатических кислот, 40 алкалоидов, шесть стероидов, три карденолида, пять лигнаноидов и 34 других соединения (Zhu, 2012).

Кроме того, в плодах этих растений уже давно было найдено непищевое жирное масло (Blakelock, 1951). Было показано, что оно накапливается не только в семенах, но и в ариллусах плодов. Капли масла в клетках эпидермы ариллусов Е. europaeus обнаружил ещё Corner (1976), а о содержании таких капель в клетках паренхимы ариллусов отдельных видов бересклетов ранее сообщали Меликян и Савинов (Меликян, Савинов, 2000). Таким образом, из имеющихся данных можно было заключить, что виды рода Euonymus принадлежат к группе растений с сочными масличными плодами (Трусов, Созонова, 2012), накапливающих масло не только в высыхающих при созревании семенах, но и в водонасыщенных внесеменных частях плода (гипантиях, мезокарпах, присемянниках и др.). При этом оказалось, что данные органы плода растений этой группы резко различаются между собой по составу жирного масла.

В семенах исследованных ранее видов бересклетов резервные НАГ масла на 8098% состояли из ацДАТ и лишь на 2-15% - из 1,2,3-триацил-£и-глицеринов (ТАГ) обычного состава, свойственных почти всем органам запаса растений, в том числе - и масличным плодам. В то же время, в НАГ ариллусов из Е. alatus (Durrett et al., 2010)

обладают пониженной на 30% вязкостью (Ииггеи е1 а1, 2010) и калорийностью (5 ккал/г, в отличие от ТАГ, калорийность которых составляет 9 ккал/г) (Богетеп е/ а1, 2008). Необычные оптически активные 3-ацетил-1,2-диацил-л'«-глицерины (ацДАГ) из семян некоторых растений являются природным аналогом препарата БАЬАТММ®, однако в настоящее время информация о ЖК-составе растительных ацДАГ и об их количественном содержании в разных частях плода практически отсутствует.

В представленной работе изложены результаты определения абсолютного содержания, качественного и количественного состава этих классов НАГ и их ЖК-состава, а также уровня сухой массы в семенах и ариллусах зрелых плодов 14 видов бересклетов, принадлежащих к обоим подродам рода Еиопутт. Помимо этого, нами было изучено формирование морфолого-анатомической структуры семян и ариллусов плодов бересклетов в ходе их созревания, а также особенности накопления в них обоих классов НАГ. Наконец, приводятся доказательства того, что в семенах бересклетов остаток уксусной кислоты в молекуле ацДАГ этерифицирует исключительно 5я-3-положение.

дополнительными десатуразами, которые хоть и близки по структуре к Д9-десатуразе, но вводят этиленовую связь в другое положение ацила и могут обладать иной субстратной специфичностью (Voelker, Kinney А, 2001). Так, растения семейства Зонтичных (Umbelliferae), например, морковь и кориандр, содержат в семенах масла, богатые петрозелиновой кислотой (Д6-18:1). Эта необычная ЖК образуется в результате действия пластидной Д4-десатуразы, вводящей двойную связь между 4 и 5 углеродными атомами ацила пальмитоил-АПБ, превращая его в Д4-гексадеценоил-АПБ, который затем элонгируется до петрозелиновой кислоты (Cahoon, Ohlrogge, 1994). Другими любопытными примерами «необычной» десатурации могут служить масло пенника лугового {Limnanthes alba), в составе которого до 65% приходится на Д5-20:1 ЖК {Metzger, Bornscheuer, 2006), ряд Д5-ЖК в липидах хвои сосны {Wolff et al„ 2001).

1.2.2. Биосинтез окси-, эпокси- и ацетиленовых ЖК у высших растений

ЖК с дополнительными функциональными группами в ацильной цепи представляют собой ценное сырьё для промышленности и, благодаря их особым физическим и химическим свойствам, могут быть использованы для производства разнообразных биопродуктов {Dyer et al., 2008).

Биосинтез ЖК, содержащих гидроксильные, эпокси- и ацетиленовые функциональные группы осуществляется благодаря действию семейства соответствующих ферментов. Структурно эти ферменты подобны экстрапластидным мембранно-связанным Д12-десатуразам (FAD2). Замена всего четырёх аминокислот достаточна для превращения 18:1-десатуразы в 18:1-гидроксилазу {Li, Yu, Hildebrand, 2010). Предполагается, что синтез этих ЖК, содержащих функциональные группы, происходит в ЭР, а субстратом для ферментов являются ЖК, этерифицирующие главный липид большинства клеточных мембран - фосфатидилхолин (ФХ) {Voelker, Kinney, 2001).

К числу наиболее широко известных растений, способных синтезировать гидрокси-лированные ЖК, относятся клещевина, масло которой содержит свыше 90% рицинолевой (12-окси-олеиновой) кислоты {Somerville et ah, 2000), лесной орех {Lesquerella densipila), масло семян которого богато лесквероловой (14-окси-эйкоза-г/ис-11-еновой) кислотой и масла представителей рода Strophantus, содержащие изорици-нолевую (9-окси-октадека-t/wc-12-еновую) кислоту, а также Salvia nilotica и Thymus vulgaris, накапливающие масла, включающие, соответственно 2-окси-олеиновую и 2-окси-линоленовую кислоты {Christie, 2012). Некоторые растения запасают в составе ТАГ эпоксидированные ЖК или ЖК с разветвлённой цепью. Это, например, Vernonia galamensis, Euphorbia lagascae и Stokesia

61. Cagliari A., Pinheiro-Margis M., Loss G., Mastroberti A, de Araujo Mariath J, Margis R. (2010) Identification and expression analysis of castor bean (Ricinus communis) genes encoding enzymes from the triacylglycerol biosynthesis pathway. Plant Science, 179, 499509.

62. Cahoon E., Ohlrogge J. (1994) Metabolic Evidence for the Involvement of a A4-Palmitoyl-Acyl Carrier Protein Desaturase in Petroselinic Acid Synthesis in Coriander Endosperm and Transgenic Tobacco Cells. Plant Physiol., 104, 827-837.

63. Cahoon E., Ohlrogge, J. (1994) Apparent role of phosphatidylcholine in the metabolism of petroselinic acid in developing Umbelliferae endosperm. Plant Physiol., 104, 845-855.

64. Cahoon E.B., Shockey J.M., Dietrich C.R., Gidda S.K., Mullen R.T., Dyer J.M. (2007) Engineering oilseeds for sustainable production of industrial and nutritional feedstocks: solving bottlenecks in fatty acid flux. Curr. Opin. Plant Biol., 10, 236-244.

65. Cakir A. (2004) Essential oil and fatty acid composition of the fruits of Hippophae rhamnoides L. (Sea Buckthorn) and Myrtus communis L. from Turkey. Biochemical Systematics and Ecology, 32, 809-816.

66. Cartea M.E., Migdal M., Galle A.M., Pelletier G., Guerche P. (1998) Comparison of sense and antisense methodologies for modifying the fatty acid composition of Arabidopsis thaliana oilseed. Plant Sci., 136, 181-194.

67. Cases S., Smith SJ., Zheng Y.W., Myers H.M., Lear S.R., Sande E., Novak S., Collins C., Welch C.B., Lusis A. J., Erickson S.K., Farese R.V. Jr.(1998) Identification of a gene encoding an acyl CoA : diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 13018-13023.

68. Cases S., Stone S.J., Zhou P., Yen E., Tow B., Lardizabal K.D., Voelker T., Farese R.V. Jr. (2001) Cloning of DGAT2, a second mammalian diacylglycerol acyltransferase, and related family members. J. Biol. Chem., 276, 38870-38876.

69. Cernac A., Benning C. (2004) WRINKLED 1 encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J., 40, 575585.

70. Chen J.C., Tsai C.C., Tzen J.T. (1999). Cloning and secondary structure analysis of caleosin, a unique calcium-binding protein in oil bodies of plant seeds. Plant Cell Physiol., 40, 1079 -1086.

71. Cheng K. (2007) Fatty Acids Analysis in Decaisnea insignis and Akebia trifoliate Seed Oil by GC-MS. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 5, 183-186.

72. Christie W. (1969) The glyceride structure of Sapium sebiferum seed oil. Biochim. Biophys. Acta, 187, 1-5.