Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический анализ основных компонентов семян зиры (Вunium persicum (Вoiss.) B.Fedtsch.) в зависимости от зоны произрастания.

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимический анализ основных компонентов семян зиры (Вunium persicum (Вoiss.) B.Fedtsch.) в зависимости от зоны произрастания."

Па правах рукописи

УСМОНОВА ШОИСТАХОН ХАЙДАРКУЛИЕВПА

БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ СЕМЯН ЧШ'Ы (вимим РЕКЯГСиМ (ВОЮЪ.) ll.FF.mSCH.) И ЗАВИСИМОСТИ о г ЗОНЫ ПРОИЗРАСТАНИЯ

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 7 июн жг

Душанбе-2012

005045593

005045593

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Таджикского технического университета им. акад. М. С. Осими.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Халиков Ширинбек Халнковнч

кандидат химических наук Пброгимов Дилшод Эмомович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

член-корр. Академии образования при МО РТ Бобиев Гулямкоднр Муккамолович Малое предприятие ООО «Занд»

кандидат биологических наук, Давлятназарова Зулфия Буриевна Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН РТ

Ведущая организация: кафедра фармацевтической и токсикологической химии Таджикского медицинского университета им. Абуали ибни Сино.

Защита состоится 30 мая 2012 г. в 13.00 час. на заседании Диссертационного совета Д 737.004.05 при Таджикском национальном университете по адресу г. Душанбе, пр. Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета

Автореферат разослан « 30 » ОЦ_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Хамрабаева З.М.

Актуальность темы. Таджикистан является одним из мировых центров многообразия культурных и дикорастущих растений, характеризующих уникальные эко-климатические условия.

Благодаря ярко выраженному орографическому расчленению и особенностям географического расположения очень велико видовое разнообразие растений, что даёт возможность выявить новые источники физиологе - биохимических активных веществ, которые используются в пищевой и парфюмерной промышленности, а также в медицине.

Особое место в этой связи имеют те дикорастущие растения, произрастающие в Таджикистане, которые продуцируют эфирные и жирные масла, а также и другие биологически активные вещества. Поэтому вполне актуальной задачей является исследование биохимического состава эфироносных дикорастущих растений произрастающих в горных зонах Таджикистана. Более того низкомолекулярные соединения, для которых свойственны полифункциональность действия, играют ключевую роль не только в адаптации организма к стрессовым условиям жизнедеятельности, но также поддерживают их патогенную значимость.

Цель работы - изучение изопропеноидных, флавоноидных, глицеридных, микроэлементных и полисахаридных комплексов семян зиры (Виптт ретсшп), произрастающей в Таджикистане, в разных фазах формирования семян, и разработка оптимальных условий выделения эфирного масла и витаминов группы А.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить состав эфирных масел семян зиры в разных периодах созревания и хроматографическими методами определить их компонентный состав в зависимости от зоны произрастания в Республике Таджикистан;

- определить влияние природного бентонита «Топкок» на улучшение качества эфирных и жирных масел зиры, с целью повышения их

органолептических свойств;

- изучить глицеридный состав семян зиры в разных климатических зонах и дать качественную и количественную оценку выделенного эфирного и жирного масла;

- разработать новый способ получения эфирного масла и витаминов группы А из семян зиры;

- изучить флавоноидный состав семян зиры и разработать метод, позволяющий определить сумму фенольных соединений;

- изучить микроэлементный состав и полисахаридные комплексы семян зиры методом атомно-эмиссионного спектрального и рентгенофазового

анализов.

Научная новизна работы:

- с применением биохимических методов анализа впервые выявлен компонентный состав семян зиры, произрастающей в разных климатических зонах Республики Таджикистан;

- разработан новый способ выделения эфирного масла путём вымораживания масличного экстракта, способствующий улучшению выхода масла по сравнению с существующими способами, а также с помощью колоночной хроматографии разработан метод выделения витаминов группы А из масла;

- изучена динамика накопления изопропеноидных, флавоноидных и глицеридных соединений в семенах зиры в разных фазах развития семян зиры;

- найдена новая константа, характеризующая сумму фенольных соединений состава растительных масел.

- бентонитом «Топкок» улучшены органолептические свойства эфирных и жирных масел;

Практическая значимость работы:

- на основе эфирного масла зиры подготовлена душистая композиция, имеющая хорошее качество и приятный запах;

- для улучшения органолептического качества продукта рекомендуется провести обработку масла бентонитом марки «Топкок» по разработанной нами схеме;

- использованные научно-методические подходы могут быть применены для выполнения аналогичных исследований других растительных объектов.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научно-теоретической конференции «Материалы республиканской конференции: «Новые теоретические и прикладные исследования химии в высших учебных заведениях Республики Таджикистан» (ТГПУ имени С. Айни, Душанбе 2010 г.); «Материалы республиканской научной конференции «Химия: исследования, преподавание, технология», посвященной «году образования и технических знаний» (ТНУ, Душанбе 29-30 сентября 2010 г.); «Материалы республиканской научной конференции: «Подготовка научных кадров и специалистов новой формации в свете инновационного развития государств» (ТУТ, Душанбе 30, 31 октября и 1 ноября 2010 г.); «Международной конференции: «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений», посвященной 50-летию кафедры органической химии и 70-летию д.х.н., профессора Ш.Х. Халикова (ТНУ Душанбе 3-4 октября 2011 г.). '

Публикация

По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 6 тезисов докладов и 3 авторские заявки.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, списка использованной литературы, включающего 65 источников, содержит 28 таблицы и 31 рисунков.

1. Характеристика эфирного масла зиры

Для изучения и характеристики компонентного состава и определения влияния климатических факторов на процесс образования эфирного масла в

семенах зиры, использовали семена собранные из двух регионов Республики Таджикистана (Даштиджумского и Тавильдаринского районов). Для сравнения использована зира Ирана. Эфирное масло получили перегонкой водяным паром и выделили от водных растворов двумя способами: вымораживанием (а) и ректификацией (б).

Для характеристики гетерогенности компонентного состава исследуемых образцов, определяли их основные физико-химические константы (табл.1)

Таблица 1

Основные физико-химические константы образцов эфирного масла

Эфиро-

масличность

Ы2,'

[п]1

КЧ мг КОН/г

40 мг КОН/г

ЭЧ мг КОН/г

ИЧ мг КОН/г

1 4753

31.5

28.60 2225

34.32 26.87

0.820 0.916

19.3

25.92

59.5

0.865 0 810

40.00

1.4735

1.4745

12.05 32.70

24.59

23.80

а - По новому методу; б - По известному методу;

А - семена зиры из Тавнпьдары, в фазе после полного созревания; А, - семена зиры из Тавильдары, в фазе перед полным созреванием; Л2 - семена зиры из Тавильдары, в фазе плодоношения; В - семена зиры из Даштиджума, в фазе после полного созревания; В,- семена зиры из Даштиджума, в фазе перед полным созреванием; В2- семена зиры из Даштиджума, в фазе плодоношения; С - семена зиры Ирана в фазе после полного созревания.

Как видно из таблицы, в составе образцов семян зиры максимальное количество эфирных масел накапливается в фазе после полного созревания. Выход эфирного масла в наибольшем количестве наблюдается в образце А. Данные о климатических условиях этих регионов (температура воздуха, высота над уровнем моря) и полученные результаты свидетельствуют о том, что зира с наибольшим выходом эфирного масла произрастает в Тавильдаринском районе. Климатические условия данной зоны наиболее благоприятны для роста и развития растений, что создает оптимальные условия прохождения физиологических и биохимических процессов, способствующих улучшению процесса максимального светопоглощения и освоения солнечной энергии, усиливающих фиксации С02 и регуляции ферментативных процессов клеточного метаболизма и более интенсивному накоплению эфиромасличных и физиолого-биологически активных веществ.

Для изучения динамики накопления основных компонентов эфирного масла семян зиры был исследован химический состав образцов в фазах плодоношения, до и после полного созревания методом ГЖХ - анализа (носитель азот, скорость 0.6 см3/мин, от 60 °С до 238 °С, сорбент хроматом N -ду - ОЫС8, жидкая фаза БЕ - 30, 5%). Выделенные компоненты идентифицированы по времени удержания, температуре кипения и сравнением с эталонами. Процентное содержание выделенных компонентов вычислили по площади пиков хроматограммы (табл. 2).

Хроматограммы приведены на рисунках 1-3.

.Алл

Г

и 10 12 , 9

Рис. 1. ГЖХ анализ эфирного масла семян зиры Тавильдаринского района РТ, в фазе после полного созревания, в %: 1 - камфора, 4.27; 2 - а-пинен, 8.19; 3 - (3-пинён, 11.5; 4 - цитронеллол, 14.23; 5 - лимонен 0.28; 6 - тимол, 1.07; 7 - п-цимол, 27.69; 8 -куминовый альдегид,32.00; 9 - цитраль,0.26; 10 - олеиновая кислота,0.07; 11 -масляная кислота,0.04; 12 - уксусная кислота, 0.04.

Рис. 2. ГЖХ анализ эфирного масла семян зиры Даштиджумского района РТ, в фазе после полного созревания, в %: 1 - камфора, 3.89; 2 - а-пинен, 11.80; 3 - р-пинен, 10.29; 4 - цитронеллол, 10.02; 5 - лимонен, 1.85; 6 - тимол, 0.27; 7 - п-цимол, 21.88; 8 -куминовый альдегид, 38.31; 9 - цитраль, 0.37; 10 - олеиновая кислота, 0.32; 11 -масляная кислота, 0.45; 12 - уксусная кислота, 0.55.

Рис. 3. ГЖХ анализ эфирного масла семян зиры Ирана, в фазе после полного созревания, в %: 1 - камфора, 2.98; 2 - а-пинен, 9.01; 3 - Р-пинен, 19.87; 4 -цитронеллол, 4.76; 5 - лимонен, 0.26; 6 - тимол, 4.24; 7 - п-цимол, 22.57; 8 -куминовый альдегид, 32.00; 9 - цитраль, 2.38; 10 - олеиновая кислота, 0.20;'11 -масляная кислота, 0.31; 12 - уксусная кислота, 1.39.

Таблица 2.

Динамика накопления основных компонентов эфнрного масла

Компоненты А В С

1 2 3 1 2 3 3

а-пинен 6.80 7.93 8.19 8.45 11.44 11.80 9.01

Р-пннен 12.9 10.08 11.50 9.85 10.12 10.29 19.87

Лимонен 0.08 0.12 0.28 1.56 1.65 1.85 0.26

п-цимол 23.35 24.55 27.69 20.04 20.8 21.88 22.57

Камфора 3.85 4.05 4.27 3.48 3.65 3.89 2.98

Куминовый альдегид 27.00 30.00 32.00 35.45 37.70 38.31 32.00

Цитраль 0.12 0.20 0.26 0.12 0.22 0.37 2.38

Цитронеллол 8.90 12.34 14.23 9.32 9.80 10.02 4.76

Тимол 1.00 1. 54 1.07 0.19 0.35 0.27 4.24

Уксусная кислота 3.80 1. 00 0.04 2.19 1.27 0.55 1.39

Олеиновая кислота 10.40 7.37 0.07 7.35 1.85 0.32 0.20

Масляная кислота 1.80 0.82 0.04 2.00 1.15 0.45 0.31

А - Зира, произрастающая в Тавильдаринском районе; В - Зира, произрастающая в Даштиджумском районе; С - Зира, произрастающая в Иране; 1 - фаза плодоношения; 2 - фаза перед полным созреванием; 3 - фаза после полного созревания.

При исследовании динамики накопления основных компонентов эфирного масла выявили, что в процессе созревания семян количество органических кислот уменьшается, а количество других органических компонентов постепенно увеличивается.

Для улучшения органолептических свойств эфирного масла семян зиры, использовали бентонит «Топкок» с соотношением масла + бентонит (10:0.1). После обработки бентонитом определили основные физико-химические константы эфирного масла. Результаты анализа показали, что в процессе обработки уменьшается концентрация компонентов, имеющих кислотное свойство.

Для определения кинетики взаимодействия бентонита с эфирным маслом, провели атомно-эмиссионный спектральный анализ бентонита. Исследование показало, что основу бентонита составляют оксиды алюминия и кремния. Наряду с макроэлементами также были обнаружены такие микроэлементы, как: кальций (до 2%), калий (0.7%), натрий (0.1%), магний (1.5%), которые в процессе обработки взаимодействуют с компонентами, имеющими кислотное свойство, и в результате адсорбируются на бентоните.

Для подтверждения результатов кинетики, эфирное масло, обработанное бентонитом, подвергли ГЖХ анализу. Анализ ГЖХ показал отсутствие кислот и фенолов, которые были адсорбированы бентонитом. Отсутствие этих компонентов в эфирном масле, также подтверждено значением кислотного числа, которое составило 0.12 мг КОН/г.

Следует отметить, что обработка эфирных масел бентонитом значительно увеличивает их качество за счет уменьшения КЧ (кислотного числа) и улучшения органолептических свойств.

2. Биохимические исследования и характеристика жирных масел семян

зпры.

2.1 Определение масличности жирных масел семян зиры

Масло из семян зиры, произрастающей в Тавильдаринском и Даштиджумском районе Таджикистана и привезенные из Ирана, собранные в фазе плодоношения, до и после полного созревания сортов, выделили методом горячей экстракции в аппарате Сокслета с помощью диэтилового эфира. Масличность масла определили методом Рушковского и Сокслета (табл. 3).

Между полученными результатами наблюдается различие, которое заключается в том, что по Сокслету не учитываются компоненты, имеющие наименьшую температуру кипения, которые в результате упаривания растворителя улетучиваются одновременно вместе с растворителем. Учитывая данное различие можно вычислить содержание легколетучих компонентов, растворяющихся в диэтиловом эфире по уравнению С=А-В, где А - масличность по Рушковскому; В - масличность по Сокслету; С - сумма легколетучих компонентов в %. Условия определения масличности семян зиры приведены в табл. 3.

Исследуемый экстракт

Условия определения масличности семян зиры

20

20.60

0.864

19.253

Масличность, %

6.54

4.32

ж ~ 5 § £1

2.2

20

20.58

20

20.62

2.08

18.254

3.404

11.30

16.975

10.40

17.68

0.90

17.02

0.66

В,

20

20.60

0.764

19.430

20

20.62

5.68

18.580

9.89

20

20.58

9.12

2.930

20

20.61

3.400

17.460

17.050

15.16

14.65

17.27

17.00

0.52

0.27

-т-----——-. _ "•»»

А, - семена зиры из Тавильдары, в фазе плодоношения; А2 - семена зиры из Тавильдары, в фазе перед полным созреванием; А3 - семена зиры из Тавильдары, в фазе после полного созревания; В, - семена зиры из Даштиджума, в фазе плодоношения; В2- семена зиры из Даштиджума, в фазе перед полным созреванием; В3 - семена зиры из Даштиджума, в фазе после полного созревания; С - семена зиры Ирана в фазе после полного созревания

Как видно из таблицы, в образцах семян зиры, собранных в фазе после полного созревания наибольшую масличность имеет зира Тавильдаринского района, что связано с более интенсивным прохождением фотосинтетической функции и, следовательно, накоплением физиологических и биохимических активных соединений. Возможно, их образование неразрывно связано с климатическими факторами зоны произрастания зиры.

2.2 Физико-химические показатели образцов семян зиры

С целью определения суммы компонентов и характеристики полученных масел определили их основные физико-химические константы, такие как: температура плавления, температура застывания, плотность, показатель преломления, кислотное число, число омыления, йодное число и эфирное число.

Температуру плавления и застывания определили, используя обычный термометр. Плотность определили с помощью пикнометров. Показатель преломления вычислили, используя рефрактометр ИРФ-56, а йодное число определили по методу Гануса. Полученные результаты приведены в табл.4.

фщнко-химнческие константы масла семян зиры

Физико-химические константы

Образец

21-23

9-10

3-4

22-24

9-10

3-4

3-4

/ С

заст

18-20

2-3

8-6

2-3

[рТ

0.791

0.865

0.783

2-3

0.850

0.905

1.3250

1.3335

1.3340

1.3300

1.335

1.3380

19.74

9.64

2.50

20.50

10.55

1.3370

2.63

2.35

69.44

120.24

152.0

70.8

126.55

147.0

131.76

о 2 и

I. ой

Л 5 о

О т

49.7

110.6

149.5

50.3

116.0

144.37

129.41

40.2

80.5

106.0

45.0

102.5

94.3

А, - семена зиры из Тавнльдары, в фазе плодоношения; А2 - семена зиры из Тавильдары, в фазе перед полным созреванием; А3 - семена зиры из Тавильдары, после полного созревания; В, - семена зиры из Даштаджума, в фазе плодоношения; В2 - семена зиры из Даштаджума, в фазе перед полным созреванием; В3 - семена зиры из Даштиджума, в фазе после полного созревания; С - семена зиры Ирана в фазе после полного созревания;

Как показывают результаты анализов, в процессе созревания семян уменьшается значение КЧ и наблюдается рост значений ИЧ (йодного числа). Это объясняется тем, что насыщенные жирные кислоты под действием ацетил-СоА в цикле лимонной кислоты, образуют ненасыщенные жирные кислоты из углеводов через пируат и ацетил-СоА. Рост значений ЭЧ свидетельствует о биохимической реакции взаимодействия свободных кислот с глицерином, в результате которой образуются сложные эфиры (этерефикация).

Судя по константе ИЧ, полученные образцы масла относятся к полувысыхающим маслам, поскольку их среднее значение составляет 102 г 12 в 100 г исследуемого образца.

23 Свободные кислоты состава масла семян образцов зиры

Для качественной и количественной характеристики свободных жирных кислот образцов масла применили метод бумажной хроматографии (БХ) в системе бутанол - муравьиная кислота - вода (45:5:22.5). Хроматограмму проявили спиртовым раствором бромфенола синего, что позволило обнаружить компоненты в виде четких синих и голубых пятен, относящиеся к органическим кислотам.

Количество свободных жирных кислот определили методом извлечения продуктов из хроматограмм элюированием хлороформом. Результаты качественной и количественной характеристики обнаруженных кислот приведены в табл. 5. Идентичность кислот установили сравнением значении коэффициента распределения (Яг) с Ягом эталонов и использованием литературных данных температуры плавления, а также с помощью качественных реакций (табл. 5).

Массу идентифицированных кислот (в процентах и в граммах) определили титриметрически, т.е. титрованием 0.01 н раствором КОН определенного раствора кислоты. Расчет проводили по реакции взаимодействия КОН с идентифицированной кислотой.

Таблица 5

Качественная н количественная характеристика органических кислот

Компоненты Температура плавления,"С Rr Система П роцентное содержание

А, А, А, В, В2 Вз С

Олеиновая кислота СНз(СН2)тСН= СН(СН2)тСООН 13-14 0.91 1 0.32 0.58 0.16 0.35 0.56 0.48

0.82 2

0.50 3

0.70 4

Стеариновая (н-октодекановая кислота) СН3(СН2)16СООН 69-71 0.83 1 0.98 0.71 0.54 0.85 0.64 0.56 0.32

0.32 2

0.30 3

0.39 4

Пальмитиновая (н-гексадокановая кислота) СН3(СН2)мСООН 63-64 0.72 1 0.54 0.42 0.38 0.45 0.34 0.28 0.24

0.10 2

0.25 3

0.37 4

Линолевая кислота СН3(СН2)4СН= СНСН2СН=СН (СН;КХЮН -5...-4 0.50 1 0.21 0.33 0.42 0.23 0.34 0.42 0.38

0.72 2

0.50 3

0.42 4

Линоленовая кислота СНз сн,сн=снсн2 СН=СНСН,С№ СН(СН;),СООН 0.35 1 - 0.02 0.08 0.09 0.15 0.24 0.44

0.70 2

0.62 3

0.50 4

------------,,„. .„„.„.„„„Н1)1> 0 иладимишении, /\2 - семена зиры из

Тавильдары, в фазе перед полным созреванием; А3 - семена зиры из Тавильдары, в фазе после полного созревания; В, - семена зиры из Даштиджума, в фазе плодоношения; В2- семена зиры из Даштиджума, в фазе перед полным созреванием; В3 - семена зиры из Даштиджума, в фазе после полного созревания; С - семена зиры Ирана в фазе после полного созревания. Системы: 1 - бутанол-муравьиная кислота-вода (45:5:22.5); 2 - хлороформ-метанол-уксусная кислота (1:2:0.1); 3 - амиловый спирт-вода (2:1); 4 - изоамиловый спирт-метанол-вода (1:2:1).

Из результатов, приведенных в таблице, видно, что в процессе созревания семян образование ненасыщенных жирных кислот возрастает, а синтез насыщенных кислот убывает, что напрямую связано с биосинтезом ненасыщенных жирных кислот из насыщенных, с помощью малонил-СоА.

Исследования показали, что в образцах семян зиры обоих районов Республики содержание свободных жирных кислот намного больше, по сравнению с зирой Ирана

2.4 Биохимическая характеристика жирного масла образцов семян

зиры

Для решения поставленной цели мы использовали образцы семян зиры, собранные в фазе после полного созревания.

Для исследования глицеридных соединений образцов масла зиры необходимо было удалить из них некоторые компоненты, имеющие кислотное свойство, а именно: свободные кислоты, фенолы и др. Для этого необходимо было выявить общее количество всех компонентов, содержащихся в масле. Мы решили эту задачу, используя метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:1:0.1), проявителем служили пары йода. На хроматограммах обнаружили присутствие 9 компонентов, затем для удаления вышеупомянутых компонентов, не относящихся к глицеридам, образцы масла обработали водным раствором КОН, чтобы превратить их в соли калия. Далее глицериды извлекли из водной вытяжки экстрагированием

диэтиловым эфиром.

ТСХ анализ полученного экстракта показал присутствие 4 компонентов, относящихся к глицеридам. Глицеридные компоненты подвергли ГЖХ анализу на приборе Хром - 5. Результаты анализа глицеридного состава образцов масла зиры приведены на рис. 4,5,6.

_

Рис.4 ГЖХ анализ масла зиры из Тавильдары, в фазе после полного созревания.

Рис.5 ГЖХ анализ масла зиры из Даштиджума, в фазе после полного созревания.

Рис.6 ГЖХ анализ масла зиры Ирана, в фазе после полного созревания.

Из профиля ГЖХ хроматограмм видно, что количество обнаруженных веществ в исследуемых маслах составляет 6 компонентов, вопреки ТСХ анализу, где было обнаружено 4 компонента. Вероятно, это несоответствие возникло за счет неполного разделения глицеридов, которые имеют близкие коэффициенты , находящиеся в виде оптических рацематов, не разделяемых ТСХ анализом. ГЖХ анализ показал себя более эффективным методом в плане четкого

разделения рацематов.

Для определения и идентификации жирных кислот глицеридов, образцы масел повторно обработали водным раствором (0.1 н) КОН. Водную часть удалили, глицериды гидролизовали и полученные свободные кислоты превратили в метиловые эфиры. Полученные метиловые эфиры жирных кислот повторно подвергли ГЖХ анализу (носитель азот, скорость 0.6 см /мин, от 60 С до 238 °С, сорбент хроматом N - АУ - жидкая фаза 8Е - 30, 5%),

хроматограмма которого приведена на рис. 5-7.

7 8 9

Рис. 7. ГЖХ анализ метиловых эфиров жирных кислот, зиры из Тавильдары в фазе после полного созревания: 1 - С|70; 2 - С,8:1; 3 - С,6о; 4 - С,8:3; 5 - С22:0; 6 - С,67 — С|8:2; 8 — С)8 о.

Рис. 8. ГЖХ анализ метиловых эфиров жирных кислот, зиры из Даштиджума в фазе после полного созревания: 1 - С17:0; 2 - С18:1; 3 - С16:0; 4 - С,8:3; 5 - С22:0; 6 - С,67 ~ C]S:2; 8 - Cigo.

Рис. 9. ГЖХ анализ метиловых эфиров жирных кислот, зиры Ирана в фазе после полного созревания: 1 - Ci7:0; 2 - С,8:1; 3 - С,6:0; 4 - С,8:3; 5 - С22:0; 6 - С,6:1; 7 - С182; 8 -Cigo.

Идентификацию жирных кислот проводили по времени удержания, температуре кипения, в сравнении с эталонами. Процентное содержание этих кислот, вычислили по площади пиков, результаты которых приведены в таблице

Таблица 6

Жнрно-кнслотнын состав образцов семян знпы_

Образцы Компоненты. %

С22:0 Ci82 ■ Cisi C|80 Ci7:0

Зира Тавильдары 0.74 61.23 10.53 0.84 2.05 3.75 19.90 0.93

Зира Даштиджума 0.17 58.40 14.10 0.88 0.35 6.02 19.17 0.59

Зира Ирана 0.76 61.27 8.26 0.76 2.08 3.80 21.75 0.94

3 Исследование витаминного состава семян зиры 3.1 Определение к-аротиноидов (витаминов группы А)

Для качественного и количественного определения каротиноидов образцов семян зиры Тавильдаринского и Даштиджумского районов Таджикистана и Ирана, использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ).

ТСХ - анализ экстрактов семян проводили в системе бензол - этанол амиловый спирт (10:5:2). Содержание каротиноидов определили элюированием хроматографических пятен продуктов из хроматограммы, а оптическую плотность определили на приборе ФЭК-56 при длине волны 270 нм в кювете толщиной 1мм, используя светофильтр, имеющий коэффициент 33. Полученные результаты приведены в табл. 7

Образец

а-

каротин

Содержания каротнноидов семян зиры (В. ретсит)

Масса исследуемого объекта, г

0.63

0.86

О.П

0.72

0.63

0.86

0.11

0.72

0.63

0.11

0.72

0.63

Элюат

Бензол

Бензол

Этанол

Бензол

Бензол

Бензол

Этанол

Бензол

Бензол

Бензол

Этанол

Бензол

[о г;

1.40

1.25

0.32

0.15

1.40

1.25

0.32

0.15

1.40

1.25

0.32

0.15

1.30

Содержание каротнноидов мг/г

9.24

!.25

2.10

1.42

3.99

7.80

2.05

1.35

9.85

!.80

2.67

2.10

9.84

А - семена зиры в фазе после полного созревания из Тавильдаринского района; В - семена зиры в фазе после полного созревания из Даштиджумского района; С - семена зиры в фазе после полного созревания из Ирана.

Идентичность выделенных компонентов определили по оптическим свойствам и качественными реакциями. Условия идентификации, выделенных каротнноидов, приведены в табл. 8.

Таблица 8

Условия идентификации каротиноидных компонентов состава семян

Качественные реакции

« 3 £ 5 X 4> 4> С ч О « £ система) (итель пар! иода Н2504 вьсь НМ03 НС1 И ¡1 |э? | | и г Е (пл.. "С

2 о 02 * *1 С 5 * I5

(СС -каротин) Яг=0.63 Бензол-петролейный эфир (3:1) синий - - - 478.0, 447.5 при добавлении 1 капли 0.1% 5ЬСЬ -> 509 (в бензоле) 186-188

II (ликопин) ^=0.86 Бензол- петроле и ный эфир-этанол (3:1) синий синий пурпуровый - 522.0, 487.0,455.0 172-175

III (цеоксантин) Иг=0.72 Бе нзол-петроле и ный эфир-этанол (60:15:4) - - - красный 410,430,472 под действием НС1 —* 425, 400,460 203-205

1У(виалоксан-тин) Яг=0.11 - синий - оранжевый 463.5, 451.5 423 0 199-201

Изучение накопления каротиноидных соединений в образце зиры Тавильдаринского района показало, что их содержание в фазе плодоношения минимально (0.637%), в фазе перед полным созреванием максимально (2.570%), а при фазе после полного созревании их содержание уменьшается до 2.092%, что

свидетельствует об их частичном превращении в другие компоненты, в процессе обмена веществ.

3.2 Токоферолы состава семян зиры

Для определения токоферолов (витаминов группы Е) образцов масла, семена зиры экстрагировали диэтиловым эфиром и гидролизовали спиртовым раствором гидроксидом калия в присутствии пирогалола. Гидролизат промыли водой. Экстракт высушили над безводным Ка2504 и растворили в бензоле. После упаривания эфира бензольный раствор пропустили через колонку наполненную силикагелем с целью очистки основного продукта от других сопутствующих компонентов.

Полученный элюат отгоняли и колориметрировали. Содержание токоферолов определили по калибровочному графику, построенному на основе растворов токоферола.

Для характеристики токоферолов, полученные продукты подвергли бумажно-хроматографическому анализу обработанным 3 %-ным раствором 2пСО} в различных системах.

Идентификацию токоферолов проводили по значению коэффициента распределения после УФ облучения. Количество идентифицированных токоферолов определили методом соскабливания продукта из полученных хроматографичесих пятен (таблица 9).

Таблица 9

Токоферолы состава масла семян зиры_

Образцы Сумма токоферолов (мкг/г) Содержание токоферольных компонентов (мкг/г)

а- токоферол У- токоферол у- токотреинол Р- токоферол

Семеназиры Тавильдаринского района 397.0 270.0 123.5 27.0 6,5

Семена зиры Даштиджумского района 426.6 260.0 121.7 29.4 15.5

Семеназиры Ирана 469.4 284.5 132.0 31.6 21.3

Как видно из полученных результатов, семена, собранные в фазе после полного созревания больше всего в своем составе содержат а - и у -токоферолы. Следует отметить, что при анализе не учитывались частичные потери выделенных изомеров в процессе соскабливания продукта из хроматографической бумаги.

С целью изучения динамики накопления витаминов группы Е в составе семян зиры Тавильдаринского района, семена собирали в разных фазах развития (через каждые 10 суток). Анализировали сумму токоферолов аналогично, как в предыдущем случае. Полученные результаты представлены на рис. 10.

(мкг/г)

Рис. 10. Динамика накопления токоферолов в разных фазах развития семян зиры: А-фаза плодоношения; Б-фаза перед полным созреванием; В-фаза после полного созревания.

Как видно из диаграммного графика, максимальное накопление токоферолов во всех случаях наблюдается в фазе перед полным созреванием (1525 июня), т. е. в период активного роста растений.

4. Фенольные соединения семян зиры

Для выделения фенольных соединений, семена зиры Тавильдаринского и Даштиджумского районов, а также зиры Ирана, перемололи в кофемолке и подвергли холодной экстракции, чтобы неустойчивые флавоноиды не разлагались при термообработке. В качестве экстрагента использовали 70%-ный С2Н5ОН. Затем определили сумму фенолов, фенольное число (ФЧ), кислотное число (КЧ) и показатель преломления по вышеприведенным методам.

Фенольное число характеризует сумму фенольных соединений состава растительных масел и экстрактов, характеризующих мг КОН или №ОН в 1 г исследуемого образца масел. Этот метод разработан и потентирован нами, сущность которого заключается в блокировании карбоксильных групп свободных кислот, сопутствующих наряду с фенольными соединениями. Из-за весьма слабой кислотности флавоноиды не вступают в реакцию с блокиратором. Свободные жирные кислоты взаимодействуют с блокиратором дициклогексилкарбодиимидом по схеме:

После блокировки свободных жирных кислот сумму свободных фенольных соединений определили путем титрования спиртовым раствором (0.1 н) КОН или ЫаОН по мг израсходованной щелочи в 1 г исследуемого образца по разработанной нами формуле:

где

ФЧ - фенольное число (мг КОН/г); V - объем титранта, израсходованного на титрование навески (мл); У0 - объем израсходованного титранта, при холостом опыте (мл); ш - масса титранта (г); Т - титр использованного титранта (г/мл).

Также для достоверности полученных результатов определили КЧ. Условия определения суммы фенольных соединений приведены в табл. 10

Таблица 10

Условия определения суммы флавоноидных соединений в семенах

Объект исследования Содержание экстрагируемых веществ КЧ (мг КОН/г) ФЧ (мг КОН/г) Г„120 М 4

г %

Зира Тавильдары 4.46 0.932 4.830 1.92 1.464

Зира Даштиджума 4.35 0.870 4.758 1.80 1.464

Зира Ирана 4.10 0.820 4.645 1.65 1.465

Как видно из значений ФЧ, по количеству флавоноидных соединений семена зиры Тавильдары превосходят другие объекты.

Для определения регуляции активности образования фенольных соединений в процессе вегетации в семенах зиры, произрастающих в Тавильдаринском районе построили график зависимости КЧ и ФЧ от фазы развития. Полученные результаты приведены на Рис. 11, 12.

5- 4 ,

' ¡11 I Л

А В С Фаза развития

Рис. 11. Зависимость изменения фенольного числа от фазы развития семян зиры. А - фаза плодоношения; В - фаза до полного созревания; С - фаза после полного созревания.

—»

X о 15

г 10 •

т 1

5

А в с Фаза созревания

Рис. 12. Зависимость образования соединений органических кислот от фазы развития семян зиры. А - фаза плодоношения; В - фаза до полного созревания; С -фаза после полного созревания.

Как видно из графика зависимости КЧ и ФЧ, при созревании семян наблюдается значительный спад содержания свободных кислот и фенольных соединений состава семян зиры, т.е. переход этих соединений в другие соединения через метаболические системы или циклические регуляции. Применение разработанной константы ФЧ для определения этих веществ может эффективно характеризовать сумму этих компонентов в растительных маслах и экстрактах.

Качественный состав выделенных фенольных фракций исследовался в тонком слое силикагеля на пластинках «ЗПиПэЬ) в системах бензол - этанол -уксусная кислота (45:3:2), бензол - этанол (9:1) и дихлорэтан - этанол (9:1). Хроматограммы проявлялись 1%-ным раствором РеС13.

После обработки проявителем (РеС13) на хроматографических пластинках обнаружили три пятна с зелеными и темно-зелеными оттенками, свидетельствующими о присутствии в экстракте, полученного из семян зиры, трех флавоноидов.

По отдельности эти флаваноиды были получены в результате их хроматографирования на колонке заполненной окисью алюминия. В качестве элюента подвижной фазы использовали бензол - этанол.

После элюирования и упаривания элюатов из каждого образца получили 3 кристаллических компонента. На основе данных о температуре плавления, коэффициенте распределения (по сравнению с литературными данными), ИК- и УФ-спектрах охарактеризовали выделенные компоненты. Из-за того, что эти компоненты выделили в малом количестве, не смогли определить их содержание весовым методом, поэтому использовали титриметрический метод. Выделенные флавоноиды растворили в этаноле (70%) и оттитровали 0.01 н спиртовым раствором КОН до нейтрапизации в присутствии индикатора фенолфталеина По количеству израсходованного КОН вычислили их содержание (в граммах и в процентах) в исследуемых семенах зиры (табл. 11).

Таблица 11

Компоненты Зира, произрастающая в Тавнльдаринском районе Зира, произрастающая в Даштиджумском районе Зира, произрастающая в Иране

г % г % г %

Флороглюцин 0.0217 0.108 0.0204 0.102 0.0178 0.0892

Флороглюцин эфир 0.0132 0.066 0.0128 0.0640 0.0117 0.0585

Крезол 0.0067 0.0338 0.0062 | 0.0314 0.0282 0.0282

Как видно из таблицы, несмотря на то, что 3 полученных фенольных соединения были идентичными, они отличались по количественному содержанию. Большое накопление фенольных соединений наблюдалось в семенах зиры Тавильдаринского района

Компонент, который мы называем флороглюцин эфиром, скорее всего, является флороглюцин глюкозидом. Из-за его недостаточного количества и его

сложной структуры мы не смогли точно установить строение флороглюцин глюкоз ида.

Флороглюцин и его производные относятся к биологически активным веществам, обладающим антисептической активностью. Полученные результаты подтверждают антисептическое свойство помола зиры.

5 Изучение полисахаридных комплексов семян знры

С целью выделения и идентификации полисахаридных комплексов (ПСК) семена, собранные в фазе после полного созревания измельчили в кофемолке, а полисахариды экстрагировали горячей дистиллированной водой. Водный экстракт концентрировали и подвергли холодной экстракции этиловым спиртом, из которого осаждался ПСК. Следует отметить, что при ТСХ анализе (система бутанол-вода (2:1), проявитель бромфенол синий и качественная реакция с раствором йода) наряду с ПСК также обнаружили соли низкомолекулярных кислот и крахмал в виде кристаллов.

С целью улучшения выхода ПСК и удаления сопутствующих компонентов при их осаждении, помол сперва экстрагировали хлороформом. Затем аналогично вышеприведенному способу осадили ПСК из этанола. Полученные результаты приведены в таблице 12.

Таблица 12

Содержание полисахаридных комплексов в семенах знры_

Объект исследования Выход ПСК (г) Содержание ПСК, %

нейтральные сахара свободные сахара

Семена размельченные 2.60 24.90 0.21

Семена, размельченные и обработанные хлороформом 3.70 21.25 0.27

Как видно из таблицы очистка хлороформом, также увеличивает выход ПСК. Предварительная обработка сырья, экстрагированного хлороформом, не изменяет содержания нейтральных Сахаров в ПСК.

Далее мы исследовали ПСК из обработанного хлороформом сырья. ПСК представляют собой порошкообразные вещества, растворимые в воде, нерастворимые в органических растворителях. Выделенные ПСК не содержат крахмала, о чем свидетельствует отрицательная йодокрахмальная реакция. Полученные полисахаридные комплексы подвергли кислотному и щелочному гидролизу.

В продуктах кислотного гидролиза и анализа методами бумажной хроматографии обнаружили присутствие раминозы (Rha), арабинозы (Ara), ксилозы (Xul), манната (Man), глюкозы (Glc) и галактозы (Gal) в заметном количестве (табл. 13).

Продукты щелочного гидролиза анализировали аналогично как вышеприведенные продукты кислотного гидролизата. Полученные результаты приведены в табл. 13.

Выделенные продукты идентифицировали по коэффициентам Иг, температуре плавления, показателю преломления (5% - растворы в воде), качественными реакциями и специальными методами анализа.

Таблица 13

Состав полисахаридных комплексов семян знры

Образец Состав гидролизата Соотношение компонентов в гидролизате

ПСК (нейтральные полисахариды) ЯЬа- Ага- ХЫ- Мап- 61с- Са1 1:11:3:2:19.7:21.3

ПСК (кислые полисахариды) СаЮА-ЯЬа-Ага- Хи1- Мап- Ос- ва! 11:10:2.4:2:1.4:12:1

Также к аналогичному исследованию были подвергнуты семена зиры, произрастающие в Даштиджумском районе и в Иране. Анализы показали, что содержание полисахаридов по выходу отличаются. Например, содержание полисахаридов ' в зире, произрастающей в Иране (после экстрагирования хлороформом) составляло 4.2%, а в зире Даштиджумского района - 3.9%. Но мономеры полисахаридных комплексов в обоих объектах являются идентичными, т.е. не отличаются по компонентному составу.

После выделения и идентификации ПСК из образцов семян зиры исследовали их свободные сахара Как показывает таблица 8, семена зиры, произрастающие в Тавильдаринском районе в своем составе содержат свободные сахара в количестве 0.21 - 0.27%. Для определения содержания свободных Сахаров других образцов семян зиры, использовали вышеупомянутый метод Результаты анализа показали, что семена зиры Даштиджумского района и Ирана содержат в своем составе 0.23 - 0.18% и 0.19 - 0.14% свободных Сахаров соответственно. Это наводит на мысль, что климатические условия данной зоны Таджикистана благоприятно воздействуют на рост развития и накопления физиологически и биохимически активных соединений.

Также при идентификации полученных моносахаридов из состава ПСК, нами впервые был использован рентгенофазовый анализ. Полученные результаты показали эффективность рентгенофазового анализа при идентификации моносахаридов.

6 Исследование макро- и мнкроэлементного состава зиры

Для идентификации макро- и микроэлементного состава семян зиры использовали метод атомно-эмиссионного спектрального анализа. Здесь следует отметить, что этот анализ является полуколичественным, так как с помощью используемых эталонов невозможно определить элементы, имеющие концентрацию более 5 %. Поэтому макроэлементы, которые имеют концентрацию более 5 %, обозначаются символом «>». Анализу подверглись образцы зиры собранные в фазе после полного созревания из Тавильдаринского и Даштиджумского районов РТ, а также зира собранная в фазе после полного созревания, произрастающая в Иране (коммерческие семена).

Количественный спектральный анализ определения элементного состава заключается в исследовании линейчатого спектра, который возбуждается в зоне дугового разряда и изменением интенсивности методом визуальной оценки. После сожжения пробы, фотографирование спектров производили с помощью диафрагмы Гартмана. Расшифровку спектрограмм и оценку концентрации определенных элементов осуществляли по стандартным образцам, контрольным пробам и эталонам. Полученные результаты представлены в табл. 14.

Как видно из таблицы 14, семена зиры, произрастающие в районах Республики в своем составе содержат ряд микроэлементов, таких как: Са, К, Ыа, 7п, Мо, Си, Мп и т.д., имеющих большую роль в жизнедеятельности живых организмов. Самые важные различия между зирой Даштиджумского, Тавильдаринского районов и зирой Ирана наблюдаются в микроэлементном составе. Например, семена зиры, произрастающей в Таджикистане в отличие от семян зиры Ирана в своем составе содержат такой микроэлемент, как серебро, что указывает на высокое качество и биологическую активность данной зиры.

Таблица 14

Зольные микро- и макроэлементы состава семян В. решсит (зиры)

Тавильдаринский район

1 фисутсгвующий элемент Мп № Т1 V Мо Си РЬ Хп Аё

Процентный состав 0.09 0.001 0.03 0.0005 0.0005 0.003 0.0001 0.005 0.00001

Присутствующий элемент А1 мё К N3 Са Ре Р и

Процентный состав 0.05 0.3 3 3 >5 5.3 0.003 0.2 0.001

Даштиджумский район

Присутствующий элемент Мп N1 л V Мо Си РЬ Ъъ Аё

Процентный состав 0.015 - 0.015 0.0005 0.0002 0.0005 0.0003 0.005 0.00005

Присутствующий элемент А1 м§ К N3 Сз Ре Р 1л

Процентный состав 0.05 0.05 3 2 3 0.05 0.002 0.2 0.001

Иран

Присутствующий элемент Мп № Т1 V Мо Си РЬ гп

Процентный состав 0.012 - 0.015 - 0.0002 0.0002 0.0003 0.005 _

Присутствующий элемент А1 мё К N3 Сз Ре Р и

Процентный состав 0.09 0.05 2 2 2 0.05 0.002 0.2 0.001

Выводы

1. Охарактеризован биохимический состав низкомалекулярных соединений, таких как: флавоноиды, изопропеноиды и низкомолекулярные углеводы семян зиры, произрастающей в Таджикистане.

2. Установлена идентичность биохимических компонентов зиры, произрастающей в разных географических зонах Таджикистана и коммерческой зиры Ирана.

3. Установлен состав микроэлементов зиры, произрастающей в Таджикистане и коммерческой зиры Ирана. В составе зиры Таджикистана обнаружен ион серебра, который отсутствует в коммерческой зире Ирана.

4. С помощью природного бентонита разработана система очистки эфиромасличных соединений семян зиры, которые отличаются своими органолептическими свойствами.

5. Разработан способ определения новой константы фенольного числа (ФЧ), характеризующей количество фенолов в маслах и изучена динамика накопления эфирных масел, свободных кислот, флавоноидов и витаминов группы Е в разных фазах развития семян.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х., Зумратов А.Х. Малый патент № ТС 357 на изобретение «Способ выделения эфирных масел», приоритет изобретения 11.05.2010 г.

2. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х., Иброхимов Ф.А. Малый патент № ТС 359 на изобретение «Способ получения витаминов группы А», приоритет изобретения 17.05.2010 г.

3. Ибрагимов Д.Э., Зумратов А.Х., Усмонова Ш.Х., Ёдгорова С. Дж. Малый патент № ТС 339 на изобретение «Композиция для духов из растительного сирья», приоритет изобретения 20.04.2010 г.

4. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х. Каротиноиды семян Витит рег51сит (Боке.) В. рес^с!)., произраставшего в Таджикистане Доклады Академии наук Республики Таджикистан, Т.53, № 5, 2010 г. с. 377 -381.

5. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х. Биологически активные вещества масла семян Витит регз!сит(знра). Научно-медицинскиП журнал «Иаеми Сино» («Вестник Авиценны») Таджикского государственного медицинского университета имени Абуали ибни Сино, № 2, апрель - июнь, Душанбе, 2010 г. с. 106-111.

6. Иброгимов Д.Э., Усмонова Ш.Х. Хроматографическая характеристика флаваноидов семян ВититреШсит. Научно-медицинский журнал «Пабми Сино» («Вестник Авиценны») Таджикского государственного медицинского университета имени Абуалн ибни Сино, № 3, июль - сентябрь, Душанбе, 2010 г. с. 123 -126.

7. Ш.Х.Халиков, Д.Э.Иброгимов, А.Х.Зумратов, Ш.Х.Усмонова, Г.М.Муллоева, Ф.А.Иброгимов. Влияние антиоксидантов на процессы окисления некоторых растительных масел. Вестник таджикского национального университета (научный журнал), № 1(65), Душанбе, 2011 г., с. 77-83.

8. Ш.Х.Халиков, Д.Э.Иброгимов, Ш.Х.Усмонова. Свободные кислоты семян Витит реШсит (зира). Вестник таджикского национального университета (научный журнал), № 9 (75), Душанбе, 2011 г., с. 16-19.

9. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х. Новый метод определения кислотного числа в маслах и экстрактах. Научная перспектива (научно-аналитический журнал), № 9,2010 г., Россия, с. 84-86.

10. Ибрагимов Д.Э., Халиков Ш.Х., Усмонова Ш.Х. ГЖХ анализ глицеридного состава масла зиры. «Материалы республиканской конференции «Новые теоретические и прикладные исследования химии в высших учебных заведениях Республики Таджикистан», Душанбе, 2010 г. с. 30-32.

11. Усмонова Ш.Х. Фенолы эфирных масел семян Витит репюит. «Материалы республиканской научной конференции «Химия: исследования, преподавание, технология», посвященной «году образования и технических знаний» (29-30 сентября 2010 г.). с. 18-19.

12. Ибрагимов Д.Э., Усмонова Ш.Х. Новая технология получения эфирных масел из дикорастущих растений. «Подготовка научных кадров и специалистов новой формации в свете инновационного развития государств», Материалы международной конференции (30,31 октября и 1 ноября 2010 г.). с. 203-205.

13. Иброгимов Д.Э., Усмонова Ш.Х., Ёдгорова С.Ч., Муллоева Г.М. Технология производства душистых композиций для духов. «Материалы республиканской конференции «Новые теоретические и прикладные исследования химии в высших учебных заведениях Республики Таджикистан», Душанбе, 2010 г. с. 137-139.

14. Иброгимов Д.Э., Усмонова Ш.Х. Новый способ определения фенольных соединений в маслах и экстрактах. Международная конференция экстракция органических соединений, РФ-Воронеж-2006, с. 112-113.

15. Иброгимов Д.Э., Усмонова Ш.Х., Нажбуддинов С. Модернизирование способа выделения эфирных масел из некоторых эфироносных растений. Материалы международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений», посвященной 50-летию кафедры органической химии и 70-летнему юбилею доктора химических наук, профессора Халикова Ш.Х.(3-4 октября 2011.) Душанбе, с. 115-117.

Подписано в печать 19.04.2012 г. Формат 60X84 Бумага офсетная 80г/м. Объём 1,3 пл. Тираж 100 экз. заказ № 38 ООО «ПРОМЭКСПО» Адрес г. Душанбе, улица Айни 13в Тел: +(99237) 227 63 73 E-mail: promexpoJj@mail.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Усмонова, Шоистахон Хайдаркулиевна

Глава I. Литературный обзор.

1.1 Биохимический состав эфирных масел.

1.1.2 Биохимические методы исследования эфирных масел.

1.2. Биохимические методы определения жирных масел и других липидов

1.2.1 Особенности важнейших липидов и методы их определения.

1.2.2 Определение общего содержания липидов (масел).

1.3 Хроматографический анализ каротиноидных соединений и пигментов растений.

1.3.1 Качественное разделение пигментов.

1.3.2 Способы разделения, основанные на хроматографии.

1.3.3 Количественное определение пигментов.

1.4 Биохимия фенольных соединений.

1.4.1 Идентификация фенольных соединений.

1.4.2 УФ- спектроскопия фенольных соединений.

1.4.3 ИК- и ЯМР- спектроскопия фенольных соединений.

Глава ^Экспериментальная часть.

2.1 Эфиромасличность семян зиры и основные физико-химические константы.

2.1.2 Физико-химические константы эфирных масел.

2.1.3 ГЖХ анализ эфирных масел зиры.

2.1.4 Улучшение органолептических свойств эфирных масел с бентонитом «Топкок».

2.1.4.1 Изучение микроэлементного состава бентонита «Топкок».

2.1.4.2 Определение динамики испарения эфирного масла.

2.2 Качественные и количественные характеристики жирных масел образцов семян зиры.

2.2.1 Определение масличности образцов семян зиры.

2.2.2 Определение важнейших физико-химических констант.

2.2.3 Физико-химические константы жирных масел образцов семян зиры, после обработки бентонитом «Топкок».

2.3 Хроматографический анализ компонентного состава масла семян зиры.

2.3.1 Хроматографическое разделение и идентификация свободных кислот состава масла образцов семян зиры.

2.3.1.а ГЖХ анализ глицеридов состава масла семян зиры.

2.3.2 Качественный и количественный анализ связанных кислот глицеридного состава масел семян зиры.

2.4 Определение витаминного состава масла семян зиры.

2.4.1 Определение каротиноидов состава масла семян зиры.

2.4.2 Определение динамики накопления каротиноидных соединений

2.4.3 Определение токоферолов.

2.5 Фенольные компоненты состава семян зиры.

2.5.1 Определение суммы фенольных соединений.

2.5.2 Хроматографический анализ фенольных соединений.

2.5.2.а Качественный анализ фенольных соединений.

2.5.2.6 Биохимическое исследование и идентификация фенольных соединений.

2.5.2.В Количественное определение флавоноидных соединений.

2.5.2.Г Взаимодействие флавоноидов состава семян зиры с тяжелыми металлами.

2.6 Изучение полисахаридных комплексов образцов семян зиры.

2.6.1 Выделение полисахаридных комплексов и свободных Сахаров.

2.6.2 Идентификация моносахаридов образцов семян зиры.

2.6.3 Определение состава ПСК.

2.7 Исследование микроэлементного состава образцов семян зиры.

2.7.1 Определение зольности и щелочности золей.

2.7.2 Анализ микроэлементов семян зиры методом атомно-эмиссионного спектрального анализа.

Глава III. Обсуяедение результатов.

3.1 Ботаническая характеристика зиры Витит рег81сит (Во1з8.) В.РеЛзсИ.

3.2 Биохимическое исследование эфирного масла семян зиры.

3.2.1 Технология получения эфирного масла из семян зиры.

3.2.2 Физико-химические анализы эфирного масла зиры

3.2.3 Изучение динамики накопления эфирных масел.

3.2.4 Улучшение органолептических свойств эфирных масел зиры методом сорбции бентонитом.

3.3. Биохимическое исследование жирных масел и других липидов.

3.3.1 Определение масличности семян зиры и характеристика маслообразовательного процесса в семенах зиры.

3.4 Физико-химическое исследование органических компонентов и характеристика жирных масел семян зиры.

3.4.1 Физико-химические показатели образцов семян зиры.

3.5 Биохимическое исследование компонентов масла семян зиры.

3.5.1 Свободные кислоты масла семян зиры.

3.5.2 Глицеридный состав.

3.6 Характеристика витаминного состава семян зиры.

3.6.1 Определение каротиноидов (витамины группы А).

3.6.2 Токоферолы семян зиры.

3.7 Фенольные соединения семян зиры.

3.8 Биохимическое исследование полисахаридных комплексов семян зиры.

3.9 Исследование микроэлементного состава зиры.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимический анализ основных компонентов семян зиры (Вunium persicum (Вoiss.) B.Fedtsch.) в зависимости от зоны произрастания."

Актуальность темы: Таджикистан является одним из мировых центров многообразия культурных и дикорастущих растений, характеризующих уникальные эко-климатические условия.

Благодаря ярко выраженному орографическому расчленению и особенностям географического расположения очень велико видовое разнообразие растений, что даёт возможность выявить новые источники физиолого - биохимических активных веществ, которые используются в пищевой и парфюмерной промышленности, а также в медицине (Азонов А, 2006).

Особое место в этой связи имеют те дикорастущие растения, произрастающие в Таджикистане, которые продуцируют эфирные и жирные масла, а также и другие биологически активные вещества. Поэтому вполне актуальной задачей является исследование биохимического состава эфироносных дикорастущих растений произрастающих в горных зонах Таджикистана. Более того низкомолекулярные соединения, для которых свойственны полифункциональность действия, играют ключевую роль не только в адаптации организма к стрессовым условиям жизнедеятельности, но также поддерживают их протогенную значимость.

Образование нанокомпонентов - фармакологически активных веществ в лекарственных растениях, является динамическим процессом, изменяющим онтогенезию растений и зависит от многочисленных факторов внешней среды. В процессе онтогенезии, последней стадией синтеза являются алкалоиды, глюкозиды, терпены, фенольные соединения (флавоноиды), душистые вещества и др.

Образование и накопление химических компонентов в процессе фотосинтеза зависит от многих факторов внешней и внутренней среды. Например, от питания, почвы, воды, воздуха, газов микрофлоры и ферментативных процессов. Химизм лекарственных растений изменяется также в зависимости от светового режима. Одним, из которых являются просторные поля и солнечный свет, последний стимулирует образование и накопление в них предшествующих веществ. Особенно это относится к эфиромасличным растениям. С другой стороны, существует много тенелюбивых растений, для которых затененность играет важную роль в накоплении алкалоидов и некоторых стероидов. На химизм процессов метаболизма в растениях также влияет количество солнечных дней, определённые часы дня, сила освещения, условия светового освещения и тепло.

Среди природных факторов, влияющих на жизнедеятельность растений, не последнюю роль играют географические зоны местности. В условиях Таджикистана восточные горные регионы с влажной почвой являются более приемлемыми для лучшего произрастания зиры, накапливающей значительно больше эфирных масел в своих семенах. Установлено, что у масличных растений данных регионов количество жирных кислот и йодное число в маслах отличаются от масел масличных растений, произрастающих в других климатических условиях регионов республики (Шарапов Н.И., 1954), причину которого можно отнести к лучшим климатическим условиям. Вот такая существующая природно-климатическая аномальная зависимость побудила нас заниматься выделением и исследованием органических компонентов семян зиры юго-восточных регионов республики, в том числе Тавильдаринской и Даштиджумской зоны.

Для исследования использовали семена зиры этих регионах в разных фазах развития растений, а также для сравнения использовали привезенные семена зиры из Ирана, климатические условия которого отличаются от наших.

В связи с вышеизложенным, актуальность настоящего исследования заключается в изучении динамики накопления в онтогенезе и биосинтеза основных компонентов, таких как эфирные и жирные масла, фенольные соединения, полисахаридные комплексы и микроэлементы состава эфироносного растения зиры, широко распространенного в горных районах Республики Таджикистан и выявление влияния климатических факторов на образование данных компонентов.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение изопропеноидных, флавоноидных и глицеридных соединений микроэлементного состава и полисахаридных комплексов семян зиры (Витит рек гейт), произрастающей в Таджикистане, в разных фазах формирования семян; разработка оптимальных условий выделения эфирного масла и витаминов группы А.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить состав эфирных масел семян зиры в разных периодах формирования семян и хроматографическими методами определить их компонентный состав в зависимости от зоны произрастания в Республике Таджикистан;

- изучить глицеридный состав семян зиры в разных климатических зонах и дать качественную и количественную оценку выделенного эфирного и жирного масла;

- разработать новый способ получения эфирного масла и витаминов группы А из семян зиры;

- изучить флавоноидный состав семян зиры и разработать метод, позволяющий определить сумму фенольных соединений;

- изучить микроэлементный состав и полисахаридные комплексы семян зиры методом атомно-эмиссионного спектрального и рентгенофазового анализов;

- определить влияние природного бентонита «Топкок» на качество эфирных и жирных масел семян зиры, с целью повышения их органолептических свойств.

Научная новизна работы. Новизна научных положений диссертационной работы заключается в том, что впервые с применением биохимических методов анализа, выявлен компонентный состав семян зиры, произрастающей в разных климатических зонах Республики Таджикистан. Разработан новый способ выделения эфирного масла путём вымораживания масличного экстракта, способствующий улучшению выхода масла по сравнению с существующими способами, а также с помощью колоночной хроматографии разработан метод выделения витаминов группы А из масла. Изучена динамика накопления изопропеноидных, флавоноидных и глицеридных соединений в семенах зиры в разных фазах развития семян. Найдена новая константа, характеризующая сумму фенольных соединений состава растительных масел.

Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций, оформленных в диссертации. Охарактеризован биохимический состав низкомалекулярных соединений, таких как: флавоноиды, изопропеноиды и низкомолекулярные углеводы семян зиры, произрастающей в Таджикистане. Установлена идентичность биохимических компонентов зиры, произрастающей в разных географических зонах Таджикистана и коммерческой зиры Ирана. Установлен состав микроэлементов зиры, произрастающей в Таджикистане и коммерческой зиры Ирана. В составе зиры Таджикистана обнаружен ион серебра, который отсутствует в коммерческой зире Ирана. С помощью природного бентонита разработана система очистки эфиромасличных соединений, отличающихся своими органолептическими свойствами, которые в дальнейшем могут использоваться в пищевой и парфюмерной промышленности. Разработан способ определения новой константы фенольного числа (ФЧ), характеризующей количество фенолов в маслах и изучена динамика накопления эфирных масел, свободных кислот, флавоноидов и витаминов группы Е в разных фазах формирования семян.

Теоретическое и практическое значение работы. Диссертация Усмоновой Ш.Х. практически значима, т.к. получены результаты по улучшению органолептических свойств эфирных и жирных масел бентонитом «Топкок» и на основе эфирного масла зиры. Подготовлена душистая композиция, имеющая хорошее качество и приятный запах. Разработан новый способ выделения эфирного масла путём вымораживания масличного экстракта, способствующий улучшению выхода масла по сравнению с существующими способами, а также с помощью колоночной хроматографии разработан метод выделения витаминов группы А из масла. Полученные результаты и вышеизложенные методы могут быть применены в пищевой и парфюмерной промышленности. Изученная динамика накопления изопропеноидных, флавоноидных и глицеридных соединений в семенах зиры, в разных фазах развития семян, даёт возможность установить оптимальные сроки сбора сырья с наибольшим выходом и лучшим качеством. Использованные научно-методические подходы и найденная новая константа, характеризующая сумму фенольных соединений состава растительных масел, могут быть применены для выполнения аналогичных исследований других растительных объектов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научно-теоретической конференции: «Новые теоретические и прикладные исследования химии в высших учебных заведениях Республики Таджикистан» (ТГПУ имени С. Айни, Душанбе 2010 г.), Республиканской научной конференции: «Химия: исследования, преподавание, технология», посвященной «году образования и технических знаний» (ТНУ, Душанбе 29-30 сентября 2010 г.), Республиканской научной конференции: «Подготовка научных кадров и специалистов новой формации в свете инновационного развития государств» (ТУТ, Душанбе 30, 31 октября и 1 ноября 2010 г.); «Международной конференции: «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений», посвященной 50-летию кафедры органической химии и 70-летию д.х.н., профессора Ш.Х. Халикова (ТНУ, Душанбе 3-4 октября 2011 г.). Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, списка использованной литературы, включающего 65 источников, содержит 28 таблиц и 31 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Усмонова, Шоистахон Хайдаркулиевна

Выводы

1. Охарактеризован биохимический состав низкомалекулярных соединений, таких как: фенолы, изопропеноиды и низкомолекулярные углеводы семян зиры, произрастающей в Таджикистане.

2. Установлена идентичность биохимических компонентов зиры, произрастающей в разных географических зонах Таджикистана и коммерческой зиры Ирана.

3. Установлен микроэлементный состав зиры, произрастающей в Таджикистане и коммерческой зиры Ирана. В составе зиры Таджикистана обнаружен ион серебра, который отсутствует в коммерческой зире Ирана.

4. С помощью природного бентонита разработана система очистки эфиромасличных соединений, которые отличаются своими органолептическими свойствами.

5. Разработан способ определения новой константы фенольного числа (ФЧ), характеризующей количество фенолов в маслах и изучена динамика накопления эфирных масел, свободных кислот, флавоноидов и витаминов группы Е в разных фазах формирования семян.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усмонова, Шоистахон Хайдаркулиевна, Душанбе

1. Авторское свидетельство СССР № 1818338.

2. Азонов А.Д., Денисенко П.П., Лосев Н.А., Холназаров Б.М. Лечебные свойства фенхелевого и лавандового эфирных масел. Монография.-Душанбе: «Эчод», 2006. 132 с.

3. Алексеев В.Н. Количественный анализ. М.: Химия, 1976.

4. Андрющенко В.К. Методы оптимизации биохимической селекцииовощных культур. Кишинев: Штиинца. 1981, 128 с.

5. Арасимович В.В.,.Ермаков А.И. и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат. Ленинград. 1978, 430 с.

6. Бажакова И.В., Маслова Т.Г.и др. Пигменты пластид зеленых растений и методика их исследования. «Наука». М. - Л. 1964, 113 с.

7. Бобранский Б. Количественный анализ органических соединений. Госхимиздат. Москва. 1961, с 85.

8. Гиллер Я.Л. Таблицы межплоскостных расстояний. Т.П, «Недра», М., 1966.

9. Гиоргиевский В.П., Комиссариенко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск, 1990, с 191.

10. Губен-Вейль. Методы органической химии. -М.: «Химия», 1967, 1032 с.

11. Гудвин Э. Сравнительная биохимия каротиноидов. М.: Наука, 1984.

12. Гусеева В.А., Пасешниченко В.А. и др. -Методы современной биохимии. М., 1975, с. 72-74.

13. Ибрагимов Д.Э., Зумратов А.Х. /Мат. рес. научн. практической конф. «Современные проблемы химии, химической технологии и металлургии». - Душанбе: Изд. Сектор, 2009, с. 99-100.

14. Ибрагимов Д.Э. Физико-химические константы масла семян лопуха. Молодые, ученые и современная наука (сборник научных трудов). -Душанбе. 2001, с 33-37.

15. Ковба Л.М. Рентгенография в неорганической химии. МГУ, М., 1991.

16. Кретович В.JI. Биохимия растений. М.: «Высшая школа», 1980, 445 с.

17. Л.Н.Харченко. -Сб. науч. работ. Краснодар: ВНИИМК, 1973, с. 16-31.

18. Луковникова Г.А., Рогожник Ф.А. Сборник научных трудов. - Л.: Изд.ЛГУ, 1982, с 29-30.

19. М.Д.Алания, Э.П.Келертелидзе, Н.Ф.Комиссаренко. Флаваноиды некоторых видов Astragalus флоры Грузии, Мецниереба, Тблиси. 2002, 152 с.

20. М.И.Горяев, И.А.Евдаков. Справочник по газожидкостной хроматографии органических кислот. АН КазССР, Алма-Аты, 1977, с 550.

21. М.И.Горяев. Эфирные масла флоры СССР. -М.: Из-во АН КазССР. -Алма-Ата, 1952, 380 с.

22. М.Кейтс. Техника липодологии. М.: Мир, 1975. 264 с.

23. М.М.Гаразд, Я.Л.Гаразд, В.П.Хиля. Неофлавоны 2. Методы синтеза и модификации 4-арилкумарин. -Химия природных соединений. Ташкент №3. 2005, с 199-219.

24. М.М.Горяев, И.Плива. Методы исследования эфирных масел. -Алма-Ата, 1962, 532 с.

25. М.Н.Запрометов. Основы биохимии фенольных соединений. М.: «Высшая школа». 1974, 213 с.

26. Мовсумов И.С., Гараев Э.А. Флаваноиды Limoniummeyeri. -Химия природных соединений. Ташкент №3. 2005, с 281-284.

27. Н.И.Шарапов. Химизм растений и климат. Изд-во АН СССР. М.-Л., 1954, 205 с.

28. Н.Т.Ульченко, З.А.Хушбактова, И.П.Беккер, Е.Н.Кидисюк и др. Липиды цветков и листьев Artemisia Annua и их биологическая активность. Химия природных соединений. - Ташкент. № 3, 2005. с. 226-229.

29. Н.Ф.Розов, В.А.Каюкова Изв. ТСХА. 1973. №1. с 218-222.

30. Патент Российской Федерации № 2133767.

31. Полевой В.В., Максимова Г.Б. Методы биохимического анализа растений.- Л.: Из-во ЛГУ. 1978, 192 с.

32. Практические работы по физической химии: Учебное пособие для вузов/Под ред. К.П.Мищенко и др. 5-е изд., перераб. - СПб, изд-во «Профессия», 2002 - 384 с.

33. Р.А.Музычкина. Реакции и реактивы для химического анализа некоторых групп БАВ в лекарственном растительном сырье. Алматы, 2002. 32 с.

34. Растительные ресурсы СССР, семейства Magnoliaceae Limoniaceae, -Л., 1985, с. 293.

35. Растительные ресурсы. Цветковые растения, их химический состав. -Л.: «Наука», 1986, с 264.

36. Репицкая И.Б. и др. Избранные методы синтеза органических соединений. - Новосибирск: «Новосибирский университет», 2000, 284 с.

37. Руководство по методам исследования технохимическому контролю и учету производства в масложировой промышленности. Л.: ВНИИЖ. 1967, - Т. 1, кн. 1, с 284-285.

38. Руководство по методам исследования, техно-химическому контролю и учету производства в масложировой промышленности, 1, кн. 2. Л.: 1967, 827 с.

39. Садыков Ю.Дж. и др. Состав эфирного масла плодов зиры -Buniumpersicum (Boiss.) B.Fedtsch.,HAH, 1978, Т. XXI, № 5. с. 33-36.

40. Самородова Бианки Г.Б., С.А.Стрельцина. Исследования биологически активных веществ плодов: Методические указания. - Л.: ВИР. 1979, 84 с.

41. Снегерева И.А. Современные методы исследования качества пищевых продуктов. -М., 1976, с. 47-103.

42. T.B. Черненко, Ф.Ю.Газизов, А.И.Глушенкова, А.М.Нигмагуллоев. Липиды листьев и клубней EminiumLehmanii. Химия природных соединений. - Ташкент.: АНРУ № 2, 2005 с 115-117.

43. Т.В.Ганенко, Е.А.Хамидулина, С.А.Медведева. Химическое изучение шишек Pinns sylvestris. -Химия природных соединений. Ташкент. 2006, с. 493-494.

44. Тютюмников. Химия жиров. М.: «Наука», 1958, с. 204.

45. Умбетова К., IgbalChoudhary М.и др. Тритерпеноиды растений рода Tamarix. -Хим. прир. соед. Ташкент №3. 2006, с 271-274.

46. Флора Таджикской ССР. Т.VII, Л.: Наука, 1984, с. 95.

47. Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. Иностранная литература. Москва. 1962, с 550.

48. Христова Ю.П. Изменчивость содержания и компонентного 'состава эфирного масла OcimumbasilicumL. // Бюл.Никит.ботан.сада. 2008. Вып. 97. с. 75-79.

49. Шарапов А.Е. Масличные растения маслообразовательных процессов. -Л.: Из-во АН СССР, 1968, 580 с.

50. Э.Преч, Ф.Бюльманн, К. Аффольтер. Определение строения органических соединений. М. Мир; Бином. Лаборатория знаний. 2009, 438 с.

51. Э.Преч, Ф.Бюльманн, К. Аффольтер. Определение строения органических соединений. М. Мир; Бином. Лаборатория знаний. 2009, с. 424.

52. Э.Шеллард. Количественная хроматография на бумаге и в тонком слое. -М.: Наука. 1971, с 85.

53. Ю.Р.Скорикова, Э.А.Шафтан. /Тр. 3-го Всемирного семинара по биологически активным веществам плодов и ягод. Свердловск. 1968, с 451-460.

54. В.Sever. Investigation of deterpenoid and flavonoid contens of Ballota species growing in Turkey, PhD Thesis, Ankara, 2002.

55. Fragner J. Vitaminy, Jejich chemie a biochemie. N.C.A.V., Praga, 1961.

56. J.P.Teresa, J.G.Urones, A.Fernandez, M.D.V.Alvarez. Phytochem., 23, № 2, 1984, c. 461.

57. JenningsW., Shibamoto T. Qualitative analysis of flavor and fragrance volatites by glass capillary gas chromatography//N.Y.: Academie Press. 1980, 240 p.

58. John Wilry and Sons. Biochemical applications of mass spectrometry. -New-York. 1980, 1150 p.

59. K.P.Markhan. Techniques of flavanoid «identification. London. Academic press. 1982, p 113.

60. Nybon M.Frudit saft. -Industrie. 1963, -Vol. 4. p 205.

61. O.S.Citoglu, T.Coban, B.Sever, M.Iscan, J. Ethnopharmacol.,92,275 (2004).

62. P.Comez Serranillos, O.M.Palomino, A.I.Villarrubia. M.A.Gasses, E.Garreteo, A.Villar. J. Chromatogr. A, 778, 421 (1997).

63. T.Y.Mabry, K.R.Markham, M.B.Thomas. The systematic identification of Flavonoids. Acad-Press. New-York. 1970, 354 p.

64. Y.Ahirateki, I/Yokoe, M.Noguchi, T/Tomimori, M.Komatsu. Chem. Pharm. Bull, 36, 2220(1988).

65. Y.Miyaichi, Y.Imoto, T.Tomimori, C.Lin. Pharm. Bull, 35, 3720 (1987).