Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез фермента фитазы грибом Aspergillus niger

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вардоян, Гаянэ Сашиковна, Санкт-Петербург



Санкт-Петербургский государственный. Технологический институт

(Технический университет)

На правах рукописи

'qJ"

ВАРДОЯН ГАЯНЭ САШИКОВНА Биосинтез фермента фитазы грибом Aspergillus niger

03.00.23 - биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д-р техн.наук, проф. В.И.Яковлев

Санкт-Петербург 1999'

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................5

Глава 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР....,.,...,.......................................................7

1.1 .Фитаты: распространение и пищевое значение..................................7

1.2. Фитазы - ферменты, дефосфорилируюише фитаты.........................12

1.2.1 .Фитазы растений......................................................................13

1.2.2.Микроорганизмы - продуценты фитаз...................................14

1.2.3.Характеристика микробных фитаз..........................................16

1.3.Области применения грибных фитаз..................................................20

1.3.1.Фитазы как кормовые добавки.................................................2!

1.3.2. Дефосфорилирование фдаЗт^шщевьгх

продуктов микробными фйтаз'&Мй............................................23

1.4. Техно логические аспекты биосинтеза микробных

фитаз....................................................................................................28

1.4.1.Поверхностная и глубинная ферментация

продуцентов. Источники углерода и азота............................28

1.4.2.Влияние источника фосфора в среде на синтез фитаз...........30

1.4.3.Влияние некоторых параметров ферментации

на синтез фитазы.....................................................................33

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................35 •

2.1.Выявление микроорганизмов, гидролизующих фитин.....................35

2.2.Продуцент фитазы, методы и условия культивирования..................36

2.3.Определение активности фосфатаз.............;......................................37

2.3.1.Определение активности кислой фосфатазы

по фенолфталеинфосфату.....................................................37

2.3.2.Определение активности кислой фосфатазы

по р-нитрофенилфосфату...................................................... 3 8

2.3.3.Определение активности кислой фосфатазы по

Р -глицерофосфату...............................................................39

2.3.4.Определение активности фитазы.,......................................40

2.4.Оптимизация состава питательной среды.........................................41

2.4,1 .Полный факторный эксперимент........................................42

2,4.2.Метод Брандона...................................................................43

2.5.Концентрирование фермента фитазы................................................44

2.5.1 .Ультрафильтрация...............................................................44

2.5.2. Вакуум-выпаривание............................................................44

2.6.Дефосфорил ирование фитатов соевой муки фитазой.......................46

2.6.1 .Определение содержания фитатов в соевых продуктах.....46

2.6.2.Количественное определение фитатов в растворе..............46

2.6.3.Ферментативный гидролиз соевых фитатов.......................48

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................49

3.1 .Скрининг продуцента фитазы из музейных культур.......................49

3.2.Синтез фермента фитазы культурой Aspergillus niger.....................57

3.3.Влияние условий культивирования на синтез фитазы....................60

3.3.1.Влияние аэрации..................................................................61

3.3.2.Влияние значения рН питательной среды

на биосинтез фитазы............................................................63

3.3.3. Сезонные изменения............................................................66

3.4.Влияние компонентов питательной среды на синез фитазы........68

3.4.1 .Построение математической модели

биосинтеза фитазы........................................................68

3.4.2.Влияние концентрации сахарозы на биосинтез фитазы.....73

3.4.3.Использование мелассы для выращивания

продуцента фитазы..............................................................76

3.4.4.Влияние источника азота на активность фитазы................79

3.4.5.Синтез фитазы в условиях промышленного

производства лимонной кислоты.......................................80

3.5.Изучение регуляции синтеза фитазы.................................................82

3.5.1. Влияние фита га питательной среды на биосинтез фитазы.... 82

3.5.2.Влияние продуктов ферментативного гидролиза

фитина на синтез внеклеточной фитазы...................................83

3.6.Концентрирование фитазы культуральной жидкости.......................88

3.6.1. Ультрафильтрация....................................................................88

3.6.2.Вакуум-выпаривани е................................................................94

3.7.Изучение свойств фитазы...................................................................97

3.8.Использование фитазы для дефосфорилирования

({штатов соевой муки.........................................................................108

ВЫВОДЫ............................................................................................................114

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................................115

ВВЕДЕНИЕ

Одним из перспективных направлений биотехнологии является технология получения ферментных препаратов. Ферменты, как биологически активные вещества, широко используются в различных отраслях народного хозяйства. Основным источником ферментов являются микроорганизмы.

Разработка технологии получения гидролитического фермента фитазы началась только в последние годы в связи с широкой перспективой его практического использования. Под действием фитазы происходит дефосфорилирование фитиновой кислоты. Это соединение чрезвычайно широко распространено в природе и, особенно, в растениях. Фитаты -основная форма фосфорного запаса семян. Содержание фитиновой кислоты в семенах злаковых и бобовых культур составляет 0,5 - 5,0% от сухого веса. Присутствуя в пищевых продуктах из растительных семян, фитаты могут оказывать негативное влияние на некоторые процессы жизнедеятельности человека. Поэтому, актуальным является применение ферментов фитаз для удаления фитатов из растительных пищевых продуктов, особенно из продуктов на основе сои.

В начале 90-х годов в Европе две фирмы начали выпуск фермента фитазы, как кормовой добавки. Голландская фирма BASF предлагает на рынке препарат «Натуфос», а финская AI ко Ltd. Biotechnology - препарат «Финаза». Продуцентами в обоих случаях являются грибы рода Aspergillus. В России работы по получению и применению этого фермента не ведутся. Поэтому исследования в данном направлении актуальны.

Цель работы. В свете выше сказанного была поставлена цель настоящей работы: получить отечественный препарат фитазы путем микробиологического синтеза.

Научная новизна. Проведенный многоэтапный скрининг среди музейных культур эукариотных и прокариотных микроорганизмов по их фитатмобилизующей активности и способности синтезировать фитазу позволил выявить продуцент этого фермента - микромицет Aspergillus niger.

Исследованы условия биосинтеза экстрацеллюлярного фермента фи газы грибом A. niger на малокомпонентной питательной среде, содержащей универсальные источники углерода и азота.

Изучена регуляция синтеза фи т азы и показано, что продукт ферментативного гидролиза фитата - неорганический фосфат является репрессором биосинтеза фермента. При использовании подобранной питательной среды и условий культивирования продуцент синтезирует фитазу, которая по активности не уступает зарубежным аналогам.

Показано, что добавление хлорида кальция обеспечивает практически полное сохранение активности при концентрировании культуральной жидкости методом вакуум-выпаривания.

Практическая значимость. Разработан способ биосинтеза фитазы грибом A. niger на оптимизированной среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу (мелассу), источника азота - нитрат аммония. Показано, что с практической точки зрения получение фитазы можно совместить с промышленным биосинтезом лимонной кислоты, продуцент которой синтезирует не только кислоту, но и фермент.

Полученная фитаза A. niger обладает высокой фитатгидролизующей активностью, что позволяет при получении соевых белковых концентратов совместить процесс обогащения соевого белка с гидролизом антипитательных компонентов - фитатов. В оптимальных условиях возможно полное и быстрое удаление фитатов из соевых продуктов.

Глава I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Фитаты: распространение и пищевое значение.

Фитиновая кислота (фитат) представляет собой гексафосфорный эфир шестиатомного циклического спирта мио-инозита (ТР6). Ее систематическое название - 1,2,3,4,5,б-гексакис(дигидрофосфат) [1]. По современным представлениям, фитиновая кислота имеет структуру, представленную на рис.1 [2].

Соли фитиновой кислоты носят название "фитаты", а для обозначения кальций-магниевой соли используется термин "фитин".

Фитиновая кислота является чрезвычайно широко распространенным природным соединением. Она обнаруживается во всех семенах растений. Как правило, фитиновая кислота встречается в виде солей моно- и дивалентных металлов или комплексов с белками и выполняет функцию фосфорного запаса семян [3].

С тех пор, как в 1879 г. фитиновая кислота была впервые экстрагирована из семян горчицы, это соединение вызывает широкий интерес, особенно, в пищевой химии. Причиной этого, в первую очередь, является наличие фитатов в семенах злаковых и бобовых культур, которые

Структура и конфигурация фитиновой кислоты

0-R

Н н /

R: -РО3Н2

Рис. 1

составляют основу пищевого рациона человека и животных. Количественное содержание фитиновой кислоты варьируется не только от культуры к культуре, но зависит также от сорта и условий выращивания. Некоторые данные, иллюстрирующие распространение фитата, представлены в табл.1.

Таблица 1.

Содержание фитиновой кислоты в семенах некоторых растений и продуктах

из них.

Культура Содержание фитата, % от сухого веса Источник данных

пшеница отруби 0,62-1,35 [4,5]

4,59-5,52 [4]

рис 0,89 [4]

соя мука. хлопья изолят 1,00-1,47 Г6,7]

1.42 [4]

1.52 |4]

1.52 [4]

овес 0,84-1.01 [8,9]

кукуруза 1,03-1,35 [10]

рапсовая мука 3,00-5,00 [11.12]

кунжут 1,44 [10]

В литературе отмечается, что наиболее богаты фитатами злаки, орехи и бобы. Следовые количества инозитолгексафосфата обнаружены в картофеле, моркови, капусте. Салат, лук, сельдерей, некоторые фрукты (яблоки, бананы, цитрусовые) не содержат фитата. В то же время, в черной смородине и клубнике фитиновая кислота присутствует в следовых количествах [3,4]. Таким образом, перечень продуктов, в составе которых фитиновая кислота попадает в пищу человека и в корма животных, очень широк. Поэтому и география исследований, касающихся содержания фитатов непосредственно в пищевом рационе людей, крайне разнообразна: США и Мексика [3,13],

Швеция и Финляндия [9/14], Малайзия и Пакистан [15,16], Африка [17,18], Новая Зеландия [19].

Основная проблема, связанная с фи гагами продуктов питания, состоит

в следующем. .Шесть реащионноспособных фосфатных групп в молекуле 1Р6 являются сильным хелатирующим фактором для таких элементов, как Са2+, Mg:t, Fe2+, Zn2+. В условиях рН пищеварительного тракта формируются нерастворимые металлфитатные комплексы, которые делают металлы недоступными для всасывания в кишечном тракте человека и животных [20,21].

Erdman в своей работе показал, что наиболее сильно фитиновая кислота снижает био доступность цинка [22]. Davies и Olpin подтвердили этот вывод. В опытах in vitro при изменении молярного соотношения фитат:2п в диапазоне от 0:1 до 45:1 авторами было установлено, что уже при соотношении 5:1 более 85% цинка переходило в нерастворимую форму при значении рН=6,5. В аналогичных условиях влияние фитата на растворимость цинка было сильнее, чем на медь и марганец [23].

Особое внимание на комплексообразующую способность фитатов обращено по отношению к соевым продуктам, так как их использование в питании очень распространено. Forbes и Parker продемонстрировали на крысах, что цинк, добавленный в корм на основе цельной жирной соевой муки, потреблялся значительно меньше, чем цинк, добавленный в корм из яичного белка [24]. Среднедневной привес и концентрация цинка в плазме у крыс, потребляющих соевый корм (содержание фитата 4.23 г/кг), были в два раза меньше, чем у крыс, потребляющих яичный белок (фитат отсутствует) [25,26].

Биодоступность цинка становится еще меньше, если одновременно с фитатом присутствуют ионы Са2"1" Причина этого - явление синергизма.

Кальций усиливает также образование фитат-магниевого комплекса [4]. Связывание же самого кальция фитатом злаковых семян рассматривается как одна из возможных причин рахита [27]. На примере цыплят было показано, что когда в корме фитат отсутствовал, необходимое для нормального развития количество кальция составляло 0,5%. Однако, когда корм содержал 1,25% фитата, необходимое количество кальция возрастало до 0,95% [4]. Sandberg и др. также показали, что образование нерастворимого фитат-кальциевого комплекса является помехой для абсорбции этого минерала в кишечном тракте свиней [28].

Фитиновая кислота влияет также на биодоступность железа. Установлено, например, что содержащийся в продуктах из овса фитат способен связывать негеминовое железо. В результате может быть сильно нарушен и без того критический баланс железа в организме некоторых групп людей, особенно детей, подростков и женщин [29-32]. Образование плохо растворимого фитата железа лежит в основе некоторых методов количественного определения содержания фитиновой кислоты [33,34],

Отсутствие фитата в диете способствовало в организме человека повышению абсорбции марганца в 2,3 раза по сравнению с фитатсодержащим рационом [35].

фитат образует комплексы с некоторыми белками, делая их устойчивыми к протеолизу. При изучении перевариваемое™ белков in vitro использовались следующие объекты; горох, цельная мука, белковые изоляты и концентраты, лактальбумин, казеин и сывороточный альбумин. Во всех случаях после инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре отмечалось негативное влияние добавок фитиновой кислоты (до 10 г) на перев ари в ае мост ь белков (содержание N= 10 мг) [36].

Установлено, что фитат, попадающий в организм человека в составе злаков и бобов, оказывает влияние на. метаболизм крахмала. Содержание глюкозы в крови людей, потребляющих фитатсодержащие продукты, по некоторым наблюдениям, ниже, чем в случае с теми же продуктами после удаления из них фитата [37,38], Исследователи постулировали, что фитат, связывая ионы Са, ингибирует тем самым действие амилазы. Для последней Са" является необходимым кофактором. Гидролиз in vitro пшеничного или бобового крахмала, инкубированного с человеческой слюной как источником амилазы, замедлялся, когда вводили в среду фитат Na, и вновь

'*) 4-

восстанавливался при добавлении ионов С а [37-39]. Фитиновая кислота оказывает ингибирующее действие на такие ферменты как пепсин [40] и трипсин [41].

Таким образОхМ, результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что фитиновая кислота является антипитательным фактором, В связи с этим особую важность имеет разработка методов удаления фитатов из пищевого сырья. Многие исследования в этом направлении посвящены соевым продуктам. Как известно, соя служит источником растительного белка, В промышленности для извлечения белков из соевых бобов используется принцип изоэлектрической преципитации [6], Существует два вида технологий. Во-первых, технология получения соевых белковых изолятов, В этом процессе проводят экстракцию белков из предварительно обезжиренной соевой муки при рН=10. В щелочных условиях белки переходят в раствор. После отделения нерастворимой твердой фазы, кислотность среды доводят до изоэлектрической точки белков (pH=4,2-4s6). Белки выпадают в осадок. Получаемый таким образом продукт называется соевым изолятом. По другой технологии проводится вымывание балластных веществ из соевой муки непосредственно в условиях изоэлектрической точки

белков. При этом в раствор переходят примеси. Получаемый продукт носит название соевого концентрата. Ни в одном, ни в другом случае удалить фитаты не удается. Причина этого состоит в том, что в сое фитиновая кислота образует комплексы с белками [4,6,10]. Кроме того, сами по себе фитаты мало растворимы в условиях изоэлектрической точки соевых белков 110]. Поэтому, повышение содержания белка в конечном продукте по сравнению с сырыми соевыми бобами сопровождается ростом концентрации фитата.

Г)а\че8 и 1^1(1 проанализировали содержание фитата в 19 заменителях мяса, полученных из соевых концентратов и изолятов. Если в необработанных соевых бобах концентрация фитата составила 12.1 г/кг, то в мясных заменителях она увеличилась до 15,5-17.2 г/кг. Приготовление такого "соевого мяса" в соответствии с рецептами, предлагаемыми фирмами изготовителями, не оказало влияния на содержание фитата [25].

Фитаты устойчивы при нагревании. Так, для полного разрушения фитатов соевого июля га требовалось автоклавирование в течение 4 часов при 115°С. В пищевой технологии такой способ удаления фитиновой кислоты неприемлем, поскольку сопровождается деструкцией аминокислот [4]. Избежать качественных и количественных потерь белка позволяет применение диализа и ультрафильтрации [4,11], ионного обмена [42,43]. Упомянутые методы обладали высокой эффективностью в лабораторных условиях, однако не имели практического значения для промышленности. Одним из наиболее перспективных методов уменьшения содержания фитатов в растительных продуктах является гидролиз с пом�