Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез алкногольоксидазы дрожжами Candida Boidinii

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез алкногольоксидазы дрожжами Candida Boidinii"

ЛЕНШГРАДШЙ ОГДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОДНЩ И ОРДЕНА

трудового кисного- знамени тшолошесий иштшт

имени ЛЕНСОВЕТА

РВСИПТЕЗ АЖС ЛШШЩЗЫ • ДГОННШ1

саымра ьошыи

03.00.23 - бнотехнологая

Алорофора?

дкосоргсодп о сонгкаага учгаой сгепенп* яандядега тохшпесгах шуа.

Сают-Петарбурр 1991

15а правах рркопгся

ЛШШЕКЙЯ

-у

Работа зыполнана на кафедре, технология микробиологического синтеза Лвншградского технологического института имени Ленсовета. -

Научный руководит ельг доктор технических наук,

профессор СШГЕВИ Валентина Иваконю

Научный консультант: •

кандвдат химических к,

старапй научный сотрудник РОДИОНОВ Врий Владимирович

Официальные оппонеиш: 1 доктор лологичвских наук ЯКОЕЯЕМ Елена Павловна ..

кавдвдат тохначоскнх наук ЖЗИЦКАЯ Татьяна Борзоовна.

; Ведааде предприятие: Ленинградский НОИ Гидролиз.. _

Защита состоится '¿ОЙЪ 1991 г. д-/<9- .часов

аудигогаш на заоздашн сиецкалсзированного совета Д 063.25.09 ири Ленинградском ТсШГОЛогечоскоы институте имени Ленсовета. .

О диссертацией мояно ознакомиться в библиотека института. ' •

Замечания и отзывы по работе, 8оперенные гербовой печати. в одном экземпляре, нросны направлять по адрссу: 1960ГЗ, Санкт-Петербург, Загородный пр., 49, ЛТП швкк Деп-совота, Ученый совет. тУ у • '

Автореферат раэоолад ОеЯ&пЛ/ 19Э1 г.

'" УЧЕНЫЙ СШЕШЬ л специализированного совета, кандидат бнологкеешх наук

Л. С. Алш;сацг;роЕа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия интенсивно исследуются различные аспекты метаболизма метилотроф- " ных микроорганизмов. Эта группа организмов, стоящая меаду автотрофами и гетэротрофаг.ш, привлекает внимание в связи о перспективностью их использования в качестве продуттентов .: ,формальдегиде. метплкетонов, дг^кскацетола, ОАД, ка-' талазн, алкогольокендазы и др. /Подгорский, 1982/.'

Алкогольоксэдаза (алкоголь: кислород оксидорецуктаза; Ш 1.1.3.13) является шшче?им формектогд метаболизма меха-нолокисляюдих дрожжей я может быть использована при производства перегаси водорода и формальдегида /ТЬп1 1983, Тап1 , 1984/, моющих и отбеливающих средств /Моос/-а/, 1986/, а также в аналитических целях для опредоло-шот содер?л.ля первичных спиртов в различных жидкостях.

Производство алкогольокевдазы в нааей страна пока ив организовано и находится ка стадия разработок. В связи о этим исследования, проводимы? с цальо поиска способов направленной регуляции и интенсификации синтеза алкогольок-садазы являются актуальными.

Работа выполнена в соответствии .о постановдением СМ СССР Л 807 ст 26.Ud.85 "О дальнейшей развитии новых направлений в биологии и биотехнологии".

Цель и задачи работыг Основной целью данной работы являлась разработка способа шггенсификацш процесса биосинтеза алкогольокендазы. Исследования проводили по треи основным направлениям - поиску активного продуцента, оптимизации условий его культивирования и стабилизации активности ферментного препарата.

В работе были поставлены следующие задачг:

- отобрать активный продуцент алкогольокендазы;

- оптимизировать состав питательной среда и условия культивирования продуцента, обеспечивающие высокий выход алкогольоксЕдазн;

- определить условия, при которых происходит стабилизация г-стивности алкогольокедцазы;

- разработать методику анализа первичных спиртов о поыодьэ алкогодьоксидазц.

Научная новизяч, Выделен и вдентифацирован новый штамм ¿втидот|-офш>те дрожкей - продуцент? аякогодьоксадазы Candi' ¿a íoidin'd КЗ.

, Показано, что ошдааяьнне значения уровней рН среды -для процесса роста продуцента и синтеза фермента различны^ при этом процесс синтеза фермента более ■чувствителен к зто- : му фактору, чем рост ¿.иомассы.

Выявлена ранее неизвесная зависимость физиологической , активности меткдотрофных дрожжей Candiólo Soidiríi j£3 от окисли". ино-восстаноЕИтельного уровня среды и интенсивно- , сте аэрации в широком диапазоне значений этих факторов.

Установлено, что фактором, ограшчяващим продешш-тельность процесса культивирования ? периодических условиях с подпиткой Во метанолу, ямяетоя определенная концентрация биомассы продг'Цвнга, при достижении которой процес- -сы биосинтеза прекращаются.

Практическая значимость. Рсзработая состав ферментационной среди, пра использовании которой выход биоиассы и активность ашсогольохсадазы продуцента увеличиваются в 1,8 раза.

Для иосладованнцх штампов метшютрофннх дрозжей обоснованы условия ведения процесса культивирования /аэрация,., уровни Eü, температура/, обеспечиваодио стабильность к 8$фектввность процесса. .

Бол^чшаса1 >з psíivi'O результаты были подтверждены па опытно-про1ша1зззой установке НПО "Биолар" г.ОлаШо.

• из бяогаосн еового штадгла дрокаей был выделен Е очп-чш препарат олкогольоксадазн, срадюяап простой способ его стабшшзацаг. Разработана штодпка фотометрического определения перютшх спиртов с поаоараэ алкогодьоксодазы и состав набора реактивов дал ого проведения.

Дпгюбастя работы, Результаты работы бшш дожжшш на научном скашара во ШКЙ ПБ г.Олг&то /19Э0 г./..

Пуг1тт-п---.ттггл. По тс.-'о диссертаций опубликовано 5 patíos.

Объем и структура работы. Диссертация изложена н&//£ страницах машинописного текста н содержит введение, обзор литературы, изложение экспериментального материала, обсуждение результатов, выводы и приложение. Работа иллюстрирована Ю рисунками и содержит 29 таблиц. Список литературы включает 119 названий.

СОДЕРЖАНИЕ) РАБОТЫ

Материала и метод» исследований. В работе проворшш способность к росту на метаноле 13 штатов дрсстеЛ, полученных из коллекции культур кафедры микробиологии МГУ им. Ломоносова. •

Культуры дрожжей хранили я поддерживали на оусло-, агаре (4° по Валлхшгу) или ьа агаризованной среде следующего состав^ (г/л) : АЛЬ(,¿-2,0; М^^-О.Об; //«¿£-1,0; К^РО^-Г.О; ?еС1з-0,005; дрозгаевой экстракт - 0,2; агар -20-22; метанол - 0,5/6; рН среды - 6,0-6,5. Эту среду использовали а в качестве» ферментационной.

Посевной материал шшцивали в колбах о ферментационной средой при температуре ¿8-30°С на качалке двое суток и вносили ото в количества 10 од.%. Ферментацию проводили двумя способами - с подпиткой метанолом в процессе роста и без его дополнитольного внесения. ;

Основные розуль^тш. полученные при культивировании в колбах, проверяли в ферментаторе объемом 20 л на НПО "Биолар".

Прирост биомассы дрожжей определяли нефелометричес-ки о последующим пересчетом на а. о.б. и ияража^л в г/л.

Определение концентрации ионов аммония в питательной среде проводили с ¡^пользованием реактива Несслвра, а фосфора - по колориметрическому методу, основанному на реакции фосфорной кислоты с иолийдагом ашония.

Содержание белка в бесклеточном экстракте оценивали по методу Брэдфорда.

Уровень и динацику изменения окислительно-восстановительного потенциала /ОШ/ среды в процессе- роста дрожжей

определяла потенциометрически с использованием гладких платиновых а каломелевого электродов.

Актклиоотъ алкогольоксвдазы, катадазы, малатдегидро-геназн, формагвдегиздегвдрогенаэы и форшатдегадрогеназы определяла е бесклеточшх экстрактах, которые получали с использованием дегинтегратора и бус ЪаНо&лс .

Активность алхогольоксвдазы (так же как и концентра- ' ци» магаиола в питательной среде) определяла с использованием дероксдцазы. Количество образующейся перекиси водорода рагиетрировали на спектрофотометре /СФ-26/ яри длине/ волны 490 нм (кювета I см). В качестве субстратов пероксн-дазы ис: зльзоваяи 8-оксихчнолин и 4-а\шяоанттшркн. Актив- . ность алкогольоксидазы выражали в ыкмоль/мин на мг белка.-

Активность катализы оценивали по методу ¡йо^реп^ат}о, 1974^ малатдегидрогенаэы /Осйоа, 1955/, форыаяьдегицде-гадрогеназы /'€, 1958/, форшатдегидрогеназы /Родионов и др.» 197?/.

Измерение интенсивности дыхания проводили по метода баланса между концентрацией кислорода в воздухе и концентрацией кислорода, растворенного в культуральной жидкости (метод разработан в ДТЙ им.Ленсовета) или с помощью киало-. родного Блоктрода Клар:«.

Оптимизаций состава шпататьной "среда проводили с использование« адамвно-решзтчахого описания /Бирюков и др., 1985/.

Математическую обработ^ результатов исследований проводили по ИйодшедДшарш и др., 1975/..

Результат в обсженля.

I. Бибор активного продуцента алкогольоксидазы.

Из исследованных 18 культур ыетялотрофнш: дровжей на порвой стадии работы били отобраны 1 культуры, обладавшие наиболее высокими скоростью роста я активностью алкогольоксвдазы. Одна из них, СапЫа/й ВысЬпи ЛК&47, в настоящее врзыя использует .ж для получения алкогольоксидазы на ННО "Биодар", другая была наделена нами из проб ила. Для определена!: возможности и целесообразности использова-

1шя выделенной культуры а качестве продуцента алкогольок-свдазы были проведены исследования по уточнению ее систематического положения.

В соответствии с признаками и согласно определителям /Кгецеъ , 1984, &atnetl , 1983/ исследуемая культура отнесена к роду Candide) еиду èciolinii . Однако, ыезду . культурами Candida êoLdinii ДК5-4У и вдентифицир,, ¿мой выявлены различия, касаюциеся размеров меток, способности использовать некоторые источники углерода, удельной активности алкоголь оксид азы, скорости роста и других физко- ч логических признаков, позволяющие иссло.чуе.'Я'ю культуру считать новым штаммом, который получи обозначение КЗ.

Результаты шранщвашя культур С. êûcdc/tii hKMY а С, èoidinii КЗ в одинаковых'условиях (состав среди, кон- -.' цент рация v -виола 0,5$ л др.) показали, что выделенная культура С. èoLdinii 23 по такш критериям, как выход био-^ массы, удельная активность алкогольоксидазы и экономический коэффициент превосходила С. SOidlnii поэтому большая часть исследований проведена с ее использованием.

2. Выбор метода дезинтеграции клеток дрожжей..

Так как алкогольоксидаза - вз1утриклеточный фермент, для определения ее активности необходимо проводить дозип-тегращго меток. Использовали как механические, так и ферментативные метода дезинтеграции клеточной массы. Степень дезинтеграции оправляли микроскопически, а такза методом Коха.

Наивысшая степень дезинтеграции меток - 90-95$ бшш получена при использовании дезинтегратора Jncm<-d tf&iiuft АВ. Несколько ниже степень дезинтеграции 65-70$ и 70-80$ была при использовании <"vc &Q?Petite в сосу/э с мешалкой и комплексного метода (обработка зимолиазой а ультразвуком) соответственно. Tait как аппарат УлСпСа/ tfùttiuit АВ постоянно использовать в исследованиях не представлялось возмо.ашм, а фермент зимолиаза пока еще не выпускается в достаточная количестве, то в качестве основного был выбран мс .'Од механического разрушения клеток при помощи

бус Ойььоит . Этот метод позволяет достигать значительной степени дезинтеграции клеток, осуществляется с необходимой скоростьэ, точность» и воспроизводимостью.

3. Оптимизация состава питательной средн.

С хдолью определения наиболее благоприятной ксвдент-• рации метанола для используемых в работе культур дрожжей, , бцди проведены эксперименты, з которых их культивирование проводили на среда*, содержащих 0,25, С,5 ц 0,75% метанола. С увеличением концентрации метанола в указанных пределах - в 1,8-2,7 раза возрастает продолжительность • процесса, поэтому для последующа этапов оптимизация ис-сл0довь_.лй предварительно была выбрана концентрация 0,5$.

При исяользсвашш смэаанных углеродных субстратов: ыеганол с глицерином и метанол с глюкозой, взятых в различных соотношениях, положительный эффект наблюдался только в случав использования в качестве углеродсодержа-щих субстратов метанола и глицерина в соотношении 3:2. При этом .выход биомассы увеличивался на 20$ и, как следствие, общая активность алкогольокендазы на 10$.

Учитывая данные результаты глицерин был включен в качества компонента питательной среда.

Для шрадквания метилотрофных дрожжей используют дрожжевой экстракт, однако этот источник ростовых факторов характеризуется шогоковдокантностью и нестандартностью по своему химическому составу, что в значительной степени может влиять на стабильность п уровень процесса • биосинтеза. При 'замена дрсстевого экстракта на шдаваду-алыше витамина - теами, биотш или' дестиобиотин происходит увеличение выхода биомассы в среднем на 10-14% в зависимости от продуцента. В значительно большей степени возрастает удельная активность алкогольокендазы: в случае СопЖ^а .Ш-47 на 47-52£, а в случае СсыЖебг

босЖни £3 на 29-32$. Однако, во всех вариантах удельная активность алкогольокендазы у отобранного шгаша С. ваЖ/Ш КЗ не менее, чем на 155? вше, чем у исходного. Для достгяания талого эффекта концентрация биотина

в среде должна быть но меньше 2 мкг/л, дестиобиотина - 25 мкг/л, тиамина - 300 мкг/л. Биотпн монет быть заменен без снижения общей и удельной активности алхогольокевдазы. на дестиобиотш, более доступный и дешевый, чем биотип.

Исследования по выбору источника азота показали, что наибольший выход биомассы и фермента наблюдался па средах с ионами см>ло,гил.

Поел еду вдую оптимизацию состава питательной среда проводили в песколько этапов с использованием аддитившь- . решетчатого описания, Критерием оптимизации был выбран уровень оиочассы, и в результате была получена питательная. • среда следующего состава (г/л): /Л^С^-З.О; Мо$ 0^-0,075; А/аС£—1,0; КН2Р04-1,5; глнцеран-3,0 мл; метанол - 5,0 «л; тиамин - 550 мкг; дестиобиотин - 50 млг.

4. От лизация -услиаий культивирования продуцентов.

Как известно, оптимум рН роста культуры и биосинтеза метаболитов на всегда совпадают. Поэтому' нами были проведены эксперименты по определению оптимальных уровней рН как.для синтеза алкогольоксадазы, так и биомассы дрожжей.

' Как показали результат ¿таблица I), оптимальными-значениями рН для роста биомассы продуцента является 6,0, а для биосинтеза алкогольоксадазы - 4,5-5,0.

В экспериментах по культивнров&чию дредасвй с использованием посешого материала взятого из саредшш экспоненциальной фазы роста и вносимого в'ферментационную сраду в различных концентрациях - 0,26, 0,51, 0,77 г/л (а.с.б.) установлено, что увеличение количества посешого от 0,26 до 0,77 г/л практически не влияет на выход биоь^сси. Аналогичные рззультаты получены для активности фермента.

Сравнительно невысокий выход биомассы, а 'следовательно н активности алкогольоксидазы обусловлен низким /0,5%/ исходным содерзанием метанола в среде, которой полностью ' потребляется уяэ через 24 ч ферментации. Однако, при остановке роста продуцента, в культуральной яидкости содержится еще значительное количество азота и фосфора - 61 и 68$ соответственно от исходных их концентраций, что свидетель-

от вдет о возможности продолжения процесса путем дополнительного внесения метанола.

Таблица I

Влияние рК на рост дрожжей и образование тл алкогольоксвдазн

Уровень рН среди

С- 6aicfi/iii КЗ

Ис- Б теУхз- Биомасса, Удельная ак- Биомасса, Удельная ход- нив фзр-г/л (а.с.б) тивкость ал- г/л активность нцй мента- когольокси- (а.с,б) адкогольок-

цг дазы, садазы,

мкмоль мкмоль

мин.мг белка

мин.мр белка

6,.О

/кон-6,0-3,0 2,15±0,05 трать/

6,С 6,0 2,40±0,06 6,0 4,5-6,0 2,15+0,04 6,0 3,5-4,0 2,05+0,05 4,5 4,5-2,8 2,00±Р,04 4,5 4,5-5,0 2,00±0,04

О,780^0,013 2,50+0,04 I,00Q±0,020

O,7I0tP.OB 1,020+0.025 0,770+0,013 0.760^0,025 0,95(^0,022

2,65+O.Oi 0,750±0,020 2,50+G,03 1,210+0,023 2,40+0,04 0,970+0,020 2,30+0,05 0,950+0,ОГ? 2,30+0,06 I,130t0,024

Как следует вз рис.1, при дополнительном внесения метанола (суммарно 5,5$) длительность процесса увеличилась до 78 ч. Остаточная концентрация фосфора в среде составила 20-27$, а азота 1'6-Г?!^ 01 Еача>1ьно внесенного в среду их количества. Танки образом, несмотря на наличие в среде метанола, фосфора и азота рост культура прекращается через 72-78 ч.

Учитывая значительно возросшую биомассу (12 г/л), можно предположить, что лимитирующим фактором в этих условиях является кислород. Культивирование дрожкей при различных уровнях аэрации показало, что как для процесса синтеза биомассы, так и для синтеза фермента необходим умеренный уровень интенсивности аэрации - около 3,0 г /л

£4> 36 46.00 Я2 & &

Рпс.1. Динамика прироста биомассы дрота ей, актив-.

ности алкогольоксидазы, потребления азота *.'

и фосфора -

I - прирост биомассы; 2 - потребление Р; 3 - потребление н ; 4 - удельная активность ажкогольонсндаэы; § -время добавления иетанода.

к

в час (таблица 2).

Таблица 2

Зависимость прироста биомассы и активности алкогодьокседазн от интенсивности аэрации среда

Сульфитноа число К-5, гО^л.ч Биомасса, г/л (а.с.б.) Активность алко-гольоксидазы, шшоль/шш на I л

Г,4 6,30+0,15 1165+50

1,8 8,70^.0,22 1614+80

3,0 . 12,10+0,34 2248+90

4,4 • 11,00+0,25 • 2049+90

7,2 9,00+0,23 1674+$0

8,6 7,96+0,30 1483+70

.9,6 7,88±|0,ЗГ . 146"+72

16,8 7,76+0,30 1436¿68

19,2 7,36+0,33 1356^50

2? 3 4,5810,20 847+40

Одьахо, эти эксперименты проводили ь неизменных условиях по аэрации от'начала до конца процесса. Возможно, что' ши'ябнрущоо действие повышенных концентраций 0£ проявляется уже на яарвшг стадиях роста культуры» что приводит к с^.кешжз выхода биомассы.

Б экснврдааьтах (таблица 3)а в которых в свеж,о питательную среду нчос.адш посевной'в количестве 12,7 г/л (а.с.б т.е. в том количество, в котором она образовывалась через 72-78 ч культивирована«,; даже при увеличении интенсивности аэрации в 5'с? раза (с 3,п до 16ПВ г02/л.ч) т&кке не набл^ далось прироста биомассы дроажвй. Эти данные позволяют предположитьа что остановка процесса через 72-78 ч не вызва на лимитацией по кислороду„

С целью разделить действие двух взаимосвязанных факторов ~ интенсивности аэрации и ОШ работу проводили по двум направлениям, по одному из которых дроааи культивировали при различных уровнях аэрации срода я, соответотвенно0 раз-

личных уровнях ОШ; по другому - продуцент культивировали при постоянном уровне аэрации; а уровень ОШ варьировали с помощью окислителей и восстановителей.

Таблица 3

Прирост биомассы дрожжей на среде с повышенным . содержанием посевного материала

Сульйитноо Посевной, число г/л (а.с.б)-К5,г0^/л.ч Выход биомассы, г/л { а.с.б.) .

24 ч 48 ч 72 ч

19,(1 12,70±.0,23 13,40+0,18 14,35+0,23 15,25+0,23

16,8 12,70+0,19 13,00+0,23 12,80+0,23 13,00+0,28

8,6 12,65^0,21 12,70+0,28 13,00+0,23 12,Я0+Р,30

4,4 12,70±С,23 13,20+0,46 13.30+0,35 13,00±р,35

3,0 12,70+0,23 13,20+0,46 13,20+0,46 13,0010,23

'1.4 22,70^0,24 I2.75t0.24 12,5010,46 12,25+0,46

Предварительно была изучена динамика изменения ОШ : ферментационной среды при выращивании дрожкей в течение " 72 ч и при различных уровнях аэрации (ряс.2). Установлено, что нрямопропорциональная зависимость моду - интенсивностью аэрации и урошом ОШ сохраняется в течение гсего процесса" ферментации. В связи с тем, что зги два фактора взаимосвязаны, для исследования действия каздого из них в отдельно-, стн проводили эксперименты по выращиванию продуцента в уо-ловиях постоянной аэрации при различиях уровнях ОШ, созда-. ваемих окислителями и восстановителями. В качестве окпсли-толей использовали КМлО^ и Кз^Рс(СЛ')^], а з качества вое--' ' стансвитвлей - Г/й^дО^, ¿,-цистеин, глутатион. ' *

Установлено, что сниаенно ОШ на 100-300 нВ прпводо* к уменьшению на 8-17^ прироста биомассы. Общая активность' алкогольокевдазы, также снижается на 3-ИЙ.

В условиях повышенного ОШ наблюдалось достоверное' увеличение прироста биомассы на 4-Щ5 и„ соответственно, общей активности алкогольокевдазы. - -

Таким обраэоа, снижение концентрации биомассы проду-

/7'--Ь—1-1-1-'_I_1 1 1 '

• £464 /0 /2 М&^&ПЯЯР Я2

2 4 6 <? & & 66

Гис.2. Динащгка изуенения уровня ОШ в процессе

культивирования дрожкей при различной интенсивности аэрацш (г02/д.ч):

а) кодбн без отбойников б) колбы с отбойниками

I - 1,4; 2 - 1,8; 3 - 3,0; 4 - 4,4; 5 - 7.2; 6 - 8,6;

7 - 9,6; 8 - 16,8; 9 - 19,2; 10 - 28,8.

цента или увеличение еэ обусловлено не уменьшением уровня С>2 в среде, а происходящим при этом изменении ОШ.

То, что эти различия закономерны, било показано в экспериментах, в которых определяли физиологическую активность продуцента при повыщешшх и пониженных уровнях ОМ. В качество показателя физиологической активности использовали интенсивность дыхания (ряс.З). Интенсивность дыхания ' в присутствии окислителя несколько снижается, а в присутст^ вии восстановителя резко возрастает (рис.3). Врзможчо, этим может быть объяснена тенденция к снижению выхода био. массы при пояснении ОШ.

Исследование зависимости роста культуры С. &о1с^(Пи КЗ от урошя аэрации и ОШ среда показало, что изменяя'''.: ОШ, можно регулировать интенсивность дыхания дрожжей и, соответственно, выход биомассы, а как следствие и общую активность алкогольоксадазы.

Таким образом, остановка процесса роста биомассы через 72 ч ферментации происходит при наличии в среда пита--тельных компонентов (источников N , Р, метанола), при отсутствии лимита по кислороду, при значениях ОШ, близких к;' оптимальным, а также при отсутствии метаболитов в среде.

Полученные результаты позволяют предположить, что в данных условиях концентрация биомассы драккей 12-14 г/л приближается к максимально возможной. Известно, что концентрация клеток даже в благоприятных условиях ограничивается максимально возможной плотностью клеток в среде, что -в значительной степени связано и с неблагоприятными воз- ' действиями межклеточных столкновений, аугорогуляторцых факторов и др. '-,■•.,

5; Расчет теоретически и практически еозиогпшх выходов биомассы п оптимизированных услошяг

При Культивировании С.боЫС/гиШ в оптимизированных условиях п с подпиткой по метанолу выход биошссы достигает 12 г/л, а удельная активность аяногояьояоддазы 1,600.1 шшоль/мин.на мг белка. Для культуры С. еыхсд биомассы составляет 7-8 т/а, а удельная активность

Л 6

4 з & /в ¿о г*

В/эвмл /<&аьтоёцос&г"С'<9,</

Рнс,3. Динамика изменения интенснвности поглощения кислорода и изменения ОБО в процессе культивирования дрожжей прз аэрации 1,00 г^/л.ч.

Интенсивность дыханий? 1-контрсль; 2-е восстановителей}

3-е окислителем. ОЕП: I1-контроль; 2'-о восстановит «л ем; д-с окислит ал еы.

г?

алкоголъоксвдазы 1,000 мкмоль/мин.на мг балка.

С целью сравнения эффективности способов культивирования дрожжей периодическим и периодическим с подпиткой метанолом были проведены расчеты теоретического и практического выходов биомассы от метанола с использованием метода Еросяна (таблица 4), •

Таблица 4

Расчетные выходы биомассы от субстрата

Способ Эмпирическая Доля Бос- Расчетный выход от культ-- формула угле- ста- субстрата,Я (г)

' вироьа.- • рода ноэ~ -■ ■ ■ .......

кия лен- теорети- практячео->

ность чвекий - кий ' био- Ч.

массы

Перио- . . • . .

дичее- „. • .

кий с сНх,714°0,492,/0,Е0 0,460 4,28 ВД1»1* 25,61(0,29)

кой ьо метанолу .

Перио- - -

дичее- - <-

киГ ,714°0,492 0,150 0,460 4»28 ЮО(1,1) 52,89(0,60)

без* * * *

подшгг— ч

КЯ ' "

При ведении процесса в оптимизированных условиях с подплткой по ыотанолу абсолютный выход бпоыасса увеллчпвэг*. отся, однако составляет лнль 26$ от теоретически возусшго-го. В тех аэ условиях, го без подпитки метанолом выход бпшассн составляет 53$ от теоретически еоз?'о:*отого. Однако пз-за низкого истода биомассы, а следовательно папло-гольокепдазы о£от способ нецелесообразно попользовать для получения фэрг-'сптного препарата.

6. ПолучоЕпз очгаценшго фер-ленгного препарата

аякогольоксцдазы Для гвдйленпя л очлетки прэгшрага алпсгольокежтази дротавй С. 5<н<ЗиО*с КЗ Сила хшбрапа цетодша, осногшшан

на сочетании ионообменной и высаливающей хроматографии.

Полученные таким образом препараты алкогольоксидазы из С. éoiéniL КЗ (с Умвлыюй активностью 4-7 мкмоль/мин ка мг белка) сопоставимы с препаратами фирмы Sienta (4~ 10 од/на мг белка).

При хранении лиофшшзированного прэпарата алкогольоксидазы при комнатной температуре происходит его инактивация - за 5 суток активность фермента снижается в 2-3 раза.

С целью повышения стабильности препарата исследовали влияние на скорость его инактивации наполнителей (сахаро- • 8Н, С"Я4)2$о4, Util ЭДТА), вносимых в препарат перед его " диофшшэацией. Положительный эффект был достигнут при вво-_ денш в раствор препарата сахарозы в концентрации 2%. " ■ Одним из наиболее важных практических применений алкогольоксидазы метилотрофных дрожжей является с: радоление концентрации первичных спиртов. Нами была паз работала ме- ■ годика определения концентрации этилового спирта с помощь» очищенное препаратов алкогольоксидазы, получаемой па биомассы дцюжаей С. Boidinii КЗ.

дая приготовления, аналитического реагента две таблетки буферной смеси растворяли в 100 ил дистиллированной вс • да» »К полученному раствору добавляли 2 иг пороксэдазы н алкогольоксидазы (удельная активность 4,5 UES/иг).

Фотометрические измерения при длине волны 490км проводит на спектрофотометре GS- 26 и фотоэлектрокодс .шетре ШЛ. ' ■ ■

Расчет' концентрации этанола производит по формуле:

с а f - ' °ст«

Е0 - оптическая плотность в кюьзте с образцом, измеренная относительно холостой пробы; оптическая плотность в кювете со стандартом; Q-- концекграцня этанола в стандартном растворе.

UT

Линейность калибровки обеспечивается при концентрации этанола в реакционной сиосн (0,8-20)•10"^.

На основании данной методики разработан набор реактивов "ЮТОЭТАНОЛ", включающий три вида реактивов - смесь ферментов, таблетировашую буферно-суботратнуи смесь, стандартный раствор этанола.

ВЫВОДЫ

1. Взделвк и идентифицирован штамм метияотрофных • дрожжей , обладающий высокой актз-шностью алкогольоксидазы - Ûkndida ùolduni КЗ. Удатьнап активность алкогольоксидазы, выделенного продуцента в 3 раза превышает актия-ность известного штамма Carsdfdq êoidieiU ДК4МУ.

2. Опимизировал состав ферментационной среды, при' использовании которой ьыход бгомасси л активность алкогольоксидазы увеличиваэтся в 1,8 раза. Показано, что в составе среды био*шг может без сшсхения эффективности процесса заменен на более дешевый и иенсо дефздийшй дестиобиотзн.

3. Для интенсифякации процесса в период активного роста продуцента необходим рЯ среды подозревать ' на у ровно 6,0-6,5, а в период синтеза алкогодьокепдазц 4,5-5,0. "

4. Оггределе'Ш оптямалышо урони осповтаг факторов, влн°тещх па рост и бпосютгоз шпсогольоксидазн у дро&жей Candide âûldùiu КЗ - температура, рН, S*'?, кощект рация посевного материала, интенсивность аэрация.

5. Установлено, что для роста п образования алкогольоксидазы для исследуемой культу m мотшютрэфшх дроляей;-CQttéda èoidùttifâ п Czrtdjefa ûcidir.ii iffèlft кообхо-:"' дни определенный п умарзнпый уровень аэрсцття,' ¿кгае и тта, которого яабладаотся сгапгоипо шстихностл процессов блссхятп. теза. . : .. '

5. Выявлена завпссдость псупегл.-'г. прогтсп'соп •- роста дрогявй з образотанио ю-ш адкогольоЕсцсмзн ог уровня оыт-сллтолько-восстаковитольпого погенщиала сродн. Пскагаяо, что повышение ОШ стимулирует синтез бгоетссн, нодавлксг процесс клеточного дыхания; еппгзпло ОШ опазясаст обратное действие - повышает икроиссшосгь даазп.а црях«аг к craisoîrra выхода биомассы.

• 20

7. Показано, что при выращивании дрожжей в периодических условиях с подпиткой по метанолу процессы биосинтеза продолжаются толь: до того периода, к которому концентрация биомассы продуцента достигает 12-14 г/л (а.с.б), т.е» критического уровня.

8. Разработана методика фотометрического определения первичных спиртов с помощью алкогольоксидазы С.ёос-оОпи КЗ и состав набора реактивов для ее проведения.

СПЖХЖ ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Люблинская Г.М. и др. Влияние аэрации и окислигельно-воссгановительного потенциала на рост метилотрофных дрожжей / Г.М.Люблинская, Ю.В.Родионов, В.И.Сухаревич;' !•',. ЛТИ км.Ленсовета., - Д., 1991. - 8 с. - Деп. в Медбио-, экономике г.Москва 19.04.91, й 555 - ыб 91.

Люблинская Г.М, а Родионов Ю.В. Рост дрожжей на мртано-ло к образование шли алкогольоксвдазц / ЛТП им.Денсов&£ та."'- I., 1591. -Ос,- Деп. в Медбноэкоцоыико г.Ыос-19.04.91» & 555 - ыб 91.

3. Хабич'ева , Люблинская Г.М. Повышение стабильности препарата алкогольоксвдазы, ьолучаемога из метилотрофных'дратаей // Проблемы хшш и технологии органичес-

. иах веществ и биотехнологии: Тез ¡.докл. 1-й научной еое£ молодых ученых /ЛТИ тДенсовета. - Л., 1991. - С.55.

4. Люблинская Г»М., Сухарзвич В.И. Оптимизация .питательной средн для ыетилотрофных дрозией // Проблемы химии н тох нологии'органических зацеств а биотехнологии: Тез.докл. 1-й научной конф. молодых.ученых / ЛТИ шЛенсовета. -

• Л., 1991. - С„56. .

5. Люблинская Г.М., Сух^екя В.И. Влияние условий культк-вирования на рост метилотро^чих дрожжей // Дроблеш хи-шш и технологий органических веществ и биотехнологии: Тсз.докд. 1-й научной конф.мододнх ученых / ЛТИ км.Лен-совета. - Л., 1991„ - С.5б-57_.

12.11.91 г. Зак,342-100, Бзсплатно РГИ ЛТИ та.ДзЕсовэ?а8УосховсхлД др. ,26