Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биомасса гриба Aspergillus oryzne 3-9-15 - источник белков, аминокислот, липидов и углеводов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биомасса гриба Aspergillus oryzne 3-9-15 - источник белков, аминокислот, липидов и углеводов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи

ГКЕШЕШШШ МАЙЯ ЯШОВНА

УДО 663.15(008.8).14.031

БИОМАССА ГРИБА АорегсШиз огугае 3-9-15 - ИСТОЧНИК БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ, ЛИ1МД0В И УГЛЕВОДОВ

03.00.04-Биохимия - 03.00.23 -Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тбилиси - 1992 г.

Работа выполнена в Институте Биохимии Растений АН Республики Грузия.

Научные руководители - Академик АН Республики Грузия, Квеситадзе Г.И., кандидат биологических наук, 1 старший научный сотрудник Берикашвили В.Ш.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Хачидзе О.Т,

доктор биологических наук, Романов В.И.

Ведущая организация - Тбилисский Государственный Университет, кафедра биоорганической химии

Защита состоится июня 1992 г. в час на заседании специализированного совета К 00.04.01 в Институте биохимии растений АН Республики Грузия (380059,Тбилиси, аллея Давида Лгмашенебели 10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии растений АН Республики Грузия.

■/3

Автореферат разослан 'мая 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, канди-

// (т^р*.

дат биологических наук // ИхЦЛЛ М.В.Бендианишвили

Актуальность Проблемы. Комплексная переработка биомассы микроорганизмов позволяет получать вещества, применение которых возможно в ряде отраслей народного хозяйства, например, в пищевой промышленности для улучшения качества и вкуса продуктов питания.

Вкусовая ценность пищевых продуктов, как известно, определяется содержанием целого ряда веществ, содержащихся в исходном сырье и образующихся при его переработке в результате происходящих биохимических процессов.

В настоящее время особое внимание заслуживает производство пищевых добавок на основе биомасс микроорганизмов. Они содержат белки,витамин«, углеводы и целый ряд вторичны.", метаболитов,зыфяк-теризуищихся биологической активностью. Использование компонентов биомассы микроорганизмов позволяет получать новые и весьма нужные виды пищевых веществ и композиций.

Производство пищевых добавок методом микробиологического синтеза берет свое начало с производства дрожжевой биомассы и продуктов ее переработки, в настоящее время для этой цели используются и микроскопические грибы, образующие широкий спектр соединений разных классов. Несоменно, большой интерес представляют грибпые биомассы, выращенные на отходах сельского хозяйства и пищевой промышленности Республики Грузия, где ежегодно их накапливается свыше 600-800 тыс. тонн.

Цель и задачи исследования. Целыэнастоящей роботы являлось -ПОДбор УСЛОВИЙ ДЛЯ КуЛЬТИВИрОВШИЯ НетОКСИЧНОГО Гриба ЛярегдШия огугав 3-9-15 на отходах сельского хозяйства и пищевой промышленности для получения биомасс с высоким содержанием сырого белка, ли-пидов и других компонентов, разработка метода комплексной переработки биомасс для выделения входящих в нее компонентов.

В связи с этим предусматривалось решение следующих задач:

- установление возможности микробиологической конверсии томатных выжимок, цитрусовой муки, отходов производства растворимого чая, обрезков вйногрэдней лозы,хукурузных кочерыжек;

- подбор состава питательной среды и условий культивирования с целью максимального выходя биомассы;

- разработка технологии комплексной переработки грибной биомассы для получения белковых препаратов, липидов, углеводов, смеси аминокислот и пептидов, нуклеиновых компонентов.

Практическое значение работы. Разработана биотехнология трансформации целлилозосодеряащих субстратов грибом Аарсг.-аИп.э

эху где 3-9-15 для получения биомасс,- содержащих 25-35^ сырого бтлха. 0-10% липвдза, 10-16/5 углеводов, & нуклеиновых кислот.

Предложен способ комплексной переработки грибной биомассы, включающий автолиз, экстракцию липидов, кислотную экстракцию биополимеров, ультрафитрацию.

Научная новизна. Показана принципиальная возможность использования грибной биомассы Авре^Шиа огугае 3-9 -15 для получения белковых,углеводных препаратов, липидов, смеси аминокислот и пептидов с использованием метода комплексной переработки.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции "Выделение, очистка и анализ биологически активных соединений"(Сухуми,1987), на республиканской конференции "Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты"(Тбилиси,1987),на второй республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйстве"(Кишинев,1991).

Дубликации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи.

Структура и объем работы . Диссертация изложена на 109 стр. машинописного текста, иллюстрирована рисунками итаблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, содержащего ¿¡Ь источника, из них ¿г Ц иностранных авторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили высушенные и измельченные цел-люлозосодержащие отходы - цитрусовая мука, томатные выжимки, отходы чайного производства, кукурузные кочерыжки, однолетние обрезки виноградной лозы. Для получения белковой биомассы использовали нетоксичный и непатогенный штамм А. огугае 3-9-15 - продуцент амилаз и целл;олаз, полученный из коллекции типовых культур микро--организмов-тгаоораторий^бйотёхнологии ИБР-йН_Республики Грузии.

Биомассу гриба получали выращиванием на целлшозосодержащих субстратах в условиях глубинного культивирования в колбах на качалке и ферментере фирмы " 11с« Вгапзу<1ск "(ЩА)(АлексидзеД984).

Общий азот определяли по Кельдалю с использованием реактива Нес-лора (Конарева,1973), растворимый белок по метбду А.пдегра|.а( ир-deEra.fi ,1969), редуцирующие сахара - по метода Шомоди -Нельсона ( аотоду1,;;е1яоц ,1952),

Определение золы проводили методом сжигания органических ве- ( г,еотв з фарфоровых тиглях в муфельной печи при температуре 600-

- 5 -

800°(0боленская и др. 1965).

Содержание нуклеиновых кислот определяли по методу Спирина (Спирин, 1958), количество растворимых углеводов определяли антронным методом (Максименко и др.1975), определение общего количества углеводов проводили фенольным методом (Максименко и др. 1575).

Содержание липидоэ определяли методом экстракции органическими растворителями (Белозерский, 1951).

В культуральной жидкости амилолитическую активность определяли по модифицированному метод/ ГОСТ СССР,202644(1975), а глюкоамилаз-ную по методу Квеситадзе (1980).

Протеолитическую активность по модифицированному методу Ансона ( Васильева и др. 1976), а целлмазнуо активность по натриевой соли карбоксиметилцеллюлоэы С Иа-КМЦ)(Родионов и др. 1960) и по фильтровальной бумаге (ФВ)( Ьаа<1в1а , йоав» , 1964).

В автолизатах аминный азот определяли по модифицированному методу Филдза (¿Че1аа ,1978). Разделение водорастворимой фракции автолизатов проводили методом ионообменной хроматографии ( Неклюдов к др. 1983). Отделение пептидной фракции проводили методом лиган-дооСменной хроматографии на в-25 в медной форме С На№епЬисЫог, 1979). Для установления длины цепи аминокислотных остатков в пептидных фракциях автолизатов проводили кислотный и щелочной гидролиз в соответствии с методом Хирчз ( И1гсЬ , 1956).

В аминокислотной фракции автолизата триптофан определяли по методу, модифицированному Збарским (Белозерский-, 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ И И X ОБСУЖДЕНИЕ

I. Получение и характеристика биомассы гриба А. сгугае 3-9-15.

Наличие в клетках мицелиальных грибов ферментных систем создает возможность утилизации сложных растительных субстратов и получение биомасс» "которке могу» быть использованы в дальне&аем для получения белковмх «эолятой, липидов, полисахаридов, смесей аминокислот и ряда других физиологически активных веществ.

В качестве субстратов использовала целлалозосодерна^ке отходи: тсдатнте гилжчкм, цитрусовую -чуху, однолетние обрезки виноградной лозы, отходе чаГ.ного производства, кукурузные яочеретжи. В тзбхице 1 ирмведен хкиичйсяий состав данних субстратов.

Внсохое содержание угдлеодов а этих субстратах дг^т сеног>ж& предзалежгь, что о«а могут быть испсльзозаж; дгя кжср^;:агсг:г<«:.--ке.1 2№»зс{йка а:!кроч«Ц8тааа.

Таблица I.

Химический состав исследуемых отходов (% на а.с.ь.)

Отходи Редуци- . Целлю- Гемицел- Лигнин Сырой Лип иди Зола рующие лоза люлоза белок

вещест*-ви

Отходы чайной промышленности ?,7 18,6 9,3 18,8 9,4 3,5 4,0.

Томатные выжимки 2,6 14,8 1,7 15,7 11,0 7,4 4,3

Однолетние обрезки виноградной лозы 1,8 20,3 12,8 16,0 7,0 4,1 5,8

Цитрусовая мука 22,5 11,0 10,0 4,6 10,0 4,3 4,6

Кукурузные кочерыжки 1,2 16,0 10,6 16,3 12,0 5,1 5,0

В качестве трпнсформирующего агента был выбран нетоксичный,непатогенный мутант АэрегйШия огугае 3-9-15, который характеризуете способностью к интенсивному накоплению белка в биомассе.

Било изучено влияние температуры, рН среды, источника азота и фосфора, время культивирования гриба А. эгугае3-9-15 на целлюлозо-содержащих отходах с целью получения биомасс с высоким содержанием биополимеров.

В питательную среду вносили азот в виде разных солей в концентра ции 0,05$ по азоту: азотнокислый натрий и калий, сернокислый и хлористый аммоний. Лучшим источником азота из выше исследованных солей является азотнокислый натрий, так как приего внесении в питательную .среду наблюдается наибольшее накопление_биомассы-гри6а-

-Аг-огугае-3-9-15Т1 Оелка.

При отборе ..сточника фосфора были исследованы соли КоНРО^.КЬ^РО^, ( 1Ш4)2НЮ4, которые вносили в количестве 0,045% по фосфору. Как показали исследования, при ферментации гриба на среде, в которой источником фссфора использовалась соль фосфорнокислого калия, накаплр валось наибольшее количество биомассы и , белка.

При изучении влияния температуры на накопление биомассы и белка в неЯ бшо установлено, что оптимальной температурой культивирования является 30°( Табл.2.}. ,

Таблицо 2.

Влияние температуры культивирования на накопление белка и биомассы грибом А.огугае 3-9-15, выращенной на цитрусовой муке

Т е м п е р а т Ура, С0

X 20 25 30 35 40 45

Выход биомассы, г/100 мл 1,5 2,0 2,5 1,8 1,6 1.6

Содержание сырого белка, h 13 15 30 24 13 13

Для подбора оптимальной рН среды были исследованы значени i рН от 2,5 до 6,5 с интервалом 0,5. В процессе культивирования происходит сдвиг рН культурзльной жидкости в нейтральную область при всех исследованиях значений рН. Наибольший выход биомассы и сырого белка наблюдается при исходном рН - 4,5( таблица 3.).

Таблица 3.

Влияние рН среды на накопление белка и биомасоы . грибом A.oryzae 3-9-15, выращенной на цитрусовой муке.

V Начальное рН среды

2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5

Выход биомассы, г/100 мл 1,6 1,6 1,8 2,0 2,5 2,1 .1,8 1,6 1,6

Содержание сырого белка, "¡о 15 15 20 27 30 28 23 17 17

Для установления длительности процесса Ориентации гриба А.огу-гае 3-9-15,во время которого накапливается наибольшее количество биомассы и сырого белка, исследования проводили в течение 7 суток.

В течение первых трех суток ферментации наблюдается интенсивное накопление биомассы и сырого белка. В следующие дай культивирования выход биомассы и сирого белка уменьшается, что надо полагать вызвано лизисом клеток.

для эффективной утилизации целлюлоэосодертацих отходов и нягсгы-ния сырого белка в биомассе подобрана питательная среда сль;;у<,..'.го состава (г/л): ».ам'03 - 2, к*04-0,65, К112Р04 - 1,3 , КЛ -О,'.,

«

- 0,02, в качестве источника углерода использованы отхода: томатные выжимки - 50, цитрусовая мука -40, однолетние обрезки виноградной лозы -5, кукурузные кочерыжки - 60, отходы чайного производства - 20; установлены условия культивирования: исходное рН среды - 4,5, темпбратура - 30°, длительность культивирования -72 часа, возраст посевного материала - 14 суток. Изучен химический состав биомасс. А.огуиае 3-9-15, полученных на этих отходах (таблица 4).

Таблица 4.

Химический состав биомасс гриба А.огуаае 3-9-15,выращенных на целлюлозосодержащих субстратах, глюкозе и сахарозе

Субстраты Влага Сырой Углево- Липиды Нуклеи- Зола

% бедок ды,% % новые %

% компо-

ненты

Отходы чайного производства 5

Однолетние обрез- . ки виноградной лозы

Кукурузные кочерыжки

Цитрусовая мука

Томатные выжим' ки

Глюкоза Сахароза

35

10

12

1,5

5 21 12 12 2,0 5

5 25 12 14 2,0 6

6 30 16 16 1,6 5

4 30 14 15 1,6 5

3 34 26 14,5 1,5 4

3 32 24 12,3 1,5 4

4

Как видао из .таблицы 4 биомасса гриба А. огугие 3-9-15 характеризуется высоким содержанием биополимеров, в связи с этим ни -могут-быть-использованы-для-получения-аминокислот^псптидов^угле-водов, липидов методом комплексной переработки.Тпк ¿не было показано, что при ферментации гриба А. огуаае 3-9-15 на целлюлозосодержащих отходах уже на первые сутки культивирования в культураль-ной жидкости отмечается присутствие внеклеточных целлолаз,

-амилазы, глюкоамилазы, протеазы, наибольшая- активность которых наблюдается на третьи сутки и соответственно равна для целлюлаз по ьЕБ - 0,08 ед/мл, по КМЦ- 3,0 ед/мл,«иамилазы - 1,3,глкжоамилазц-3,3, протеазы - 2,9 ед/мл.

Установлен аминокислотный состав белке биомасс гриба Алгуяие З-С-15, выращенпй .»а цитрусовой муке, сахарозе, глюкозе (т^бли-' ца 5).

Таблица 5

Аминокислотный состав белка биомассы А. огугае 3-9-1^, выра-щенпй на цитрусовой муке, сахарозе, глюкозе

Содержание аминокислот,г/100 г белка

Аминокис- Е_лок гриба А. огугае 3-9-15

лоты цитрусовая

мука сахароза глюкоза

Л''зин 2,1 2,3 2,2

Треонин 4,2 4,4 4,3

Ви.;к:. 4,5 5,6 *,8

Метионин 2,7 3,0 3,2

Изолейцкн 6,0 6,2 6,3

Лейц'-ч 7,5 4,8 7,0

Фенилалак.ш 3,9 3,6 3,8

Гистидин 2,6 2.5 2,3

Аспа/агинопая кислота ■>,8 • 9,2 9,5

Глутаминовая кислота 15,8 15,8 15,6

Се^ин 8,0 8,2 8,2

Прол»-.н 6,2 6,8 6,6

А. г !ин 9,2 7,5 7,5

Тирозин 3.4 4,0 4,1

Тшг~офак 1.0 0,9 0,8

Глицин 1,3 4,С 4,3

Таким образом, все исследуемые нами отходы могу™'бить усполно лсябл. зованьг для полу* .ния биомасс гриба А.охугав 3-9-15, так как в процесс« ферментации в них накяп ивается сырого белка 21-35*.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что биомассы гриба А.огугае 3-9-15, выращенные на целлюлс юсодертащлх отходах могут быть использованы как белковьк. кормовые добрпки.

3 дальнейшем мы попытались исследовать возмегда-^ть комплекснс! переоаботк/, полученных оиомасс так как нрч представлялось более . целесообразным использование и: в качестве сырья для получ ния белковых кзолят'-в, липидов, углеводов, см^сеЯ аминокислот, пе..-т/",ов и других физиологически активных соединений.

Комплексуя ггреработ са биомассы гриба АврегйПлиа ог'ихв 3-9-15 Суи>"ств.уют разные способы переработки С.юмассы микроорганизмов: ьвточиз, ф рментолиз, и азные варианты экстракции. Основываясь на этих материалах, в нсча-е "ами был исслелопан иьдуцировакный ивтсиз гп'бнг'. С ;омасс, которгЧ в отличие от ее .'ественного ускоряется ПчД действием веществ - активаторов автолиз^ ( Этанол толуол, бензол, хлороформ), температуре«, механической дезинтеграцие" ( ИцЬауп ,1985).

На .основании разработанных условий автолиза для грибны: биомасс в лаборатории биотехнологии Института биохимии растений(содержа-н-е с;у..ой биомассы не бслео 50 I 'л, предварительная дезинте^раци™ л ультразвуком 44 К"ц в течеьае 5 мин,температура - 55°, индуктор -этанол в тичестве 5/а от объема, длителт чооть автолиза -23 ч ¿са) привели автолиз бпмасс гриба А. о^/аа« 3-9-15, выращенных на цитрусовой муке, томатных выжимках, сахарозе и глюкозе, содержащих сырой протеин соответственно 30,30,32 и 34%.

С результате автолиза получены две фракции: нергчтворимая и растворимая часть автолиэата

И таб; 1це 6 представлен хим1.веский гост« 1 нерастворимой части автолизата.

Таблица 6.

Химический состав нерастворимой части аколизата ¿иомасс гриба А. 3-^-15, выращенных на цитрусор^й муке, томатнгх выжимках, огугае глюкозе и сахарозе.

х сырой бе- упаво- липида нуклеиновые

лок, % ды,% % компоненты,^

Биомасса,выращен-нг ! на цитру.овой

мук»;-!-20--10-: 9 до I

Б: 1 одосса, выращенная на томатных выжчмках

Биомасса, выращенная на глюкозе

Биомасса,выращен-' ная на гчхарозе

20 Р 10 До I

17 16 8 Д- I

16 17 5,2 Яп I

Как иидгю из таСл.щы, содержание оелкв в нерастворимой час г.1 ,

автолизата на 1/3 меньше, чем в исходной _иомяссе, т.е. 30$ белка петлило в растпс им.,10 честь автолизата ь виде аминокислот и -епгидов.

Растворимую часть автолизата фракционировали последовательном пропускание»' через гидрофобный ионит карки ИА-1Р в ОН" >орме и . сильно ислый сульфо атионит КУ-2х8 в Н+ форме по методу (ич-баян 1969).

В результате очистки и разделения кп ионообменных смолах растворимых в воде продуктов автолиза выделили три фракции: аминокислоты и нижние пепг-цы, углеводы, нуклеин-зые компоненты.

В таблице 7 представлены данные этих опытов.

Таблица 7.

Состав растворимой части автолизатов биомасс 1 ряба А. огугае 3-9-15.

Ь ы х о Д п р о д у к т а, % от а.с.в.

Фракции 2 у 1 страт

томатные ВЫЖИМКИ цитрусова мука сахароза глюкоза

аминокислоты + пептиды 30 40 50 50

углуводь; 28 24 . 35 40

НуКЛеиН0В!.16 компоненты 22 23 10 Ю

Анализ аминокислотно-пеп. идаой фракции Д1/х автолизаточ показал чтг содержание свободных аминокислот достигает примерно 40?!.Б их состаэ входят "ряктически все незаменимые и заменимые еми окисле, ли А анализ денных, полученных при автолизе биом гс гриба А.огуьо« 1-9-15, выращенных на сахарозе и глюкозе показал,. чтл сумарнсс. со-дер дчие -вободаых амином ;лот составляет б0#(таблиця 8).

Во фракции ш'«1"лкис..от+петиды содержатс.. низгче пептиды и друг. : производные аминокислот, что подтверждается увеличением ня 30/ хог.-л-чест! д аминокислот после щелочного гидролиза выделенной массы.

Для установления длины пептидов их отделяли от а:.« юккслот ли-гандообменнок хроматографией на сефадексе ^ -25 в медали фщж ( Кс .-ЬеаЬисЫег ,1979).

На рис. I. представлены хроу тограммы пептидных .^ракциГчвдс-леннь:х н:: серидекое а-25 о вида медных комплексов. Как о »-у , зероматограм-лы лр|.илк элвдроэ'дния пептадшх фракций у образцов блиэч/ что спядстс-лютвует ои идентичности их мслекуляр м^с-.

Табл"ца 8.

Сост'.в аминокислотных фракций автолизами, полученных на разных субстратах

Концентрагчя аминокислот, % ст суммы

Аминокислоты цитрусовая мука томатный ВЫЖ"МКИ сахароза глюкоза

Лизин 2,3 3,3 3,3 3.4

Треонин 4,0 4.4 4,2 4.1

'^алин ■ 3,8 3,о 3,7 ? 8

Метионин 4,3 3,8 3,6 3,8

Из лейцин 5,8 5,8 5.9

Лейцин 8,9 8.* Я,8 8,8

Фенилал лин 4,9 3,7 4,3 4,6

Гистидин 4,2 3,2 з.г 3,9

лспарагпновая кислота 10,5 9,5 10,0 И,0

Глутаминовая кислота 17,2 16,4 16,8 т.6,5

Серин 7,5 7,3 7.4 7,4

11р тин * ,5 4,3 4,4 4,7

Глицин 3,7 *\5 3,8 3,6

ллан'Ч :о,2 9.6 ^.8 9,8

Тирозин 5,8 6,2 о,0

"риптоЛан 0,5 0,5 1,0 1.0

Методом гель-проникающей хроматографии (Лаюв, 1990) оыла уста-но- ин" длина пептидов, которая не превышает 350.

Методом г<—>о—жидкостной хроматограф! л была исследована угле-чодная фракция растворимой части автолизата.

Установлено, что ; .'лег днчя часть фракгчи содержит пе' тозы, а ше-но,арабинозу, ксилозу'.гексоэы - фруктозу,гл^.соэу,галактозу, "манноз^рмнозу и^несколько ной, .энтифицированных соедин. .шйСтаб-лица 9).

По данным этой таблицы можно с ;елать вывод, что в результате автолиза биомассы гриба А. ->гугае 3-9-15,выращенного на разных суютратпх, в углеводной т-асти автолизам а преобладают гексозы:^оук-тоаа,глюкоза, галактоза, манноэа и рлмноза.

Иесле/ ование ракции нуклеиновых I. лмло''гнтов. показало, что они содержат нуклеотиды, ьуклеозиды и чуклеиклвые кислоты.

Изв(. тно, что мик,.омицеты способки накай. .тать значительное ••оличестЕ лип:;дов, " эстоящ..х и- восков и углево. ородов, эфиров '

Раг.1. Характеристик; пе.'.гидов растворимой части автолизатоа,полученных ри автолизе ломасс гриба Адгугае 3-9-15.вьг^енных на разньгх субстра'. Условия опыта: иазмер чо.'^нки: 1,5x11 с».; ¿1 г ЗеГеавх 3-25 в меда--» ^осме, кано'..ли 125 мг'образца в 5 мл боратного буфера рЧ-П.эчсирова."!:« тем :ке

- и -

Taf9.

Сс„тан у: певодно* фракции автализптоп для разлччных субстратов

Количрстпо углеводе , %

Углеводы J у о с т р а '*

цитрусовая томатные сахароза глюкоза

M¿ ;а ВЫ/КИМКИ

Apa6i..,o:ja 3,3 к.6 4,5 5/'

Ксилоза 4,0 U,4 с-.2 8.4

фруктоза 7,6 7,2 10,0 8,2

Глюкоза 8,5 8,4 12,5 12,8

Галактоза 21.5 т2,4 20,и 20,0

"инь.>оа 36,3 . "27.9 35,3 зе ,з

Рамноз!* 12,8 1Я..З £.8 8,7

стопинов,стеринп, моно- и диглицеридов, триглицеридов, жирных кислот, то есть компонентов, вхгяящих в состав растительных масел. По содержанию и характеристике жирных кислот лгпиды грибов Слизки к липидам облепг-ового и подсолнечногс масе. (Морозова, 1у85).

Липилы микроорганизмов х-рактеризучтеч очень сложный состав м, п причем на долю наиболее ре :<цион: эспособных фос$ липидов приходится до Ь'ТЙ от суммарного содержат..! липидов кпточной массы.

Подобраны усле JHA экстракции липидов из нерастворимой части автолизата биомасс! гриба А.огугав 3-9-15, выраще-лой на разных убс патах.

Из клеточной массы экстракцию г.ш..доа cr./ртом проводили в два вт^па следующим образом: соотношение клеточная масса; спирт - 1:3, температура длительность экс^ракци- 30 минут.

-Пропеденч-исследования-по-определению-фракционного-составам ипи-_

дов и :«ирнок11слотного состаь...

|у!я выделения из образцов нейтральных липидов была nj )ве;,зна ТСХ в системе - петролейный эф..р: серный эфир:уксусна кислота Зо:20:1. Разделение прог.JДили на силикагелевои пластинке со стеклянной подложкой фирмы "Mr -ok /уанные приведены нь деж;итогр*мме (рис.2). ,

Идентифици^вани сле^ющие вещества стегчны - пик 3, жирны« кислоты - пи- 5, убихинон - пик В, три1лицериды-пик т1. Пик т3 со-'¡тав-иющи!! наибо-ълий проц ít по сравнению с процентным содержанием дгугих д;коь фрак., .и ,иде-г вь' "е пика 'воска . '

Рис. 2. Денситограмма лглидов биомассы гшба А.огу-гае 3-9-15.

Условия опита: 10Х I системе - петролейный эфир:

серный )фир: уьг.усная кислота -30:?0:1

гп а

» я

В

РЭ . н» Э ОИ 1 .; № X да Я -8 1 2 я о со о ^ 1 Площадь о пиков • • а. к ■ж о а ы

15 2,85 105 Л5

- - 5,84 215 »-1

0,31 56 3,8 140 - СО

0,33 61 6,52 240 ^

0,39 72 8,33 325 сл

0,42 76 8,15 300 о>

0,45 82 9,43 347

14

— - 0,35 13 4

0,63 Л5 г 04 75 ОЭ

0,68 12 2,85 105 ю

м

0,72 132 2,99 НО о

►ч

0,78 144 6,39 2"Чэ ,-1

- 2 — 1045 го

0,96 175 33,7 . 1240 ы и

- - - 3680

Я X

Ф 12

•о тз

О №

О ж '

►Э -3

«в со

. о -о

•в я

3 °

2 Н

о я

5* Я

'л Р

И Я

о к

•л я

я о

о

в »

•а я

о -в

}э Й К

О) а

в> ч

в '

да и> ы

О ф

X X

г 56 о

0 ж

1 е>

"3 я

13 <0

Я X

СК о

(а х

> 3

• 1

о -1

м г

р> а>

в -

а

. X

со о

и

О!

а £

£ п> Р

о гя 5» за к о я

Я 8 5

* § I

х; о

с

11

§1

з»

По ^ для данной сис темы выше воска 0 48 идут ^фиры и стерины ( Я} -0,90. сквален- (-1.90) углеводороды,пар.. )ины и с :еЛи-ны( Иф -0,93).Вероятнее всего пик 13 соответствует эфирам стеринов. Данш ) представлены на денсито. рамма липид^в гриба АлгугьЗ-9-ТЕ рит. 2 и в таолице 10.

Из данных таб-ицы 10 следует, что липид"ая фракция сод ргпит стерин-в 1,8убихинона -2,1%, т;иглицепид^в -6,4%, жирных кисло 9/о и больше всего эфирор сг зркнов -3°,7/5.

/уь< сравнен .я и расшифровки нейтральных лгпидов были взяты: зргостерин, убихйнон жирные кислоты, три"чицериды и воск(г'е-линый).

Проведен анализ жирнокислот! >го состава липид^з нерастворимой час.и автоли'ата, получе них из биомассы ^риба А.огугае 3-9-15, выращенной ни цитрус.зой муке. По данным таблицы II можно сделать вывод, что жирнокислотна« фракция липид 1 содержит больше всего ненасыщенных кислот.олеиновой - С^д.р-22,7$,линоленовий -С^д.^-40,6$, что в -ум.-ю составляет 63,О/ь. На дол» насыщенных кислсг. приходится 25,1%, ненасыщенных 76,0$, ::■) 1.их содержание кислот ряда поставляет 1г,2л>, а содержание кислот ^чда С|д -64,8%.

В таблице г/чедены данные о содержании жирных кислот, полу^-ченть. из липи;.гчых фракций нерастворимой част г автолиг эта биомаг :ы гриба А. огугае 3-9-15, выращенной на цитрусовой муке.томатны выжимках, глюпозе, сахарозе. Как вг.дно из таблицы с~особность гриба накапливать ж.мные кислоты не утрачивается с заменой глюкозы и сахарозы целлюлозосодержащими отходами.Количест^а олеиновой, линолевои и линоленовой кисло- во ьоех вариантах почти неизменны. Ед"нственным отличием является присутствие лауриновой и

миристиновои кислот в автолизате биомассы гриба, выращенной на цитрусовой муке.

Обезж'-ренк е клеточные массы подвергали кислотной обработке. Их "V шивала с водные раствором соляной кислс.н в соотноаении 1:5 для установления в системе рН 1,5. Систему нагревали До 70° в течение 60 мин. Затем нейтрали, эвали 10^-ым рас вором щелочи д'

4.5. После нейтрализации клеточной экстракт отделя..и от твердой массы центрифуги^оча^лег Растворимая часть предст1" "эляла биопре-п; рат химический состав котс;ого представлен з таблице 13.

Проведена гель- фильтрация на колонке с -~50(Швеция) для установления пределов молекулярных масс углеводов белк..а и остатке нукл^иновы.. компонентов. За .ем проводили овуступе^чатуь ультрафильтрацию кис этног^ экт/ракта. На первой стадии ; :стракт проп^к&гч чепе° мембра^ с ,чгчками по моле../лярноГ- 1 ссе Г'О-

Таблица II

кирнокислотный состав липидеи нерастворимой чаоти автолиаата биомассы гриба Аогуга« 3~9-15,выращенной га цитрусовой "уке

Жирна, кислота

Содержание %

Сд.д каприловая кислота

п

"9:0

С10.0 КаПрнновая кислота СП:0

^12-0 лаурино^ая кислота

с1з;°

Сг

^14-0 мкристинов. л кислота

Сх '

С15:0

^16:0

пальмитинова. кислота пальмитолеиновая кмелота

С-,

6:1 "17:0

"17:1

47:1

С^р.д стсарино ая кислс.'э

16.1

С18:1 ~С18:2 СХЬ:0

олеиновая кислота

-линолеваялислота___

линоленовая кислота

19:0 Сх

Vй*

Сх

С2С 0 аРахкдс1Новая кислота

Я20.-1

-I гадоле'.'.ковая кислота

0,1 0,1 0,2 0,3 0,8

1.4 0,6

1.5 0,4 1.2 0,6

9.7 0,8

0,7 0,8 0,5

1.6 0,2 6,3. ->,2

1.8 • 22,7

_40,6 . 071 .,5 0,5 0,3 1.0/ т,7 0,1 1,1 1,1 ' 1.1 ^.3

• Таблица 12

Содержание жирных кислот в липидаых фракциях нераствориь эй час .'и автолизата, биомассы грчба А.огуаае 3-9-15,выращенной ^а разных субстратах

Жирные »"слоты Субстрат

глю..оза цитрусовая мука ТОМаТНЛ« ВЫЖИМКИ

площадь ПИКОВд содержание площадь ПИКОВ 2 содержание площадь П,ЖОВ 3 содержание

Сл£ ^ лауриновая кислот.* - - 4,0 - -

14:0 миристино~ая кислота - 0,* 1.0

п ЧКэгаО пальмитиновая кислота 1,5 18 3 7,2 17,7 4,2 14,0

С стеариновая клолота 5,5 67.: 33,0 68,3 20,4 68,0

п ^.8:1 олеиновая кислота 1,2 14,7 6,4 13,0 5,0 18,0

51 з 8,„ ЬО 49,1 1и0 29,6 100

Таблица 13.

Химический состав клетс пых остатко- после кислот- юй экстракции

сыр й белок углеводы липчды нуклеино. ые X % от а,с.в. % от а.с. % от компоненты

в. а.с.в. % 01 а.с.в.

Цитрусова. мука 20,0 35,4 10,0 До I

Томатные ижимк». 19,2 30,3 9,Г До т

Глюкоза •20,0 40,0 10,0 Дс I

Сахароза и,5 39,2 6,0 ДО I

1000 При этом дос -икалось отделение 2/3 свободных аминокислот и 1/3 пептидов. На второй стадии были использованы мембраны с ячейками по молекулярной массз 10 ООО При этом разделении получали продукт, с-цержшций-до 70^ белка,"глеводов меньше 1<Ж, нуклеиновых компонентов --еньше 1%, золы до 4,5%, соли и аминокисло ты ( таблицы 14).

Таблица 14.

Распределение компонентов после ультрафильтрации

Фракции Белки углеводы ■ Нуклеиновые

/и % компоненты /0

Цитру овая '-ука

I. Концентрат ЮОСО ¡¡¡-1 10 80 следы

2. Концентрат 1000 ^ 70 10 ' следы

—Томатные^ыжимки

1.Конц:нтрат 10000 Дк 12 75- следы

2. Ко: ;ентрат 1000 ^ 70 15 ¿леды

Глюкоза

I. Кон:, :нтрат 10000 М 10 УО следа

2. Концентрат 1000 ¡41 30 10 следы

На основании проведенных исследований предложена схема технологии комплексной переработки биомасс гриба А. огугае 3-9-15, выращенных на целлюлозосодержащих отходах(рис.3)(Послана заявка на получение авторского свидетельства на "Способ переработки биомассы грибов).

Рис. 3. Схема технологии комплексной переработки биомассы гриба А. огугае 3-9-15, выращенной на целлюлозосодержащих отходах.

Таким образом, в результате комплексной переработки биомасс гриба можно получать следующие продукты : I -белковый продукт, 2 - углеводаыП продукт, 3 - липидный продукт, 4 - смеси аминокислот и пептидов, 5- смесь нуклеиновых компонентов, 6- смесь моноса-ров, 7- клеточные остатки, содержащие до 10% белка и 40$ углеводов.

- 22 -выводы

1. Предложена питательная среда для глубинного культивиронания гриба А. огуиае 3-9-15 следующего состава (г/л ): Каи03-12, №;304 - 0,65, КН2Р04 - 1,3, КС1 - 0,5, Уе304 -0,02 с целью максимального выхода биомассы. Источник углерода один из отходов сельского хозяйства и консервной промышленности (томатные выжимки - 50, однолетние ибр^з^и виноградной лозы - 5, кукурузные кочерыжки - 60, отходы чайного, производства - 20). Подобраны оптимальные условия культивирования: исходное рК среды -4,5, температура -30°, длительность ферментации - 72 ч.

2. Установлено, что биомасса гриба А.огугае 3-9-15, выращенная на отходах сельского хозяйства и консервной промышленности, содержит 20-35% белка,12-16% липидов, 10-16% углеводов, нук~ леиновых компонентов до

3. Автолизом биомассы гриба А. огугаэ 3-9-15, выращенной на целлюлозосодержащих отходах в течение 23 ч, содержанием биомассы не более 50 г/л, с предварительной дезинтеграцией ультразвуком (44 кГц) п течение 5 мин., при температуре 55? индуктором -этонолом 5/1!, получены две фракции: нерастворимая (клеточная масса) и растворимая ( автолизат) части. Изучен химический состав нерастворимой части автолизата, содержащий 16-21% сырого белка, 3-16% углеводов, 5-10 % липидов, нуклеиновых компонентов до 1%.

Из растворимой части автолизата методом ионообменной хроматографии выделены три фракции: I - 40% аминокислот и пептидов, 2 - 28% углеводов,3 - 23% нуклеиновых компонентов.

4. Установлено, что аминокислотно-пептидная фракция состоит на 40% из аминокислот ( идентифицировано -16, среди которых -

7 незаменимых) и на 30% из низших пептидов с молекулярной массой"окшю^50ГТглёводная_фракция_состои'г-из-пснтоз -(кси— лоза, арабиноза) и гексоз (фруктоза, глюкоза,галактоза, ман-ноэг, рамноза).

5. Подобраны условия экстракции липидов ( соотношение спирт: клеточная масса 1:3, длительность - 30 мин, температура -70° фракционирование липидоз показало, что они содержат стершя-3,8;', убихинон -2,1%, триглицериды -6,4%, э^иры стершов -33,7;«, зкирнке кислоты - 9,0%. Было установлено, что жкрнь:о

- 23 -

кислоты содержат: 76.О/о ненасыщенных, 24,1 насыщенных;

22,олеиновой кислоты Cjq.j, 40,ОЙ - линолевой. кислоты.

Cjg.g, 9,7fo - пальмитиновой кислоты Cj^.q*

6. Подобраны условия кислотной экстракции: соотношение клеточная масса: кислота 1:5, 2н HCI, рН-1,5, время -60 мин, температура - 70°, нейтрализация 10/а раствором NaOH до рН 4,5. В результате кислотной экстракции клеточной массы получены белковый продукт, содержащий 10-15$ белка, 5-1095 углеводов, до 2% липидов, следовые количества нуклеиновых компонентов; а также растворимая часть (биопрепарат) содержащий до 20% белка, до 4Qfo углеводов, до Ю/а липидов,меньше 1% нуклеиновы> компонентов.

Методом гель-фильтрации установлены пределы молекулярных масс выше перечисленных веществ: белков - 500-1000 Дн, углеводов - 15000 fin, нуклеиновых компонентов - 1000-2000

Методом дэустадийной ультрафильтрации кислотный экстракт разделен на углеводный препарат, содержащий до 80$ углеводов, 2Q& белка; белковый препарат, содержащий до 70% белка и 10% углеводов.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Аладашвили Н.В.,Гордиенко С.В. .Ткешелашвили М.Я..Берикашви ли В.Ш..Мачапнриани М.О..долидзе Д.А. Получение смеси аминокислот автолизом белковой биомассы гриба - Всесоюзная конференция "Выделение,очистка и анализ биологически активных соединений"«Сухуми, 1987,Тезисы докладоа,Сухуми,с.35.

2. Аладашвили Н.В..Ткешелашвили М.Я. .Бериказтшш В.Ш.Получение новых добавок из автолизатов грибной биомассы -Республиканская конференция "Биотрансформация вторичного растительного сырья п белковые кормовые продукты",Тбилиси,1987,Тезисы докладов,Тбилиси, с.4.

3.Ткешелаивили М.Я..Аладашвили Н.В..Берикашвили В.Ш."Автолиз биомассы гриба Aspergillus oryzae 3-9-15, выращенной на целлюле зосодержащих отходах"-Всесо»зная конференция "Химические превраще ния пищевых полимеров".Светлогорск, 1991г,Тезисы докладов,Москва,• с.56.

. - 24 -

4.Ткешелашвили М.Я..Аладашвили Н.В.»Берикашвили В.Ш. Комплексная переработка биомассы гриба АарегеШиа огувм 3-9-15, выращенной на целлюлозосодержащих отходах- II Республиканская конференция "Микробиология в сельском хозяйстве",Кикшнев,1991г,Тезкой докладов.Кишинев,с.124.

5. Аладашвили Н.В.,Ткетелашвили М.Я. .Метревел/ З.М.,Борикаа-вили В.Ш., Долидзе Д.А. Получение кормовых добавок микробиологической конверсией, отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности микромицетами - Известия АН РГ, оер.биол. ,т.1б.)Й,с.325-329,1990 г.

6. Аладашвили Н.В..Ткешелашвили М.Я., Берикашвили В.Ш.,Бабэви Т.Л.Датов В.К. .Беликов В.М. .Квеситадзе Г.И. Индуцированный автолиг биомассы гриба А.<;оггеив АТ-490, выращенной на отходах сельского хозяйства и пищевой промышленности.-Биотехнология, 1991,№1.с»

¿тг*