Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биолюминесцентные системы почвенных энхитреид (Annelida: clitellata: oligochaeta: enchytraeidae)

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биолюминесцентные системы почвенных энхитреид (Annelida: clitellata: oligochaeta: enchytraeidae)"

На правах рукописи

Родионова Наталья Сергеевна

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ПОЧВЕННЫХ ЭНХИТРЕИД (ЛММЕЫВА:СЫТЕЬЬЛТАЮЫООСНЛЕТА:ЕМСНУТЕЛЕШЛЕ)

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2004

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук В.Н.Петушков Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Е.Судачкова

кандидат биологических наук В.В.Межевикин

Ведущая организация: Красноярский государственный университет

. 2004 года в

часов

Защита состоится _

на заседании диссертационного Совета Д 003.007.01 по защитам диссертаций в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г.Красноярск, Академгородок.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан _ 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.007.01, кандидат физ.-мат. наук

Л.Г.Косолапова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Открытие и исследование новых люминесцентных систем, выяснение химической природы их структурных и регуляторных компонентов имеют большое значение: для понимания механизмов преобразования энергии химических связей в кванты света, что является одной из фундаментальных задач биофизики. В биологии такие исследования помогают полнее проследить эволюционные пути, а также приблизиться к разгадке возникновения и значения люминесценции для биохимии и этиологии живых организмов. С практической точки зрения, каждое такое открытие расширяет спектр анализируемых веществ, приводит к разработке новых методов мониторинга окружающей среды, технологических и биологических процессов.

К настоящему времени в разной степени изучены люминесцентные системы бактерий, медуз, рачков, полихет, светляков и др. Из всего класса олигохет довольно хорошо исследована только люминесценция Diplocardia longa, субтропического представителя семейства мегасколецид. Единичные наблюдения свечения энхитреид, сделанные около ста лет назад, впоследствии не получили подтверждения, и этих червей исключили из современной классификации светящихся организмов.

Цель работы - исследование биолюминесцентной системы неизвестных почвенных энхитреид, обнаруженных в Сибири. Задачи исследования:

1. Определить видовую принадлежность найденных червей.

2. Исследовать параметры биолюминесценции in vivo.

3. Установить тип и структурно-функциональную организацию люминесцентной системы энхитреид.

4. Реконструировать люминесцентную систему и определить оптимальные условия проведения реакции in vitro.

5. Исследовать. физико-химические свойства компонентов люминесцентной системы.

6. Изучить возможности использования люминесцентной системы энхитреид в аналитических целях.

Основные результаты работы и их новизна. Все результаты данной работы получены, впервые. Открыто два новых вида кольчатых червей, принадлежащих разным родам класса. олигохет, семейства энхитреид -Fridericia heliota и Henlea sp. Сделано описание их внешнего и внутреннего строения. Впервые достоверно установлен сам факт люминесценции представителей семейства Enchytraeidae. Показано, что, несмотря на таксономическую близость данных червей, локализация и параметры их люминесценции in vivo различны. В ходе исследования выявлены структурно-функциональные отличия люминесцентных систем энхитреид друг от друга и от всех известных среди олигохет. Установлено, что для

люминесцентной реакции Henlea sp. необходимы четыре компонента: люцифераза, люциферин, кальций, кислород, а люминесцентная система F. heliota включает пять компонентов: люциферазу, люциферин, АТФ, магний и кислород. Определены оптимальные значения рН, температуры, концентрации буфера, экзогенных металлов, БСА и Тритона X 100 для реакции in vitro. Изучено воздействие на люминесценцию системы F. heliota катионов двухвалентных металлов, различных анионов и алифатических соединений. Предложен экспресс-метод очистки люциферазы и люциферина F. heliota, определены их молекулярные массы. Показана возможность применения тест-системы F. heliota в аналитических целях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные новые научные результаты представляют интерес как для систематики кольчатых червей и изучения эволюционных связей между ними, так и для таксономии светящихся организмов. Они дополняют и расширяют представления о механизмах биолюминесцентных реакций, дают материал для исследования структур новых люцифераз. Тест-система F. heliota является реальным конкурентом светляковых систем и имеет свой дополнительный спектр анализируемых веществ, что приведет к созданию новых методов в аналитике.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Впервые описанные почвенные энхитреиды Fridericia heliota и Henlea sp. являются новой группой биолюминесцентных организмов.

2. Особенности структурно-функциональной организации металл-зависимых люциферин-люциферазных систем энхитреид определяют их уникальность среди известных люминесцентных систем.

3. Высокая чувствительность люциферазы F. heliota к АТФ, его аналогам и различным ионам позволяет использовать тест-систему этих энхитреид в различных областях науки и практики.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на семинарах Института биофизики СО РАН, Сибирского Технологического Университета, Института леса. СО РАН, Красноярского государственного Университета. По теме диссертации опубликовано шесть статей. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав с выводами, заключения, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, включает 47 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 132 источника, из них 112 зарубежных.

Работа выполнена в рамках темы Института биофизики СО РАН "Физико-химические механизмы функционирования биолюминесцентных систем", №01.200117940.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1, Люминесценция наземных организмов. В ней рассмотрены типы хемилюминесцентных реакций, приведен обзор литературных данных по люминесценции бактерий, червей, многоножек, насекомых. Приводится таксономия люминесцентных видов олигохет, список которых в настоящее время включает около 30 видов семейства Megascolecidae и 2-3 вида семейства Lumbricidae. Изложена история исследования люминесценции олигохет и полученные различными исследователями результаты. Более подробно приводятся данные по изучению перекись-зависимой люминесцентной системы мегасколецид Diplocardia longa, а также постулаты некоторых авторов, что все светящиеся олигохеты имеют сходные механизмы и локализацию люминесценции.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Измерение люминесценции проводили на биолюминометре конструкции Петушкова В.Н. в термостатируемой кювете с перемешиванием. Для каждого эксперимента измерения проводили не менее трех раз, ошибка составляла не более 10%.

Приготовление препаратов F. heliota. Гомогенаты F. heliota получали, растирая червей в 20мМ трис-HCl буфере, рН 8.1. Гомогенат двукратно замораживали при -80°С, центрифугировали (16000 g x 3 мин.) и супернатант использовали в работе. Для выделения люциферина F. heliota червей гомогенизировали в 1 мл 0.2% ТХУ при 0°С, центрифугировали, супернатант использовали в работе.

Приготовление препаратов Henlea sp. Гомогенаты Henlea sp. получали, растирая червей в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 7.0. Далее действовали как и в случае F. heliota. Для выделения люциферина Henlea sp. гомогенизировали в холодном ацетоне и затем центрифугировали (16000g x 3 мин).

Спектр люминесценции червей in vivo записывали на люминесцентном спектрометре "Aminco Bowman Series 2" в Красноярском Государственном Университете. Скорость 15 нм/с, шаг 2 нм, щель 8 нм, диапазон 430 - 550 нм. Суммировали 20 сканов для Henlea sp. и 35 сканов для F. heliota.

Для жидкостной хроматографии использовали стандартное оборудование фирм "LKB" и "Pharmacia" (Швеция). Чистоту белковых препаратов оценивали элетрофорезом по методу Лэммли.

Синтез люциферина Diplocardia longa проводили по методике Wampler

et al.

Глава 3. Описание новых видов светящихся энхитреид. В главе охарактеризованы места обитания светящихся энхитреид, подробно описаны видовые особенности их внешнего вида и строения внутренних органов, указана локализация люминесцентных систем.

Основные характеристики взрослой особи F. Нв1Ша: небольшие размеры (20 х 0.5 мм), число сегментов 50-58, прямые щетинки по 1-2(3) в пучке, эпидермальные железы в 4-5 рядов на каждом сегменте, трапециевидный головной мозг, пептонефридии коротковетвистые, ампулы парных семяприемников с двумя большими удлиненными дивертикулами. Образцы Fridвricia Нв1Ша как нового вида почвенных энхитреид, размещены в зоологических коллекциях музеев Рима, Стокгольма и Москвы.

Отличительные признаки Нвп1ва sp.: длина до 35 мм, число сегментов 43-65, щетинки по 2-6 в пучке, кишечник образует луковичное расширение, семяприемники в виде цилиндрических трубок, кровеносная система образует три крупных пульсирующих резервуара. Образцы энхитреид Нвп1ва sp. отправлены специалистам для подтверждения новизны вида.

Уникальной особенностью энхитреид F. Нв1Ша является то, что, в отличие от всех известных люминесцентных олигохет, эти черви имеют только стационарную локализацию люминесцентной системы: источник свечения находится в области эпидермальных железистых клеток (Рис. 1). Светящиеся точки расположены регулярно, в несколько рядов на каждом сегменте.

Для Нвп1ва sp. характерна двойственная локализации люминесценции. Эти энхитреиды в ответ на раздражение секретируют люминесцентную жидкость (Рис. 1) и имеют люминесцентные образования под кутикулой, в отличие от таковых у F. Нв1Ша, расположенные нерегулярно.

Свечение исследуемых энхитреид является собственным. Проведенная проверка на наличие светящихся бактерий в испускаемой жидкости и в самих червях (их гомогенатах) дала отрицательный результат.

Рис. 1. Люмографии энхитреид Fridвricia Нв1Ша (слева) и Нвп1ва sp. (справа).

Глава 4. Исследование люминесценции энхитреид. В главе описаны спектральные характеристики люминесценции энхитреид Fridericia heliota и Henlea sp. in vivo, проведено исследование компонентов их люминесцентных систем, а также влияния рН, температуры и других факторов на люминесценцию in vitro.

На электрическую и механическую стимуляцию, а также воздействие различных химических реагентов (кислот, щелочей,. перекиси водорода, солевых растворов) черви обоих видов отвечают резким усилением люминесценции. Свечение довольно продолжительное, интенсивность люминесцентного ответа Henlea sp. в среднем в 2-5 раз выше, чем у F. heliota.

I ВОЛНЫ, 1

Рис. 2. Спектр биолюминесценции почвенных энхитреид in vivo.

Спектр люминесценции F. heliota in vivo имеет максимум в области 478 нм, у Henlea sp. - 464 нм (Рис. 2). Это самые коротковолновые значения среди спектральных характеристик всех известных олигохет.

Определение компонентов люминесцентной системы F. heliota.

Было предпринято множество попыток получения отдельных препаратов люциферазы и люциферина из биомассы червей. Супернатант, не обладающий собственной люминесценцией, но содержащий. люциферазу, получили по описанной выше методике. При добавлении к нему в качестве возможного субстрата таких соединений, как АТФ, АДФ, АМФ, НАД(Ф)Н, НАД(Ф)+, ФМН, ФМННг, рибофлавин, алифатические альдегиды, люминол, реакции - светоизлучения не наблюдалось. Чтобы получить из гомогената препарат люциферина, для сохранения субстрата необходимо было инактивировать фермент либо высокой температурой, либо химическими реагентами. Однако ни гомогенизация червей в горячей воде (методика

s

Dubois), ни использование в качестве "стоп"-фиксаторов реакции диэтилдитиокарбамата, ЭДТА, аскорбата Na, SDS, ацетона, не привели к нужному результату. Первый раз бесклеточный препарат люциферина был получен в результате кислотной или щелочной экстракции. Он также не обладал собственной люминесценцией, но добавление его к супернатанту люцнферазы инициировало световую эмиссию с константой спада реакции 0.1-1 мин"1. Последовательные добавки свежих порций субстрата в измерительную кювету каждый раз стимулировали новые вспышки света. Так, впервые была продемонстрирована люциферин-пюциферазнаяреакция для энхитреид F. heliota. Выделенный люциферин оказался

термостабильным, выдерживал инкубацию при 100°С в течение 1 мин без потери активности. Однако при хранении в течение дня акгивность люциферина заметно снижалась даже при +4°С.

Добавление дитионита натрия (анаэробные условия) в реакционную смесь приводило к прекращению люминесценции, которая восстанавливалась при перемешивании. При добавлении Н2О2, вопреки ожидаемому, наблюдалось не стимулирование, а ингибирование биолюминесценции. Таким образом, люминесцентная система F. heliota не является перекись-зависимой, а для реакции светоизлучения необходим кислород.

При проведении биохимических исследований было показано, что активность люциферазы F. heliota подавляется добавками в реакционную смесь хелатора ионов двухвалентных металлов - ЭДТА. Ингибирующий эффект ЭДТА в разной степени компенсировался последующим добавлением в реакционную смесь различных двухвалентных ионов (Рис. 3, кривая А). При этом только ионы магния восстанавливали интенсивность светового сигнала до исходного уровня и даже повышали его в 2-3 раза (Рис. 3, кривая Б). Было сделано предположение, что ионы магния выполняют функцию специфического активатора люциферазы F. heliota. Известно, что константы связывания двухвалентных ионов с ЭДТА возрастают в ряду: Mg2+, Са2+, Sr2+, Ва2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+, Cu2+, Hg2+, то есть любой ион этого ряда может частично или полностью вытеснять Mg2+ из хелатного комплекса с ЭДТА, возвращая его в люциферазную реакцию и восстанавливая, тем самым, интенсивность люминесценции. При прямом воздействии только Mg2+ стимулировал реакцию люциферазы F. heliota с люциферином (Рис. 4, кривая Б), остальные ионы приведенного выше ряда ингибировали свечение (Рис. 4, кривая В). Таким образом, установлен четвертый компонент, необходимый для реакции светоизлучения - ион магния, выполняющий функцию активатора люциферазы F. heliota. В ходе очистки люциферазы из-за потери ферментом своего активатора ингибирующий эффект ЭДТА на фермент проявлялся все более сильно. Поэтому мы добавляли в реакционную смесь при тестировании ионы магния, тем самым увеличивая сигнал в 2-3 раза.

Время, ми

Рис. 3. Динамика люминесценции люциферин-люциферазной системы ¥. Не1Ыа в ответ на добавление ЭДТА и ионов двухвалентных металлов.

Время, мин

Рис.4. Динамика люминесценции люциферин-люциферазной системы ¥. Нв1Ша (Кривая А). Кривые Б и В -добавление ионов двухвалентных металлов.

После обнаружения активирующей роли ионов Mg2+ нам представлялось целесообразным проверить действие аденозинфосфатов на люминесцентную систему Р. кеИо1а. Общеизвестно, что они находятся в клетках, в основном, в виде комплексов и сродство

АТФ к ионам магния в 10 раз.выше, чем у АДФ. В экспериментах без добавления экзогенного магния все аденозинфосфаты ингибировали люминесцентную реакцию Не1Ша, причем эффект их действия нарастал в ряду: АМФ < АДФ < АТФ. Это объясняется хелатированием фосфатными группами ионов магния, присутствующих в препаратах и участвующих. в реакции свето излучения. Действительно, конечная концентрация добавляемых аденозинфосфатов в реакционной смеси (2.5 ЧО^М) превышает концентрацию эндогенных ионов магния более чем в 30 раз. Добавка избытка ионов магния, казалось бы, должна приводить к восстановлению люминесценции до исходного уровня. Однако в проверочном эксперименте наблюдалось не просто восстановление уровня световой эмиссии, а многократное его превышение (Рис. 5, кривая А). Повторная добавка АТФ не приводила к изменению кинетики люминесценции, что свидетельствует о насыщающей концентрации АТФ в реакционной смеси. Спад люминесценции, следовательно, обусловлен иными причинами. Значительное ингибирующее действие АДФ на люминесценцию можно объяснить двояко: либо АДФ является конкурентом АТФ в реакции, либо продуктом этой реакции.

Рис. 5. Динамика люминесценции системы F. heliota в ответ на последовательные добавки АТФ, ионов Mg2+ и АДФ.

Возможны два варианта участия АТФ в люминесцентной реакции: прямой, где АТФ является косубстратом люциферазы, и опосредованный. Например, АТФ может участвовать в синтезе люциферина из предшественника, присутствующего в препарате люциферазы. Однако в этом случае в препарате должны присутствовать как минимум еще два компонента: некий фермент со своим субстратом. Но тогда зависимость, интенсивности люминесценции от количества препарата люциферазы имела бы порядок реакции 4, чего никогда не наблюдалось. Итак, АТФ выполняет функцию косубстрата люциферазы F. heliota и является пятым компонентом, необходимым для реакции светоизлучения. Очевидно, что АТФ не может претендовать на роль основного субстрата, так как изменение стандартной свободной энергии при гидролизе его до АДФ составляет всего 7.3 ккал/моль, а для генерации кванта света необходимо обеспечить изменение свободной энергии не менее 70 ккал/моль. Кажущаяся константа Михаэлиса для АТФ при насыщающей концентрации магния в реакционной смеси (1 - 2.5 мМ) составила 90 мкМ.

В работе показана способность БСА стимулировать люциферин-люциферазную реакцию F. heliota. Наибольшая стимуляция (в 5-10 раз) наблюдается при 3 мМ Mg2+ в реакционной смеси. Оптимальная концентрация БСА в реакционной смеси 0.2 - 0.3 мг/мл. Максимальная интенсивность люминесценции в реакции in vitro наблюдается при 10 мМ концентрации используемого Трис-HCl буфера. Однако мы использовали и

20 мМ Трис, так как буферная емкость в этой точке выше, что играет важную роль при добавлении реагентов с различными рН.

Компоненты люминесцентной, системы Henlea sp. Отдельные препараты люциферазы и люциферина Henlea sp. получили, применив во втором случае ацетоновую экстракцию. Нативная масса белка, по данным гель-фильтрации, составила 72 кДа. 8Б8-электрофорез высокоочищенного препарата люциферазы показал наличие доминантной полосы в районе 36 кДа. Полученные данные позволяют предположить, что люцифераза Henlea sp. является гомодимером.

Необходимость кислорода для реакции светоизлучения было показана как на грубых препаратах Henlea sp. (гомогенат, супернатант), так и на очищенных. Перекись водорода, как и в случае F. heliota, не оказывала стимулирующего действия на люминесцентную активность высокочищенной люциферазы.

При исследовании люминесценции гомогенатов и супернатантов Henlea sp. была установлена кубическая зависимость интенсивности свечения от разведения. Это позволило предположить наличие еще, как минимум, одного эндогенного компонента, кроме фермента и субстрата, способного также лимитировать.реакцию светоизлучения. Этот компонент, названный активатором за способность стимулировать люминесценцию, оказался термостабильным соединением с молекулярной массой менее 2 кДа, сорбировался гранулами ионообменной смолы СЬе1ех 100, применяемой обычно для очистки растворов от примесей ионов двухвалентных металлов. На основании этих данных логично было предположить, что активатором реакции Неп1еа как и у F. ке1Ыа, является ион металла.

Время, мин

Рис. 6. Динамика люминесценции люциферазы Неп1еа sp. в ответ на добавление ЭДТА и ионов двухвалентных металлов.

Последовательные добавки ЭДТА в реакционную смесь приводили к ступенчатому снижению люминесценции практически до нулевого уровня (Рис. 6), а добавками катионов металлов удавалось частично восстановить люминесценцию (Кривая А). Только Mg2* не обладал этим эффектом, хотя добавка на фоне магния любого иона перечисленного ниже ряда все же приводила к повышению люминесценции (кривая Б). ЭДТА связывает ион металла в реакционной смеси, приводя к изменению равновесия холофермент - апофермент в сторону образования последнего, чем и объясняется падение интенсивности люминесценции. Экзогенная добавка ионов восстанавливает активность люциферазы за счет вытеснения эндогенного кофактора из хелатного комплекса. Проанализировав значения логарифмов констант связывания двухвалентных ионов с ЭДТА (Mg2*- 8.8 , Са2+- 10.6, Мп2+- 13.8, Со2+- 16.1, Zn2+- 16.4, Cd2+- 16.5, Ni2+- 18.5, Cu2+- 18.8, H^-21.8), мы пришли к выводу, что функцию кофактора люциферазы Henlea sp. может выполнять только ион кальция, так как именно он полностью или частично вытесняется всеми ионами, кроме магния. Данный вывод неоднократно был подтвержден результатами других экспериментов. Исследована зависимость интенсивности люминесценции от количества ионов кальция в реакционной смеси. Оптимальная концентрация Са2+ составила 2*10-3 М. Достигнутая на данный момент чувствительность к экзогенному кальцию, полученная с использованием частично очищенной люциферазы, составляет 1 мкМ. Применение высокоочищенного фермента и синтетического субстрата без примеси ионов кальция позволит многократно увеличить чувствительность системы, что, несомненно, окажется полезным для аналитических приложений. Таким образом, для энхитреид Henlea sp. установлено четыре необходимых компонента люминесцентной системы: люцифераза, люциферин, кислород и ион кальция - активатор люциферазы.

Дня светящихся почвенных червей ранее уже было установлено участие иона двухвалентного металла в реакции светоизлучения: активатором люциферазы Diplocardia longa является Cu2+. Мы показали, что функцию активатора Fridericia heliota выполняют ионы Mg2*, а в случае Henlea sp. таковым является Са2+. На основании этих данных выделена отдельная группа люминесцентных ферментов - "металл-зависимые люциферазы олигохет", хотя несомненно, что механизмы участия ионов в реакции светоизлучения различны в каждом случае.

Важной характеристикой любых ферментативных систем является их рН-зависимость. Изменение скоростей реакций люцифераз F. heliota и Henlea sp. от рН выражается колоколообразными кривыми с одним максимумом (Рис. 7). Подгонку параметров нормального распределения: среднего арифметического распределения и стандартного отклонения

распределения (о) проводили методом наименьших квадратов, используя приложение "Excel". рНопг. для F. heliota составил 8.21, пр и = 0.5. pHom-,

для Ивп1ва эр. - 7.25 , при а = 0.9. Оба графика приведены в относительных единицах и нормированы в точке максимума. Как видно из рисунка, интервал значений рН для оптимальной скорости реакции у Т. Нв1Ша находится в щелочной области. При этом он значительно уже, чем у Ивп1ва эрч то есть люцифераза Р. ке1Ша более чувствительна к изменению рН среды. Изменение активности люциферазы Б. Нв1Ша вдали от рНош. является необратимым, что может быть связано с денатурацией белковой молекулы.

Рис. 7. рН-зависимости активности люциферин-люциферазных реакций энхитреид F. heliota и Henlea sp. in vitro.

На рисунке 8 приведена температурная зависимость интенсивности люминесценции F. heliota in vitro в условиях насыщения по АТФ. tom = 33° С, затем скорость люминесцентной реакции начинает падать, что объясняется необратимой инактивацией люциферазы. Чем выше температура, тем быстрее происходит инактивация. При 45°С за одну минуту люцифераза инактивируется на 90%. При значениях температуры, близких к 100° С, инактивация происходит практически мгновенно.

Для сравнения приведена и температурная зависимость Henlea sp. in vitro. Ее tom-. = 20° С существенно отличается от такового для F. heliota. Причем следует отметить, что хотя люцифераза Henlea sp. более чувствительна к повышению температуры после оптимума, ее инактивация является полностью обратимой на коротких временах. Например, при снижении люминесценции на 90% при 37°С быстрый возврат к tour, восстанавливает люминесценцию до максимального уровня.

О

О

10

20

30

40

JO

Температура, °С

Рис. %. Температурные зависимости люминесценции F. hehota и

Henlea sp. in vitro.

Энергия активации, рассчитанная по возрастанию люминесценции от температуры, выраженному в координатах Аррениуса [ln(Vmax), 1/Т)], составила: 23 ккал/моль для F. hehota и 6.3 ккал/моль для Henlea sp.

Глава 5. Получение частично--очишенных препаратов люциферазы и люпиферина F hehota и изучение их свойств.

Люцифераза F. hehota, особенно при низкой концентрации, способна в значительной степени инактивироваться в течение дня, поэтому была разработана методика экспресс-очистки ее и люциферина (Табл. 1). Хроматография проводилась в темноте, при +8 °С. Применяли 0.1 мМ ДТТ в качестве протектанта в препаратах люциферазы и в используемых буферах. Учитывая высокую чувствительность люциферазы к ионам, для уменьшения времени их контакта с ферментом максимально сокращены объемы применяемых колонок.

Так как было выявлено, что люциферин при рН 8.1 несет на себе отрицательный заряд и хорошо сорбируется на анионообменных носителях, на первом этапе очистки супернатант, содержащий люциферазу и люциферин, наносили на колонку 0.7 х 9 см с DEAE-Sepharose, предварительно уравновешенной стартовым. Элюцию белков проводили градиентом от 0 до 1 М NaCl в стартовом буфере. Первый пик идентифицирован как люцифераза (при 0.1 М NaCl), а второй - люциферин (при 0.55 MNaCl).

Наследующем этапе люциферазу (первый пик) сконцентрировали до 0.5 мл на мембране Amicon (10 кДа) и далее хроматографировали на колонке 0.7 х 50 см с ультрагелем АсА-44.

Таблица 1.

Схема экспресс-очистки люциферазы Fridericia Нв1Ыа.

Стада» Объем (ил) Белох (А}80/МЯ) Т. белок (Ало) Активность (отиед,/мд) I • агг-ть (отн.ед) Удельная активность (отн.ед/А28о) Выход <%) Фактор ОЧИСТКИ

Супер-натант 10.3 152 . 1560 11.7 120 0.077 100 1

ОЕАЕ-БерЬшке 8 9.25 74 11.3 90 1.22 75 15.8

Агшсоп 0.5 40.8 20.4 176 88 4.31 73.3 56.1

АсА-44 3.3 2.55 8.4 15 50 5.89 41.2 76.5

Вся процедура очистки заняла 6 часов. В результате удельная активность люциферазы возросла более чем в 70 раз (Табл.1). Однако все еще нельзя с уверенностью сказать, какая именно полоса на SDS-фореграммах соответствует люциферазе F. кв1Ыа.

Ранее, на колонке с АсА 44, пик люциферазы имел максимум на 60 кДа. Теперь, используя результаты гель-фильтрации калибровочных белков, . определили молекулярную массу люциферазы - 28 кДа. Возможно, люцифераза F. Нв1Ша действительно является гомодимером, причем проявляет активность и в диссоциированном состоянии. Молекулярная масса люциферина (0.5-0.7 кДа) была определена на колонках с биогелями Р-2 и Р-4.

После экспресс-очистки исследованы зависимости интенсивности люминесценции при постоянном уровне люциферина и варьировании количества люциферазы в реакционной смеси, и наоборот (Рис. 10 и 11). На интервале в 3-4 порядка зависимости имеют линейный характер, то есть интенсивность люминесценции пропорциональна количеству и люциферазы, и люциферина. Динамика спада люминесценции имеет экспоненциальный характер, где константа линейно зависит от количества люциферазы. При увеличении количества люциферазы вдвое, константа спада также меняется в 2 раза (Рис. 12). Никогда в экспериментах нам пока не удавалось достичь условий насыщения. по субстрату. Предполагая, что ферментативное окисление 1 молекулы люциферина сопровождается излучением 1 кванта, а по калибровке люминометра, 1 ед =107 квант/сек (т.е. 10 мкл люциферина дает 2.97 * 1011 квантов), мы рассчитали концентрацию люциферина в используемом препарате - 50 нмоль/л и в биомассе червей - 10-6 М. Это, с учетом молекулярной массы, соответствует 5-7 мкг люциферина на 1 г биомассы F. Нв1Ыа.

Рис. 10. Зависимость интенсивности люминесценции от количества люциферазы. Приведены уравнение линейной регрессии и коэффициент корреляции Я2.

Рис. 11. Зависимость интенсивности люминесценции от количества люциферина.

Рис. 12. Динамика люминесценции: слева - 8 мкл люциферазы и 10 мкл люциферина; справа - 4 мкл и 8 мкл, соответственно.

Были проверены все возможные перекрестные реакции с участием люцифераз и люциферинов F. heliota и Henlea sp. Обе люциферазы неактивны с субстратами люцифераз бактерий, светляков и гидроидных полипов. Ввиду недоступности люциферина D. longa, был проведен его химический синтез, подтвержденный результатами масс-спектрометрии и анализом ТСХ на альдегидную группу. Полученный препарат N-изовалерил-3-амино-пропаналя проявлял активность с бактериальной люциферазой. Однако, добавление его к люциферазе Henlea sp., несмотря на то, что люминесцентная система этой энхитреиды наиболее близка к таковой D. longa, не привело к люминесценции. Отрицательный результат был получен и с люциферазой F. heliota.

Люциферины F. heliota и Henlea sp. не проявляют активности с бактериальной и светляковой люциферазами. Более того, люциферины и люциферазы F. heliota и Henlea sp. не активны в перекрестных реакциях даже друг с другом, что говорит о том, что они биохимически различаются.

Глава 6. Влияние ионов на люминесценцию F. heliota in vitro.

Выше было сказано, что ионы Са2+ Sr2+, Ba2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+, Cu2+, Hg2+ в миллимолярной концентрации, на фоне эндогенных Nig^ и АТФ, ингибировали люминесценцию. Подобный эксперимент, но с насыщающей концентрацией АТФ и люциферазой, освобожденной от свободных ионов, дал иной результат (Рис. 13). Ионы в разной степени (Си < Cd < Са < Zn < Mg) и при разных концентрациях способны стимулировать активность люциферазы F. heliota. Измерения проводились с хлоридами указанных металлов.

1000

0.1 н......."I...........' ..............Ч

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 Ион2*, М

Рис. 13. Активность люциферазы F. heliota с различными катионами.

С повышением концентраций ионов проявляется их токсичность для фермента, и люминесценция падает. Исключение составляют лишь Са2+ и М^2+, имеющие широкий диапазон действия; но с кальцием активность люциферазы F. Не1Ша в 20 раз меньше. В физиологических условиях всегда преобладают комплексы. АТФ с М^2+, поскольку логарифм' константы связывания АТФ с ним (4.2) больше, чем с кальцием (3.8).

При исследовании эффектов ингибирования солями металлов была отмечена высокая чувствительность не только к катионам, но и к анионам. Варьируя анионную часть соли одного и того же металла (калия), мы получили ряд кривых ингибирования. Полный перечень значений констант ингибирования люциферазы Г. Не1Ша различными соединениями приведен в таблице 2. Соединения условно сгруппированы в соответствии с химической • формулой и расположены сверху вниз по мере увеличения К,.

Таблица 2.

Константы ингибирования люциферазы Г. Не1Ша различными' соединениями.

Соединение К;,М Соединение К;,М Соединение к„м

№(04)6 4.7.10'7

Ыа-додецил-сульфат Г.ЫО"5

К2Сг207 2.5.10"5

Иа-цитрат 8.4. Ю-4

К1 1.4.10"3 Глутатион окисленный 1.1.КГ3

КЫ03 2.5.10"3 На2504 3.2.10"3

К3Р04 3.5.10"3 (Ш^БО« 3.4.10'3

КВг 4.9.10"3 ИагБОз 4.6.10"3 Ыа2С03 3.9.10"3

К2С03 5.5.10"3

КС1 7.5.103 ЫаС1 6.6.10"3

Ш4С1 7.0.103

Трис-НС1 1.5-Ю"2

Анионы сильнее катионов воздействуют на активность люциферазы. Так, варьирование анионной части для солей калия приводит к разбросу К; более чем на четыре порядка. В ряду галоидов ингибирование усиливается в ряду КС1 < KBr < KI . Аналогичная зависимость была показана в случае бактериальной люминесценции. Замена калия на натрий или аммоний в хлоридах и в сульфатах практически не сказывается на К;, то есть природа одновалентного катиона здесь не играет существенной роли. Большая разница в величинах констант ингибирования додецилсульфата и сульфата натрия (в 300 раз), возможно, объясняется образованием специфического комплекса гидрофобного характера в первом случае. Известно, что SDS -сильный денатурирующий агент, разрушающий белок-белковые и белок-липидные связи.

Наряду с анионными детергентами, к числу которых относится SDS, мы исследовали влияние на люминесценцию F. heliota неионных детергентов: Тритона X 100, Твин 20, Твин 60, Твин 80 и других. Выяснилось, что Тритон X100 обладает самой высокой стимулирующей способностью, его добавки увеличивают интенсивность люминесценции более чем в 5 раз. Было проверено действие Тритона X100 в модельном эксперименте по ингибированию люциферазы алифатическими ингибиторами: органическими кислотами (к), их солями (C12Na), альдегидами (ал) и спиртами (сп), разведенными в метаноле (Рис. 14). Начальная интенсивность люминесценции везде была 100 отн.ед. По эффекту ингибирования их можно расположить в ряд:

Рис. 14. Ингибирование люциферазы Б. Нв1Ша различными алифатическими соединениями и последующее восстановление люминесценции Тритоном XI00.

Как видно из приведенных данных, додецилсульфат натрия и соли жирных кислот обладают максимальным ингибирующим действием. Последующее добавление Тритона X100 всегда восстанавливает активность люциферазы практически до исходного уровня (с учетом контроля). Надо отметить, что эффект Тритона обусловлен снятием действия ингибиторов, так как он почти не стимулирует люминесценцию чистых препаратов люциферазы и люциферина.

Ингибирование люциферазу F. heliota додецилсульфатом натрия в диапазоне концентраций от 0 до 10-4 М полностью обратимо при добавлении Тритона X100. Так как критическая точка мицеллообразования для Тритона Х100 равна 0.5 мМ, а конечная концентрация его в нашем эксперименте 1012 мМ, получается, что на 100 молекул Тритона приходится менее 1 молекулы SDS. Легкое встраивание его в мицеллы Тритона, возможно, и объясняет полное восстановление активности люциферазы.

В данной главе экспериментально продемонстрирована возможность использования тест-системы F. heliota для анализа содержания ионов металлов и анионных детергентов в различных растворах.

В заключении подводятся итоги проделанной работы, люминесцентная система F. heliota сравнивается с АТФ-зависимыми системами других организмов, обсуждаются предполагаемые механизмы реакций и структуры субстратов, говорится о перспективах развития исследований в области биолюминесценции почвенных энхитреид. Очередные задачи - это изучение конкретной роли ионов металлов в катализе люминесценции энхитреид; установление точной химической природы люциферинов, что откроет пути либо для их синтеза, либо для подбора аналогов, а также позволит расширить круг веществ, анализируемых с помощью тест-систем энхитреид. Еще не решена задача получения высокоочищенной люциферазы F. heliota.

Сделаны лишь первые шаги в исследовании люминесцентной системы Henlea sp. Этот вид открыт позже, чем F. heliota, и встречается редко. Широкомасштабное исследование люцифераз энхитреид, установление их структур сдерживается трудностями сбора биологического материала и ограниченным количеством белков. Получение рекомбинантных люцифераз в будущем снимет эту проблему.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Обнаруженные в Сибири светящиеся черви являются представителями двух новых видов почвенных энхитреид: Fridericia heliota и Henlea sp. На их примере впервые доказан факт люминесценции представителей данного семейства кольчатых червей.

2. Люминесцентные системы F. heliota и Henlea sp. принадлежат к разным типам, имеют разную локализацию и спектральные характеристики in vivo, а также различные рН и 10-оптимумы. Их структурно-функциональные отличия от известных люминесцентных систем земляных червей опровергают постулат о единой природе люминесценции олигохет. Металл-зависимые люциферазы олигохет выделены в особую группу люминесцентных ферментов.

3. Люминесцентная система Henlea sp. включает четыре компонента: люциферазу (гомодимер с молекулярной массой 72 кДа), люциферин, ион кальция - активатор люциферазы и кислород.

4. Для люминесцентной реакции F. heliota необходимо пять компонентов: люцифераза, люциферин, АТФ - косубстрат люциферазы, ион магния - активатор люциферазы и кислород. По набору компонентов данная система похожа на АТФ-зависимые системы организмов из других таксономических групп: многоножек Luminodesmus sequoia, грибных мушек Arachnocampa flava и всех видов светляков.

5. Предложенный метод экспресс-очистки компонентов люминесцентной системы F. heliota позволяет в течение шести часов за два хроматографических этапа повысить специфическую активность люциферазы более чем в 70 раз. Молекулярная масса люциферазы F. heliota - 60 кДа (возможно, гомодимер), люциферина - 0.5-0.7 кДа.

6. Люцифераза F. heliota проявляет высокую чувствительность к АТФ, его аналогам, катионам двухвалентных металлов, различным анионам. Тест-систему F. heliota можно применять в аналитических целях для детекции этих реагентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Залесская Н. Т., Петушков В. Н., Родионова Н. С. Светящиеся почвенные энхитреиды (Oligochaeta, Enchytraeidae) II Докл.АН СССР. - 1990. - Т. 310. - N 2. - С. 496- 498.

2. Петушков В. Н., Родионова Н. С, Пуртов К. В., Бондарь В. С. Люминесцентная система почвенных энхитреид Henlea sp. (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) ИДАН. - 2002. - Т. 385. - N 3. -С. 416-418.

3. Родионова Н. С, Бондарь В. С, Петушков В. Н. Са 2+ - активатор люминесцентной системы земляных червей- Henlea sp. (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) If ДАН. - 2002. - Т. 386. - N 2. -С. 270-273.

4. Rota E., Zalesskaja N.T., Rodionova N.S., Petushkov V.N. Redescription of Fridericia heliota {Annelida: Clitellata: Enchytraeidae), a luminous worm from the Siberian taiga, with- a review of bioluminescence in the Oligochaeta IIJ. Zoology., London. - 2003. - V. 260. - P. 291-299.

5. Петушков В. Н., Родионова Н. С, Бондарь В. С. Исследование люминесцентной системы почвенных энхитреид Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) II ДАН. - 2003. - Т. 391.-Ш.-С. 269-272.

6. Родионова Н. С, Бондарь В. С, Петушков В. Н. АТФ - косубстрат люциферазы земляных червей Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta:Enchytraeidae)ИДАН. - 2003. - Т. 392. - N 2. - С. 264-266.

Подписано в печать 29.04.04 Формат бумаги 60x84/16. Усл. печ. л. 1.5. Тираж 100 экз. Заказ №81

Отпечатано на ризографе КГТУ 660074, Красноярск, Киренского 26

»1170t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родионова, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ НАЗЕМНЫХ ОРГАНИЗМОВ

1.1. Типы хемилюминесцентных реакций.

1.2. Бактериальная люминесценция.

1.3. Люминесценция червей

1.3.1. Светящиеся полихеты.

1.3.2. Люминесцентные олигохеты

1.3.2.1. История вопроса.

1.3.2.2. Таксономия люминесцентных видов олигохет.

1.3.2.3. Исследования люминесценции олигохет.

1.3.2.4. Люминесценция Diplocardia longa.

1.4. Светящиеся многоножки.

1.5. Люминесценция насекомых.

1.5.1. Двукрылые семейства Mycetophilidae.

1.5.2. Жуки семейства Lampyridae.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ОПИСАНИЕ НОВЫХ ВИДОВ СВЕТЯЩИХСЯ ЭНХИТРЕИД

3.1. Географическое распределение.

3.2. Fridericia heliota: внешний вид и внутренние органы.

3.2.1. Классификационные замечания.

3.2.2. Локализация люминесцентной системы F. heliota.

3.3. Henlea sp. \ описание вида, двойственность локализации люминесцентной системы.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЭНХИТРЕИД

4.1. Особенности люминесценции in vivo, спектры.

4.2. Определение компонентов люминесцентной системы F. heliota 4.2.1. Разделение системы на люциферазу и люциферин.

4.2.2. Магний- активатор люциферазы F. heliota.

4.2.3. АТФ - косубстрат люциферазы F. heliota.

4.2.4. Люциферин F. heliota.

4.3. Компоненты люминесцентной системы Henlea sp.

4.4. Оптимальные условия реакции люминесценции F. heliota in vitro.

4.5. Влияние рН и температуры на люминесценцию

F. heliota и Henlea sp.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ЧАСТИЧНО-ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ЛЮЦИФЕРАЗЫ И ЛЮЦИФЕРИНА F. HELIOTA И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

5.1. Метод экспресс-очистки люциферазы.

5.2. Динамика люминесценции F. heliota в условиях недостатка люциферина.

5.3. Перекрестные реакции.

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ НА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ F. HELIOTA

IN VITRO

6.1. Эффект действия катионов двухвалентных металлов.

6.2. Влияние анионов и детергентов.

6.3. Демонстрация применения тест-системы F. heliota.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биолюминесцентные системы почвенных энхитреид (Annelida: clitellata: oligochaeta: enchytraeidae)"

Феномен биолюминесценции с давних пор привлекал внимание исследователей. Период разрозненных описаний сменился систематическими исследованиями. Накапливались знания по экологии и физиологии разнообразных светящихся организмов. Огромное количество работ посвящено изучению биохимических механизмов люминесценции. Развитие молекулярной биологии и генной инженерии в последние годы дало новый импульс в исследовании взаимосвязи между структурой белка и выполняемой им специализированной функцией. Высокая специфичность люцифераз к субстратам, прямая пропорциональность между интенсивностью люминесценции и концентрацией компонентов реакции, высокий квантовый выход позволяют создавать на основе люциферин-люциферазных систем высокочувствительные аналитические методы для использования в науке, промышленности и медицине.

Актуальность работы. Открытие и исследование новых люминесцентных систем, выяснение химической природы их структурных и регуляторных компонентов имеют большое значение для понимания механизмов преобразования энергии химических связей в кванты света, что является одной из фундаментальных задач биофизики. В биологии такие исследования помогают полнее проследить эволюционные пути, а также приблизиться к разгадке возникновения и значения люминесценции для биохимии и этиологии живых организмов. С практической точки зрения, каждое такое открытие расширяет спектр анализируемых веществ, приводит к разработке новых методов мониторинга окружающей среды, технологических и биологических процессов. Современная биотехнология получения рекомбинантных белков ускоряет путь от обнаружения нового светящегося организма до создания аналитических методов на основе его специфической люминесцентной системы.

Разработанность конкретной проблемы. К настоящему времени в разной степени изучены люминесцентные системы бактерий, медуз, рачков, полихет, светляков и др. Из всего класса олигохет довольно хорошо исследована только люминесценция Diplocardia longa, субтропического представителя семейства мегасколецид. Единичные наблюдения свечения энхитреид, сделанные около ста лет назад, впоследствии не получили подтверждения, и этих червей исключили из современной классификации светящихся организмов.

Цель работы - исследование биолюминесцентной системы неизвестных почвенных энхитреид, обнаруженных в Сибири. Задачи исследования:

1. Определить видовую принадлежность найденных червей.

2. Исследовать параметры биолюминесценции in vivo.

3. Установить тип и структурно-функциональную организацию люминесцентной системы энхитреид.

4. Реконструировать люминесцентную систему и определить оптимальные условия проведения реакции in vitro.

5. Исследовать физико-химические свойства компонентов люминесцентной системы.

6. Изучить возможности использования люминесцентной системы энхитреид в аналитических целях.

В ходе исследования открыто два новых вида кольчатых червей, принадлежащих к классу олигохет, семейству энхитреид. Показано, что, несмотря на таксономическую близость Fridericia heliota и Henlea sp., локализация и параметры их люминесценции in vivo различны. Установлено, что люминесцентные системы данных энхитреид отличаются от всех известных люминесцентных систем олигохет. Для люминесцентной реакции Henlea sp. необходимы 4 компонента: люцифераза, люциферин, кальций, кислород; а люминесцентная система F. heliota включает 5 компонентов: люциферазу, люциферин, АТФ, магний и кислород. Установлены оптимальные значения рН, температуры, концентрации буфера, экзогенных металлов, БСА и Тритона XI00 для реакции in vitro. Изучено воздействие на люминесценцию системы F. heliota катионов двухвалентных металлов, различных анионов и алифатических соединений. Предложен экспресс-метод очистки люциферазы и люциферина F. heliota, определены их молекулярные массы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые описанные почвенные энхитреиды Fridericia heliota и Henlea sp. являются новой группой биолюминесцентных организмов.

2. Особенности структурно-функциональной организации металл-зависимых люциферин-люциферазных систем энхитреид определяют их уникальность среди известных люминесцентных систем.

3. Чувствительность люциферазы F. heliota к АТФ, его аналогам и различным ионам позволяет использовать тест-систему этих энхитреид в различных областях науки и практики.

Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ [1-6]. Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на семинарах Института биофизики СО РАН, Сибирского Технологического Университета, Института леса СО РАН, Красноярского государственного Университета.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав с выводами, заключения, основных выводов и списка цитируемой литературы из 132 наименований. Материал диссертации изложен на 124 страницах машинописного текста, включает 47 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Родионова, Наталья Сергеевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Обнаруженные в Сибири светящиеся черви являются представителями двух новых видов почвенных энхитреид: Fridericia heliota и Henlea sp. На их примере впервые доказан факт люминесценции представителей данного семейства кольчатых червей.

2. Люминесцентные системы F. heliota и Henlea sp. принадлежат к разным типам, имеют разную локализацию и спектральные характеристики in vivo, а также различные рН и ^-оптимумы. Их структурно-функциональные отличия от известных люминесцентных систем земляных червей опровергают постулат о единой природе люминесценции олигохет. Металл-зависимые люциферазы олигохет выделены в особую группу люминесцентных ферментов.

3. Люминесцентная система Henlea sp. включает четыре компонента: люциферазу (гомодимер с молекулярной массой 72 кДа), люциферин, ион кальция - активатор люциферазы и кислород.

4. Для люминесцентной реакции F. heliota необходимо пять компонентов: люцифераза, люциферин, АТФ - косубстрат люциферазы, ион магния — активатор люциферазы и кислород. По набору компонентов данная система похожа на АТФ-зависимые системы организмов из других таксономических групп: многоножек Luminodesmus sequoia, грибных мушек Arachnocampa flava и всех видов светляков.

5. Предложенный метод экспресс-очистки компонентов люминесцентной системы F. heliota позволяет в течение шести часов за два хроматографических этапа повысить специфическую активность люциферазы более чем в 70 раз. Молекулярная масса люциферазы F. heliota - 60 кДа (возможно, гомодимер), люциферина - 0.5-0.7 кДа.

6. Люцифераза F. heliota проявляет высокую чувствительность к АТФ, его аналогам, катионам двухвалентных металлов, различным анионам. Тест-систему F. heliota можно применять в аналитических целях для детекции этих реагентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые исследованы светящиеся почвенные энхитреиды, обнаруженные в Сибири. Сделано полное описание внешнего и внутреннего строения нового вида этих червей, получившего название Fridericia heliota. Основные характеристики взрослой особи: небольшие размеры (20 х 0.5 мм), число сегментов 50-58, прямые щетинки по 1-2(3) в пучке, эпидермальные железы в 4-5 рядов на каждом сегменте, трапециевидный головной мозг, пептонефридии коротковетвистые, ампулы парных семяприемников с двумя большими удлиненными дивертикулами, похожими на уши. Слово "heliota" образовано от греческих helios — Солнце и otos - ухо. Новый вид включен в таксономию энхитреид, образцы F. heliota размещены в коллекциях музеев Рима, Стокгольма и Москвы.

Подтверждение заявленной новизны второго вида, принадлежащего к роду Henlea, еще требует времени. Однако с полной уверенностью можно сказать, что сибирская Henlea sp. - неизвестный ранее вид светящихся энхитреид.

Около ста лет в мире не было никаких сообщений о люминесценции энхитреид. В 1982 году этих кольчатых червей исключили из классификации светящихся организмов [901]. Сейчас, после установления нами двух достоверных фактов люминесценции, энхитреиды займут свое законное место в этом списке. Люминесценция в роду Fridericia зафиксирована впервые. Ввиду того, что упоминавшиеся в начале XX века светящиеся Henlea ventriculosa (=Enchytraeus albidus) [1594] и Henlea (=Michaelseniella) nasuta [1597] имели неясное таксономическое положение и по описанию не похожи на исследуемую нами Henlea sp., рискнем заявить, что и в роду Henlea нами впервые установлен факт люминесценции.

Источник свечения F. heliota находится в области эпидермальных железистых клеток, целомическая жидкость этих энхитреид не светится.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родионова, Наталья Сергеевна, Красноярск

1. Залесская Н. Т., Петушков В. Н., Родионова Н. С. Светящиеся почвенные энхитреиды (Oligochaeta, Enchytraeidae) // Докл.АН СССР. - 1990. - Т. 310. - N 2. - С. 496- 498.

2. Петушков В. Н., Родионова Н. С., Пуртов К. В., Бондарь В. С. Люминесцентная система почвенных энхитреид Henlea sp. (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) Н ДАН. 2002. - Т. 385. - N 3. -С. 416-418.

3. Родионова Н. С., Бондарь В. С., Петушков В. Н. Са активатор люминесцентной системы земляных червей Henlea sp. (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) II ДАН. - 2002. - Т. 386. - N 2. -С. 270-273.

4. Петушков В. H., Родионова Н. С., Бондарь В. С. Исследование люминесцентной системы почвенных энхитреид Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) II ДАН. 2003. — Т. 391.-N2.-С. 269-272.

5. Родионова H. С., Бондарь В. С., Петушков В. Н. АТФ косубстрат люциферазы земляных червей Fridericia heliota (Annelida: Clitellata: Oligochaeta: Enchytraeidae) // ДАН. - 2003. - Т. 392. - N 2. - С. 264266.

6. Roda A., Guardigli M., Michelini E., Mirasoli M., Pasini P. Analytical Bioluminescence and Chemiluminescence // Analytical Chemistry. Nov. 1 -2003.-P. 463-470.

7. Shimomura О., Johnson F. H. Mechanism of the luminescent oxidation of Cypridina luciferin // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1971. - V. 44. - P. 340-346.

8. Viviani V. R. The origin, diversity, and structure function relationships of insect luciferases // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - V. 59 - N 11. - P. 18331850.

9. Cormier M. J., Lee J., Wampler J. E. Bioluminescence: recent advances. // Ann. Rev. Biochem. 1975. - V. 44. - P. 255-272.

10. Campbell A. K. Chemiluminescence: principles and applications in biology and medicine / VCH / Horwood, Chichester. — 1988.

11. Harvey E. N. Bioluminescence / N.Y. Acad.Press. 1952. - 649 p.

12. Rees J.-F., De Wergifosse В., Noiset O., Dubuisson M., Janssens В., Thompson E.M. The origins of marine bioluminescence: turning oxygen defense mechanisms into deep-sea communication tools // Journal of Experimental Biology. 1998.-V. 201.-P. 1211-1221.

13. Cormier M. J. Comparative biochemistry of animal systems // Bioluminescence in Action. / London. Academic Press. 1978. - P. 75108.

14. Roda A., Pasini P., Guardigli M., Baraldini M., Musiani M., Mirasoli M. Bio- and Chemiluminescence in bioanalysis // Fresenius J. Anal. Chem. -2000.-V. 366.-P. 752-759.

15. Hastings J. W, Johnson С. H. Bioluminescence and chemiluminescence // Methods Enzymol. 2003. - V. 360. - P. 75-104.

16. Inouye S., Watanabe K., Nakamura H., Shimomura O. Secretional luciferase of the luminous shrimp Oplophorus gracilirostris: cDNA cloning of a novel imidazopyrazinone luciferase // FEBS Letters. 2000. -V.481.-P. 19-25.

17. Johnson F. H., Shimomura O. Bacterial and other luciferins // Bio Science. 1975. - V. 25. - N 11. - P. 718-722.

18. Tu S.- С., Mager H. I. X. Biochemistry bacterial bioluminescence // Photochem. Photobiol. 1995. - V. 62. -N 4. - P. 615-624.

19. Wilson Т., Hastings J. W. Bioluminescence // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. -1998.-V. 14.-P. 197-230.

20. Чумакова P. И., Гительзон И. И. Светящиеся бактерии / М. Наука. — 1975.- 108 с.

21. Светящиеся бактерии / под ред. Кондратьевой Е.Н. / Новосибирск, Наука.-1984.-280 с.

22. Mager Н. I. X., Tu S.- С. Chemical aspects of bioluminescence // Photochem. Photobiol. 1995. - V. 62. -N 4. - P. 607-614.

23. Nicol J. А. С. Luminescence in polynoid worms // J. Mar. Biol. Assoc. UK. 1953. -V. 32. - P. 65-84.

24. Herring P. J. Systematic distribution of bioluminescence in living organisms // J. Biolum. Chemilum. 1987. - V. 1. - P. 147-163.

25. Dubois R. Fonction photogenique des pyrophores // C. R. Soc. Biol. -1885.-V. 37.-P. 559-562.

26. Dubois R. Note sur la fonction photogenique chez les pholades // C. R. Soc. Biol.-1887.-V. 39.-P. 564-566.

27. Shimomura O., Beers J. R., Johnson F. H. The cyanide activation of Odontosyllis luminescence // J. Cell Physiol. 1964. - V. 64. - P. 15-21.

28. Nicol J. A. C. Studies on Chaetopterus variopedatus (Renier). II Nervous control of light production // J. Mar. Biol. Assoc. 1952. - V. 30. - P. 433452.

29. Nicol J. A. C. Studies on Chaetopterus variopedatus (Renier). Ill Factors affecting the light response // J. Mar. Biol. Assoc. 1952. - V. 31. -P. 113-144.

30. Martin N., Anctil M. Luminescence control in the tube-worm Chaetopterus variopedatus: role of nerve cord and photogenic gland // Biol. Bull. 1984. - V. 166. - P. 583-593.

31. Shimomura O., Johnson F. H. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / Bioluminescence in Progress. 1966. -P. 495-521.

32. Bassot J. M., Nicolas G. An optional dyadic junctional complex revealed by fast-freeze fixation in the bioluminescent system of the scale worm // J. Cell Biol. - 1987. - V. 105. - P. 2245-2256.

33. Bassot J.- M. A transient intracellular coupling explains the facilitation of responses in the bioluminescent system of scale worms // J.Cell Biol. -1987.-V. 105.-P. 2235-2243.

34. Fresneau C., Arrio В., Lecuyer В., Dupaix A., Lescure N., Volfin P. The fluorescent product of scaleworm bioluminescent reaction: an in vitro study // Photochem. Photobiol. 1984. - V. 39. - N 2. - P. 255-261.

35. Nicolas G., Bassot J. M., Shimomura O. Polynoidin: a membrane photoprotein isolated from the bioluminescent system of scale-worms // Photochem. Photobiol. - 1982. - V. 35. - P. 201-207

36. Vejdovsky F. System und Morphologie der Oligochaeten / Prague, Franz. Rivac.- 1884.

37. Skowron S. The luminous material of Microscolex phosphoreus // Dug. Biol. Bull. -1928.-V. 54. P. 191-195.

38. Cohn F. Leuchtende Regenwurmer. Zeitschrift wiss // Zool. 1873.

39. Atkinson A. A remarkable case of phosphorescence in an earthworm // The American Naturalist. 1887. - V. 21. - P. 773-774.

40. Giard G. Sur la distribution geographique du Phot. Ph. Duges // C.-Rend. Soc. De Biol. 1891. - V. 9. - N 3. - P. 252.

41. Friend H. Luminous worms // Nature. 1919. - V. 103. - N 2597. - P. 446.

42. Friend H. Luminous Earthworms // Nature. 1893. - V. 48. - P. 462.

43. Beddard K. A note upon phosphorescent earthworms // Nature. 1899. -V. 60.-P. 52.

44. Benham W. B. Phosphorescent earthworms // Nature (Lond.). 1899. - V. 60.-P. 591.

45. Pierantoni U. Gli animali luminosi / Milano, Sonzogno. 1922. - 52 p.

46. Secchi P. A. Nouvelles observations // Ann. Sci. Nat. 1872. - V. 16. -68.

47. Eversmann E. Lumbricus noctilucus II Utshen. Zapiski. Kazan. Univ. -1838.-P. 156-157.

48. Owsiannikow P. Uber das Leuchten der Larven von Lampyris noctiluca II Bull. Acad. imp. Sci. St. Petersburg. 1864. - V. 7. - P. 55-61.

49. Вальтер А. Случай свечения наземных Oligochaeta II Труды Императорскаго С. Петербургскаго общества естествоиспытателей. -1909. -Т.40. -N 1.-Р. 103-109.

50. Догель В. А. / Зоология беспозвоночных / М., Высшая школа. 1981. - 606 с.

51. Cormier М. J. Luminescence in Annelids // Chemica Zoiology. / Annelida Echiura and Sipuncula. / N. Y., London, Academic Press. 1969. - V. 4. -P. 467-479.

52. Herring P. J. Appendix: a classification of luminous organisms / Bioluminescence in Action. / London, N.Y., San Francisco, Academic Press.- 1978b.-P. 461-476.

53. Herring P. J. Bioluminescent of invertebrates other than insect / Bioluminescence in Action. / London, N. Y., San Francisco, Academic Press. 1978 a. - P. 199-240.

54. Wampler J. E., Jamieson B. G. M. Earthworm bioluminescence: comparative physiology and biochemistry // Сотр. Biochem. Physiol. -1980.-V. 66 В.-P. 43-50.

55. Pickford G. E. / A monograph of the acantodriline earthworms of South Africa. / Cambridge, Heffer. 1937.

56. Wampler J. E. The bioluminescence system of Microscolex phosphoreus, and its similarities to those of other bioluminescent earthworms (Oligochaeta) II Сотр. Biochem. Physiol. 1982. - V. 71 A. - N 4. - P. 599-604.

57. Wampler J. E., Jamieson B. G. M. Cell bound bioluminescence from Pontodrilus bermudensis, and its similarities to other earthworm bioluminescence // Сотр. Biochem. Physiol. 1986. - V. 84 A. - N 1. - P. 81-87.

58. Rota E., Healy B. A taxonomic study of some Swedish Enchytraeidae (Oligochaeta), with description of four new species and notes on the genus Fridericia I I J. Natural History. 1999. - V. 33. - P. 29-64.

59. Jamieson B. Bioluminescent Australian earthworms, I. Digaster keasti sp. nov. (Megascolecidae), the first record of an oligochaete from Fraser Island // Proc. R. Soc. Qd. 1977. - V. 88. - P. 83-88.

60. Issatschenko В. Erforschung der bakterielle Leuchten des Chironomus (.Diptera) // Bull. Jard. bot. St.-Petersb. 1911. - V. 11. - P. 31 -49.

61. Rudie N. G., Wampler J .E. Earthworm bioluminescence: characterization of the luminescent cell from Diplocardia longa II Сотр. Biochem. Physiol. 1978. - V. 59 A. - P. 1-8.

62. Bellisario R., Spencer Т. E., Cormier M. J. Isolation and properties of luciferase, a non-heme peroxidase from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa И Biochem. 1972. - V.l 1. - N 12. - P. 2256-2266.

63. Baruah G. D. Emission spectrum of p-luciferin and its comparison with the bioluminescence spectra of Fireflies and earthworms // Indian J. Pure & Applied Phys. 1986. - V. 24. - P. 47-49.

64. Baruah R. K., Baruah G. D. A comparison of the in vivo bioluminescence emission of fireflies and earthworms // Indian J. Phys. 1984. - V. 58 B. -P. 362-368.

65. Wenig K. Bioluminescence of Eusenia submontana II Vestn. Cesk. Zool. Spolec. 1946. - V. 10. - P. 293.

66. Johnson F. H., Shimomura O., Haneda, Y. / Bioluminescence in Progress. / Princeton University Press, Princeton, New Jersey. 1966. - P. 385-390.

67. Wampler J. E., Mulkerrin M. G., Rich E.S. J. Instrumentation and techniques for analysis of hydrogen peroxide-producing reactions involving earthworm {Diplocardia longa) bioluminescence // Clin. Chem. 1979. - V. 25. - N 9. - P. 1628-1634.

68. Rudie N. G., Ohtsuka H., Wampler J. E. Purification and properties of luciferin from the bioluminescent earthworm Diplocardia longa II Photochem. Photobiol. 1976. - V. 23. -N 1. - P. 71-73.

69. Rudie N. G., Mulkerrin M. G., Wampler J. E. Earthworm bioluminescence: characterization of high specific activity Diplocardia longa luciferase and the reaction it catalyzes // Biochem. 1981. — V. 20. -N 2. - P. 344-350.

70. Ohtsuka H., Rudie N. E., Wampler J. E. Structural identification and synthesis of luciferin from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa II Biochem. 1976. - V. 15. - N 5. - P. 1001 -1004.

71. Mulkerrin M. G, Wampler J. E. Assaying hydrogen peroxide using the earthworm bioluminescence system // Methods in Enzymology. 1978. -V. 57.-P. 375-381.

72. Rudie N. G., Wampler J. E. A unique aldehyde chemiluminescence involving peroxide and copper I in acidic DMSO // Photochem. Photobiol. 1979. — V. 29.-P. 171-174.

73. Hastings J. W., Davenport D. The luminescence of the millipede, Luminodesmus sequoiae II Biol. Bull. 1957. - V. 113. - P. 120-128.

74. Shimomura O. A new type of ATP-activated bioluminescent system in the millipede Luminodesmus sequoiae II FEBS Letters. — 1981. — V. 128. — N 2. P. 242-244.

75. Shimomura O. Porphyrin chromophore in Luminodesmus photoprotein // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. - V. 79 B. - N 4. - P. 565-567.

76. Shimomura O. Chlorophyl-derives bile pigment in bioluminescence euphausiids И FEBS Letters. 1980. - V. 116. - P. 203-206.

77. Kuse M., Kanakubo A., Suwan S., Koga K., Isobe M., Shimomura O. 7,8-dihydropterin-6-carboxylic acid as light emitter of luminous Millipede, Luminodesmus sequoiae II Bioorganic. Med. Chem. Letters. 2001. - V. 11.-P. 1037-1040.

78. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of of beetle bioluminescence // Photochem. Photobiol. 1995. - V. 62. - N 4. -P. 662-673.

79. Stolz U., Velez S., Wood K. W., Wood M., Feder J. L. Darwinian natural selection for orange bioluminescent color in a Jamaican click beetle // PNAS — 2003.- V. 100.-P. 14955-14959.

80. Viviani V., Uchida A., Suenaga N., Ryufuku M., Ohmiya Y. Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases // BBRC. 2001. - V. 280. - P. 1286-1291.

81. Viviani V.R., Ohmiya Y. Bioluminescence color determinants of Phrixothrix railroad-worm luciferases: chimeric luciferases, site-directed mutagenesis of Arg 215 and guanidine effect // Photochem. Photobiol. -2000. V. 72. - N 2. - P. 267-271.

82. Viviani V. R., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescence spectra and primary structures // Biochemistry.- 1999.-V. 38.-P. 8271-8279.

83. Lee J. Bioluminescence of the Australian glow-worm, Arachnocampa richardsae Harrison // Photochem. Photobiol. 1976. - V. 24. - P. 279285.

84. Viviani V. R., Hastings J. W., Wilson T. Two bioluminescent diptera: the North American Orfelia fultoni and the Australian Arachnocampa flava. Similar niche, different bioluminescence systems // Photochem. Photobiol.- 2002. V. 75. - N 1. - P. 22-27.

85. Fulton B.B. A luminous fly larva with spider traits // Ann. Entomol. Soc. Am. 1941. - V. 34. - P. 289-302.

86. Wood K.V. Evolution of bioluminescence in insects / Bioluminescence and Chemiluminescence: Status Report. 1993. - P. 104-108.

87. Ugarova N. N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism // J. Biolum. Chemilum. 1989. - V. 4. - P. 406418.

88. Sala-Newby G. В., Thomson С. M., Campbell A. K. Sequence and biochemical similarities between the luciferase of the glow-worm Lampyris noctiluca and the firefly Photinus pyralis II Biochemical J. — 1996.-V. 313.-P. 761-767.

89. Hannah R. R., Mc Caslin D. R., Wood K. Evidence for molecular aggregation of beetle luciferases / Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for the 21st Century. 1999. - P. 361 -364.

90. Бровко Л. Ю., Беляева Е. И., Угарова Н. Н. Субъединичные взаимодействия в люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль в проявлении активности фермента и процессе термоинактивации // Биохимия. 1982. - Т. 47. - Вып. 5. -С. 760-766.

91. Pojoga L. Н., Moose J. Е., Hilderman R. Н. Characterization of the interaction of P 1 ,P 4 -diadenosine 5 0 -tetraphosphate with luciferase // Biochem. Biophys. Res. Com. 2004. - V. 315. - P. 756-762.

92. Min K. L., Steghens J. P. ADP is produced by firefly luciferase but its synthesis is independent of the light emitting properties // Biochimie. -2001.-V. 83.-P. 523-528.

93. Угарова H. H., Бровко Л. Ю. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ / М., МГУ. 1981. - 138с.

94. McElroy W. D., DeLuca M. Chemical and enzymatic mechanisms of firefly luminescence / Chemilum. Biolum. / N.Y., Plenum Press. P. 285308.

95. Филиппова H. Ю., Угарова H. H. Ингибирование люциферазы из светляка Luciola mingrelica аналогами АТФ // Биохимия. 1982. - Т. 47.-Вып. 8, С. 1342-1347.

96. Branchini B.R., Southworth Т. L., Murtiashaw М. Н., Boije Н., Fleet S. Е. A mutagenesis study of the putative luciferin binding site residues of firefly luciferase // Biochem. 2003. - V. 42. - P. 10429-10436.

97. Strehler B. L., Totter J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanisms. I. Substrate and enzyme determination // Arch. Biochem. Biophys. 1952. - V. 40. - P. 28-41.

98. Fraga H.,.Esteves da Silva J. C. G, Fontes R. Identification of luciferyl adenylate and luciferyl coenzyme A synthesized by firefly luciferase // Chem. Biochem. 2004. - V. 5. - P. 110-115.

99. McElroy W. D., DeLuca M. Chemistry of firefly bioluminescence / Bioluminescence in Action. / N. Y., Academic Press. 1978. - P. 109— 127.

100. De Luca M., Mc Elroy W. D. Kinetics of firefly luciferase catalyzed reactions // Biochemistry. 1974. - V. 13. - P. 921-925.

101. Branchini B. R., Magyar R. A., Murtiashaw M. H., Anderson S. M., Zimmer M. Site-directed mutagenesis of histidine 245 in firefly luciferase: a proposed model of the active site // Biochem. 1998. - V. 37. - P. 15311-15319.

102. Branchini В. R., Magyar R. A., Murtiashaw M. H., Portier N. C. The role of active site residue arginine 218 in firefly luciferase bioluminescence // Biochem. 2001. - V. 40. - P. 2410-2418.

103. Seliger H. H., Mc Elroy W. D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence // Arch. Biochem. Biophys. 1960. - V. 88. - P. 136-141.

104. Бровко Л. Ю., Угарова Н. Н. Кинетика и механизм инактивации и реактивации иммобилизованной люциферазы светляков Luciola mingrelica, и роль сульфгидрильных групп в этих процессах // Биохимия. 1980. - Т. 45. - Вып. 5. - С. 794-801.

105. Thore A. Technical aspects of the bioluminescent firefly luciferase assay of ATP // Science Tools. 1979. - V. 26. - P. 30-34.

106. Nielsen C.O., Christensen B. The Enchytraeidae. Critical revision and taxonomy of European species. (Studies on enchytraeidae VII) // Natura Jutlandica. 1959. -V. 8-9. - P. 160.

107. Буров В. Новый вид Henlea из окрестностей города Иркутска: Henlea irkutensis п. sp. II Известия Биолого-Географического НИИ при Государственном Иркутском Университете. 1929. - Т. 4. - Вып. 2. -С. 99-129.

108. Michelson А. М. Purification and properties of Pholas dactylus luciferin and luciferase // Methods in Enzymology. 1978. - V. 57. - P. 385-400.

109. Мецлер Д. E. / Биохимия / M., Наука. 1980. - Т. 1.- 407 с.

110. Bjerrum J., Schwarzenbach G., Sillen L. G. Stability constants. P. 1: Organic ligands // L. Chem. Soc. 1957.

111. Горкин В.З. Роль металлов в каталитическом действии ферментов / Ферменты. / М., Наука. 1964. - С. 192 - 214.

112. Ленинджер А. / Биохимия / М., Мир. 1974.- 957 с.

113. Lynch R. V., Tsuji F. I., Donald D. H. Evidence for calcium requirements in the Cypridina bioluminescence reaction // BBRC. 1972. - V. 46. - N 4.-P. 1544-1550.

114. Johnson F. H., Shimomura O. Introduction to the Cypridina system // Methods in Enzymology. 1978. - V. 57. - P. 331-364.

115. Thompson E. M., Nagata S., Tsuji F. I. Vargula hilgendorfii luciferase: a secreted reporter enzyme for monitoring gene expression in mammalian cells // Gene. 1990. - V. 96. - P. 257-262.

116. Rajgopal S., Vijayalakshmi M. A. Metal-ion mediated interaction of luciferase with tetraiodofluorescein // J. Chromatography. 1984. — V. 315.-P. 175-184.

117. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов / М., Мир. -1976.-600 с.

118. Hastings J.W., Spudich J.A., Malnic G. The influence of aldehyde chain length on the relative quantum yield of the bioluminescent reaction of Achromobacter fischeri И J. Biol. Chem. 1963. - V. 238. - N 9. - P. 3100-3106.

119. Петушков В. H., Кратасюк Г. А., Кратасюк В. А., Белобров П. И. Термоинактивация бактериальной люциферазы // Биохимия. — 1982. -Т. 47. Вып.11. - С. 1773-1777.

120. Holzman Т. F., Baldwin Т. О. Reversible inhibition of the bacterial luciferase catalyzed bioluminescence reaction by aldehyde substrate: kinetic mechanism and ligand effects // Biochem. 1983. - V. 20. - N12. -P. 2838-2846.

121. Угарова H. H., Филиппова H. Ю., Березин И. В. Ингибирование люциферазы светляков Luciola mingrelica неорганическими солями // Биохимия. 1981. - Т. 6. - N 5. - С. 851-858.

122. Духович А. Ф., Угарова Н. Н., Березин И. В. Люцифераза светляков как комплекс белка с липидами // ДАН СССР. 1986. - Т. 289. - N 1. -С. 231-233.

123. Gerasimova М.А., Kudryasheva N.S. Effects of potassium halides on bacterial bioluminescence // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2001. -V. 66.-P. 218-222.

124. McGovern S. L., Helfand В. Т., Feng В., Shoichet В. K. A Specific mechanism of nonspecific inhibition // J. Med. Chem. 2003. — V. 46. -P. 4265-4272.

125. Ryan A. J., Gray N. M., Lowe P. N., Chung C. Effect of detergent on "promiscuous" inhibitors // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - P. 34483451.