Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биология ценного съедобного и лекарственного гриба шии-таке Lentinula edodes (Berk.) Pegler при интенсивном культивировании

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Биология ценного съедобного и лекарственного гриба шии-таке Lentinula edodes (Berk.) Pegler при интенсивном культивировании"

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України

Біологія цінного їстівного і лікарського гриба шіі-таке Lentinula edodes (Berk.) Pegler при інтенсивному культивувашіі

(03.00.2^- мікологія)

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

УДК 582 (284+287.23):635.8+581.5 581.14

Кірхгофф Буркхард

Київ- 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ботаніки ім.М.ПХолодного НАН України

Науковий керівник: д-р біол.наук, Лауреат Державної премії України, Бухало Ася Сергіївна головний науковий співробітник Інституту ботаніки ім.М.Г.Холодного

Офіційні оппонента: д-р біол. наук Коваль Елеонора Захарівна, консультанат Інституту мікробіології ім. Д, К. Заболотного НАНУ; канд. біол. наук Гродзинська Ганна Андріївна наук.співробітник Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного

Провідна установа: Донецький державний університет, кафедра фізіології рослин, Міністерство освіти України, мДонецк

Захист дисертації відбудеться Уг” &3 1998р. о/ї годині на засіданні

спеціалізованої ради Д50.06.01, в Інституті ботаніки ім.М.Г.Холодного за адресою: 252601, м.Київ, вул.Терещенківська, 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного

за адресою: 252025, м.Київ, вул. Велика Житомирська 28.

Автореферат розісланий ‘¿4^” 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Ільїнська А. П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вищий базидіальний гриб Lentinula edodes /Berk./ Pegler (шіі-таке) є цінним їстівним грибом, що має також числені і унікальні лікарські властивості. Антиканцерогенні, тонізуючі та імуностимулюючі властивості ші-таке відомі в традиційній східно-азіатській фітотерапії вже протягом багатьох сотень років (ICONES OF MEDICINAL FUNGI FROM CHINA, 1991; STAMETS, 1993). На протязі останніх десятирічь цей гриб став також об'єктом культивування в країнах Америки і Європи та детальних біохімічних і фармакологічних досліджень. Препарат протипухлинної дії з шіі-таке лентинан знайшов широке застосування у медицині (MIZUNO, 1996). Крім протиракової та імуномодулюючої дії, препарати з шіі-таке ефективно застосовуються з метою попередження і лікування вірусних і бактеріальних захворювань, нормалізації рівня холестерину в крові і процесів обміну в цілому (LELLEY, 1997). За обсягом виробництва шіі-таке займає сьогодні друге місце у світі після шампіньйону двоспорового. Високі смакові якості і фармакологічні властивості L. edodes та ряду продуктів, отриманих з нього, зумовлюють все зростаючий попит на цей гриб у світі, який традиційне екстенсивне вирощування, що й досі практикується в країнах Східної Азії, вже не спроможне задовольнити. Сучасні вимоги ринку до якості грибів, безперервності їх постачання споживачам, рентабельності виробничого процесу потребують застосування інтенсивних методів культивування. З цієї точки зору важливим є грунтовне дослідження біології шіі-таке в умовах штучної культури, створення банку штамів та умов їх вирощування, пристосування цього східно-азіатського гриба до наявних і доступних в європейських умовах субстратів, застосування нових біотехнологічних прийомів у культивуванні: пастеризації чи стерилізації субстратів; інокуляції субстратів рідким посівним міцелієм, отриманим у глибинній культурі; точних методів контролю якості субстратів, посівного міцелія тощо. Вивчення особливостей біології L. edodes в умовах інтенсивного культивування сприятиме також інтродукції в грибівництво і інших цінних їстівних і лікарських дереворуйнуючих грибів, як то Hericium erinaceum, Grifóla frondosa та інших, фармацевтичні властивості яких поглиблено досліджуються (HOBBS, 1996).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В 1996-1997 pp. робота виконувалась в рамках наукового співробітництва між Інститутом ботаніки ім. М. Г. Холодного НАНУ та компанією ВЕЗЕР-ШАМПІНЬЙОН (Німеччина) по проблемі дослідження та отримання імуностимулюючих та протиракових речовин із базидіальних макроміцетів.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановлення особливостей

біології 53 штамів цінного їстівного і лікарського гриба L. edodes в умовах інтенсивної культури та вивчення екологічних факторів, які підвищують біологічну продуктивність цього гриба на субстратах з буковою тирсою. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Перевірити ідентичність штамів мікотеки Інституту грибівництва і комерційних штамів шіі-таке шляхом тестування мультиалельної системи статевої несумісності та відібрати штами для впровадження у промислове грибівництво.

2. Провести фізіологічні дослідження селекгованих штамів, встановити, які екологічні фактори впливають на їх біологічну продуктивність, та відповідно олтимізувати компонентний склад субстратів з буковою тирсою, режими їх термічної обробки, зволоження та аерації.

3. Дослідити мікроструктури вегетативного міцелія із застосуванням методів світлової та скануючої електронної мікроскопії.

4. Визначити вплив альтернативних варіантів інокулюма на біологічну продуктивність шіі-таке. Розробити метод отримання рідкого посівного міцелія та способу його інокуляції.

5. Дослідити можливість застосування розробленого способу інтенсивного культивування шіі-таке для вирощування плодових тіл інших лігнотрофних видів їстівних лікарських базидіальних грибів Hericium erinaceum та Grifóla frondosa.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені біологічні особливості 53 штамів Lentinula edodes (шіі-таке), в тому числі штамів 4055, 4070, S610, LEL, 257, 39, 305, 307, 485, Shiil, Shii4, L-30, які використовувались в грибівництві, та встановлена генетична ідентичність ряду штамів, відомих під різними назвами. Із застосуванням методу скануючої електронної мікроскопії досліджені маркерні ознаки мікроструктур вегетативного міцелія на видовому рівні та одержані нові відомості про мікроструктури вегетативного міцелія Lentinula edodes, Hericium erinaceum та Grifóla frondosa (пряжки, стадія анаморфи, кристали на гіфах), що має значення для контроля чистоти та фізіологічного стану культур цих видів. З урахуванням досліджених фізіологічних властивостей штамів для їх культивування розроблені нові варіанти субсгратних сумішей на основі букової тирси (76-89%) з доданням пшеничних висівок (5-20%) та СаС03 (1%). Показано, що при деструкції найбільш продуктивних варіантів субстрату біологічний процес трансформації поживних речовин субстрату в біомасу гриба супроводжується зниженням значення pH субстрату від 6 до 4. Одночасно відносний вміст азоту зростає з 0.55% до 0.79% а. с. м. міцелію, вміст сирої золи збільшується вдвоє (від 1.825 до 3.925), вміст в субстраті лігніну і целюлози зменшується на 10-15%. У зв'язку з підвищенням вмісту

з

азоту співвідношення C:N змінюється від 107:1 до 74:1. Встановлені абіотичні екологічні фактори, які впливають на біологічну продуктивність селектованих штамів, і обгрунтовані оптимальні режими температурної обробки та зволоження субстратів і газообміну в них. Досліджений вплив на біологічну продуктивність шіі-таке альтернативних варіантів інокулюму і показана перевага (підвищення врожаю плодових тіл на 5-10%) рідкого, одержаного методом глибинного культивування, та паличкового посівного міцелію перед традиційним зерновим інокулюмом.

Практичне значення одержаних результатів. Для використання у промисловому грибівництві рекомендовано як найкращий селекгований штам шіі-таке LE-5 та варіанти культиваційних субстратних сумішей з буковою тирсою як основним та шротом кукурудзи, чи пшеничними висівками як додатковими компонентами. Для практичного використання рекомендовано ряд прийомів, які підвищують продуктивність цього гриба при культивуванні за інтенсивною технологією: проведення стерилізації при 100°С в середині пастеризаційної камери на протязі 24 годин; застосування кульків з фільтром типу BJ для посилення газообміну; зволоження субстратних блоків після першої хвилі плодоношення шляхом занурювання у воду на протязі 8 годин для ініціації наступних хвиль плодоношення. Розроблена оригінальна методика інокуляції в середину субстратних блоків рідким посівним міцелієм в концентрації 350 мг/л

а. с. м. за допомогою стерильної трубки і шприца. Встановлено, що застосування 0.5% розчину дезінфікуючого засобу P-З Oxonia aktiv запобігає ураженню культури шіі-таке конкурентними видами дейтероміцетів. Для використання у грибівництві селектовані продуктивні штами Hericium erinaceum та рекомендовані субстрати для одержання плодових тіл Н. erinaceum та Grifóla frondosa в інтенсивній культурі. Результати дослідження практично реалізуються в грибівницькій компанії ВЕЗЕР-ПІАМПІНЬЙОН (Німеччина).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота базується на матеріалах експериментальних досліджень, одержаних автором на протязі 10 років. Дисертантом досліджені біологічні особливості 53 штамів шіі-таке та на пілотному рівні проведений селекційний скринінг культиварів на 30 варіантах субстратів з буковою тирсою. Автором встановлений вплив основних абіотичних факторів (параметри режимів температурної обробки, газообміну, зволоження субстратів та ін.) на біологічну продуктивність шіі-таке при інтенсивному культивуванні.

Апробація результатів роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на засіданнях відділу мікології Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, Інституту грибівництва у Крефельді; 4-му Міжнародному Мікологічному Конгресі (ІМС4), Регенсбург,

1991; 13-му Конгресі наукових проблем культивування їстівних грибів (13-th ICSC), Дублін, вересень 1991 p., 2-й Міжнародній конференції “Біологія грибів і грибні продукти”, Пенсильванія, США, липень 1996 p., X з’їзді Українського ботанічного товариства, Полтава, травень 1997 p., 7-му з'їзді Німецького товариства мікології і ліхенології, Регенсбург, жовтень 1997 р. Дослідження з культивування на пілотному рівні виконувались в компанії ВЕЗЕР-ШАМПІНЬЙОН, Хессіш-Ольдендорф, Німеччина та Інституті ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України. Частина роботи виконана у дослідницькому Інституті грибівництва сільського господарства області Рейнланд у Крефельді, Німеччина та компанії АУПІ, Вайден, Німеччина. Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 праць, з них 3 статті у наукових журналах, 2 статті в збірнику доповідей міжнародної конференції "Mushroom Biology and Mushroom Products" (1996), а також 3 роботи в тезах доповідей міжнародних та української конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, 7-й розділів експериментальної частини, висновків та списку літератури, що містить 277 найменувань. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту, ілюстрована ЗО таблицями і 43 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури

В огляді літератури відображені систематичне положення, морфологія та світове виробництво лікарського їстівного базидіоміцета L. edodes. грунтовно освітлені питання культивування цього гриба за інтенсивною технологією, включаючи скринінг штамів, контроль чистоти культур, виробництво посівного міцелія, вплив основних екологічних факторів на продуктивність цього виду. Детально обговорені література і матеріали стосовно поживного складу L. edodes, його лікарських властивостей, а також лікарських властивостей ряду інших, переважно лігнотрофних, видів базидіальних грибів.

Матеріали і методи

У роботі використані 53 культивари L. edodes, отримані з мікотеки Інституту грибівництва сільського господарства області Рейнланд, Німеччина (Versuchsanschtalt fer Pilzanbau) та від фірм-виробників посівного міцелія. Культури підтримувались на мальц-пептонному агарі (МПА).

Для дослідження генетичної подібності культиварів використали метод тестування мультиалельної системи статевої несумісності. При ідентифікації подібності використовували такі критерії: реакція сумісності у місцях контакту міцеліальних колоній, текстура колонії, утворення пігменту на поверхні міцелія.

Мікроскопічні дослідження проводили у світловому мікроскопі Еі^ауаі, Німеччина, за загальноприйнятою методикою. Мікроструктури вегетативного міцелію досліджувались за модифікованим методом (БУХАЛО, 1988) в скануючому електронному мікроскопі компанії Джеол, Японія, при збільшенні 1500-18000.

В усіх експериментах зерновий посівний міцелій готували за БТОІХЕІІ (1962) та ЬЕІХЕУ е( аі. (1976) на основі зерна жита.

Для отримання глибинного посівного міцелія шіі-таке культуру вирощували в ферментері "Віовіаі V” компанії Браун, Німеччина ємкістю 12 л та в 300 мл колбах Ерленмейера з 200 мл середовища. Для культивування були використані рідкі поживні середовища різного складу, pH всіх рідких поживних середовищ був доведений до 4.5 шляхом додавання 0.5%-ї НС1. Після автоклавування колби стерильно інокулювали 5-ма міцеліальними дисками діаметром 8 мм, вирізаними з колонії, вирощеної на агарі в чашках Петрі. Культуру вирощували при 25°С у шести повторностях.

Кількість міцелія визначали по абсолютно сухій масі (а. с. м.) після фільтрації та висушування при 105°С.

Наробку біомаси міцелія штама шіі-таке ЬЕ-5 в ферментері проводили при 25°С, легкому механічному обертанні і стерильній подачі повітря протягом 710 днів у розчині меляси (20 г/л Н20). Інокуляцію проводили 2 л міцеліальної суспензії, отриманої в культурі на качалці.

Інокуляцію субстратів проводили безпосередньо з інокуляційного апарату власної конструкції за допомогою насоса і стерильного шлангу з ін'єкційним каналом.

Здатність міцелія до регенерації і життєздатності при зберіганні в умовах охолодження оцінювали за ростом міцеліальних фрагментів, також оцінювали його інфікованість сторонньою мікрофлорою.

Рідкий посівний міцелій, розведений в 2.5-, 5.0- і 10 разів стерильною водою, був тестований на здатність утворювати плодові тіла. Для інокуляції використовували по 20 і 100 мл, порівнюючи з 2.5% зернового посівного міцелія штама ЬЕ-5.

При тестуванні паличкового інокулюма загострені букові палички замочували у воді 2 дні, автоклавували і інокулювали міцелієм штаму ЬЕ-5. На 14-21-й день після інокуляції палички повністю обростали міцелієм шіі-таке і були використані для інокуляції блоків.

Як основний субстрат для сумішей був використаний гранулят деревини бука (Бг) з величиною гранул 0.3-2.0 мм (фірма Бранденбург, Гольденштедт). Всі інші складові субстрату були отримані з торгівельної мережі.

Складові компоненти субстратів були змішані у сухому вигляді в бетономішалці і зволожені водою до 60-63% вологості. Як стандартний

субстрат була використана суміш, що складалась з 80% букової тирси і 20% кукурудзяного борошна. Субстрат був поміщений у термостійкі пластикові кульки з повного вагою 2.5-4.0 кг. У дослідах були використані як спеціальні кульки з фільтрами (BJ, ВК та BU), так і звичайні кульки, закриті целюлозним корком з пластиковим кільцем. Заключно субстрат піддавали термічній обробці, в залежності від мети досліду при температурі 70-12ГС.

Визначення значення pH проводили потенціометрично з використанням комбінованого скляного електрода (Schott Н61; рН-метр 530.WTW); (NEBE, 1982). Вміст сухої речовини в субстратних сумішах визначали після висушування проб при 105*С і зважування після охолодження в ексикаторі. Загальний вміст азоту та вміст сирої золи селектованих субстратних сумішей визначали за методом Кьельдаля перед інокуляцією субстрату і наприкінці періоду збору врожаю. Визначення вмісту лігніну та целюлози проводили на установці ROHFIX (VDLUFA, 1976).

Після стерилізації субстрат охолоджували до 25-30°С і інокулювали. Проростання міцелія відбувалось в темному приміщенні при 25°С і 60-80% відносної вологості повітря. Фаза проросташія тривала 70-105 днів. Під час цієї фази проводили оцінку росту міцелія, формування примордіїв і частоти появи конкурентних грибів.

Утворення плодових тіл і плодоношення відбувалось у приміщенні з температурою 15-180С, 90-95% відносної вологості повітря, концентрації С02 нижче 1.500 ррт і 150 Lux освітлення. Звільнені від пластикових кульків, пророслі міцелієм шіі-таке субстратні блоки виставляли на полиці. Облік врожаю плодових тіл починали на 7-10 добу.

Для отримання додаткових хвиль плодоношення субстратні блоки занурювали у воду на 8-28 год. Біологічну продуктивність оцінювали за показниками біологічної ефективності (БЕ, співвідношення маси свіжих плодових тіл до а. с. м. субстрату), маси і кількості плодових тіл. Субстратні блоки занурювали у розчин води з 0.1 мг/л стрептоміцину, 1% нітрату амонія, 1% шроту екстракції сої і 1% меляси.

Як дезинфікуючі засоби були використані P3-Oxonia aktiv (Хенкель) і DSC (Менно-Хемі) в концентрації 0.3%, 0.5%, 0.75%, 1.0% і 1.5%.

Для обчислення експериментальних даних була застосована комп'ютерна програма PC Statistik фірми Топ-Софт, Ганновер, Німеччина. Результати дослідів оцінювали за допомогою варіаціонного аналізу. Перевірка значущості проведена за допомогою F-тесту, статистича оцінка окремих різниць проведена через обрахування різниці граничних значень за допомогою Multiplan t-тесту.

РЕЗУЛЬТАТИ

Визначення генетичної ідентичності штамів У зв’язку зі значною кількістю використаних у роботі штамів шіі-таке ми застосували простий і швидкий метод тестування мультиалельної системи статевої несумісності, успішно апробований іншими дослідниками (SCHbNEMANN, 1988) для встановлення ідентичних або близьких культиварів. Проведене тестування колекційних штамів з мікотеки Інституту грибівництва і комерційних штамів шіі-таке дозволило встановити генетичну ідентичність комерційних штамів S-600, 4078, Shii 2 та LE-307 з культиваром LE-5 (мікотека Інституту грибівництва), а також ідентичність штамів з мікотеки Інституту грибівництва LE-755, LE-767, L-XI, L-l Nr. та 465 між собою. Досліди на плодоношення з культивованими штамами LEL 307, S-600

і LE-5 чітко підтвердили ці зроблені in-virtro експерименти: за врожаєм плодових тіл, перебігом фази плодоношення і середньою вагою плодових тіл ці штами виявились майже ідентичними (KIRCHHOFF, 1991).

Дослідження мікроструктур в культурах Lentinus edodes. Hericium erinaceum.

Grifula frondosa

Проведене методами світлової та скануючої електронної мікроскопії дослідження структур вегетативного міцелія показало, що у L. edodes, Н. erinaceum та G. frondosa наявні пряжки - характерні структури вищих базидіоміцетів. Стадія анаморфи (термінальні та апікальні хламідоспори) виявлена у Н. erinaceum та G. frondosa. Утворення кристалів характерне для культур L. edodes та Н. erinaceum. В культурах L. edodes на шкірястих ділянках колонії утворюються гіфи дендроїдного типу із загостреними кінчиками, а у G. frondosa розгалужені тонкі гіфи - дихогіфідії. Описані вище морфологічні ознаки можуть бути використані для контролю чистоти та фізіологічного стану культур даних видів у біотехнологічному процесі.

Вплив інокулюма на продуктивність шіі-таке Біологічна продуктивність базидіальних макроміцетів при інтенсивному культивуванні в значній мірі залежить від типу та фізіологічного стану інокулюма, способів інокуляції субстратів. Нами досліджувався вплив альтернативних варіантів інокулюма: рідкого глибинного, паличкового та традиційного зернового посівного міцелія. Спеціальна увага була приділена розробці методу одержання рідкого інокулюма та способів його внесення до субстратних блоків.

Порівняльне дослідження вищезгаданих трьох типів інокулюма показало перевагу рідкого та паличкового інокулюма у порівнянні з зерновим, як видно на рис. 1. Найбільш ефективним виявилось використання рідкого інокулюма,

коли обростання субстрату відбувалось у спеціальних пластикових кульках з фільтрами, які забезпечували достатню аерацію.

Для вирощування глибинного міцелія було випробувано б типів рідких середовищ. Найвищий вихід біомаси в глибинній культурі був отриманий на середовищі з 50 г меляси і на середовищі з ЗО г мальц-екстракту і 5 г пептону на л води. Встановлено зниження регенераційної здатності міцеліальних фрагментів рідкого посівного міцелія при збільшенні часу його зберігання понад 25 днів та підвищенні температури зберігання понад 20°С.

зол

25,0

е-

І 15,0

Я

5 10я

5,0 0,0

Рис. 1. Врожайність плодових тіл шіі-таке в залежності від типу інокулюма Примітка. * - кульки з фільтром

Для інокуляції глибинним посівним міцелієм була розроблена методика введення інокулюма механічно за допомогою стерильного шлангу і шприца в середину субстратного блоку. Найвищий врожай був нами отриманий при застосуванні 50 мл рідкого посівного міцелія на поверхню субстратних блоків вагою 2.5 кг. Враховуючи значні витрати на виробництво глибинного міцелія у ферментері, ми перевірили вплив його концентрації на врожай плодових тіл. Найвищий врожай ми отримали при 10-кратному розведенні 100 мл рідкого посівного міцелія (350 мг/л а. с. м.). При застосуванні глибинного інокулюма і введенні його в середину субстратних блоків ми отримали врожай плодових тіл на 15% вищий, ніж при використанні зернового інокулюма.

Вплив субстратів на біологічну продуктивність шіі-таке Відомо, що склад субстратів є одним із найважливіших екологічних факторів, які впливають на біологію вищих базидіоміцетів в умовах культури і в значній мірі обумовлюють продуктивність культур (ЬЕІХЕУ, 1991). У наших дослідженнях велика увага була приділена вивченню та підбору компонентного складу субстратів, які забезпечують рясний ріст міцелія та високу врожайність

зерясвж* лавдковхй рідогї рідагї*

Тнашахудои

плодових тіл селектованих штамів шіі-таке. Всього було досліджено ЗО варіантів субстратних сумішей. Використані нами врожайні варіанти субстратів характеризуються такими показниками: швидка колонізація субстрату і рясне утворення примордіїв, слабке ураження субстрату конкурентними грибами. Найвища врожайність плодових тіл отримана на субстратах, основу яких складала букова тирса. Нам не вдалося виявити однозначно найкращої субстратної суміші для всіх використаних культиварів шіі-таке. Рекомендованими для культивування багатьох штамів можуть бути варіанти Nr. 1, Nr. 12 і Nr. 16, основним компонентом яких є букова тирса (75-83%), додатковими компонентами: шріт кукурудзи (5-25%) та пшеничні висівки (510%). На цих субстратах одержані досить високі і стабільні врожаї, вони не містять небезпечних для здоров'я компонентів (типу деревного клею) і порівняно слабко уражуються конкурентними мікроорганізмами.

Оптимальне співвідношення C:N у субстраті, визначене нами, становить 80130:1. Подальше збагачення субстрату додатковими джерелами азоту збільшує небезпеку заселення субстрату пліснявими грибами. Обростання субстрату міцелієм шіі-таке і утворення плодових тіл не корелюють зі ступенем розкладу культурою гриба низькомолекулярних вуглеводів у субстраті.

При дослідженні високоефективних штамів на селектованих врожайних субстратах у створених нами умовах експериментів було встановлено перевагу культивара LE-5 на всіх досліджених середовищах як за врожайністю, так і за якістю плодових тії. Культивар HU-1 мав найвищу врожайність плодових тіл, якість яких, на нашу думку, може бути поліпшена шляхом зниження температури у приміщенні або при використанні субстратів з більш низьким вмістом азоту (табл. 1).

Для отримання невеликих світлобурих плодових тіл, що мають підвищений попит, найбільш підходить штам LE-756. Культивари з темними плодовими тілами, як, наприклад LE-6/2, Nr. 465, "MORI" і W-305 також можуть бути застосовані для інтенсивного культивування. Нами були перевірені тридцять субстратних сумішей на врожайність з високопродуктивним культиваром LE-5. Значний вихід плодових тіл було отримано на субстратних варіантах Nr. 9 (89% букової тирси, 15% пшеничних висівок, 1% СаС03) і Nr. 28 (74% букової тирси, 10% пшеничних висівок, 10% пшеничної соломи, 5% чорного торфу,

1% СаС03). Проте на цих субстратних сумішах спостерігались також випадки загибелі культури, викликані переважно ураженням субстрату видами роду Trichoderma.

Абіотичні Фактори, які впливають на ріст і плодоношення Великий, а часто вирішальний вплив на біологічну продуктивність їстівних грибів в інтенсивній культурі справляють такі екологічні фактори як температура, вологість, газообмін, наявність певних хімічних речовин, тощо.

При вивченні впливу цих факторів на продуктивність селектованих штамів шіі-таке встановлена залежність врожайності досліджених штамів від температурного режиму обробки субстратів, ступеня їх зволоженості та газообміну в субстратах на стадії їх колонізації міцелієм, внесення дезинфікуючих хімічних речовин.

Вищу врожайність плодових тіл шіі-таке забезпечує такий режим термічної обробки субстрату, коли всередині пастеризаційної камери протягом 24 годин підтримується температура 100”С у порівнянні із застосуванням нижчих температур чи коротшого часу пастеризації.

Табл. 1. Середні врожайність і вага плодових тіл та біологічна ефективність (БЕ) досліджених штамів шіі-таке на субстраті з 80% букової тирси і 20%

шроту кукурудзи (блоки 2.5 кг)

Штам Середній вихід плодових тіл, г/блок Середня вага плодових тіл, г БЕ, %

ни-і 493.5 12.85 55.27

ІЕ 5 489.0 11.37 54.77

иім 442.0 12.66 49.51

Ни-2 414.5 11.64 46.43

ЬЕ-756 413.0 7.65 46.26

\V-305 407.5 29.32 45.64

№. 465 394.0 40.26 44.13

"МОШ" 390.0 42.39 43.68

ЦЕЗ 366.0 12.58 40.99

І.Е 6/2 337.0 18.32 37.75

№. 701 330.5 29.50 37.02

10-1 329.5 21.12 36.91

"ТАГ 287.5 23.96 32.20

13-1 230.5 22.16 25.82

ЬХ-2 224.5 24.94 25.15

ЬЕ-767 131.5 29.87 14.73

В 505 113.5 20.27 12.71

ТМІ 358 108.5 41.73 12.15

ТМІ 1115 104.0 29.79 15.68

ЬХ-1 88.5 68.08 9.91

ЬЕ-754 76.5 69.55 8.75

ТМІ 241 71.0 35.50 7.95

22-1 37.5 46.87 4.20

ЬЕ-236 36.0 72.00 4.03

ІЛі-757 30.0 42.86 3.36

ТМІ 514 6.0 30.00 0.67

ЦЕ-765 0.0 0.00 0.00

ТМІ 101 0.0 0.00 0.00

49725 0.0 0.00 0.00

Вміст вологи в субсгратних блоках є одним з важливих екологічних факторів, який лімітує утворення плодових тіл шіі-таке в 2-ій-З-ій хвилях

плодоношення. На прикладі штаму LE-5 показано, що на субстратних блоках вагою 2.5 кг занурювання у воду на протязі 8 годин є достатнім для ініціації наступної хвилі плодоношення. Збільшення часу занурювання не призводить до помітного росту врожаю.

Збагачення води, у яку занурювались субстратні блоки, поживними речовинами, достовірно не збільшувало кількості плодових тіл під час 2-ї та 3-ї хвиль плодоношення.

Нами показано, що на врожайність плодових тіл впливає газообмін в субстратних блоках. Найбільш ефективний стерильний газообмін забезпечується при застосуванні кульків з фільтром типу BJ.

Для запобігання ураження субтрату видами роду Trichoderma під час фази плодоношення ефективним було обприскування блоків нетоксичними дезинфікуючими засобами, особливо 0.5%-го розчину РЗ-Охопіа aktiv.

Культивування Hericium erinaceum та Grifóla frondosa.

Схема культивування, розроблена нами для L. edodes, була використана з незначними модифікаціями і для вирощування інших цінних видів їстівних і лікарських грибів, а саме Н. erinaceum та G. frondosa, які також відносяться до екологічної групи лігнотрофів і характеризуються подібними умовами вегетативного росту і плодоношення.

Окремими дослідниками показано (STAMETS, 1993), що Н. erinaceum та G. frondosa ростуть і плодоносять на широкому спектрі субстратів як у природі, так і в умовах штучного культивування. Проте для успішного маркетингу цих видів грибів важливим є не тільки врожай, але й якість плодових тіл. Використаний нами субстрат БК (букова тирса 80%, шріт кукурудзи 20%), задовольняє цим вимогам. В експериментах з Н. erinaceum та G. frondosa на цьому субстраті ми отримали високий врожай плодових тіл. Низьку врожайність Н. erinaceum, і відсутність плодоношення G. frondosa в наших дослідах на інших субстратах можна пояснити більш низьким вмістом в них азоту у порівнянні з субстратом БК. В окремих дослідах з G. frondosa ми спостерігали припинення розвитку примордіїв та утворення деформованих плодових тіл на ранній стадії плодоношення, яке могло бути викликане несприятливими умовами навколишнього середовища або недостатньою деградацією субстрату ферментними системами цього гриба. Визначення абіотичних факторів, що впливають на плодоношення G. frondosa, потребує проведення подальших досліджень.

При дослідженні Н. erinaceum були відібрані для промислового використання високоврожайні штами Неї, Не2, а також штами Неб та НеІЗ, які характеризуються утворенням плодових тіл високої якості. Селекційний відбір штамів G. frondosa, придатних для промислового культивування, має бути

продовжений на більш широкому колі культур.

При виробництві плодових тіл H. erinaceum у Європі застосовують переважно зерновий міцелій (HIRT et al., 1994). Виробництво рідкого посівного інокулюма, зважаючи на значні продукційні кошти, є економічно доцільним лише при умові розвиненого ринку споживання цих грибів. На жаль до теперішнього часу ринок збуту плодових тіл Н. erinaceum та G. frondosa у Європі, на відміну від країн Далекого Сходу (ОЕІ, 1991), все ще не існує. Проте, у майбутньому, виробництво рідкого посівного міцелія у невеликому об'ємі при постійному контролі чистоти виробництва може знайти своє застосування. Найкращими середовищами для отримання максимального виходу біомаси глибинного міцелія Н. erinaceum виявилось средовище з мелясою та пептоном, G. frondosa краще ріс у глибинній культурі на розчині біомальцу. На цих середовищах ми отримали задовільні результати для обох видів як в колбах на качалці, так і в ферментері.

Таким чином, розроблені нами на прикладі шіі-таке підходи до культивування цінних їстівних лікарських базидіальних макроміцетів з екологічної групи лігнотрофів відкривають перспективу впровадження у європейське грибівництво нових видів, зокрема Н. erinaceum та G. frondosa.

ВИСНОВКИ

1. Досліджена біологія та проведений скринінг 53 штамів нового д ля європейського грибівництва цінного їстівного лікарського вищого базидіального гриба Lentinula edodes /Berk./ Pegler (шіі-таке) і визначені фактори, що впливають на їх ріст і плодоношення при інтенсивному культивуванні. Розроблені оригінальні композиції культиваційних субстратів, запропоновані альтернативні варіанти інокулюму та технологічні прийоми, які забезпечують високу біологічну продуктивність селектованих штамів L. edodes.

2. Показано, що на підвищення біологічної продуктивності досліджених штамів та запобігання ураженню сторонньою мікрофлорою на субстратах з буковою тирсою вшивають такі екологічні фактори як вміст азоту (0.390.59%), співвідношення азоту і вуглецю (75-100:1) в субстраті, значення pH субстрату (5.8-6.5), а також режими стерилізації (24 год при 100°С) і вологості (61-64%) субстратів.

3. Досліджені біологічні особливості та проведений скринінг штамів L. edodes на ЗО варіантах субстратних сумішей (блоки 2.5 та 4.0 кг). В результаті для комерційного використання на субстратах з буковою тирсою як основним та шротом кукурудзи, сої чи пшеничними висівками як додатковими компонентами рекомендований штам LE-5.

4. Проведене тестування колекційних штамів з мікотеки Інституту грибівництва у Крефельді і комерційних штамів L. edodes на їх генетичну

ідентичність. В результаті встановлено, що комерційні штами S-600, 4078, Shii

2 та LE-307 ідентичні між собою та із штамом LE-5 з колекції Інституту грибівництва, а також доведена ідентичність штамів LE-755, LE-767, L-XI, L-1 та Nr. 465 з колекції Їнстшута грибівництва.

5. Методами світлової та скануючої електронної мікроскопії досліджені мікроструктури вегетативного міцелію L. edodes, H. erinaceum та G. frondosa та встановлені маркерні ознаки на видовому рівні (пряжки, стадія анаморфи, кристали на гіфах), які можуть бути використані для контроля чистоти та фізіологічного стану культур досліджених видів.

6. Показано, що при деструкції найбільш продуктивних варіантів субстрату біологічний процес трансформації поживних речовин субстрату в біомасу гриба супроводжується зниженням значення pH субстрату від 6 до 4. Одночасно відносний вміст азоту зростає з 0.55% до 0.79% а. с. м. міцелію, вміст сирої золи збільшується вдвоє (від 1.825 до 3.925), вміст лігніну і целюлози в субстраті зменшується на 10-15%. У звязку з підвищенням вмісту азоту співвідношення C:N змінюється від 107:1 до 74:1.

7. Досліджений вплив на біологічну продуктивність шіі-таке альтернативних видів інокулюма. Встановлено, що застосування рідкого та паличкового інокулюмів, порівняльно з традиційним зерновим, призводить до збільшення врожаю плодових тіл на 5-15%. Найкращі результати одержані при інокуляції за розробленою автором методикою в середину субстратних блоків глибинно вирощеним міцелієм, у концентрації 350 мг/л а. с. м. міцелія.

8. Розроблений спосіб одержання рідкого інокулюма на качалках у 12-літровому

Batch-ферментері. Для глибинного культивовання міцелія L. edodes запропоновані поживні середовища з мелясою, а також з мальц-екстракгом і пептоном.

9. Встановлений вплив абіотичних факторів на біологію L. edodes, що дозволило рекомендувати ряд прийомів, які підвищують продуктивність цього гриба при культивуванні за інтенсивною технологією: проведення стерилізації при 100°С в середині пастеризаційної камери на протязі 24 годин; застосування кульків з фільтром типу BJ для посилення газообміну; зволоження субстратних блоків після першої хвилі плодоношення шляхом занурювання у воду на протязі 8 годин для ініціації наступних хвиль плодоношення; використання як дезинфікуючого засобу 0.5% P3-Oxonia activ.

10. Показано, що розроблений інтенсивний спосіб культивування шіі-таке може бути застосований у європейському грибівництві також для культивування інших лігнотрофних видів їстівних лікарських базидіальних макроміцетів Hericium erinaceum (Bull.: Fr.) Pers. та Grifóla frondosa Dicks.: Fr..

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

KIRCHHOFF В. Möglichkeiten und Tendenzen zur Produktivitfltssteigerung in der Shii-take (Lentinus edodes) Intensivkultur // Mitteilungen der Versuchsanstalt fbr Pilzanbau der Landwirtschaftskammer Rheinland. - 1991. - №14. - S. 27-33. KIRCHHOFF B. Einige Aspekte zur Verbesserung der Shii-take -Intensivekulture in Deutshland // Mitteilungen der Versuchsanstalt fur Pilzanbau der Landwirtschaftskammer Rheinland.-1992.- N°15.-S.25-29.

KIRCHHOFF B. Biotechnological Investigations of Hericium erinaceum (BuE.: Fr.) Pcrs. Bag-Log Cultivation to Increase Yield // Mushroom Biology and Mushroom Products / Ed. B. J. Royse. Proceeding of the Second International Conference, University Park, Pennsylvania (USA). - 1996. - P. 401-406.

KIRCHHOFF B. Investigations of Genotypes and Substrates for the Fruitbody Production of Grifola frondosa Dicks.: Fr. // Mushroom Biology and Mushroom Products / Ed. B. J. Royse. Proceeding of the Second International Conference, University Park, Pennsylvania (USA). -1996. - P. 401-406.

KIRCHHOFF B., LELLEY J. Liquid spawn of Lentinus edodes and it's efficiency to the fruitbody production in "bag log" cultivation // Abstracts. Fourth International Mycological Congress. - Regensburg (Germany). - 1990. - P. 239.

KIRCHHOFF B., LELLEY J. Investigations of Shii-take (Lentinus edodes (Berk.) SING.)) bag log cultivation to increase the yield in Germany // Science and cultivationof edible fungi / Proceedings of 13 International Congress of the science and cultivation of edible fungi, Dublin (13 September 1991). - 1991. - P. 509-516. БУХАЛО A. C., КІРХГОФФ Б., ГРИГАНСЬКИЙ А. Ф. Скринінг культур лікарського базидіального гриба Hericium erinaceum (Bull.: Fr.) Pers. // Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття. / Ред. K. М. Ситник. Матеріали X з'їзду Українського ботанічного товариства. - Полтава (Україна). - 1997. - С. 86.

KIRCHHOFF В., BUCHALO A. S. Biotechnologische Untersuchungen zur Fruchtkmperproduktion des Speisepilz Hericium erinaceum (Bull.: Fr.) Pers., Igelstachelbart auf Substratblucken // Abstracts. Tagung der Gesellschaft fbr Mykologie und Lichenologie. - Regensburg (Deutschland). - 1997. - S. 26.

Кірхгофф Б. Біологія цінного їстівного і лікарського гриба шіі-таке Lentinula edodes (Berk.) Pegler при інтенсивному культивуванні.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.21 - мікологія.- Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України. Київ, 1998.

Дисертацію присвячено дослідженню біології їстівного лікарського базидіального мак-роміцета шіі-таке Lentinula edodes в умовах інтенсивного

культивування. Проведена се-лекція врожайних штамів і тестування їх на генетичну ідентичність, досліджені мікроструктури вегетативного міцелія та визначені основні екологічні параметри, що впливають на біологічну продуктивність L. edodes в інтенсивній культурі (компонентний склад субстратів, вміст в них азоту та співвідношення C:N, значення pH субстратів, режими стерилізації, зволоження і газообміну субстратних блоків, вплив конкурентних мікроорганізмів). Показано, що застосування альтернативних до зернового видів посівного інокулюма (глибинний та паличковий інокулюм) забезпечують підвищення продуктивності досліджених штамів. Розроблений дисертантом інтенсивний спосіб культивування шіі-таке був використаний для одержання плодових тіл інших видів лікарських їстівних лігнотрофних базидіоміцетів Hericium erinaceum та Grifóla frondosa.

Ключові слова: шіі-таке, високопродуктивні штами, інтенсивне культивування, екологічні фактори, композиція та оптимізація субстратів, режими термічної обробки, глибинний інокулюм.

Кирхгофф В. Биология ценного съедобного и лекарственного гриба шии-таке Lentinula edodes (Berk.) Pegler при интенсивном культивировании.- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.21 - микология.- Институт ботаники им. Н. Г. Холодного НАН Украины. Киев, 1998.

Диссертация посвящена исследованию биологии ценного съедобного лекарственного базидиального макромицета шии-таке Lentinula edodes в условиях интенсивного культивирования. Проведена селекция урожайных штаммов и их тестирование на генетическую идентичность, исследованы микроструктуры вегетативного мицелия и определены основные экологические параметры, которые влияют на биологическую продуктивность L. edodes при интенсивном культивировании (компонентный состав субстратов, содержание в них азота и соотношение C:N, значение pH субстратов, режимы стерилизации, увлажнения и газообмена субстратных блоков, влияние конкурентных микроорганизмов). Показано, что использование альтернативных зерновому видов посевного инокулюма (глубинный и палочковый инокулюм) обеспечивают заметное увеличение продуктивности исследованных штаммов. Разработанный диссертантом интенсивный метод культивирования шии-таке был использован для получения плодовых тел других видов лекарственных съедобных лигнотрофных базидиомицетов Hericium erinaceum и Grifóla frondosa. Ключевые слова: шии-таке, высокопродуктивные штаммы, интенсивное культивирование, экологические факторы, композиция и оптимизация субстратов, режимы термической обработки, глубинный инокулюм.

Kirchhoff B. Biology of valued edible and medicinal mushroom shii-take Lentinula edodes (Berk.) Pegler in intensive cultivation.- Manuscript.

Thesis for degree of Candidate of biological science on the speciality 03.00.21 -mycology.- M. G. Kholodny Institute of botany NAS of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to investigations on the biology of valued edible and medicinal basidial macromycete Lentinula edodes under the conditions of intensive cultuvation.

Selection of high productive strains was carried out, the microstructures of the vegetative mycelium were determined, the main ecological factors affecting the biological productivity of L. edodes under the intensive cultivation (component composition of substrates, content of N and C:N ratio, pH value of the substrates, regims of thermic treatment, soaking and gas exchange of substrate blocks and the influence of competitive microorganisms) were determined. It is showed that the use of alternatives to grain kinds of inoculum (liquid and stick spawn) provided evident increase of productivity of the studied strains. Intensive method of shii-take cultivation proposed from the dissertant was used for fruitbody production of other medicinal edible lignotrophic Basidiomycetes like Hericium erinaceum and Grifola frondosa.

Key words: shii-take, high productive strains, intensive cultivation, ecological factors, formulation and optimisation of substrates, liquid spawn, heat treatment regimes