Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ ДО НИТРАТОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ (ОПЫТЫ СО СТЕРИЛЬНЫМИ КУЛЬТУРАМИ)

ВАК РФ 06.01.04, Агрохимия

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ ДО НИТРАТОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ (ОПЫТЫ СО СТЕРИЛЬНЫМИ КУЛЬТУРАМИ)"

л-

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи САВИДОВ Николай Александрович

УДК 631.811.1

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ ДО НИТРАТОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ (опыты со стерильными культурами)

Специальность 06.01.04 — агрохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологической химии Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Научный руководитель академик ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор Б. А. Ягодин.

Официальные оппоненты доктор биологических на>к, профессор Н. П. Львов, кандидат биологических наук, доцент Н. Г. Ракипов.

Ведущее предприятие — Долгопрудная агрохимическая опытная станция, НИУИФ, НПО «Минудобрений»

Защита состоится « » . ......1991 г

п « /5>> час /Ъна заседании специализированного совета К 1203501 в Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА. Автореферат разослан « ».......1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биолс ских наук, ст. научный

М. В. Вильяме

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Процессы взаимопревращения окисленных и восстановленных форм азота играют важную роль в жизнедеятельности высших растений. Значимость этих процессов для обмена веществ в растениях определяется необходимостью восстанавливать нитрати до аммония, поскольку азот поступает в растения, главным образом, в форме нитратов^ в то время как важнейшие азотсодержащие органические вещества - белки.и нуклеиновые кислоты - содержат азот в восстановленном состоянии. - • : '

В настоящее время усилиями многих исследователей в значительной степени установлены механизмы восстановления нитратов, роль в этих процессах молибденсодержащих белков - нитратредуктаз. Вместе . с тем, несмотря на неоднократные попытки, ' существование для высших растений обратного процесса -" окисления аммония до нитратов, .- осуществляемого низшими организмами, строго не доказано. Из этого следует, что растения обладают незамкнутым путём обмена окисленныхи восстановленных форм азота. Доказательство способности высших растений окислять аммоний до нитратов означало бы' существование' замкнутого цикла взаимопревращений различных форм азота в растениях,'.а так как цикличность обменных процессов является неотъемлимым свойством живых организмов, этот вывод может иметь важное концептуальное значение. •

Подтверждение существования нитрификации высших. растений, также как и денитрификацш, * будет способствовать формированию новых представлений о путях эволюции,систем азотного метаболизма и обмена ведаств живых организмов. • ; ;

, Избыточное накопление ' нитратов в . растениях нежелательно в

.....Цьнт^аяьйля-

научная библиотека

I «мювкае а-сядэмии

•»«. К. А. Тимирязева Ин^ые__

сельскохозяйственном производстве, так как нитраты токсичны для человека и животных. В настоящее время единственным источником нитратов в растениях, считается почва, однако нитрификация в растениях означает возможность накопления эндогенных нитратов. Знание скорости нитрификации для отдельных сельскохозяйственных культур и размеров накоплении эндогенных нитратов в сельскохозяйственной продукции позволит правильнее определить источник нитратов в растениях и выорать адекватный способ снижения уровня нитратов в сельскохозяйственной продукции.

Таким образом, существующая в настоящее время неопределенность представлений в этой области агрохимии и физиологии растений и важность окончательного вывода о возможности нитрификации в растениях для научной и практической деятельности человека определяют актуальность данного исследования

Цель и задачи исследований Целью работы являлось доказательство способности высших растений окислять аммоний до нитратов.

В задачи исследований входило:

1. Шлучение аксеничной культуры растений как из поверхностно стерилизованных семян, так и из стерильных меристем, при соблюдении условий полной стерильности и применении различных методов контроля за стерильностью а течении периода вегетации.

2. Разработка точных методов определения количества нитратов эндогенного г.роисхо вдения, которые Ектеч^иг использование »ечер

«его М предшественника, выделение ив раетолгч, I *р 1 гируюсее отсутствие пр.шееи а^ота из других источнике» и оар<.д^ленл_> изо тонного состава

3. Прямое доказательство образования нитратов из меченного

15 - •

N предшественника - аммония, введёшюго в питательную смесь в

начале вегетации.

4. Определение размеров накопления эндогенных нитратов у исследуемых видов растений.

Впервые доказано окисление аммония до нитратов у растений. • полученных из ашкапьных меристем с помощью культуоы ткани. Полученные. данные изменяют существующие представления о путях накопления нитратов в высших растениях.. ,

Разработана методика выделения и точного определения изотопного состава нитратного азота .растений, которая может быть использована в исследованиях, связанных с изучением азотного метаболизма в растениях..

'Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научной конференции молодых учёных ТСХА факультета агрохимии и почвоведения в 1987 году и научной конференции ТСХА в 1388 году.

■ Публикации, По материалам диссертации оформлены 5 изобретений.. .' •-/■ : ,

- Структура и объем "диссертации. Диссертация состоит из введе-

• ния,'. - обзора литературы, ' результатов экспериментальных исследований, описания области научного, и* практического использовании, - пиво дов;—'списка литературы-• и приложения. # 1'абота изложена на 124 страницах машинописного текста^ включая.28 таблиц.' Список исподь-.зовшшой; литературы, содержит" гво наимекоЕашгЛ, в-том чиалг 1С<3 на иностранных язшсах., '' >• ','

1. ОБЪЕКТЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

В ячестве объектов исследования использовали растения,. вы-выращешше из поверхностно стерилизованных семян - кукурузы, лука, салата, огурцов, пшеницы . и 'клевера, микроклональную культуру картофеля, полученную из' стерильных апикальных меристем на станции защиты растений ТСХА и в НИИ картофелеводства и культуру каллусной ткани салата и картофеля. Растения выращивали в стерильных условиях в пробирках с ватными пробками, которые содержали 10 мл среды lí/рашиге-Скуга (МС) с 2,38 мг N-NH^ обогащенного

15N (95,2ат£) (исключение/составляли пробирки'большего объема для

огурцов, которые содержали 200 мл той же среды с 47,64 мг N-NHJ).■

Семена стерилизовали по специально разработанной для каждой куль-' туры методике в два этапа - HgClo и HgOg* Период вегетации для

кукурузы составлял • 28 дней,' . для остальных растений -. 49 дней. Стерильность культуры проверяли в начале, в течение ив конце вегетации с помощью 4 различных сред:.'• мясб-пептонный агар США), картофельный агар (КА) , МО и Сориана-Уокера, заражённые пробирки отбраковывали. / /' • > .. ' •.' • ■

Более подробно объекты, условия , проведения экспериментов, методика стерилизации семян, ; методы контроля зал стерильностью описаны в соответствующем раздела диссертации. . !■.■'.-',.'

После окончания периода вегетации из , растением и . среды из контрольных пробирок выделяли нитратный азот для поелодующего определения изотопного состава. . . ' v : ■ ■.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ НИТРАТНОГО АЗОТА ИЗ РАСТЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО ИЗОТОПНОГО СОСТАВА

Применение дополнительных операций для выделения из растительного экстракта источников восстановленного азота.

В процессе использования принятых в настоящее время методов препаративного выделения нитратов выявилась их недостаточная пригодность для решения поставленной задачи - надёжного разделения азота нитратов и азота всех остальных соединений. Существующие пародистилляционные и микродиффузионные ' методы основаны на восстановлении нитратов сплавом Деварда или солями титана в щелочной растительной вытяжке из которой предварительно удалён аммонийный азот; Обрадующийся при . восстановлении аммиак затем улавливается в пр-иёмнике с кислой средой. Однако растительная вытяжка весьма сложна по химическому составу и содержит помимо аммония также и другие источники восстановленного азота, способные постепенно гидролизоваться в слабощелочной среде, с выделением аммиака. Таким образом в процессе; отгона создаётся практически постоянный аммиачный фон, загрязняющий,выделяемую Фракцию нитрат-,'ного азота растений. При наличии дажз небольших количеств высоко-

обогащенного N восстановленного'азота в пробе нитратов . невысокого обогащения.•резко снижается точность определения изотопного состава нитратного азота (Рис. I). ' \

В настоящих исследованиях была разработана схема выделения нитратов "из растений, : которая предусматривала применение предва-' рительных. операций для выделения из растительного экстракта гид' ролизуюшихся- органических соединений.(амиды, урёиды, глюкозамины

12 3 4

контрольный метод

Г 2 3 4 12 3 4-1.2 34

с обработкой с обработкой ' с микроионо-КУ-2-4 (ММ^О. и КУ-£-4 . .форезом

1ва|»

98 ?

контрольный. с обработкой с обработкой : с микроионо-метод КУ-2-4 (КЯ4)о304 и КУ-2-4 . форезом.

Рис.1.. Препаративное выделение нитратного азота из различных кон- : трольних проб с помощью общепринятого (контрольного) и модифицированных методов: а) отклонение фактического обогащения 15Л. нит-; ратовот исходного изотопного состава (0,36 ат.Х); ■ - . б) содержание нитратного и примесного азота в пробах после фракционного, разделения. 1 - контрольный раствор: аспарагин + / глута-

мин (обогащен. 1БМ Е2,7 ат. X) и КШ3; 2,3,4 - не содержавшие нитраты вытяжки, приготовленные соответственно из листьев картофеля; ылкроклубнеЛ картофеля и листьев кормовых боров +' К№Эд.

и т. д.) до выделения нитратного азота по Девэрду. эти операции включали в себя обработку ионообменными смолами, изотопный сСмои аммонийного азота природного обогащения введенного в экстракт с

предварительно активизированными ьысокооОогагценными 15N амидными группами, микроионофорез экстракта на кислом пслиакриламидном геле, электродиализ через ацетатцеллюлозную мембрану. Их использование основано на различии свойств соединений, содержащих • окисленный и восстановленный азот: способности адоорЬирсьатьса на сильнокислотных катионитах,. прочности связи азота с основной частью молекулы в слабощелочной среде, заряда и электрофорети-ческой подвижности, размера молекулы. Использование контрольных растворов и растительных вытяжек, . содержащих нитратный азот известного (природного) обогащения позволило выявить высокую

эффективность предваритзльных операций как средства ожижения заг-

w

рязнения пробы органическим азотом при восстановлении нитратов по Деварду и выделении пародистилляционным способом (рис.1).

При анализе опытных растительных образцов описанные выше методы использовали в сочетании,для достижения наилучших результатов в определении изотопного состава нитратов растений.

•Оценка ачистоты*выделенного 'нитратного„азота • растительной_проСы . Для оценки чистоты нитратов, выделяемых из ог.иттк растительных вытяжек, был .разработан и испольгсг.ан метод, . сеиагаик^л на принципе изотопного раг.бадлйнмл. ■ в слчбсгаллчную растительна растительную вытяжку перед ьоостшюрленкем нктрг.тов опг;а,сл* ;к>-

варда ввалили (Юф^ПО, природного обогазжния 1,5М и е процессе

- а -

паровой дистшиицил получали контрольный образец аммония Затем из той ни еытя^л ьыд»ллли опытный осреЛгц нитрагного азота по

1 ь

Девдрду Обе» получ«кных образца анализировали на содержание N

1

Количество органического азота, меченного N и загрязняющее как контрольный так и опытный образцы считали одинаковым (вследствие постоянства фона аммиака, возникающего в процессе отгона) Таким ооралм, определяя содержание примеси в контрольной пробр, устанавливали гримесь орханическсго азота в опытной пробе аммония, восстановленного из нитратов

Г-(с/Г)*100%, Сат-Х!,

где г - содержание N органического азота в опытной пробе в ат.%; Т - количество азота в опытной пробе после паровой дистилляции в мкг, а с - количество органического ааота в проое в мкг -рассчитывали по формуле.'

с - Са - 0Д))Ь/100Х. [мкг],

где а - обогаление контрольной пробы аммония, полученное

после паровой дистилляции, 0,36 атХ - исходное (природное) обогащение контрольной пробы аммония, Ь - количество азота в контрольной пробе в мкг. Если количество ааота в контрольной и опытной пробе аммония примерно равно, то формула принимает вид

% - а - 0,36 . СатДЗ;

Более строгий расчет изотопного состава нитратного азота должен учитывать не только содержание тяжелого изотопа азота аммиачного фона в пробе, но и общее количество загрязняющего опытную пробу органического азота, так как в противном случае результаты определения будут заниженными. Потребность в таком расчёте возникает только в том случае, когда количество азота примеси в опытной пробе превышает 2 - 5%. В данных исследованиях этот пока- -затель был в десятки раз меньше в результате использования предварительной очистки нитратов описанными методами, поэтому использовали упрощённый метод расчёта. Полный способ расчёта приведён в диссертации в главе " Результаты экспериментальных исследований", • Выделение нитратного азота из растительной пробы нитроксиленоловим методом (метод Сёренсена) Метод пародистилляционного выделения опытных проб нитратного азота из слабощелочной растительной вытяжки, использованный в данных исследованиях, тестировали: с помощью наиболее селективного в этом отношении оргоксиленолового метода. Ортокеиленоловый метод основан на способности нитратных ионов конденсироваться в сильнокислой среде с ароматическим соединением - 3,4-ксиленолом. Продуктом конденсации является - нитрокеиленол, который затем легко отгоняется из реакционной смеси с ацетоном. В использованной модификации ортоксиленолового метода, полученный таким образом нитрокеиленол сжигали серной кислотой по Иодльбауэру и затем отгоняли восстановленный до аммиака нитратный азот паровой дистилляцией по Кьельдалю. Предлагавшийся в литературе метод восстановления по Ольсену оказался ' непригоден для • прецизионных исследований вследствие трудноустранимого загрязнения металлического ■ железа, используемого' в этом методе в качестве"восстановителя, азотом.

Выделение нитратов иа сильнокислой среды практически исключало загрязнение последнего аммонийным и органическим азотом и обуславливало Еысокую селективность ортоксиленолОЕОГО метода. Тестирование включало параллельное выделение нитратов двумя методами из одних и тех же предварительно обработанных растительных вытяжек с последующем определением изотопного состава нитратного азота.

Результаты определения изотопного состава нитратного азота, полученными разными способами, практически совпали (Табл. 1). Та. гам образом, представленные данные свидетельствуют о равноцен-

1 к

ности обоих методов для исследований с N в случае предварительной подготовки растительных экстрактов описанными выше способами.

Таблица 1.'

1С

Избыток N в составе азота нитратов, выделенных из различных растительных'проб двумя способами,, ат. X.

N п/11 Тип раститель- Пародистилляционный Ортоксиленоловый

ной пробы способ с восстанов- способ с восстано-

лением цитратов по влением нитратов

Деварду по Иодльбауэру. .

1 Листья Triticum '' •' . • '•' "."■.'...'.■

aestivum L.,

проба 1 ' 0.024 • , 0.021

2 Листья Triticum ':■. i '■ ' ':'. ■'.у

aastivum L.,

проба 2 ••', '■ '. 0.093 /•' " 0.100

3 Листья Solarium ■ • * ■ •■ ■ -

tuberosum L., , - • • -•.

микроклснзльная • о.шо ...

культура 0.018 '■-■' .

4 Листья Cucutnis

sativa L. . 0.065 . ' ' ■ ,' 0.065 ■

Приложение: юэзффициент корреляции - 0,997; коэффициент линекно»? регрессии - 1,08.

Необходимо отметить, что хотя нитроксиленоловый метод от ли чается высокой селективностью, его сущоственними недостатками не ляются длительность и трудоемкость, поэтому основная часть ре зультатов получена с окончанием по Деварду.

. " .. Таблица 2. Результаты определения изотопного состава контрольных образ

цов, содержащих азот природного обогащения (0,366 ат. X) использованием модифицированных кварцевых сосудов.

N образца Содержание N-NH^, мкг Интенсивность линий. Полученное обогащение 15Н, ат. X Отклонение от этзлона, ат. Z

М 28 М 29

1 5.0 15. 43 0.112 0.3661 +0.0001

2 ' 5.0 19.75 0.143 0.3653 -0.0007

3 10.0 43.92 0. 321 . 0.3660 0..0000 •

4 10.0 37. 44 0.274 . 0. 3668 ' +о. оооа

X 0.36605 +0. 00005

•; . • - +0.002

' 7 :.:.:Относительная ошибка измерения х-э/з *100% » 0,01 X, - где э - исходный изотопный состав азота эталонной

пробы - 0,366 ат. %, а х - обогащение эталонной • -Ц^..;пробы,-.полученное в результате , определения на . маес-спекхроштре'.

Определение изотопного состава по Риттенбергу в пробах -

с малым содержанием азота Использование кварцевых ■ сосудов риттенберга уменьшенного • позволило снизить относительную ошибку измерения изотопного состава азота в пробах содержавших 5-10 мкг N с 7,68 до 0,01 ат. 7. по сравнению с обычными сосудами (Табл.2).

Общий ход анализа растительных образцов приведён в диссертации в главе "Результаты экспериментальных исследований".

ОБРАЗОВАНИЕ НИТРАТОВ В ТКАНЯХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Окисление аммония в культуре растений, полученной из семян Изотопный анализ нитратов растительных проб в конце вегета-

14

ции выявил значительное превышение обогащения N нитратного азо-

1 я

та над природным содержанием N (Табл.3). Достоверного изменения

обогащения 15N нитратной фракции питательной среды, в контроль- 1 с •

ных пробирках за два месяца отмечено не было (избыток*^ нитратной фракции составлял 0,004 ат£ в начале и 0,005 ат. X в конце

вегетации). Избыток 15N в опытных пробах аммония в 10-100 раз превышал этот показатель у контрольных:проб. Это позволяет гово--рить о том, что в данном случае окисление аммония обусловлено биологической активностью исследованных растений.

Подтверждают этот вывод и данные, представленные в таблице 6. Приведенная активность окисления сильно колеблется у разню.куль-.' тур. Так, например, активность окисления стерильных микроклубней картофеля, и листьев огурца различается более, чем в 150 раз, что '

Таблица 3

Избыток в состаер нитратов растений, выращенных .и (.«.млн в гтери-гьных условиях, ат X

aw растения С<ргал росте пия Контрольны., соразцы опытные образцы Значение Г-критерия для опытных образцов*

Allium листья 0 003 0 079 0 948

сера L корни 0 ооь 0 047 0 911

Tritolum листья 0 003 0 092 0 956

repens, L. корни 0.002 0 134 0 970

Lac tueа листья 0 00b 0 040 0 895

bdtiva L. корни 0 006 0. 200 0 980

Cucumi s листья 0 004 0 0Ь5 0 937

t&tiva L корни 0 003 0 026 0 833

Zed mays L лпетьл 0 003 0 242 0 983

корни 0 004 0. 137 0 970

Triticum листья 0 ООЬ 0 056 0 92Ь

üsstivum L корни - - -

г - О 072

Критическое значение Тт-критерия « О 503

бесспорно предполагает зависимость скорости окисления азота от вида растения, среди прочих культур следует отметить высокую активность окисления аммония у кукурузы (Гайл.3,6)

Процессы окисления аммонийногоазога в растениях1 годученных иа культуры ткани Особенности культуры растений, ьырашэнных из поверхностно стерилизованных семян полностью не исключают возможность суьвст-вования эндогенной микрофлоры (патогенной или симоиотичесьой), ¡юторая нроп поло зы • т а ль н о моязт сохраняться под оболочной семян и затем гов."/нгь на результаты экспериманга Поэтому иипочькование

каллусних форм и целых растений, выращенных из апикальных меристем, свободных от чужеродного генетического материала,' в этом случае особенно важно. В данных исследованиях однозначный вывод.о нитрифицирующей активности высших растений позволяет сделать накопление эндогенных нитратов следующими культурами: микроклональ-но размноженного из стерильных апикальных меристем растений картофеля и каллуса салата (Табл. 4,5).

Таблица 4.

-¡с . • - .

• Лзбыток. N в составе нитратного азота, выделенного из каллусов картофеля и салата, ат. X.

Культура Контрольные образцы Опытные образцы Значение "Г- критерия для опытных образцов*•

5Ыапат

1иЬе1-отт 1. 0,003 0,033 0,879'

ЬааЬиса

1 уа Ь. 0,001 0,022 0,810

* критическое значение критерия = 0,502

Растения картофеля наряду с кукурузой, выращенной из семян,

активнее окисляли азот чем остальные культуры (Табл.5).

Особый интерес вызывает обнаруженная в экспериментах высокая

скорость окисления восстановленного азота в тканях прорастающих

1 ^ * ■ микроклубней картофеля. Избыток N в нитратней Фракции растений

в течении б недель прорастания росрастая в 10 раз (Рис.2). Актиг

визацкя.процессов ойрозевания пндегечпих кктратов'яри прорастании

отмечалась ранее Рутченко (ПоиШ^пко 1903)» Туковой, 1971,' Упт-

* ■ Таблица 5

■

Избыток N в составе нитратного азота, выделенного '. из меристемных растений картофеля, ат.

Органы Швторность Контрольные образцы Опытные образцы

растений ' .

Листья " 1 0. ООО 0. 044

2 0.000 0.040

3 0.000 0.034 •

. 0.012

микро- . ■ 1■ .'"'.: 0. ООО . 0.210

клубни .2 0.002 0,164

з 0.002 . . 0.244

0.093

Корни 1 0.000 0.034

том,(Уа^,1997) и другими исследователями. Ыожно предположить, что данный процесс играет конкретную физиодЬгическую роль в ааот-ном обмена прорастающих растений. Например способствует детокси-кации , избыточного количества аммония, выделяющегося в процессе прорастания'.при мобилизации запасного азота амидов аминокислот. Некоторые исследователи считают,■•■ что.этот процесс имеет значение для углеводного обмена': растений (У/а^, 1937).' Характер кривой предполагает, что интенсивность процессов нитрификации в растениях со . временем ' постепенно снижается, однако это предположение требует дальнейших исследований. ,

Рис. 2. Окисление аммонийного азота в прорастающих микроклубнях картофеля. " ,

Активность окисления аммония до нитратов в высших . . ■ растениях," полученная в экспериментах .'•■■• .В таблице б представлены данные по активности окисления ам-. мония до нитратов для всех : исследованных культур.. Необходимо от- -метить, что эти результаты несколько занижены, ' так-как нитрата/ образованные в тканях растений, могли быть повторно'ассимилирова-ны в течение вегетации. Однако, хотя использованный.в эксперимен- . тах метод позволяет определить лишь'эндогенные.нитраты,_имеющиеся\ в растениях . в конце вегетации. - с его помощью можно сопоставить окислительную активность разных видов растений. - Оценивая, окисли- "/ тельную способность высших.растений в целом, ч необходимо'отметить ; крайне низкий-" уровень.. их нитрифицирующей, активности (табл. 3,4,5,6) по сравнению с прокариотами (Alexander, ■ 1965) и : грибами ( Marshai1,1962, Сорокин,1990) и значительно, уступают®й. обратному процессу; восстановлению нитратов до аммония. Отличав- . внеся наибольшей активностью окисления растения. кукурузы за -1 не - •

дели окисляли лишь 0,04* от аммония, внесенного в'субстрат в начале вегетации. Очевидно низкая скорость нитрификации у высших растений и являлась препятствием для обнаружения и детального изучения, этого процесса в предыдущих исследованиях.

В данном случае, однако, нельзя не учитывать специфики стерильной культуры (замедленный обмен веществ, малый прирост сухой массы и т.д.).' Для культуры растений, выращенных из семян, сульфат-аммония менее эффективен как предшественник нитратов. Последнее подтверждается более высокой окислительной активностью растений картофеля, полученных.из меристем по сравнению с культурами, выращенными из семян. Так как первые имели значительно меньший

1 ^

пул.собственного органического азота N экзогенный аммоний очевидно мог более активно включаться в метаболический цикл растения и затем окисляться до нитратов. Возможно и ингибирование про-• цессов нитрификации в растениях экзогенными нитратами, которые использовали как ловушку меченного продукта окисления. Представляется более вероятным, однако, что- изучаемые процессы ив естественных условиях протекают с невысокой скоростью. Пээтому использование длительных экспозиций (до двух .месяцев) вполне обоснованно для выявления таких процессов. Применение аммония

.' <1 с . • • • .

высокого обогащения N (95,2 ат. X), как предшественника нитра-. тов, в сочетании с экзогенными нитратами природного обогащения в качестве ловушки, способствующей кумуляции эндогенных нитратов в тканях растений,а тага» применение новых, более чувствительных методов определения-количества азота,' окисленного в, растениях, представляется желательным в подобных Исследованиях.

: Благодаря сочетанию, этих приёмов оказалось возможным обнаружить существование у всех изученных культур протекающих с малой

Таблица 6.

Активность окисления меченного ^ аммония исследованными культурам» за период вегетации

Культура Органы растений Содержание N-NO3 МГ/1000 растений Содержание окисленного в растении аммонийного азота Приведенная активность окисления MT/N/KT абсолютно сухой массы

мкг/1000 растений в % от внесенного в пит. смесь N-NH^x 10~3

Микроклона-льная культура . Solanum tuberosum L листья корни микроклубни целое растение каллус 327.4 6. 3, 65.2 398. 9 1188.0 132.0 2.2 134.0 268.2 392. 0 . 4.38 . 0 .07 4.47 8.92 16. 47 7.06 4. 40 25.28 12. 29 1.32

Allium cepa L. листья корни . целое растение 88,3 8. 4 96.7 71.0 4.0 75.0 2. 96 0.17 3.13 . 0.85 0. 19 ' 0.72 >

Trifolium repens L. листья. корни целое ; растение 10,2 82.9 93.1 ■ 10.0 : 117. 0 127. Ó 0.42 "' .4.89, . . 5.32 ■ 0.15 ,. 3. 64 1.26

Lactuca sativa L. листья корни -целое . растение каллус • 45,0 2.547.5 76.0 : 16.0 , 5-0 ,.. ' 2i;o;: 115.0 0. 67 " 0. 21: 0.89 .. i 4. 83 0.66 ' . 2.29 : 0.81 2.86 .;

Cucumis sativa £.. лястья. корни целое- ... растение 59,2 66.0 125.2 : зб.о '.. 24. 0 бо. о:. -. 0.08' . • 0.05 ;; 0.13 • ' 0. 16 . 0.10 • 0.16

Zea mys L. листья корни:' целое растение 167,5 391.6559. 2 421.0 / 547.0 ' 963.0 '•. . 17.69 22. 93 \ 40.67 2.41 * 15.07' . 4.09 \ •

Triticum aesti i/um L. листья ' 220,2 . 119.0 '5-00 1.62 ; ' -

скоростью процессов образования эндогенных нитратов (для сравнения, Делвич (1851), который получил отрицательный результат использовал максимум 4в часовые экспозиции листьев таОака в среде

1С ЧЬ

с меченньм N аммонием (обогащение N в экспериментах составлд ло 30 ат2)).

Полученные результагы не отрицают возможности более активного окисления аммония до нитратов в иных условиях и другими культурами Известно, что ьекоторые виды растений могут накапливать значительные количества метаболитов, содержащих окисленный азот, например кукуруза - до 2% бензоксазинов, астрагая до 82 нитрисое-динений (в пересчете на нитрогруппу) Молодые растения сои ншсап-ливают до 15Х от сухой массы дуррина, цианогенного глюкозида, предшественником которого является 4- гидроксифенилацеталь доксим. Эти примеры указывают на воеможностъ существования органического пути оооазования эндогенных нитратов в растениях, подобного существующему у гетеротрофных ьитрификаторов. 3 этом случае можно предположить, что ферментативный гидролиз метаболитов, содержащих окисленный азот в состава нитрозо* и нитрохрупп (А1з1сп,19а5) и накапливаемых некоторыми растениями в больших концентрациях, может привести к высзоооадению значительных количеств эндогенного нитратного азота

Из результатов проьедышых исследовании следует, что процесс нитрификации оказался характерным для всех изученных кулмур, хотя о-! I стьсси "ь-сь к 'им сьмийстЕам и классам и обладали разным метабол.!з.у.см. ото сайд« г<-льствует о его универсальности в пределах изу*лтч>А 1 ¡.ул.и культур Таким осрозгм, мота,о «заключить, что обмен I <с,'слгин*х Ьосстлювдккылх сч.^линенмй ахл I в г.,-¡ли;

растениях, так же как и у низших организмов, является циклически замкнутым.

Результаты проведённых исследований позволили сделать следующие выводы: •

1. Все исследованные виды высших растенийкартофель, кукуруза, лук, салат, огурцы, пшеница, клевер - способны самостоятельно окислять аммонийный азот до нитратов. Это свидетельствует о широкой распространённости нитрификации у растений.

2. Способностью окислять аммоний до нитратов . в стерильных условиях .обладали как . меристемные, так и выращенные из семян культуры растений.

3. Наибольшая биологическая активность окисления аммония до нитратов была характерна для картофеля и кукурузы, которые резко • выделялись в этом отношении среди других исследованных культур.

4. В условиях проведённых экспериментов процесс нитрификации протекал с крайне низкой скоростью. Даже наиболее активные в этом отношении растения кукурузы окисляли за 4 недели лишь: 0.04Х от всего аммонийного азота, внесённого в питательную смесь в начале вегетации. - ; ■ - '.'■-.■•".■■■' '

5. Образование нитратов в тканях растений нельзя отнести за : счёт неорганического окисления, так'как этот процесс в значительной степени зависел от вида растения и от направленности физиологических процессов.в растениях (растительная нитрификация активизировалась при прорастании клубней картофеля), : ■' " . - /

6. Разработаны методы выделения нитратной фракции раститель-кой пробы и определения изотопного состава нитратного азота при его содержании в пробе 5-10 мга\ позволяющие значительно увели- • чить точность определения количества эндогенных нитратов е расте-

Список работ по теме диссертации

1 Савидов Н А, Ягодин Б А Верниченко И В Изобретение Способ определения количества азота окисленного в растениях (Решение о выдаче АС ст 6/VI 89 г по заяв1е № 4670918)

2 Савидов Н А. Ягодин Б А, Верниченко И В Изобретение Способ определения количества азота окисленного в растениях (Решение о выдаче \С от 6/VI 89 г по зачвке № 4672019)

3 Савидов Н А Ягодин Б А, Верниченко И В Изобретение Способ опредетения количества азота, окисленного в растениях (Реше ие о выдаче АС от 14/VI 89 г по заявке № 4670916)

4 давидов Н А Ягодин Б А, Верниченко И В Изобретение Способ опреде тения количества азота окисленного в расте-1иях (Решение о выдаче АС от 15/VI 89 г по заявке N° 4670917)

5 Савидов Н А Ягодин Б А Верниченко И В Изооретенис Способ определения количества азота окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 15/VI 89 г по заявке JV» 4671199)

Объем 11 4 п л

Тираж 100

Заказ 788

Типография Московской с х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И 550, Тимирязевская ул, 44

Бесплатно