Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ НИТРАТОВ В СИЛОСЕ ИЗ КУКУРУЗЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА ВЫСОКИХ ДОЗАХ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ НИТРАТОВ В СИЛОСЕ ИЗ КУКУРУЗЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА ВЫСОКИХ ДОЗАХ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

Л ~ На правах рукописи

'МАКСИМОВА Елена Николаевна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ НИТРАТОВ В СИЛОСЕ из КУКУРУЗЫ, ВЫРАЩЕННОЙ НА ВЫСОКИХ ДОЗАХ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИИ

Специальности 03.00.07—микробиология и 06.02.02 — кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — (981

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

I

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор В. Т. Емцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л. И. Воробьева, доктор биологических наук, профессор М. Т. Таранов.

Ведущее учреждение — Всесоюзный институт кормов им. В. Р. Вильямса, Московская область, ст. Луговая.

Защита состоится «ЛУУ' д^^У <3^*4981 г. в «/¿Л часов на заседании Специализированного совета К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К- А, Тимирязева. . Адрес: ЛЭТббО, г. Москва, ул. Тимирязевская,'47. Ученый совет

ТСХА

иссертацией можно -"^хд

;и>ферат разослан «.

1981 г.

'Чекмй секретарь насланного совет-

В, Г.Марьенко

Актуальность проблемы. Решающим условием дальнейшего развития животноводства и значительного повышения его продуктивности является всемерное укрепление кормовой базы. Решения июльского (1976), ноябрьского (IÖ79) Пленумов ЦК КПСС, а также постановление ЦК КПСС и Совета Министров СССР (март 1980) направлены на увеличение производства н улучшение качества кормов.

Важнейшим приемом, повышающим урожайность кормовых культур, является применение минеральных удобрений. Известно, что использование минеральных, азотных удобрений стимулирует активный рост вегетативной массы растений, а также способствует интенсивному синтезу белков, что особенно важно для ннзкопротеиновых культур, таких, как кукуруза,

'Одновременно с этим применение высоких доз азотных удобрений нередко вызывает накопление» особенно в рано убранных растениях, избыточного количества нитратов, которое может привести к отравлениям животных (Joshi, 1977, Lawrence et al, 1968), Использование таких растений на зеленый: корм опасно.

В литературе имеются отдельные указания на то, что нитраты при силосовании частично или полностью разлагаются (Зубрилин, Мншустин, 1958; Бондарев, 1964; ,Сереньев, 1961; Akira, 1968). Однако, несмотря на ведущую роль микроорганизмов в этом процессе (Зубрилин, Мишусткн, 1958) , их мор-фол о го-физиолотческие особенности недостаточно изучены, а химизм дисснмнляцнонной нитратредукции и условия, при которых активно протекает восстановление нитратов, практически не исследованы.

Цель и задач» исследования, В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было изучение микробиологической трансформации нитратов в силосе из кукурузы, выращенной на высоких дозах азотных удобрений, а также выявление роли других факторов в этом процессе.

■В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику содержания нитратов и других форм неорганического азота в кукурузном силосе.

2. Выяснить .роль микроорганизмов, ферментов и химических процессов в трансформации нитратов в кукурузном силосе. _________

Г;:Гг чтг.з ' 1-

3. Выделить из силоса микроорганизмы, обладающие способностью активно восстанавливать нитраты, и изучить у них химизм процесса дисснмнляцнонной нитратредукции,

-1; Установить влияние внешних условий на активность процесса восстановления нитратов чистыми культурами си--лосных микроорганизмов.*

Научная новизна. В работе впервые разработаны методы определения активности, внутриклеточных днссиуиляционных нитрат- и нитритредуктаз, отражающих суммарную деятельность соответствующих микроорганизмов, а также внеклеточных ннтрат- и нитритредуктаз в силосе. На основе применения этих методик была изучена роль микрофлоры в трансформации нитратов, а также установлена потенциальная активность внеклеточных ферментов и изучена специфика нхдействия в процессе силосования. Показано участие химических реакций в.разложении нитратов и нитритов в силосе- Изучены особенности. микроорганизмов, участвующих в диссимиляшюнном восстановлении нитратов, а также получены новые данные о химизме их ннтратредукцнн. Впервые изучалась активная микрофлора силоса, позволяющая наблюдать морфологические особенности микроорганизмов непосредственно в их среде обитания—силосе.

Практическая; ценность. Результаты исследований позволяют разработать практические рекомендации по ускорению восстановления нитратов и направленному регулированию процесса трансформации их при силосовании с целью получения качественного корма.

. Апробация-работы. Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых ТОХА (секция почвоведения, г. Москва, 1Э80) и на VI съезде Всесоюзного микробиологического общества (т. Рига, 1980),

- Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 разделов, выводов' содержит 187 страниц печатного текста, 44 таблицы, 23 рисунка и список литературы из 252 наименований (из них И4 зарубежных).

Автор выражает искреннюю признательность л глубокую ■ благодарность: канд. бнол, наук, ст. научн. сотр. Т. К. Ильиной и канд. биол. наук, доц. Г. И, Переверзевой за большую помощь в работе и ценные консультации, мл. научн. сотр. Е. С, Василенко, канд. биол. наук, ст. научн. сотр. И. Н. Скворцовой, канд. хим. наук, ст. научн. сотр. Ю. М. Д\нллср, мл. научн. сотр. О. А. Капустину, канд. бнол. наук, доц. И. П. Бабье-вой, докт. бнол. наук, члену-корр. АМН П. Н. Блохиной, канд. бнол. наук, ст. научн. сотр. Г. Ф. Левановои— за помощь в выполнении отдельных разделов диссертации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫi

В качестве объекта исследования была выбрана кукуруза, как важнейшая силосная культура. Кукуруза (гибрид Днепровский 247 МВ) выращивалась в полевом опыте Центральной экспериментальной базы Института кормов (Московская область).

Почва опытного участка дерново-подзолистая, среднесуг-лннистая. . '

Для решения поставленных задач были взяты образцы со следующих вариантов опыта:

Урожай в 1978 г. снимали в стадии цветения початков, в 1979 г. из-за неблагоприятных погодных условий—в стадии выметывания. Для анализов с делянки брали средний образец (5 кг). Сырье измельчали на кусочки 1—3 см, укладывали в сосуды емкостью 500 мл с плотностью d = 1 кг/см5 и закрыва-' ли эластичными резиновыми пробками. Все анализы проводили в исходной массе, а также на 1, 3, 7t 15, 30, 60 сутки силосования.

В 1978 г. для изучения трансформации азота нитратов, содержащегося в кукурузе в аммиачную форму в процессе силосования, был поставлен опыт по силосованию кукурузы с добавлением K15NOs до легальной для животных дозы (0,2— 0,3% N—NOj на абс. сух. в-во,— Joshi, 1977; Fotuma, 1977).

Одновременно с опытами по силосованнюкукурузы, выращенной в полевом опыте, в 1979 г, с целью определения эффективности использования азотных удобрений в форме нитратов, бил заложен: вегетационный опыт на меченом нитрате (K'SN03) но вариантам Naso и N(ao. Почву для вегетационного опыта брали с полезого участка. Повторность опыта 2-кратная. Урожай снимали в фазу выметывания.

Количественный учет микроорганизмов- Общую численность гнилостных бактерий определяли на пептонном агаре, количество молочнокислых бактерий на сусло-агаре с мелом, количество денитрифицирующих бактерий и бактерий, дисси-милнрующнх нитраты в нитриты, определяли методом предельных • разведеннй на нитратном бульоне с реактивом Брея (Focht, 1974) и на среде Гнльтая (па обеих средах концентрация KN'03 увеличена до 1%, а на среде Гильтая — FeCl3 до 0,02 г/л). Учет микроорганизмов проводили в 3-кратной по-вторпости, используя таблицы Л1ак-Креди, . .

Биохимические анализы растительного материала. Общий азот определяли по Подльбауэру, аммиачный азот—в аппарате

1978 г. 1. NqPimKim

2. N3S0 Рео Kiao

3. N360 Peo KlSO+'KlSNÜ;

'з

1979 г. 1. NmPeo Киа -

2. К3бо Р6о Kim

3. N«so Р$о Kiso

кьель'даля, сумму окислен них форм азота — по Деварду, белковый азот — по Барнштейлу. Определение нитратов, нитритов, глдроксиламнна проводили колориметрически соответственно по Граидвалю-Ляжу, Илоевею-Грнссу, Эндресс-Кауф-манну (Endress, Kaufmann, 1937).

Ферментативная активность силоса. На основании опыта почвенных работ (Галстян, I960, 1970; Ильина, 1977) нами были разрабоганы.меюды определения активности внутриклеточных дксснмиляцнониых нитрат- и ннтритредуктаз, которая отражает деятельность соответствующих микроорганизмов и внеклеточных диссимнляшюшшх нитрат- и ннтритредуктаз в силосе.

Активная микрофлора силоса. Для изучения характера микрофлоры непосредственно в силосе был использован метод стекол обрастания Холодного (1930) и его модификация Ры-балкнной и Кононенко (1953).

Идентификация чистых культур микроорганизмов. Для определения видовой принадлежности выделенных бактериальных культур использовали определитель Берге (Bergey, 1974) и работу Гордона (Gordon, 1973). При идентификации дрожжей применяли определитель Лодлера (Lodder, 1970) и работу Бурнетт (Burnett, 1977), С целью уточнения систематического положения бактерии был определен нуклеотндный состав ДНК по методу Арригхи (Arrighi ct al, 1908).

Изучение г физиологических особенностей чистых культур микроорганизмов. Установление денитрифицирующей активности у выделенных культур микроорганизмов проводили на нитратном бульоне, модифицированной среде Гильтая и на комплексной синтетической среде (Ильина, Ходакова, 1972) по балансу общего азота, балансу 1SN, а также путем масс-спектрометр ического определения азотных газов в пробирках Риттенберга. Определение обогащения' азотных фракций изотопом азота lbN и опытах с чистыми культурами микроорганизмов, а также в растительном материале проводили на масс-спектрометре типа МИ-1305,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

• ■ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние азотных удобрений на биохимический состав зеленой ¿массы кукурузы и кукурузного силосав / процессе силосования

■Изучение накопления нитратов в кукурузе, выращенной на разных дозах азотных удобрений, показало, что содержание нитратов увеличивалось соответственно количеству вносимых под нее удобрений (табл. 1).

Таблица. I

Динамика содержания нитратов в кукурузном силосе (в мг N—N0) в 100 г абсолютно сухого вещества)

Дни Вариаит^-^ Исх. м I 3 7 15 30 60 3 & 3 я* 5 -«85

1978 г.

N. КМ О) 7,82 59,20 233,60 6,38 48,80 273,30 3.17 36,30 270,40 1979 г. 0 35,10 270,75 0 33,70 0 22,67 267,00 0 7,12 260,10 100 87,97 8,35

N1» Ммо 31,60 131,20 275,50 27,80 98,30 238,50 " 16.90 79.50 240,30 0 78,00 240,00 0 73,30 240,30 0 40,10 217,40 0 19,30 217,00 100 85,29 21,23

Примечание. Знак > означает, что определение не проводилось, ' 1

Существенные колебания в количестве нитратов в варианте N360 по годам были обусловлены разным сроком уборки куку-рузы^ т. к. молодые растения богаче нитратами по сравнению с более зрелыми (Церлииг, 1979), Содержание нитратов в силосе постепенно падало, что указывает на их разложение в процессе ферментации. В вариантах N0 и N1-0 за 3 дня силосования нитраты полностью восстановились,-В: силосе из кукурузы на фойе Ызво количество нитратов резко снизилось и к концу силосования их содержание в силосной массе было в пределах физиологической кормы. Более третьей части нитратов разложилось в течение первых трех суток (38,7—39,4%). В варианте N«0 нитраты за 2 месяца силосования разложились лишь частично (21,2%) и их содержание в силосе на 60*е сутки оставалось'высоким (217,0 мг N—Ы03).

Динамика содержания нитритов в силосе показала, что высокие концентрации N—N0; наблюдались лишь на 1—3-е сутки сплосовання—0,01—0,03% \т—1чтОа на абс, сух. вещество (в литературе не встречалось точное определение токсических концентраций нитритов, однако есть указание, что N—Ж)2 в С—10 раз токсичнее азота интратов У1е15, Наеетап, 1971). В последующие сроки ферментации нитриты практически не обнаруживались.

'Важным и достоверным показателем качества силоса является содержание в нем аммиачного азота (Уотсон, Нэш, 1964). За два месяца силосования наименьшее количество ам-

мначного азота накопилось в вариантах с высоким содержа-ни ем'нитратов {М3ео+1КНОз, N(3o); В этих же'вариантах были наименьшие потери сухого вещества (Мзбо+KNOj— 1,64%, N«o — '1;0б% по сравнению с N0 — 3,19%, NiSo — 2,61%,* N3"6o (0979) —2,13%), Это говорит о том, что нитраты н продукты их разложения подавляют активность-гнилостной микрофлоры. Аналогичные данные имеются и у ряда автороз (Зафрен, 1958, 1970, Зубрилин, Мншустин, 1958, Whithead, 1967).

Изменение рН среды опытных силосов показало, что их кислотность практически не зависела от присутствия нитратов в кукурузе. Стабильные значения рН - устанавливались, как правило, на.7-е сутки. В контрольном силосе (N0) с 3-х суток силосования рН;оставался на одном уровне, что связано с. невысоким содержанием: в нем растворимых Сахаров (N0 — 8,3%, N,20-15,4%, Nse» — '14,8%, N48o-13,05%).

Превращение азота нитратов, содержащегося в кукурузе, в аммиачную форму в процессе силосования

. Аккумулированные кукурузой нитраты при ассимиляции их микрофлорой силоса, а также при дисснмиляшюшшй нит-ратредукцнн некоторыми микроорганизмами в процессе силосования восстанавливаются до аммиака, который не теряется *нз кислой среды силоса. В связи с этим вопрос о доле нитратного азота, редуцированного при силосовании в ценную аммн-'ачную форму, имеет большое практическое значение.

Для решения этой задачи был поставлен специальный опыт .по силосованию кукурузы с добавлением в растительную массу KI5NOs. Для этого была взята кукуруза с делянки Naío Peo Киэ. Недостающий до летальной дозы нитрат в кукурузе возмещали добавлением меченой соли K1&NÜ3. Стерильный раствор соли вносили из пульверизатора, равномерно распределяя его в измельченной растительной массе. Для создания одинаковой влажности кукуруза в двух других вариантах увлажнялась стерильной дистиллированной водой.

Результаты опыта показали, что за 2'месяца силосования разложилось 23,68 мг N—N03 в 100 г абс. сух, вещества, что составляет 7,5% от первоначального количества азота нитрата, из них 21,28 ISN—NOj. Наиболее активное восстановление нитратов приходилось на первые трое суток, в последующие сроки скорость их разложения резко падала.

Уже в исходной растнтельной массе имелось некоторое количество меченного l5N—NH« ( табл. 3), что, вероятно, связано с активностью нитратредуктаз за время подготовки опы* ;та. Общее количество N—NH« увеличивалось в процессе силосования, a ,SN—NH4 накапливался только на 1 и 3 сутки, ■когда силосная микрофлора активно восстанавливала нитрат,

а затем выделения его не наблюдалось. На 60-е сутки, когда начален массовый лизис клеток микроорганизмов, синтезированных из меченого нитрата, выделение 1ЬМ—ЫН4 резко увеличилось;

Таблица 3

Динамика образования аммония в процессе силосования кукурузы

Дни Содержание Ы—ЫН, мг в 100 г абс, сух, вещества Содержание • М-МН« Б % Образовано в мг

мечей. немечеп. мечен. не мечен. мечен. 1 не мечен.

1 3 7 30 60 18,28 19,19 10,73 7,23 30,94 64,37 76,53 100.57 133.12 158,99 22,15 20,05 9.64 5.15 16,29 77,88 79,95 90,36 94,85 83,71 - 2,41 0,91 2зГ71 2.24 12,64 21,04 32.55 25,87

При меча и н с. Содержание аммиачного азота о исходном растительном материале—78,00 мг, из них 15,87 мг1! N—N11«.и 62,13 мг N—N111,

В итоге за 2 месяца силосования кукурузы количество меченного —уменьшилось на 21,28 мг, из них 15,07 мг обнаружено в аммиачной форме, что составляет 70;8%, причем, вероятно, что часть использованного азота нитрата еще' закреплена и органических соединениях клеток бактерий, не подвергшихся разрушению к этому времени. . '

Микробиологические исследования зеленой массы кукурузы и кукурузного силоса в процессе силосования

Динамика численности микроорганизмов; Подсчет количества клеток гнилостных бактерий показал, что максимум приходился на 1 сутки, а затем их содержание резко падало. Существенных различий в численности этой группы микроорганизмов по вариантам не наблюдалось. Однако, если учитывать данные по потерям сухого вещества видно, что в вариантах N<$9 II эти потерн были явно меньше по срав-- нению с «безнитратной» кукурузой, что говорит о депресснру-юшем действии нитратов на активность гнилостных микроорганизмов.

При количественном учете молочнокислых бактерий: было установлено, что их максимальное содержание было на 3 сутки (1979) или па 1—3 сутки (1978), в дальнейшем их количество снижалось. Какой-либо закономерности в распределении молочнокислых бактерий по вариантам установлено не было.

V Учет микроорганизмов, восстанавливающих нитраты впро-

цессе диссимиляции, показал, что на среде Гнльтая эта группа обнаруживалась лишь первые трое сугок. На нитратномбуль-оне'Денитрифнкаторы развивались также 3 суток, а микроорганизмы, диссимнлируюшие нитраты до нитритов, сохранялись до 7 или даже до 15 суток. На обеих средах наблюдалась тенденция к увеличению численности этих групп бактерий в вариантах N«0 " М«о+КГЮ3 по сравнению с М0 и N120.

Определение активности внутриклеточных дисснмиляцион-ных нитратредуктаз. Одновременно с количественным учетом восстанавливающих нитраты микроорганизмов необходимо было знать, насколько они активны в конкретных условиях силоса. Суммарную деятельность соответствующих микроорганизмов отражает активность их внутриклеточных днссимнля-ционных нитратредуктаз.

Таблица 4

Активность внутриклеточных нитратредуктаз в кукурузном силосе {в мг N—NOj на 100 г абсолютно сухого ссшестза)

1 3 7 15 30 СО

Вариант*"*—^

1978 г.

• Ко

NM» Nxo+KNO*

599,0 222,5 201,5 117,3 93,0 0

639,5 199,5 0 0 0 0

329,0 154,0 0 — 0 0

1979 г.

435,3 285,0 5.0 0 0

370,8 257,0 6,0 0 0

325,5 125,0 0 0 0

Примечание. Определенно активности проводили при значениях рН, соответствующих рН опитных енло^ов в дни анализов.

Как видно из таблицы 4, резкое падение активности происходило уже на 3-й сутки силосования, а на 7-е сутки активность либо отсутствовала, либо была очень низкой, что можно объяснить подкислением силоса к этому сроку до 4,75—4,-10 (кроме варианта N0, где активность сохранялась до 30 суток, т. к. рН не опускался ниже уровня 4,85). В последующие сроки, хотя микроорганизмы еще и обнаруживались на используемых средах, но были уже в неактивном состоянии.

Таким образом, несмотря на некоторое увеличение численности нитратредуцнрующих микроорганизмов в вариантах N«80 и Йзео+КМОз, их активность была наименьшей по сравнению'с другими вариантами, что связано с депресснрующпм

действием высоких концентраций нитратов на функционировав нне нитратредуктаз (Witt, 1975).

Динамика активной микрофлоры. Изучение микробных пейзажей показало, что характер активной микрофлоры существенно менялся в зависимости от срока ферментации силоса.

На 3-й сутки силосования, при завершении фазы развития смешанной микрофлоры, у большинства бактериальных кле:. ток появлялись слизистые капсулы, что, по-видимому, является приспособлением для перенесения неблагоприятных внешних условий. .

15-е сутки силосования характеризовались началом процесса разрушения клеток микроорганизмов и появлением множества инволюционных бактериальных форм, а на 30—60-е сутки лизис меток принимал массовый характер.

Наблюдение за морфологией клеток микроорганизмов по вариантам показало, что и енлосах с высоким содержанием нитратов часто обнаруживались уродливые клетки утолщенной «кубовидной» формы, что, вероятно, объясняется действием высоких концентраций нитратов на внешний вид бактерий (Бондаренко, 1952).

Параллельно с основными наблюдениями микробных пейзажей в силосе нами была проведена методическая работа по сравнению метода Холодного и моднф!ПШрованното метода Рыбалкииой и Кононенко.

Результаты исследований показали, что характер активной микрофлоры силоса не зависит от состава сред. Селективной' средой, определяющей состав и свойства ее микрофлоры, является экологическая обстановка силоса. В связи с этим мы полагаем, что наиболее удобным и экспрессным методом изучения микробных пейзажей силоса является метод Рыбалкнной и Кононенко.

Ферментативное разложение .нитратов в кукурузном силосе

'Как было показано выше, в первые трое суток в силоне . возможно восстановление нитратов за счет активности внутриклеточных растительных и микробных нитратредуктаз. Впоследствии, когда разрушаются клеточные структуры при изменении внешних условий, ферменты теряют связь с клетками, попадая в силосный сок. Встает вопрос об активности внеклеточных ферментов в этих условиях.

Опыты со стерильным силосом, а также опыты по ннгнби-рованию внеклеточных ферментов (насыщенным раствором NaF) показали, что внеклеточные ферменты могут участвовать в процессах редукции нитратов в силосе. В дальнейшем было установлено, что эти ферменты сохраняли свою активность, продолжая функционировать, но с меньшей: ннтененв-

ностью, н в кислой зоне р-Н. Повышенная устойчивость к неблагоприятным условиям к у внеклеточных ферментов обнаружена и в почве (Воробьева, Звягинцев, 1978; Ильина, 1977).

Таблица 5

Активность внеклеточных кктратредуктаз в кукурузном силосе (в мг N—N0» на 100 г абсолютно сухого вещества)

1 3 7 15 30 60

1978 г;

Кае» Мзз^+ККОз

N«0

191,3 213,2 100,0 190,1 194,0 78,0 139,1 156,5 ■ 66,5 158,2 135,0 151,3 151,0 60,2 1СО.О 179,0 60,2

1979 г.

263.0 260.1 205,1 203,0 249.5 137,2 200,7 153,1 130,4 185,0 105.5 130,9 185,0 255.0 132.2 170.3 157,3 145.0

Примечание. Определенно активности проводили при значе-. ннях рН, соответствующих рН опытных сил осой в дин анализов.

Так же, как и внутриклеточные ферменты, внеклеточные нн-тратреяуктазы обладали наименьшей активностью в вариантах N^80 и &збо+|КМОз (табл. 5). С возрастом силоса активность падала, но значительно медленнее и в меньшей степени по сравнению с внутриклеточными нитратредуктаэамн. Наблюда* лась некоторая тенденция к снижению активности ферментов на7—15-е сутки,азатем вновь к повышению на 30—60-е сутки, что связано, возможно, с массовым разрушением микроорганизмов в этот срок и выходом ферментов из их клеточных структур.

Химическое разложение нитратов и нитритов в кукурузном силосе-

С целью выяснения возможности химического разложения нитратов и нитритов в силосной массе, а,такжс определения конкретных значений рН; при которых этот процесс имеет место,, был поставлен специальный опыт без силоса с растворами КЖ>3 и МаМ02 и искусственным доведением рН до уровня, соответствующего рН в силосе в дни проведения анализов.

Результаты опыта показали, что за 60 суток при изменении -рН от 6,5 до 4,2 количество нитратов оставалось без изменения^ Содержание же нитритов уже на 15-е сутки уменьшилось . вдвое, а через 2 месяца.их осталось лишь 3,2% от первоначального количества.

Ю

*

-< ' Морфологические «физиологические .особенности чистых культур, восстаиавливающихиитрат микроорганизмов, выделенных из кукурузного силоса

Выделение чистых культур микроорганизмов. На 1—7-е сутки были выделены 3 споровые н 9 неспороносных культур. На 15, 30-е сутки выделялись только дрожжи. Из полученных 1*1 чистых культур отобраны 8 наиболее активных нитратре-дукторов.

Изучение некоторых морфологических и физиологических особенностей выделенных культур дало возможность отнести их к следующим видам: Arthrobactcr simplex, Bacillus lateros-portis — 2 штамма, Erwinia carotovora — 2 штамма. Pseudomonas stutzen, Candida lipolytica, Rhodotorula glutinis, Rhodo-torula graminis.

Влияние внешних факторов на физиологические особенности чистых культур микроорганизмов. На интенсивность про» цесса диссимиляшюнной ннтратредукцнн большое влияние оказывают условия аэрации. Для изучения действия разной степени аэрации культуры микроорганизмов выращивались в аэробных условиях (на воздухе) и в микроаэрофильных условиях (ванаэростатах).

Было установлено (табл. G), что присутствие кислорода воздуха снижает интенсивность прохождения первой ступени днссимиляциоиной ннтратредукцин, сильно тормозит прохождение второй ступени у выделенных культур микроорганизмов, а также уменьшает выделение аммиака у споровых культур.

Большое значение для осуществления процесса восстановления нитратов микроорганизмами в ходе диссимиляции имеет природа источника углерода. В опыте испытывались те источники углерода, которые присутствуют в силосе — глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, молочная кислота, уксусная кислота, этанол. ' ' \

■Было установлено, что Arthrobactcr simplex активно осуществлял процесс денитрнфикацин на глюкозе, молочной кислоте и этаноле с высокой скоростью и большими газообразными потерями (82—84%), на остальных источниках углерода восстановление нитратов протекало интенсивно до нитритов, гнд-рокенламина и газообразных форм азота. Вас. laterosporus в отличие от Arthr. simplex активно восстанавливал нитраты только на сахарозе, на остальных источниках углерода нитрат, ное дыхание шло'медленно до нитритов, гидр оксидами на, газообразных форм азота и аммиака. Дрожжи родов Candida и Rhodotorula проявляли слабую способность к восстановлению ■нитратов только на глюкозе.

. , _ Таблица 6

Влияние условий аэрации на процесс дисснмкляцноииоЗ нитрат редукции у микроорганизмов, выделенных

из кукурузного силоса

Микроаэр офи льн u е Аэробные

Культуры микроорганизм оо использовано N-NOs образовано мг потери из среды' использовано N-NQj образовано мг

мг % N-NO) N-NH, мг % , мг n-nh4

Arthrobacler simplex 28,50 100 ; 0 0 27,95 98,07 26,25 100 20,20 0

Дрожжи рода Rhodolorula . , . 28,50 100 0 9,24 20,20 71,09 25,12 95,69 7,55 ' 3,25 •

Вас. ¡alcrosporus шг. 1 .... 28,50 100 , 0 9,03 18,34 04,35 20,25 100 3,75 7,25

Дрожжи рода Candida . ... 28,50 100 0 0 2(5,02 91,30 20,52 78,17 8,75 0

Вас. laterosporus шт. 2..... 28,50 100 0 8,00 23,90 83,80 21,78 82,97 7,25. 3,37 '

Erwinia carotovora шг. 1 .... 26,24 92,07 1,00 0 — _ ' 13,09 49,80 9,25 0

Erwinra carotovora шг. 2 ... 21,80 87,02 0,90 0 — — 13,12 50,00 8,00 0

P^cmiomonas slulzcri..... 27,93 93,02 0,94 0 — — 18,23 69,44 13,23 0

П р и м с ч а и и с. В 25 мл исходной комплексной синтетической среди содержится: 23,50 мг N—NOj (микро-аэрофилыше условия); 26,25 мг N—NOj (аэробнuе условия).

Немаловажная роль в процессе восстановления нитратов принадлежит реакции окружающей среды.

- Было показано, что Arthr. simplex денитрифицировал нитраты в интервале рН = 8—6, причем газообразные - потери снижались при ладеннн рН. Вас. laterosporus активно редуцировал нитраты при рН 8, а при рН = 7—6 интенсивность процесса, газообразные потери и выход аммиака снижались. Процесс восстановления нитратов прекращался при рН 5 и ниже. Дрожжи полностью потеряли способность к редукции нитратов (через 10 месяцев после их выделения).

Химизм диссимиляционной нитратредукции у микроорганизмов, выделенных из кукурузного силоса. С целью познания путей превращения нитратов, а также изучения качественного и количественного состава газообразных продуктов, образованных при диссимиляции нитратов, проводилось изучение этого процесса у наиболее активных культур микроорганизмов. Превращение нитратного азота и его распределение в различных фракциях устанавливали с помощью культивирования микроорганизмов в пробирках Риттенберга (Ильина, 1977) на среде, содержащей KISN03 (с пептоном и без пептона).

Результаты исследования показали, что Arthr, simplex восстанавливал нитраты с высокой скоростью только до газообразного азота, причем на построение клетки использовалось лишь от 0,6% N—NOs (на среде с пептоном) до 12% N—N03 ,иа одном- нитрате, остальной нитрат шел на энергетические нужды. Вас. laterosporus осуществлял процесс с меньшей скоростью, однако одновременно с молекулярным азотом при нитратредукции образовывался и аммиак {32—55% N—NH4 or N—N03), причем наличие пептона в среде снижало выход аммиака. На биосинтез клетки культура использовала 1,3—7,3% N—N03.

Таблица 7

Соотношение клеточного к аммонийного азота, образованного из нитрата при развитии спороносной бактерия Вас. laterosporus

Источник азота Распределение использованного нэ нитрата азота различных фракций, % - Соотношение азотных фракций

аммония | клеток

Нитрат.......... Нитрат-)-о с л то и....... 54.99 7,31 32,32 1 1,31 7,5 21.7

Из таблицы 7 видно, что количество аммиака, образованного при восстановлении нитратов, превышало конструктивные

потребности клеток в 7,6—25 раз, что говорит о его происхождении в ходе диссимиляции нитратов.

Дрожжи рода Candida.использовали от 0,31 до 7,2% N— NO3 на построение клеточного азота, большая же часть нитратов использовалась ими в энергетическом процессе, в'ре-зультате которого образовывался молекулярный азот (19— 45% от N—МОз), большое количество нитритов, гидрокснла-мнна.

■Способность к диссимиляционной иитратредукинн у споровых культур и дрожжей резко снижалась при.хранении их в лабораторных условиях,

ВЫВОДЫ

, Результаты ,экспериментальных, исследований, полученные за период Ш76—1900 годов по изучению трансформации нитратов в силосе из кукурузы, выращенной на высоких дозах азотных удобрений, позволяют сделать следующие выводы:

Ii Выявлено, что применение азотных удобрений (NH4 NO3) в высоких дозах: (360—480 кг/га) приводит к значительному, накоплению нитратов в.кукурузе (0,'13—^0,28% N—NOj по сравнению с 0,05% при внесении 120 кг/га), убранной в ранние фазы-вегетации^

>2. Показано, что в ходе ферментации силоса нитраты, содержащиеся в растениях кукурузы, выращенной при внесении 360 кг/га разлагаются н к концу этого процесса их количество в-снлосе находится в пределах физиологической нормы. Напротив, высокое содержание нитратов в кукурузе, выращенной при внесении 480 кг/га, сохраняется до конца силосования (до 60 суток).

3. Установлено, что:редукция нитратов в силосе происходит в первые 3 суток в основном за счет деятельности разнообразных микроорганизмов: неспороносных — представителей родов Arthrobaeter, Pseudomonas, Erwinia, споровых — представителей рода Bacillus н дрожжей из родов Candida и Rho-dotorula. Дальнейшее разложение нитратов (после 3-х суток ферментации) осуществляется за счет активности внеклеточных ферментов, которые продолжают функционировать, но с меньшей активностью и при низких значениях pH.

4. Наблюдения показали,.что химического разложения нитратов в процессе созревания: силоса не происходит. Напротив, нитриты в кислой среде подвергаются-интенсивному химическому восстановлению, начиная с рН=4,4 и ниже.

5. Опытами с использованием стабиль^ого'нзотопа 15N установлено, что большая часть азота' нитратов "(70.8%) превращается в аммичную форму, которая не терястся из силоса; имеющего кислую реакцию.

6. Высокие концентраций нитратов, содержащиеся в кукурузном силосе, денресснруют активность гнилостных микроорганизмов и микроорганизмов, редуцирующих нитраты; однако их отрицательное влияние не сказывается на развитии и активности молочнокислых бактерий.

7. Изучение микробных пейзажей силоса, впервые проведенное нами с использованием метода стекол обрастания, выявило неблагоприятное влияние нитратов и продуктов их восстановления на морфологические особенности бактерий {образование уродливых клеток, утолщенной «кубовидной» формы).

8: Получены новые данные по химизму диссимнляцнонной нитратредукцни у ряда выделенных из кукурузного силоса микроорганизмов.

— Arthrobacter simplex осуществляет восстановление нитратов только до газообразного азота, образование аммиака при этом не наблюдается;

— ¡Bacillus laterosporus одновременно с образованием газообразного азота производит большое количество аммиака (32-55% N—NiH« от N—N03).

9. Изучение влняния-условий аэрации на трансформацию нитратов лри диссимиляции у выделенных из силоса микроорганизмов показывает, что более анаэробные условия обуслов-вают не только ускорение редукции нитратов, но и способствуют образованию более восстановленных азотных продуктов и, что особенно важно, такого соединения, как аммиак.

10. При определении влияния pH среды на днссимнляцнон* ную нитратредукцию у выделенных чистых культур микроорганизмов установлено, что в нейтральной зоне pH происходит активное восстановление нитратов. С подкнелением среды интенсивность процесса, газообразные потери азота и выход аммиака снижаются. Достижение pH уровня 5,0 полностью приостанавливает редукцию нитратов микроорганизмами.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

На основа mm научения физиологических особенностей чистых культур, восстанавливающих нитрат микроорганизмов и процессов, осуществляемых ими" в силосе, можно заключить, что известная рекомендация об обязательной плотной и герметичной укладке кукурузы на силос должна особенно строго выполняться при силосовании кукурузы, выращенной на высоких дозах азотных удобрений. Это необходимо для быстрого и более полного прохождения процесса разложения нитратов, присутствующих в растениях, и для их преимущественного превращения в ценную аммиачную форму.

Материалы диссертации опубликованы в работах

1. Максимова Е.'Н, Влияние высоких доз азотных удобрений на содержание нитратов в кукурузном силосе. VI съезд Всесоккз. микробнод. общества. Микроорганизмы и продуктивность сельского хозяйства, т. 5, 1980, 88—89.

2. Максимова Е, Н., Василенко Е.С., Переверзева Г. Й. Динамика активной микрофлоры при созревании кукурузного силоса. Известия Т.СХА, вьш; 2, 1980, 192—494.

. 3. Максимова Е. Н., Емцев В. Т., Переверзева Г. И. Микробиологические процессы силосования кукурузы при высоких дозах азотных удобрений. Доклады ТСХА, вып. 258, 4980, 91—94,

Л 76185 20/1—81 г. Объем 1 п. л. Заказ 74. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академик.им. К. А, Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44