Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологическое окисление аммония до нитратов в высших растениях (опыты со стерильными культурами)

ВАК РФ 06.01.04, Агрохимия

Автореферат диссертации по теме "Биологическое окисление аммония до нитратов в высших растениях (опыты со стерильными культурами)"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи САВИДОВ Николай Александрович

УДК 631.811.1

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ АММОНИЯ ДО НИТРАТОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ (опыты со стерильными культурами)

Специальность 06.01.04 — агрохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологи ческой химии Московской ордена Ленина и ордена Трудовой Красного Знамени сельскохозяйственной академии имеш К. А. Тимирязева.

Научный руководитель: академик ВАСХНИЛ, доктор био логических наук, профессор Б. А. Ягодин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, про фессор Н. П. Львов, кандидат биологических наук, доцент Н. Г. Ракипов.

Ведущее предприятие — Долгопрудная aгpoxимичecкa^ опытная станция, НИУИФ, НПО «Минудобрений».

Зашита состоится » . ......1991 г

в «/5 » час.*5^на заседании специализированного совета К 120.35.01 в Московской ордена Ленина и ордена Трудовогс Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА. Автореферат разослан « • • 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник

М. В. Вильяме

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Процессы взаимопревращения окисленных и восстановленных форм азота играют важную роль в жизнедеятельности высших растений. Значимость этих процессов для обмена веществ в растениях определяется необходимостью восстанавливать нитратн до аммония, поскольку азот поступает в растения, главным образом, в форме нитратов, в то время как вашейпме азотсодержащие органические вешэства - белки и нуклеиновые кислоты - содержат азот в восстановленном состоянии.

В настоящее время усилиями многих исследователей в значительной степени установлены механизмы восстановления нитратов, роль в этих процессах модибденсодержащих бе лгав. - нитратредуктаз. Вместе с тем, несмотря на неоднократные попытки, существование для высших растений обратного процесса - окисления аммония до нитратов, осуществляемого низшими организмами, строго не догаза-но. Из этого следует, что растения обладают незамкнутым путём об-, мена окисленных и восстановленных форм азота. Доказательство способности высших растений окислять аммоний до нитратов означало бы существование' замкнутого цикла взаимопревращений различных форм азота в растениях,'.а так как цикличность обменных процессов является неотъемлймым свойством мвых организмов, этот еывод может иметь важное концептуальное значение.

Подтверждение существования нитрификации выпшх растений, такие как и денитрификации, будет способствовать формированию новых представлений о путях эволюции систем азотного метаболизма и обмена веществ живых организмов.

Избыточное накопление нитратов в растениях недолятрлько в

сельскохозяйственном производстве, так как нитраты токсичны для человека и животных. В настоящее время единственным источником нитратов » растениях, считается почва, однако нитрификация в растениях означает возможность накопления эндогенных нитратов. Знание скорости нитрификации для отдельных сельскохозяйственных культур и ' размеров' накопления эндогенных нитратов в сельскохозяйственной продукции позволит правильнее определить источник нитратов в растениях и выбрать адекватный способ снижения уровня ' нитратов в сельскохозяйственной продукции.

Таким образом, существующая в настоящее время неопределённость представлений в этой области агрохимии и физиологии растений и важность окончательного вывода о возможности нитрификации в растениях для научной и практической деятельности" человека определят актуальность данного исследования.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось доказа-. тельство способности высших растений окислять аммоний до нитратов.

В задачи исследований входило:

1. Получение ансеиичной культуры растений как из поверхностно стерилизованных семян, так и из стерильных меристем, при соб-

• людении условий полной стерильности и применении различных методов .контроля за стерильностью в/ течении периода вегетации.

2. Разработка точных методов определения количества нитратов эндогенного происхождения, которые включает использование мэчен-

15

кого предшественника, выделение из растений, гарантирующее отсутствие примеси азота из других источников и. определение изотопного состава. . ' ■

3. Прямое доказательство образования нитратов из меченного

N предшественника - аммония, введённого в питательную смесь в начале вегетации.

4. Определение размеров накопления эндогенных нитратов у исследуемых видов растений.

Научная новизна и практическая значимость работы. • '

Впервые доказано окисление аммония до нитратов у растений.• полученных из апикальных меристем с помощью культуры ткани. Полученные данные изменяют существующие представления о путях накопления нитратов в высших растениях.

Разработана методика выделения и точного определения изотопного состава нитратного азота растений, которая можт быть использована в исследованиях, связанных с изучением азотного метаболизма в растениях.

Лп£обащ1Я_£§ботЫ;_ Материалы диссертации докладьшались на научной конференции молодых ученых ТСХА факультета агрохимии и почвоведения в 198? году и научной конференции ТСХА в 1S88 году.

Публикации. По материалам диссертации оформлены 5 изобретений.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения;. обзора литературы, результатов экспериментальных исследований, описания области научного и практического использования, выводов, списка литературы • и приложения. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, включая 23 таблиц. Список использованной литературы содержит 180 наименовании, в том число И*3 на иностранных языках.

- 4 -

1. ОБЪЕКТЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

В качестве объектов исследования использовали растения,. вы-виращешше из поверхностно стерилизованных семян - кукурузы, лука, салата, огурцов, пшеницы и 'клевера, микроклональную культуру картофеля, полученную из стерильных апикальных меристем на станции ваадл'Ш растений "ГСХЛ и в НИИ картофелеводства и культуру каллусной ткани салата и картофеля. Растения выращивали в стерильных условиях в пробирках с ватными пробками, которые содержали 10 мл среды Мурашиге-Скуга (МС) с 2,38 мг МН^ обогащенного

15Н (95,2атХ) (исключение,составляли пробирки большего объёма для

огурцов, которые содержали 200 мл той же среды с 47,64 мг М-Мьф.

Семена стерилизовали по специально разработанной для каждой культуры методике в два этапа - Нц01о и ^С^. Период вегетации для

кукурузы составлял • 28 дней,' для остальных растений - 49 дней. Стерильность культуры проверяли в начале, в течение и в конце вегетации с помощью 4 различных сред: мясо-пептонный агар (УЯ1А), картофельный агар (КА), ЫС и Сориана-Уокера, зараженные пробирки отбраковывали. .

Более подробно объекты, условия проведения экспериментов,

/

методика стерилизации семян, методы контроля ва стерильность» описаны в соответствующем разделе диссертации.

После окончания периода вегетации из растений и среды из контрольных пробирок выделяли нитратный азот для последующего определения изотопного состава.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ НИТРАТНОГО АЗОТА ИЗ РАСТЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО ИЗОТОПНОГО СОСТАВА

Применение дополнительных операций для выделения из раститель^ ного экстракта источников восстановленного азота.

В процессе использования принятых в настоящее время методов препаративного выделения нитратов выявилась их недостаточная пригодность для решения поставленной задачи - надёжного разделения азота нитратов и азота всех остальных соединений. Существующие пародистшшщионные и микродиффузионные методы основаны на восстановлении нитратов сплавом Деварда или солями титана в щелочной растительной вытяжке из которой предварительно удалён аммонийный азот; Образующийся при восстановлении аммиак затем улавливается в приемнике с кислой средой. Однако растительная вытяжка весьма сложна по химическому составу и содержит помимо аммония также и другие источники восстановленного .азота, способные постепенно гИдролизоваться в слабощелочной среде с выделением аммиака. Таким образом в процессе отгона создаётся практически постоянный аммиачный фон, загрязняющий выделяемую фракцию нитратного азота растений. При наличии даже небольших количеств высоко-

обогащенного восстановленного азота в пробе нитратов невысокого обогащения резко снижается точность определения исотоппого состава нитратного азота (Рис.1).

В настоящих исследованиях была разработана схема выделения нитратов из растений, которая предусматривала применение предварительных операций для выделения из растительного экстракта гид-ролизующихся органических соединений (амиды, уреиды, глюкозамикы

1234 1234 1234

контрольный с обработкой с обработкой метод КУ-2-4 ' (ЫН4)2304 и КУ-2-4

с микроионо-. форезом

1ег ра нн ос >/* да

98- уу КФ г/ 'Л' "А «0 чЧЧ

60- ЧУ V«- 'У

'V/ V/ уу 'ЛМ

УУ V, у.;

78- № УУ щ

Ь8- .V« Ух' У/; юх

ЧУ 'Л' '/л У/ УХ ¡¡й

58- •Ух .V» 1 УУ УУ с'

У / $} 'X.

4В' )У ■ху

•УУ у,"

уу у/'

38- УХ УУ] !« ;Л''- У'- •¡у. $

28- V/- у/ и-

•У* :<■- УУ <У

■У г V?

18- ж УУ <л

С<У лес уУ с УУ-

"'-У "л")

в- ,УГ V'/ + Л".

га да

№ «уу 'и

,у. со .'л чу ■уу

лу ;у. куч у/

ху( (v» '/у г*ху

л*. и6 <а чу

'x' .'л кх> <уу

■у> ку*

►•уу "о"

ул (у> к»' 'л'

/л Й5 уу v/

а'1 '■!> •ух] ч<

лч у> лу ух

Ыг. с.1 ух

пу ¿•л лу у>г

<*> ,'л л' уу

<&

у УУ га' чу

-уч лу •л:

с. лч 'у/ ¡уу ¡чу

Ф ос< уу

/'л' лу л,ч у>'

СН <у. 00. /л ■ч» (л 1

чх

'у/ л?* •уу

лу '•л •чу

л'у л.-*!- уу

1 2 1 3 4

6)

И Содериамне азота . ормжси к пробе,/!

Ш Содарканкч ншраиога амт& . в пробе;'/.

1

3 4

1 2

4

1

3 4

контрольный с обработкой с обработкой с микроионо-метод КУ-2-4 (ЯН4)2504 и КУ-2-4 , форезом ,

Рис.1. Препаративное выделение нитратного азота из различных контрольных проб с помощью общепринятого (контрольного) и модифицированных методов: а) отклонение фактического обогащения нитратов от исходного изотопного состава (0,35 ат. %.); б) содержание нитратного и примесиогд азота в пробах после фракционного. разделения. 1 - контрольный раствор: аспарагин + глута-

мин (обогащением 52,7 ат. %) и КМ03; 2,3,4 - не содержавшие нитриты вытяжки, приготовленные соответственно иа листьев картофеля; микроклубней картофыля и листьев кормовых бобов КЫ03>

4

и т. д. ) до виделэпия нитратного азота по Деварду. 'ли операции включали в себя обработку ионообменными смолами, изотопный обмен аммонийного азота природного обогащения введенного в экстракт о

предварительно активизированными ьнсокообогаирпишя амилнкмч группами, микроионофорез экстракта на кислом полигжриламидном геле, электроанализ через ацетатцеллюлозную мембрану. Их использование основано на различии свойств соединений, содержащих • окислеяныи и восстановленный азот: способности адеороисоваты,а на сильнокислотных катяонитах. прочности связи азота е основной частью молекулы в слабощелочной среде, заряда и' злектроетрети-ческой подвиулости, размера молекулы. Использование контрольных растворов и растительных вытялкк, - содерканих нитратный азот из-

1 с;

вестного (природного) обогащения N позволило выявить высокую эффективность предварит эльных операций как средства снкхонк»: яаг • рязнения пробы органическим азотом при восстановлении нитритов но Деварду и выделении пародиотилляционным способом (рис.1).

При анализе опытных растительных образцов описанные выше методы использовали в сочетании для достижения наилучших результатов в определении изотопного состава нитратов растений.

Оценка_чистоты выделенного нитратного_азога растительной пробы Для оценки чистоты нитратов, выделяемых из опытны.-: растительных вдгязрк, был Разработан и ксггаг.р-./'-л« гр.-год, осно; аиг.ул на принципе протонного ра-бовленлл. В олчс'пя'лоч'!/^ расппСЛ'.н/м растите.!!?.н;,'¡о вьпяжу перед Босстиновлетге» яитр-...,ов лп;;'л/''\<

вчрдч вводили | КН, природного осога^еки-) л проЦ'-соо

паровой дистилляции получали контрольный образец аммония. Затем из той же вытяжки выделяли опытный образец нитратного азота по

1 в

Деварду. Оба полученных образца анализировали на содержание N.

1*1

Количество органического азота, меченного N и загрязняющее как контрольный так и опытный образцы считали одинаковым (вследствие постоянства фона аммиака, возникающего в процессе отгона). Таким образом, определяя содержание примеси в контрольной пробе, устанавливали примесь органического азота в опытной пробе аммония, восстановленного из нитратов:

цЧс/П*100Х, [ат.%];

1 ч

где е - содержание N органического азота- в опытной пробе в ат.%; Т - количество азота в опытной пробе после паровой дистилляции в мкг, а с - количество органического азота в пробе в мкг -рассчитывали по формуле:'

с = (а - 0,ЭЗ)Ь/100Х, [мкг!;

где а - обогащение N контрольной пробы аммония, полученное после пароюй дистилляции; 0^36 атХ - исходное (природное) обогащение контрольной пробы аммония; Ь - количество азота в контрольной пробе в мкг. Если" количество азота в контрольной и опытной пробе аммония примерно равно, то формула принимает вид:

е = а - 0,36 , СатЛ];

Более строгий расчет изотопного состава нитратного азота должен учитывать не только содержание тяжелого изотопа азота аммиачного фона в пробе, но и общее количество загрязняющего опытную пробу органического азота, так как в противном, случае результаты определения будут заниженными. Потребность в тагам расчёте возникает только в том случае, когда количество азота примеси в опытной пробе превышает 2 - 5%. В данных исследованиях этот пока- -зателъ был в десятки раз меньше в результате использования предварительной очистки нитратов описанными методами, поэтому использовали упрощённый метод расчёта. Полный способ расчёта приведён в диссертации в главе " Результаты экспериментальных исследований".

Выделение нитратного азота из растительной пробы нитроксилеюловым методом (метод Сброшена) Метод пародистилляционного выделения опытных проб нитратного азота из слабощелочной растительной вытяжки, использованный в данных исследованиях, тестировали с помощью наиболее селективного в этом отнокении ортоксиленолового метода. Ортокеиленоловый метод основан на способности нитратных ионов конденсироваться в сильнокислой среде с ароматическим соединением - 3,4-кеиленолом. Продуктом конденсации является нитроксиленол, который затем легко отгоняется из реакционной смеси с ацетоном. В использованной модификации ортоксиленолового метода, полученный тагам образом нитроксиленол сжигали серной кислотой по Иодлъбауэру и затем отгоняли восстановленный до аммиака нитратный азот паровой дистилляцией по Кьелъдалю. Предлагавшийся в литературе метод восстановления по Ольеену сказался непригоден для нрецизгонных иссдедоглштй вследствие трудноустратдаого азгрягненип металлического яалвэа, используемого' в этом методе в качестве"восстановителя, азотом.

Выделение нитратов из сильнокислой среды практически исключало загрязнение последнего аммонийным и органическим азотом и обуславливало высокую селективность ортоксиленолового метода. Тестирование ышочало параллельное выделение нитратов двумя методами из одних и тех же предварительно обработанных растительных вытяжек с последующим определением изотопного состава нитратного азота.

Результаты определения изотопного состава нитратного азота, полученными разными способами, практически совпали (Табл. 1). Таким образом, представленные данные свидетельствуют о равиоцен-

1 с;

ности обоих методов для исследований с N в случае предварительной подготовки растительных экстрактов описанными выше способами.

Таблица 1.

15

Избыток М в составе азота нитратов, выделенных из различных растительных'проб двумя способами, ат. X.

N U/H Тип раститель- Пародистилляционный ортоксиленоловый

ной пробы способ с восстанов- способ с восстано-

лением нитратов по влением нитратов .

Деварду по Иодльбаузру.

1 Листья Triticum

aestivum L,

проба 1 0- 024 0.021 ■

г Листья Triticum / ■

aest i vum L.,

проба 2 0.093 . . 0.100

3 Листья Solanum

tuberosum L ,

микрокленальная

культура 0.018 ' 0. 020 . '

4 Листья Cucumis

sativa L. 0.065 '' 0.0S5

- . .

Приложение: коэффициент корреляции - 0,997; коэффициент лив<г$;нм регрессии - 1,08. •

Необходимо отметить, что хотя нитроксиленодовый метод отличается высокой селективностью, его существенными недостатками являются длительность и трудоемкость, поэтому основная часть результатов получена с окончанием по Д&варду.

Таблица 2.

Результаты определения изотопного состава контрольных образ-

1 ч

цов, содержавших азот природного обогащения N (0,356 ат. %) с использованием модифицированных кварцевых сосудов.

N Содер- Интенсивность образ- канне линий

Полученное обогащение

15М, ат. %

Отклонение от эталона,

ат. %

ца М-МН4, ] М

1 5.0 15.43 0.112 0.3861

-»0. 0001

2 5.0 19.75 0.143 0.3653

- 0. 0007

3 10. О 43. 92 0.321 0.3660

0. 0000

4 10.0 37.44 0.274 0.3668

+0. 0003

0. 36605 +0. 00005

^0. 002

■Относительная ошибка измерения х-э/э *100% - 0,01 где э - исходный изотопный состав азота эталонной

пробы - 0,356 ат. а х - обогащение 15Ы эталонной пробы, полученное в результате определения на

масс-спектрометре.

с_ малым содержанием азота Использование кварцевых сосудов Риттенберга уменьшенного позволило снизить относительную ошибку измерения изотопного состава азота в пробах содержавших 5-10 мкг N с 7,68 до 0,01 ат. % по сравнению с обычными сосудами (Табл. 2).

Общий ход анализа растительных образцов приведён в диссертации в главе "Результаты экспериментальных исследований".

ОБРАЗОВАНИЕ НИТРАТОВ В ТКАНЯХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Окисление аммония в культуре растений, полученной из семян Изотопный анализ нитратов растительных проб в конце вегета-

1 "п

ции выявил значительное превышение обогащения N нитратного азо-

1 ч

та над природным содержанием N (Табл.3). Достоверного изменения 1 я

обогащения N нитратной фракции питательной среды е контроль-

1 ^

пых пробирках за два месяца отмечено не было (избыток N нитратной фракции составлял 0,004 ат% в начале и 0,005 ат. X в конце 1 ^

вегетации). Избыток N в опытных пробах аммония в 10-100 раз превышал этот показатель у контрольных проб. Это позволяет говорить о том, что в данном случае окисление аммония обусловлено биологической активностью исследованных растений.

Подтверждают этот вывод и данные, представленные в таблице 6. 'Приведенная активность окисления сильно ютлеблется у разиых культур. Так, например, активность окисления стерильных микроклубней тартофоля и листьев огурца различается, более, чем в 150 раз, что

-1 с;

Избыток N в составе нитратов растений, выращенных из семян в стерильных условиях, ат. %.

вид растения Орган растения Контрольные образцы Опытные образцы Значение Г-критерия для опытных образцов*

Al Пит листья 0. 003 0. 079 0. 948

сера L. корни 0. 000 0. 047 0. 911

Trifolium листья 0. 003 0. 092 0. 956

repens L. корни ■ 0. 002 0.134 0. 970

Lactuca листья . 0.006 0. 040 0. 895

sativa L. ' корни 0.006 0.200 0. 980

Cucumis листья 0.004 0.065 0. 937

sativa L. корни 0.003 0.026 0. 833

Zea rmys L. листья 0. 003 0. 242 0. 983

корни 0.004 0.137 0. 970

Tri t-icum листья 0.005 0.056 0. 926

aestivum L. корни - - -

г = О. 072

Критическое значение ТП1 -критерия = О. 502

бесспорно предполагает зависимость скорости окисления азота от вида растения. Среди прочих культур следует отметить высокую активность окисления атония у кукурузы (Табл.3,6).

• Процессы окисления аммонийного азота в растениях, полученных иа культуры ткани Особенности культуры растений, выращенных из поверхностно стерилизованных семян полностью не исключают возможность существования эндогенной микрофлоры (патогенной или симбиотичёской), которая предположительно молют сохраняться под оболочкой семян и затем повлиять на результаты эксперимента. Поэтому использование

каляуспых форм к целых растений, выращенных из агоксальных меристем. свободных от чужеродного генетического материала, в этом случае особенно важно. В данных исследованиях однозначный вывод о нитрифицирующей активности высших растений позволяет сделать накопление эндогенных нитратов следующими культурами: микрокдональ-но размноженного из стерильных апикальных меристем растений картофеля и каллуса салата (Табл. 4,5).

Таблица 4.

1 5

Избыток N в составе нитратного азота, выделенного из каллусов картофеля и салата, ат.

Культура Контрольные образцы Опытные образцы Значение критерия для опытных образцов*

Souinum

tubeiomm L. 0,003 0.033 0,879

Lfjctuc.ci

sativa L. 0,001 0,022 0,810

* критическое значение Тд^ критерия = 0,502

Растения картофеля наряду с кукурузой, выращенной из се},ян, активнее оглсляли азот чем остальные культуры (Табл. 5).

Особый иаторес вмоывает обнаруженная в экспериментах высокая скорость окисления сссставовлоиного азота в тканях прорастающих

1 ч

микроклубней картофеля. Избыток N в нитратней Фракции растений в течении 6 недель прорастания возрастая а 10 раз (Рис. й). Активизации процессов о5{«лзсвуния зидогкчикх нитратов при щюрисяшии отмечалась ранее Ругченко I КоиЬс^-пко 19'53). Гуковоп, 1971. Уат-

1 я

Избыток N в составе нитратного азота, выделенного из меристемных растений картофеля, ат.

Органы растений Повторность Контрольные образцы Опытные образцы

Листья 1 2 3 0.000 0. ООО 0. ООО 0. 044 0. 040 0. 034

t05*Sx 0.012

микро- . клубни 1 2 3 0.000 0. 002 0. 002 0. 210 0,164 0. 244

t05*Sx 0.093

Корни 1 0.000 0. 034

том (УаЬЪ, 1987) и другими исследователями. Можно предположить, что данный процесс играет конкретную физиологическую роль в азотном обмене прорастающих растений. Например способствует детокси-кации избыточного количества аммония, выделяюшэгося в процессе прорастания при мобилизации запасного азота амидов аминокислот. Некоторые исследователи считают, что этот процесс имеет значение для углеводного обмена растений (Уа^,1987). Характер кривой предполагает, что интенсивность процессов нитрификации в растениях со , временем постепенно снижается, однако это предположение требует дальнейких исследований.

Время после прорлсташгс, яеде.ш! Рис. й. Окисление аммонийного азота в прорастающих микроклубнях картофеля.

Активность окисления аммония до_нитратов_ d_ высших Рй^тен^ях, пол^ченная эксjregnментах В таблице 6 представлены данные по активности окисления аммония до нитратов для всех исследованных культур. Необходимо отметить, что эти результаты несколько занижены, так гак нитраты, образованные в тканях растений, могли быть повторно ассимилированы в течение вегетации. Однако, хотя использованный в экспериментах метод позволяет определить лишь эндогенные нитраты, имеющиеся в растениях в конце вегетации, с его помощью можно сопоставить окислительную активность разных видов растений. Оценивая окислительную способность высших растений в целом, необходимо отметить крайне низкий уровень . их нитрифицирующей активности (табл. 3,4,5.6) по сравнению с прокариотами (Alexander, 1965) и грибами (Mirshall,196", Сорокин.1990) и значительно уступающей обратному процессу: восстановлению нитратоь до аммония. Отличав-¡внося наибольшей активностью окисления растения кукурузы за 4 не-

дели окисляли лишь 0,04% от аммония, внесенного в субстрат в начале вегетации. Очевидно низкая скорость нитрификации у высших растений и являлась препятствием для обнаружения и детального изучения этого процесса в предыдущих исследованиях.

В данном случае, однако, нельзя не учитывать специфики стерильной культуры (замедленный обмен веществ, малый прирост сухой массы и т.д.). Для культуры растений, выращенных из семян, сульфат аммония менее эффективен как предшественник нитратов. Последнее подтверждается более высокой окислительной активностью растений картофеля, полученных из меристем по сравнению с культурами, выращенными из семян. Так как первые имели значительно меньший

1 '5

пул.собственного органического азота N экзогенный аммоний очевидно мог более активно включаться в метаболический цикл растения и затем окисляться до нитратов. Возможно и ингибирование процессов нитрификации в растениях экзогенными нитратами, которые использовали как ловушку меченного продукта окисления. Представляется более вероятным, однако, что изучаемые процессы и в естественных условиях протекает с невысокой скоростью. Поэтому использование длительных экспозиций (до двух месяцев) вполне обоснованно для выявления таких процессов. Применение аммония 1 я

высокого обогащения N (95,2 ат. %), как предшественник нитратов, в сочетании с экзогенными нитратами природного обогащения в качестве ловушки, способствующей кумуляции эндогенных нитратов в тканях растений, а также применение новых, более чувствительных методов определения количества азота, окислениого в растениях, представляется желательным в подобных исследованиях.

Благодаря сочетанию этих приемов оказалось возможным обнаружить существование у всех изученных культур протекающих с малой

Активность окисления меченного аммония исследованными культурам» за период вегетации

Культура Органы растений Содержание Содержание окисленного в растении аммонийного азота Приведенная активность

N-N03 мг/1000 растений мкг/1000 растений в Z от внесенного в пит. смесь N-NH^x 10~3 окисления мг/Ы/кг абсолютно сухой массы

Микрокяона-льная культура Solarium tuberosum L листья корни микроклубни целое растение каллус зг?. 4 6.3 65.2 398.9 1.188.0 132. 0 2.2 134.0 268.2 392.0 4.38 0.07 4.47 8.92 16. 47 7. 06 4. 40 25. 28 12. 29 1. 32

Allium сера L. листья корни целое растение 88,3 8. 4 96.7 71. 0 4.0 75.0 2.96 , 0.17 3.13 0. 85 0.19 ' 0.72

Trifol iurn rvpens L листья корни целое растение 10,2 82.9 93.1 10.0 117.0 ■ 127.0 0.42 4.89 , 5.32 0.15 3. 64 1.26

Loctuca Seit i va L. листья корни целое растение каллус 45,0 2.5 47. 5 76.0 16.0 5.. 0 21. 0 115.0 0.67 0. 21 0. 89 . 4.83 0. 66 2. 29 . 0. 81 1 2.86

Cue и mi s saliva L листья.. корни целое растение 59,2 66.0 125.2 36.0 24. 0 60. 0 0.08 . 0.05 . 0.13 . 0.16 . 0.16 0.16

Zoa mays L. листья корни целое растение 167,5 391. 6 559. 2 421.0 547. 0 968.0 • 17. 69 22. 98 40. 67 2.41 15. 07 4. 59

Tri ticum aßsti/vm L. листья 220,2 119. 0 •5.00 1. 62

скоростью процессов образования эндогенных нитратов (для сравнения, Делвич (1951), который получил отрицательный результат, использовал максимум 48-часовые экспозиции листьев таба-з в среде

1 S \ R

с меченным N аммонием (обогащение N в экспериментах составляло 30 ат.%)). ' . '

Полученные результаты не отрицают возможности более активного окисления аммония до нитратов в иных условиях и другими культурами. Известно, что некоторые виды растений могут накапливать значительные количества метаболитов, содержащих окисленный азот, например кукуруза - до 2% бензоксазинов, астрагал, до 8% нитросое-динений (в пересчете на нитрогруппу). Молодые растения сои натапливают до 15% от сухой массы, дуррина, цианогенного глюкозида, предшественником которого является 4-гидраксифенилацетал.ьдокеим, • • Эти примеры указывают на возможность существования органического пути образования эндогенных нитратов в растениях, подобного существующему у гетеротрофных нитрификаторрв. В этом случае можно предположить, что ферментативный гидролиз .метаболитов, содержащих окисленный азот в составе нитрсш* й нитрогрупп (Alston,1935) и накапливаемых некоторыми растениями в больших концентрациях, монет привести к высвобождению значительных количеств эндогенного . нитратного, азота. .

. . Из результатов проведённых исследований следует, что процесс нитрификации оказался характерным для всех изученных культур, хотя они относились к разным семействам и 1слассам и обладали разным метаболизмом. Это свидетельствует о его универсальности в преде-■. дах изученной группы культур. Таким образом, можно заключить, что обмен окисленных и восстановленных соединений азота в высших

растениях, так же гак и у низших организмов, является циклически замкнутым.

Результаты проведенных исследований позволили сделать следующие выводы:

1. Все исследованные виды высших растений - картофель, кукуруза, лук, салат, огурцы, пшеница, клевер - способны самостоятельно окислять аммонийный азот до нитратоЕ. Это свидетельствует о широкой распространенности нитрификации у растений.

2. Способностью окислять аммоний до нитратов в стерильных условиях обладали как меристемные, так и выращенные из семян культуры растений.

а" Наибольшая биологическая активность окисления аммония до нитратов была характерна для картофеля и кукурузы, которые резко выделялись в этом отношении среди других исследованных культур.

4. В условиях проведённых экспериментов процесс нитрификации протекал с крайне низкой скоростью. Даже наиболее активные в этом отношении растения кукурузы окисляли за 4 недели лишь 0,04% от всего аммонийного азота, внесённого в питательную смесь в начале вегетации.

5. Образование нитратов в тканях растений нельзя отнести за счёт неорганического окисления, так'как этот процесс в значитель- , ной степени зависел от вида растения и от направленности физиологических процессов.в растениях (растительная нитрификация активизировалась при прорастании клубней картофеля).

6. Разработаны методы выделения нитратной фракции растительной пробы и определения изотопного состава нитратного азота при его содержании в пробе 5-10 мта', позволяющие значительно увеличить точность определения количества эндогенных нитратов в растениях.

Список работ по теме диссертации

1. Савпдов Н. А., Ягодин Б. А., Верпиченко И. В. Изобретение: Способ определения количества азота, окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 6/У1-89 г. по заявке № 4670918).

2. Савпдов Н. А., Ягодин Б. А., В е р н и ч е н к о И. В. Изобретение: Способ определения количества азота, окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 6/У1-89 г. по заявке № 4672019).

3. Савпдов Н. А., Ягодин Б. А., Верпиченко И. В. Изобретение: Способ определения количества азота, окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 14/У1-89 г. по заявке № 4670916).

4. Савпдов Н. А., Ягодин Б. А., Верпиченко И. В. Изобретение: Способ определения количества азота, окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 15/У1-89 г. по заявке ЛЬ 4670917).

5. С а в и д о в Н. А„ Ягодин Б. А,, В е р и и ч е н к о И. В. Изобретение: Способ определения количества азота, окисленного в растениях (Решение о выдаче АС от 15/У1-89 г. по заявке ЛЬ 4671199).

Заказ 788.

Тираж 100

Объем 1 '/4 п. л.

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44