Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства микроорганизмов, определяемых при внебольничных инфекциях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Кондратова, Шохида Юрьевна, Ташкент

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН УРГЕНЧСКИЙ ФИЛИАЛ ТАШКЕНТСКОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ

62 12/30

На правах рукописи УДК: 579.2/8:616.94-022.7

у

)

КОНДРАТОВА ШОХИДА ЮРЬЕВНА ф^^У

•/ /

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ, ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ ПРИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Дусчанов Б.А.

Ташкент - 2007

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................... 5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................11

1.1 Характеристика основных возбудителей внебольничных инфекций......................................................................................................................................................................................^

1.2 Особенности антибиотикорезистентности стафилококков..................16

1.3 Особенности антибиотикорезистентности грамотрицательных бактерий........................................................................................................................................................................................24

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........... 30

ГЛАВА III. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РЕЗУЛЬТАТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

38

ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ..............................................

3.1. Физиолого-биохимические свойства стафилококков....................... 39

3.2. Разработка общей схемы и отдельных дифференцирующих

тестов исследования на стафилококки................................................ 45

3.3. Физиолого-биохимические свойства грамотрицательных

бактерий.................................................................................................. 51

ГЛАВА IV. РОДОВАЯ И ВИДОВАЯ СТРУКТУРА МИКРОФЛОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ИНФЕКЦИИ............................ 54

ГЛАВА V. АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ СТАФИЛОКОККОВ..................

ГЛАВА VI. АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ГРАМОТРИЦАТЕЛБНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ......................................... 92

6.1 Чувствительность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей внебольничных инфекций................................ 92

6.2 Изучение вероятности продукции БЛРС внебольничными штаммами E.coli и K.pneumoniae.......................................... 98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................................................................................109

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................................................116

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................................................................................118

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ............................................................................................119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛРС - беталактамазы расширенного спектра

ДЗПР- диаметр зон подавления роста

ДДМ- диско-диффузионный метод

имп- инфекции мочевыводящих путей

КОЕ- колониеобразующие единицы

КОС- коагулазоотрицательные стафилококки

кпс- коагулазоположительные стафилококки

мпк- минимальная подавляющая концентрация

М.Р.- методические рекомендации

МУК- методические указания

MRSA- мецитиллинрезистентные S.aureus

MRSE- мецитиллинрезистентные коагулазоотрицательные стафилококки

MSSA- мецитиллинчувствительные S. aureus

MSSE- мецитиллинчувствительные коагулазоотрицательные стафилококки

НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии

ПСБ - пенициллинсвязывающий белок

ГГЦР - полимеразная цепная реакция

R- резистентный

S- чувствительный

RS- умеренно резистентный

ЦП- цефалоспорины

NCCLS- National Committee for Clinical Laboratory Standarts (Национальный

комитет стандартов для клинических лабораторий)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы свидетельствует, что в этиологии гнойно-воспалительных заболеваний госпитального и внегоспитального происхождения происходят существенные изменения, в частности, -возрастание удельного веса условно-патогенных бактерий с вовлечением в число возбудителей всё более широкого круга микроорганизмов (Покровский

B.И. с соавт., 1999; Белобородов В.Б., 2000; Нуралиев Н.А., 2001; Сидоренко

C.B., 2002; Мирзаева М.А. с соавт., 2005; Patel R. et al., 2000; Garcia P. et al., 2004; Jacoby G. et al., 2005). Поэтому, слежение за видовым составом и установление доминирующих видов микроорганизмов в структуре гнойно-воспалительных заболеваний человека продолжают оставаться актуальной проблемой здравоохранения. (Миронов А.Ю. с соавт., 2000; Отаханов Б.Р., 2005; Smith D. et al., 2004; Eisner A. et al., 2006). Немаловажное значение имеет изучение биологических свойств этих микроорганизмов, антибиотикорезистентности, поиск возможностей улучшения и оптимизации методов их лабораторной диагностики (Волков И.И., 1999; Исхакова Х.И. с соавт., 2002; Perry J. et al., 2004; Flayhart D et al, 2005). На протяжении многих лет одной из острых проблем здравоохранения являются госпитальные инфекции. Многочисленные работы свидетельствуют о высокой летальности, тяжести заболевания и удлинении сроков госпитализации больных с внутрибольничной инфекцией (Мухамеджанова Д. К., 2004; Яковлев C.B., 2004; Hyle Е. et al., 2005; Wei Z-Q., 2005; Sola С. et al., 2006; ТимЬагеПо M. et al., 2006). Наиболее важным аспектом этой проблемы является выраженная устойчивость возбудителей к антимикробным препаратам, включая новейшие беталактамные и другие антибиотики (Баженов Л.Г., 2000; Белобородов В.Б., 2004; Tiemerssma Е. et al., 2004; Wannet W. et al., 2004; Veen A. et al., 2005).

В то же время, к настоящему времени накопился определенный фактический материал, свидетельствующий о приобретении резистентности к антибиотикам и возбудителей внегоспитальных инфекций (Страчунский Л.С. с соавт.,2005; Domínguez Е. et al., 2002; Rodriguez-Bano J. et al., 2004; Valderde A. et al., 2004; Frazee B. et al, 2005; Faria N. et al, 2005). Так, в амбулаторной практике все большее значение приобретают оксациллинрезистентные S.aureus (MRSA), оксациллинрезистентные S.epidermidis и другие коагулазоотрицательные стафилококки (MRSE), вызывающие разнообразные инфекции, в том числе - тяжелые некротизирующие геморрагические пневмонии, фурункулёзы и другие инфекции мягких тканей (Кочетков Г.А, 2005; Kertulla A. et al, 2005; Wylie J. et al, 2005; Roberts J. et al, 2006; Tenover F. et al, 2006). Уже в настоящее время эти микроорганизмы представляют серьёзную проблему; в дальнейшем предполагается их прогрессирующее возрастание в амбулаторных условиях. Энтеробактерии, продуцирующие определенный класс ферментов - беталактамаз расширенного спектра (БЛРС),-характеризуются стремительными темпами распространения в отделениях реанимации и интенсивной терапии и постепенным увеличением их числа при внебольничных инфекциях (Гучев И.А, 2005; Bradford Р, 2001; Paterson D, 2003; Faria N.A. et al, 2005; Eisner A. et al,2006; Tenover F. et al, 2006). Это «проблемные» микроорганизмы нашего века, поскольку, несмотря на существенные различия в механизмах их устойчивости, итогом является резистентность этих штаммов ко всему обширному классу беталактамных антибиотиков, нередко ассоциирующаяся с резистентностью к аминогликозидам, фторхинолонам и другим антибиотикам (Вильяме Д, 1997; Волков И.И, 1999; Сидоренко С.В, 2002; Страчунский Л.С. с соавт, 2003; Страчунский С.В, 2005; Young D. et al, 2004; Tolun V. et al, 2004; Vindel A. et al, 2006).

Вопросы частоты выявления и роли МЫЗА-МЫЗЕ и БЛРС-продуцирующих микроорганизмов при внебольничных инфекциях у нас в республике практически не изучены. При отсутствии этих данных невозможно планировать на будущее эффективные мероприятия по сдерживанию распространения и циркуляции подобных штаммов. Недостаточно изучена роль различных видов микроорганизмов, вызывающих внебольничные инфекции в нашем регионе, их биологические свойства. В связи с этим, представляется обоснованным изучить этиологическую структуру внебольничных инфекций и особенности устойчивости к антибиотикам микроорганизмов в конкретном, экологически сложном регионе страны.

Цель исследования. Выявить этиологически значимых возбудителей внебольничных инфекций в Хорезмской области Узбекистана, определить их биологические свойства, антибиотикорезистентность и для отдельных возбудителей - оптимизировать метод бактериологической диагностики.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, культуральные и биохимические свойства возбудителей внебольничных инфекций, упростить и адаптировать к практике дифференциально-диагностическую схему исследования стафилококков.

2. Исследовать микробный пейзаж гнойно-воспалительных очагов у больных с различными формами внегоспитальных инфекций.

3. Изучить резистентность к антибиотикам выделенных грамположительных микроорганизмов, уровень и значение устойчивости стафилококков внебольничного происхождения к оксациллину.

4. Изучить резистентность к антибиотикам выделенных грамотрицательных микроорганизмов, возможность формирования среди них штаммов, продуцирующих БЛРС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лидирующее положение в развитии внебольничных инфекций разной локализации (кроме инфекций мочевыводящих путей) принадлежит стафилококкам, характерными признаками которых являются: расширение видового спектра этиологически значимых коагулазоотрицательных стафилококков, нередко их атипичность по биохимическим свойствам и высокий удельный вес MRSA и MRSE.

2. Грамотрицательные микроорганизмы во внебольничных условиях вызывают преимущественно инфекции мочевыводящих путей и по своим культурально-биохимическим свойствам относятся к типичным E.coli и K.pneumoniae. Эти возбудители во внебольничных условиях очень редко продуцируют БЛРС, хотя часто проявляют устойчивость ко многим современным антибиотикам.

Научная новизна. Изучены биологические свойства и чувствительность к антибиотикам микроорганизмов - возбудителей внебольничных инфекций в экологически неблагополучном регионе и установлено доминирование S.aureus, коагулазоотрицательных стафилококков, E.coli, K.pneumoniae. Среди коагулазоотрицательных стафилококков в гнойно-воспалительных очагах выявляются редко идентифицируемые в практике виды - S.haemolyticus, S.lugdunensis.

Установлено, что региональные штаммы MRSA и MRSE внебольничного происхождения in vitro часто проявляют «нетипичную» (ложную) чувствительность к беталактамным антибиотикам.

Впервые в республике фенотипическим методом определена продукция БЛРС у E.coli и K.pneumoniae и установлено, что внебольничные штаммы, в отличие от внутрибольничных, редко являются продуцентами БЛРС.

Научная и практическая значимость результатов исследования

Предложена простая, максимально приближенная к практике схема дифференциальной диагностики S. aureus и коагулазоотрицательных стафилококков в биоматериале от больных с гнойной инфекцией.

Разработан метод приготовления тест-дисков для определения в рутинной практике орнитиндекарбоксилазы при дифференциации медицински значимых стафилококков.

В связи с высоким удельным весом MRSA, MRSE и учитывая особенности формирования у этих штаммов устойчивости к беталактамным антибиотикам, даны практические рекомендации специалистам по правильной интерпретации результатов исследования

антибиотикорезистентности стафилококков.

Реализация результатов. Полученные результаты отражены в методических рекомендациях «Характеристика биологических свойств отдельных видов стафилококков» и информационном письме «Особенности антибиотикорезистентности стафилококков к беталактамным антибиотикам», которые утверждены МЗ РУз и внедрены в учебный процесс Ташкентской медицинской академии Ургенчского филиала Ташкентской медицинской академии, Ташкентского института усовершенствования врачей, а также в практику работы бактериологической лаборатории ЦГСЭН Ургенчского отделения железных дорог.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на научно-практической конференции молодых ученых (Ташкент, 2005); на

VIII съезде инфекционистов, микробиологов, эпидемиологов, гигиенистов, токсикологов и санитарных врачей Республики Узбекистан с международным участием (Ташкент, 2005); на Ш съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 2005), на межкафедральной научной конференции кафедры микробиологии и эпидемиологии Ургенчского филиала Ташкентской медицинской академии (Ургенч, 2006); на научном семинаре ТашНИИВиС (Ташкент, 2007); на заседании апробационного совета НИИЭМИЗ МЗ РУз (Ташкент, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 журнальные статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах компьютерного текста и состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, состоящего из 192 источников, из которых 124 на иностранных языках.

Автор выражает искреннюю благодарность за оказанную консультативную помощь при выполнении настоящей работы д.м.н., профессору Нуралиеву Неккадаму Абдуллаевичу.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных возбудителей внебольничных инфекций

Микроорганизмы являются частью биоценоза всех экологических процессов, которые наблюдаются в естественных условиях. В процессе эволюционного развития, адаптации к существующим между определенными видами и группами микроорганизмов и другими формами жизни, установились сложные взаимоотношения. Нарушение экологического баланса между микро- и макроорганизмами, а также внутри микробных ассоциаций приводит к селекции более патогенных видов и штаммов микроорганизмов, более интенсивному генетическому обмену (Мухамедов И.М., 2000; Сидоренко C.B., 2002; Smith D. et al., 2004; Eisner E. et al., 2006). Именно благодаря этому процессу изменения биологических свойств микробов носят не локальный характер, и касаются не отдельных видов или семейств, а начинают приобретать тотальный характер.

Наблюдаемое в последние десятилетия существенное расширение круга микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания у человека, пополнение этого круга за счет считавшихся ранее безвредными микроорганизмами, выраженная устойчивость современных возбудителей к антибиотикам - все это свидетельствует об актуальности проблемы и необходимости изучения этиологии инфекционных заболеваний (Баженов Л.Г., 2000; Исхакова Х.И., 2002; Эсамуратов А.И., 2004; Garcia P. et al., 2004). И если возбудители традиционных инфекционных заболеваний (брюшной тиф, дифтерия и др.) и возбудители внутригоспитальных инфекций изучены достаточно подробно (Мухамеджанова Д.К., 2004; Яковлев C.B., 2004; Сигалов Д.О., 2005; Hyle D. et al., 2005; Sola С. et al., 2006), то по внебольничным инфекциям наши знания должны существенно расширяться.

Спектр внебольничных инфекций чрезвычайно широк - от самых безобидных нагноений ссадин и ранок до серьезных заболеваний, таких как пневмонии, бронхиты, пиелонефриты и др.

Из лиц обращающихся за медицинской помощью в поликлиническую сеть, пожалуй, наиболее частыми пациентами являются люди с патологией урогенитального тракта и с заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей.

Этиологии ИМИ посвящено большое количество исследований (Лоран О.Б. и соавт., 1999; Страчунский JI.C. с соавт.,1999; Митрохин С.Д, 2002; Моисеев C.B, 2Q03; Vandepitte J. et al, 1994). Во многих работах отмечается, что ведущими возбудителями ИМП выступают E.coli (Лопаткин H.A., 2001; Коровина H.A., 2002; Кулаков В.И, 2004; Vandepitte J. et al, 1994; Haile D. et al, 2002). Например, по результатам многоцентрового исследования в России (Страчунский Л.С. с соавт, 1999) кишечная палочка выделяется в 85,9% неосложненных ИМП, особенно высок ее удельный вес у женщин, а доля грамположительных бактерий не превышает 3-5%. О высоком уровне мультирезистентных E.coli при инфекциях урологического тракта сообщает J.Rodrignues-Bano et al. (2004).

Интересно отметить, что у уропатогенных штаммов E.coli, выделенных от женщин с острым циститом, вирулентность была тем выше, чем большей была резистентность к ципрофлоксацину (Johnson J. et al, 2005). Тот же автор сообщает, что E.coli, ассоциированные с циститами и пиелонефритами женщин, в отличие от E.coli, выделенных от здоровых лиц, относились к особой строго ограниченной клональной группе A-CGA. В то же время, по данным других авторов, в последние годы происходит сдвиг в этиологии острых циститов. Так, некоторые авторы считают, что происходит замена E.coli на K.pneumoniae и другие энтеробактерии, с возрастанием их уделенного веса до 21,8% (Ахметова Л.И. и соавт, 2001; Фаязова М.П, 2001) и даже до 60,8% (Jenney A. et al, 2006).

При осложненных ИМП - видовая структура возбудителей становится значительно шире (Страчунский JI.C. с соавт. 1999; Белобородов В.Б., 2002; Синякова JI.A., 2002), особенно в госпитальной среде, где почти половина этих заболеваний вызывается синегнойной палочкой, клебсиеллами, энтерококками, нарастает количество ИМП, связанных с КОС.

При инфекциях мягких тканей, как и в предыдущие годы, лидирующими возбудителями остаются стафилококки (Зубков М.Н., 2004; Отаханов Б.Р., 2005; Tenover F., 2006). Наиболее часто здесь обнаруживается золотистый стафилококк, особенно MRSA - штаммы, которые могут иметь эпидемическое распространение во внебольничной среде (Frazee В. et al., 2005; Young D. et al., 2005; Roberts J. et al., 2006; Tenover F., 2006). В последние годы повысилась роль S.haemolyticus - этот микроорга